DE10031839A1

DE10031839A1 - Erythropoietinkonjugate

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Publication number: DE10031839A1
Application number: DE10031839A
Authority: DE
Inventors: Pascal Sebastian Bailon
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1999-07-02
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2001-02-01
Also published as: GB2353281A; NO2009010I1; HU226233B1; HUP0002553A3; HUP0002553A2; GB2353281B; ITMI20001479A1; EP1839676A2; SI1064951T1; RS49928B; ATE370748T1; LU91363I9; ITMI20001479A0; NL300289I9; GB2393960A; JP3727009B2; DK1064951T3; ID26447A; GB0400086D0; DE60036053T2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Konjugate von Erythropoietin mit Poly(ethylenglycol), umfassend ein Erythropoietinglycoprotein mit mindestens einer freien Aminogruppe und die biologische in vivo-Aktivität aufweisen, um Knochenmarkzellen zur gesteigerten Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutzellen zu veranlassen, und ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Humanerythropoietin und Analogen davon, die eine Sequenz von Humanerythropoietin, modifiziert durch Addition von 1 bis 6 Glycosylierungsstellen oder eine Umlagerung mindestens einer Glycosylierungsstelle, aufweisen, wobei das Glycoprotein kovalent an "n" Poly(ethylenglycol)-gruppen der Formel -CO-(CH 2 ) x -(OCH 2 CH 2 ) m -OR gebunden ist, wobei die Carbonylgruppe jeder Poly(ethylenglycol)gruppe eine Amidbindung mit einer der Aminogruppen bildet; wobei R Niederalkyl bedeutet; x 2 oder 3 bedeutet; m etwa 450 bis etwa 900 bedeutet; n 1 bis 3 bedeutet; und n und m so ausgewählt sind, daß das Molekulargewicht des Konjugats abzüglich des Erythropoietinglycoproteins 20 Kilodalton bis 100 Kilodalton beträgt.

Description

Die Erythropoese ist die Erzeugung von roten Blutzel len, die zum Ausgleich des Zellabbaus erfolgt. Erythropoese ist ein kontrollierter, physiologischer Mechanismus, der für eine geeignete Versorgung des Gewebes mit Sauerstoff ausrei chend rote Blutzellen zur Verfügung stellen kann. Natürlich vorkommendes Humanerythropoietin (hEPO) wild in der Niere er zeugt und ist der humorale Plasmafaktor, der die Erzeugung von roten Blutzellen stimuliert (Carnot, P. und Deflandre, C. (1906) C. R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, A. J. (1953) Blood 8: 349; Reissmann, K. R. (1950) Blood 5: 372; Jacobson, L. O., Goldwasser, E., Freid, W. und Plzak, L. F. (1957) Nature 179: 6331-4). Natürlich vorkommendes EPO stimuliert die Teilung und Differenzierung von jeweiligen erythroiden Vorläufern im Knochenmark und übt seine biologische Aktivität durch Binden an Rezeptoren an erythroiden Vorstufen aus (Krantz, BS (1991) Blood 77: 419).

Erythropoietin wurde biosynthetisch unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie hergestellt (Egrie, J. C., Strickland, T. W., Lane, J. et al. (1986) Immunobiol. 72: 213- 224) und ist das Produkt eines geklonten Human-EPO-Gens, in seriert in und exprimiert in den Ovariumgewebszellen des Chi nesischen Hamsters (CHO-Zellen). Die Primärstruktur der pre dominanten voll ausgebildeten Form von hEPO wird in SEQ ID NR.: 1 erläutert. Es gibt zwei Disulfidbrücken zwischen Cys⁷- Cys¹⁶¹ und Cys²⁹-Cys³³. Das Molekulargewicht der Polypeptidket te von EPO ohne die Zuckerreste ist 18236 Da. In dem intakten EPO-Molekül machen die Kohlenhydratgruppen, die das Protein an den Glycosylierungsstellen am Protein glycosylieren, etwa 40% des Molekulargewichts aus (Sasaki, H., Bothner, B., Dell, A. und Fukuda, M. (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059).

Da Humanerythropoietin bei der Bildung von roten Blutzellen wesentlich ist, ist das Hormon bei der Behandlung von Blutkrankheiten, die durch eine geringe oder mangelhafte Erzeugung von Blutzellen gekennzeichnet sind, brauchbar. Kli nisch wird EPO bei der Behandlung von Anämie bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF) (Eschbach, J. W., Egri, J. C., Downing, M. R. et al. (1987) NEJM 316: 73-78; Eschbach, J. W., Abdulhadi, M. H., Browne, J. K. et al. (1989) Ann. Intern. Med. 111: 992; Egrie, J. C., Eschbach, J. W., McGuire, T., Adamson, J. W. (1988) Kidney Intl. 33: 262; Lim, V. S., Degowin, R. L., Zavala, D. et al. (1989) Ann. Intern. Med. 110: 108-114) und bei AIDS und Krebspatienten, die mit einer Chemotherapie behandelt werden (Danna, RP, Rudnick, S. A., Abels, R. I. In: M. B. Garnick, Herausg. Erythropoietin in Clinical Applications-An International Perspective. New York, NY: Marcel Dekker; 1990: S. 301-324) eingesetzt. Die Bioverfügbarkeit von handelsüblichen Proteintherapeutika, wie EPO, ist allerdings durch ihre kurze Halbwertszeit in Plasma und durch ihre Anfälligkeit für Proteaseabbau begrenzt. Diese Nachteile verhindern das Erreichen einer maximalen klinischen Wirkung.

Die Erfindung stellt ein Erythropoietin-Konjugat be reit, wobei das Konjugat ein Erythropoietinglycoprotein mit mindestens einer freien Aminogruppe umfaßt und die biologi sche in vivo-Aktivität aufweist, um Knochenmarkzellen zur ge steigerten Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutzellen zu veranlassen, und ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Humanerythropoietin und Analogen davon, die eine Sequenz von Humanerythropoietin, modifiziert durch die Addition von 1 bis 6 Glycosylierungsstellen oder eine Umlagerung mindestens ei ner Glycosylierungsstelle, aufweisen, wobei das Glycoprotein kovalent an "n" Poly(ethylenglycol)gruppen der Formel -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR gebunden ist, wobei die Gruppe -CO (d. h. Carbonyl) jeder Poly(ethylenglycol)gruppe eine Amidbin dung mit einer der Aminogruppen bildet; wobei R Niederalkyl bedeutet; x 2 oder 3 bedeutet; m etwa 450 bis etwa 900 bedeu tet; n 1 bis 3 bedeutet; und n und m so ausgewählt sind, daß das Molekulargewicht des Konjugats abzüglich des Erythropoi etinglycoproteins 20 Kilodalton bis 100 Kilodalton beträgt. Die Erfindung stellt außerdem Zusammensetzungen bereit, die hierin beschriebene Konjugate enthalten, wobei der Prozent satz an Konjugaten in der Zusammensetzung, in der n gleich 1 ist, mindestens neunzig Prozent beträgt.

Verglichen mit nicht modifiziertem EPO (d. h. EPO ohne gebundenes PEG) und üblichen PEG-EPO-Konjugaten weisen die vorliegenden Konjugate erhöhte Halbwertszeit im Kreislauf und Verweilzeit im Plasma, vermindertes Clearance und verminderte klinische in vivo-Aktivität auf. Die erfindungsgemäßen Konju gate weisen dieselbe Verwendung wie EPO auf. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Konjugate zur Behandlung von Pati enten durch Stimulierung der Teilung und Differenzierung von jeweiligen erythroiden Vorläufern im Knochenmark in derselben Weise, in der EPO zur Behandlung von Patienten verwendet wird, geeignet.

Die Erfindung stellt Konjugate bereit, wobei die Kon jugate ein Erythropoietinglycoprotein mit mindestens einer freien Aminogruppe umfassen und die biologische in vivo- Aktivität aufweisen, um Knochenmarkzellen zur gesteigerten Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutzellen zu veranlas sen, und ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Human erythropoietin und Analogen davon, die eine Sequenz von Hu manerythropoietin, modifiziert durch die Addition von 1 bis 6 Glycosylierungsstellen oder eine Umlagerung mindestens einer Glycosylierungsstelle, aufweisen, wobei das Glycoprotein ko valent an "n" Poly(ethylenglycol)gruppen der Formel -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR gebunden ist, wobei die Gruppe -CO (d. h. Carbonyl) jeder Poly(ethylenglycol)gruppe eine Amidbin dung mit einer der Aminogruppen bildet; wobei R Niederalkyl bedeutet; x 2 oder 3 bedeutet; m etwa 450 bis etwa 900 bedeu tet; n 1 bis 3 bedeutet; und n und m so ausgewählt sind, daß das Molekulargewicht des Konjugats abzüglich des Erythropoi etinglycoproteins 20 Kilodalton bis 100 Kilodalton beträgt.

Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Konjuga te in derselben Weise wie nicht modifiziertes EPO verwendet werden können. Die erfindungsgemäßen Konjugate weisen jedoch eine höhere Halbwertszeit im Kreislauf und eine höhere Ver weilzeit im Plasma, vermindertes Clearance und erhöhte in vi vo-Aktivität auf. Aufgrund dieser verbesserten Eigenschaften können die erfindungsgemäßen Konjugate einmal wöchentlich, anstatt dreimal wöchentlich wie bei nicht modifiziertem EPO, verabreicht werden. Eine verminderte Verabreichungshäufigkeit führt erwartungsgemäß zu einer verbesserten Befolgung durch den Patienten, was zu einem besseren Behandlungsergebnis so wie zu einer besseren Lebensqualität des Patienten führt. Verglichen mit üblichen Konjugaten von EPO, das an Po ly(ethylenglycol) gebunden ist, wurde gefunden, daß Konjugate mit dem Molekulargewicht und der Linkerstruktur der erfin dungsgemäßen Konjugate eine verbesserte Wirksamkeit, Stabili tät, AUC (Fläche unter der Serumkonzentration-Zeit-Kurve), Halbwertszeit im Kreislauf und ein besseres Kostenprofil auf weisen.

Die erfindungsgemäßen Konjugate können in der glei chen Weise wie EPO in einer therapeutisch wirksamen Menge an Patienten verabreicht werden. Die therapeutisch wirksame Men ge ist jene Menge an Konjugat, die für die biologische in vi vo-Aktivität erforderlich ist, um die Knochenmarkzellen zu einer Steigerung der Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutzellen zu veranlassen. Die exakte Menge an Konjugat un terliegt solchen Faktoren wie der genauen Art des zu behan delnden Zustandes, dem Zustand des zu behandelnden Patienten sowie anderen Bestandteilen in der Zusammensetzung. Bei spielsweise können 0,01 bis 10 µg pro kg Körpergewicht, vor zugsweise 0,1 bis 1 µg pro kg Körpergewicht, beispielsweise einmal wöchentlich verabreicht werden.

Die das Konjugat enthaltenden pharmazeutischen Zusam mensetzungen können in einer Stärke formuliert werden, die zur Verabreichung durch verschiedene Maßnahmen an einen Pati enten (Mensch) mit Blutkrankheiten, die durch eine geringe oder mangelhafte Erzeugung von roten Blutzellen gekennzeich net sind, wirksam ist. Mittlere therapeutisch wirksame Mengen des Konjugats können variieren und insbesondere sollten sie auf den Empfehlungen und Verschreibungen eines ausgebildeten Arztes beruhen.

Die Erythropoietinglycoprotein-Produkte, welche gemäß vorliegender Erfindung hergestellt wurden, können zu pharma zeutischen Zusammensetzungen, geeignet zur Injektion mit ei nem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Vehikulum, durch an sich bekannte Verfahren zubereitet werden. Beispielsweise wurden geeignete Zusammensetzungen in WO 97/09996, WO 97/40850, WO 98/58660 und WO 99/07401 beschrieben. Unter den bevorzugten pharmazeutisch verträglichen Trägern zur Formulierung der er findungsgemäßen Produkte sind Humanserumalbumin, Humanplasma proteine usw. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in 10 mM Natrium/Kaliumphosphatpuffer bei pH 7 mit einem Tonizi tätsmittel, beispielsweise 132 mM Natriumchlorid, formuliert werden. Gegebenenfalls kann die pharmazeutische Zusammenset zung einen Konservierungsstoff enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann unterschiedliche Mengen an Erythropoi etin, beispielsweise 10-1000 µg/ml, beispielsweise 50 µg oder 400 µg enthalten.

Der Begriff "Erythropoietin" oder "EPO" betrifft ein Glycoprotein mit der Aminosäuresequenz, die in (SEQ ID NR.: 1) oder (SEQ ID NR.: 2) angeführt ist, oder eine Aminosäure sequenz, die im wesentlichen homolog dazu ist, deren biologi sche Eigenschaften die Stimulierung der Erzeugung von roten Blutzellen und die Stimulierung der Teilung und Differenzie rung von jeweiligen erythroiden Vorläufern im Knochenmark be treffen. Diese hier verwendeten Begriffe schließen solche Proteine, die gezielt, beispielsweise durch direkte Ortsmuta genese oder zufällig durch Mutationen modifiziert wurden, ein. Diese Begriffe schließen auch Analoge mit 1 bis 6 zu sätzlichen Glycosylierungsstellen, Analoge mit mindestens ei ner zusätzlichen Aminosäure an dem Carboxy-endständigen Ende von Glycoprotein, wobei die zusätzliche Aminosäure mindestens eine Glycosylierungsstelle einschließt, und Analoge mit einer Aminosäuresequenz, die eine Umlagerung von mindestens einer Glycosylierungsstelle einschließt, ein. Diese Begriffe schließen sowohl natürliches als auch rekombinant erzeugtes Humanerythropoietin ein.

Die erfindungsgemäßen Erythropoietin-Konjugate können durch die Formel I:

P-[NHCO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR]_n (I)

wiedergegeben werden, wobei x, m, n und R wie vorstehend de finiert sind. In Formel I ist P der Rest eines hier beschrie benen Erythropoietinglycoproteins (d. h. ohne die Aminogruppe oder Aminogruppen, die eine Amidbindung mit der in Formel I gezeigten Carbonylgruppe bilden) mit der biologischen in vi vo-Aktivität, die Knochenmarkzellen zur gesteigerten Erzeu gung von Reticulozyten und roten Blutzellen veranlaßt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist R Methyl. Vorzugsweise ist m etwa 650 bis etwa 750 und n ist vorzugsweise 1.

In der besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Aus führungsform ist R Methyl, m ist etwa 650 bis etwa 750 und n ist 1, d. h. das wie vorstehend definierte Konjugat hat die Formel

[CH₃O(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂CH₂CO-NH]_n-P

worin m 650 bis 750 ist, n 1 ist und P wie vorstehend defi niert ist. Vorzugsweise weist n im Durchschnitt etwa 680 auf.

Vorzugsweise ist das Glycoprotein der vorstehend de finierten Konjugate Humanerythropoietin. Humanerythropoietin und wie vorstehend definierte analoge Proteine können durch endogene Genaktivierung exprimiert werden. Bevorzugte Human erythropoietinglycoproteine sind jene von SEQ ID NR.: 1 und SEQ ID NR.: 2, besonders bevorzugt jene von SEQ ID NR.: 1.

Außerdem kann P aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Resten von Humanerythropoietin und Analogen davon mit 1 bis 6 zusätzlichen Glycosylierungsstellen besteht. Wie nach stehend genauer ausgeführt, sind die Zubereitung und Reini gung von EPO auf dem Fachgebiet bekannt. EPO bedeutet das na türliche oder rekombinante Protein, vorzugsweise humanen Ur sprungs, wie es von einer üblichen Herkunft wie Gewebe, Pro teinsynthese, Zellkulturen mit natürlichen oder rekombinanten Zellen erhalten wird. Ein beliebiges Protein mit der Aktivi tät von EPO, wie Muteine oder anderweitig modifizierte Pro teine, sind mit umfaßt. Rekombinantes EPO kann über Expressi on in CHO-, BHK- oder HeLa-Zellinien durch rekombinante DNA- Technologie oder durch endogene Genaktivierung erzeugt wer den. Expression von Proteinen, einschließlich EPO, durch en dogene Genaktivierung ist auf dem Fachgebiet bekannt und wird beispielsweise in den US-Patenten 5 733 761, 5 641 670 und 5 733 746 und in den internationalen Patentveröffentlichungen WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 und WO 91/09955 offenbart, deren Inhalt jeweils durch diesen Hinweis in die vorliegende Beschreibung aufge nommen wird. Die bevorzugten EPO-Arten zur Zubereitung von Erythropoietinglycoprotein-Produkten sind Human-EPO-Arten. Besonders bevorzugt ist die EPO-Spezies des Human-EPO mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 oder SEQ ID NR.: 2 ausgeführt ist, vorzugsweise der Aminosäuresequenz SEQ ID NR.: 1.

In einer Ausführungsform kann P der Rest eines Glyco proteinanalogen mit 1 bis 6 zusätzlichen Glycosylierungsstel len sein. Die Glycosylierung eines Proteins mit ein oder meh reren Oligosaccharidgruppen findet an speziellen Orten längs des Polypeptidgerüstes statt und beeinflußt in starkem Maße die physikalischen Eigenschaften des Proteins, wie Protein stabilität, Sekretion, subzelluläre Lokalisierung und biolo gische Aktivität. Die Glycosylierung erfolgt gewöhnlich in zwei Arten. O-gebundene Oligosaccharide werden an Serin- oder Threoninreste gebunden und N-gebundene Oligosaccharide werden an Asparaginresten gebunden. Eine Art Oligosaccharid, die man sowohl an N-gebundenen als auch an O-gebundenen Oligosaccha riden findet, ist N-Acetylneuraminsäure (Sialinsäure), näm lich eine Familie von Aminozuckern mit 9 oder mehr Kohlen stoffatomen. Sialinsäure ist gewöhnlich der endständige Rest sowohl an N-gebundenen als auch an O-gebundenen Oligosaccha riden und, da sie eine negative Ladung trägt, überträgt sie auf das Glycoprotein saure Eigenschaften. Humanerythropoietin mit 165 Aminosäuren enthält 3 N-gebundene und eine O- gebundene Oligosaccharidkette, umfassend etwa 40% des gesam ten Molekulargewichts des Glycoproteins. N-gebundene Glycosy lierung findet an Asparaginresten, angeordnet an Positionen 24, 38 und 83, statt, und O-gebundene Glycosylierung findet an einem Serinrest, angeordnet in Position 126, statt. Die Oligosaccharidketten sind mit endständigen Sialinsäureresten modifiziert. Die enzymatische Entfernung aller Sialinsäurere ste aus dem glycosylierten Erythropoietin führt zu einem Ver lust an in vivo-Aktivität, jedoch nicht an in vitro- Aktivität, da Sialylierung von Erythropoietin dessen Bin dungsvermögen und folglich Clearance durch hepatisches Bin dungsprotein verhindert.

Die erfindungsgemäßen Glycoproteine schließen Analoge von Humanerythropoietin mit ein oder mehreren Änderungen in der Aminosäuresequenz von Humanerythropoietin, was zu einer Steigerung in der Zahl der Sialinsäurebindungsstellen führt, ein. Diese Glycoproteinanaloge können durch ortsgerichtete Mutagenese mit Additionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäureresten, die die zur Glycosylierung verfügbaren Stellen steigern oder ändern, erzeugt werden. Glycoprotein analoge mit einem hohen Anteil an Sialinsäure, der größer ist als jener, den man bei Humanerythropoietin findet, werden durch Addition von Glycosylierungsstellen, die die zur biolo gischen Aktivität erforderliche sekundäre oder tertiäre Kon formation nicht stören, erzeugt. Die erfindungsgemäßen Glyco proteine schließen auch Analoge mit erhöhten Anteilen an Koh lenhydratbindung an einer Glycosylierungsstellen ein, welche gewöhnlich die Substitution von ein oder mehreren Aminosäuren in unmittelbarer Nähe zu einer N-gebundenen oder O-gebundenen Stelle einbeziehen. Die erfindungsgemäßen Glycoproteine schließen auch Analoge mit ein oder mehreren Aminosäuren, die sich vom Carboxyende des Erythropoietins erstrecken und min destens eine zusätzliche Kohlenhydratstelle bereitstellen, ein. Die erfindungsgemäßen Glycoproteine schließen auch Ana loge mit einer Aminosäuresequenz ein, die eine Umlagerung mindestens einer Stelle für die Glycosylierung einschließt. Eine solche Umlagerung der Glycosylierungsstelle bezieht die Deletion von einer oder mehreren Glycosylierungsstellen in Humanerythropoietin und die Addition von einer oder mehreren nicht natürlich vorkommenden Glycosylierungsstellen ein. Die Erhöhung der Zahl der Kohlenhydratketten am Erythropoietin und daher der Zahl an Sialinsäuren pro Erythropoietin-Mole kül kann vorteilhafte Eigenschaften, wie erhöhte Löslichkeit, größere Beständigkeit gegen Proteolyse, verminderte Immunoge nizität, erhöhte Serumhalbwertszeit und erhöhte biologische Aktivität übertragen. Erythropoietinanaloge mit zusätzlichen Glycosylierungsstellen sind genauer in EP-A-640 619, Elliot, veröffentlicht am 1. März 1995, offenbart.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die er findungsgemäßen Glycoproteine eine Aminosäuresequenz, die mindestens eine zusätzliche Stelle für die Glycosylierung einschließt, wie Erythropoietine, umfassend die Sequenz von Humanerythropoietin, modifiziert durch eine Modifizierung, ausgewählt aus den nachstehenden:

Asn³⁰Thr³²;
Asn⁵¹Thr⁵³;
Asn⁵⁷Thr⁵⁹;
Asn⁶⁹;
Asn⁶⁹Thr⁷¹;
Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹;
Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰;
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²;
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²;
Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;
Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;
Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹;
Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹;
Asn¹³⁶Thr¹³⁸;
Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰;
Thr¹²⁵; und
Pro¹²⁴Thr¹²⁵

sind jedoch nicht darauf beschränkt.

Die hierin zur Modifizierung von Aminosäuresequenzen verwendete Bezeichnungsweise bedeutet, daß die Stellung(en) des entsprechenden nicht modifizierten Proteins (d. h. hEPO von SEQ ID NR.: 1 oder SEQ ID NR.: 2), angeführt durch die hochgestellte(n) Zahl(en) zu den entsprechenden Aminosäure(n) geändert wird, die unmittelbar der entsprechenden jeweiligen Zahl(en) vorangeht/vorangehen.

Das Glycoprotein kann auch ein Analoges sein mit min destens einer zusätzlichen Aminosäure am terminalen Carboxy ende des Glycoproteins, wobei die zusätzliche Aminosäure min destens eine Glycosylierungsstelle einschließt, d. h. das wie vorstehend definierte Konjugat betrifft auch eine Verbindung, worin das Glycoprotein eine Sequenz, umfassend die Sequenz von Humanerythropoietin und eine zweite Sequenz an dem Carb oxyende der Humanerythropoietin-Sequenz, aufweist, wobei die zweite Sequenz mindestens eine Glycosylierungsstelle enthält. Die zusätzliche Aminosäure kann ein Peptidfragment umfassen, abgeleitet von dem Carboxy-terminalen Ende von Humanchorion- Gonadotropin. Vorzugsweise ist das Glycoprotein ein Analoges, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (a) Humanerythro poietin mit der Aminosäuresequenz Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln (SEQ ID NR.: 3), die sich von dem Carboxyterminus erstreckt, (b) dem Analogen in (a), außerdem umfassend Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO; und (c) dem Analogen in (a), au ßerdem umfassend Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO.

Das Glycoprotein kann auch ein Analoges mit einer Aminosäuresequenz, die eine Umlagerung von mindestens einer Glycosylierungsstelle einschließt, sein. Die Umlagerung kann eine Deletion von einer beliebigen N-gebundenen Kohlenhy dratstelle in Humanerythropoietin und eine Addition einer N- gebundenen Kohlenhydratstelle an Position 88 der Aminosäure sequenz von Humanerythropoietin sein. Vorzugsweise ist das Glycoprotein ein Analoges, ausgewählt aus der Gruppe, beste hend aus Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO; Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO; und Gln⁸³Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO.

Der hier verwendete Begriff "Niederalkyl" bedeutet eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit ein bis sechs Kohlenstoffatomen. Beispiele für Niederalkylgruppen schließen Methyl, Ethyl und Isopropyl ein. Erfindungsgemäß ist R eine Niederalkylgruppe. Konjugate, worin R Methyl ist, sind bevor zugt.

Das Symbol "m" bedeutet eine Zahl von Ethylenoxidre sten (OCH₂CH₂) in der Poly(ethylenoxid)gruppe. Eine einzige PEG-Untereinheit von Ethylenoxid weist, ein Molekulargewicht von etwa 44 Dalton auf. Somit hängt das Molekulargewicht des Konjugats (ausgenommen das Molekulargewicht des EPO) von der Zahl "m" ab. In den Konjugaten dieser Erfindung ist "m" von etwa 450 bis etwa 900 (entsprechend einem Molekulargewicht von etwa 20 kDa bis etwa 40 kDa), vorzugsweise von etwa 650 bis etwa 750 (entsprechend einem Molekulargewicht von etwa 30 kDa). Die Zahl m wird so ausgewählt, daß das erhaltene Konju gat der Erfindung eine physiologische Aktivität aufweist, die mit nicht modifiziertem EPO vergleichbar ist, wobei die Akti vität dieselbe, größer oder einen Bruchteil der entsprechen den Aktivität von nicht modifiziertem EPO darstellen kann. Ein Molekulargewicht von "etwa" einer bestimmten Zahl bedeu tet, daß es in einem angemessenen Bereich dieser Zahl liegt, was durch übliche analytische Techniken bestimmt wird. Die Zahl "m" wird so ausgewählt, daß das Molekulargewicht jeder Poly(ethylenglycol)-gruppe, die kovalent an dem Erythropoie tinglycoprotein gebunden ist, etwa 20 kDa bis etwa 40 kDa und vorzugsweise etwa 30 kDa beträgt.

In den erfindungsgemäßen Konjugaten ist die Zahl "n" die Zahl von Polyethylenglycolgruppen, die kovalent an freie Aminogruppen (einschließlich ε-Aminogruppen einer Lysinami nosäure und/oder der Amino-endständigen Aminogruppe) eines Erythropoietinproteins über Amidbindung(en) gebunden sind. Ein erfindungsgemäßes Konjugat kann ein, zwei oder drei PEG- Gruppen pro EPO-Molekül enthalten. "n" ist eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 3, vorzugsweise ist "n" 1 oder 2 und bevor zugter ist "n" 1.

Die Verbindung der Formel I kann aus dem bekannten polymeren Material hergestellt werden:

worin R und m wie vorstehend beschrieben sind, durch Konden sation der Verbindung der Formel II mit dem Erythropoi etinglycoprotein. Verbindungen der Formel II, worin x 3 be deutet, sind Alphaniederalkoxy-Buttersäuresuccinimidylester von Poly(ethylenglycol) (Niederalkoxy-PEG-SBA). Verbindungen der Formel II, worin x 2 ist, sind Alphaniederalkoxy- Propionsäuresuccinimidylester von Poly(ethylenglycol) (Nie deralkoxy-PEG-SPA). Ein beliebiges übliches Verfahren zur Um setzung eines aktivierten Esters mit einem Amin zur Bildung eines Amids kann verwendet werden. In der vorstehend be schriebenen Reaktion ist der beispielhaft angeführte Succini midylester eine Abgangsgruppe, die eine Amidbildung hervor ruft. Die Verwendung von Succinimidylester wie die Verbindun gen der Formel II zur Erzeugung von Konjugaten mit Proteinen wird in US-A-5 672 662, herausgegeben am 30. September 1997 (Harris et al.), offenbart.

Human-EPO enthält neun freie Aminogruppen, die Amino endständige Aminogruppe plus ε-Aminogruppen von 8 Lysinre sten. Wenn das Pegylierungsreagenz mit einer SBA-Verbindung der Formel II kombiniert wurde, wurde gefunden, daß bei pH 7,5, einem Verhältnis von Protein : PEG von 1 : 3 und einer Reak tionstemperatur von 20-25°C ein Gemisch von mono-, di- und Restmengen von tripegylierten Spezies erzeugt wurde. Wenn das Pegylierungsreagenz eine SPA-Verbindung der Formel II bei ähnlichen Bedingungen war, ausgenommen, daß das Verhältnis von Protein : PEG 1 : 2 war, werden vorwiegend monopegylierte Ar ten erzeugt. Das pegylierte EPO kann als Gemisch oder, wenn durch Kationenaustauschchromatographie getrennt, als unter schiedliche pegylierte Arten verabreicht werden. Durch Mani pulierung der Reaktionsbedingungen (beispielsweise Verhältnis von Reagenzien, pH-Wert, Temperatur, Proteinkonzentration, Reaktionszeit usw.) können die relativen Mengen der unter schiedlichen pegylierten Spezies variiert werden.

Humanerythropoietin (EPO) ist ein Humanglycoprotein, das die Bildung von Erythrozyten stimuliert. Seine Herstel lung und seine therapeutische Anwendung werden genauer in den US-Patenten 5 547 933 und 5 621 080, EP-B-0 148 605, Huang, S. L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712, EP-B-0 205 564, EP-B-0 209 539 und EP-B-0 411 678 sowie Lai, P. H. et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121, und Sasaki, H. et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076 beschrieben. Erythropoietin für therapeutische Verwendungen kann durch re kombinante Maßnahmen erzeugt werden (EP-B-0 148 605, EP-B-0 209 539 und Egrie, J. C., Strickland, T. W., Lane, J. et al. (1986) Immunobiol. 72: 213-224).

Verfahren zur Expression und Zubereitung von Erythro poietin in serumfreiem Medium werden beispielsweise in WO 96/35718, Burg, veröffentlicht am 14. November 1996, und in der EP-A-513 738, Koch, veröffentlicht am 12. Juni 1992, be schrieben. Zusätzlich zu den vorstehend genannten Veröffent lichungen ist bekannt, daß eine serumfreie Fermentation von rekombinanten CHO-Zellen, die ein EPO-Gen enthalten, ausge führt werden kann. Solche Verfahren sind beispielsweise in EP-A-0 513 738, EP-A-0 267 678 und in allgemeiner Form von Kawamoto, T. et al., Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453, EP-A-0 248 656, Kowar, J. und Franek, F., Methods in Enzymo logy 421 (1986) 277-292, Bavister, B. Expcology 271 (1981) 45-51, EP-A-0 481 791, EP-A-0 307 247, EP-A-0 343 635, WO 88/00967 beschrieben worden.

In EP-A-0 267 678 werden eine Ionenaustauschchromato graphie an S-Sepharose, eine präparative Umkehrphasen-HPLC an einer C₈-Säule und eine Gelfiltrationschromatographie zur Reinigung von EPO, erzeugt in einer serumfreien Kultur, nach einer Dialyse, beschrieben. In diesem Zusammenhang kann der Gelfiltrationschromatographieschritt durch Fast-Flow-Ionen austauschchromatographie an S-Sepharose ersetzt werden. Es wird auch vorgeschlagen, daß eine Farbstoffchromatographie an einer Blue Trisacryl-Säule vor der Ionenaustauschchromatogra phie ausgeführt werden kann.

Ein Verfahren zur Reinigung von rekombinantem EPO wird von Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107 (1990) 352-359, beschrieben. Bei diesem Verfahren wird EPO allerdings mit ei ner Lösung von Tween® 20, Phenylmethylsulfonylfluorid, Ethyl maleimid, Pepstatin A, Kupfersulfat und Oxaminsäure vor den Reinigungsschritten behandelt. Veröffentlichungen, ein schließlich WO 96/35718, Burg, veröffentlicht am 14. November 1996, offenbaren ein Verfahren zur Herstellung von Erythro poietin in einem serumfreien Fermentationsverfahren (EPOsf).

Die spezifische Aktivität von EPO oder EPO-Konjugaten gemäß der Erfindung kann durch verschiedene bekannte Assays ermittelt werden. Die biologische Aktivität von gereinigten EPO-Proteinen dieser Erfindung ist dergestalt, daß die Verab reichung von EPO-Protein durch Injektion an Patienten (Mensch) in Knochenmarkzellen, verglichen mit Kontrollgruppen oder Personen, die nicht injiziert wurden, zu einer erhöhten Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutzellen führt. Die biologische Aktivität von EPO-Proteinen oder Fragmenten da von, erhalten und gereinigt gemäß dieser Erfindung, kann durch Verfahren gemäß Annable, et al., Bull. Wld. Hlth. Org. (1972) 47: 99-112 und Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoi etin BRP Bio 1997 (2), geprüft werden. Ein weiteres biologi sches Assay zur Bestimmung der Aktivität von EPO-Protein, das normozythämische Mausassay, ist in Beispiel 4 beschrieben.

Die Erfindung liefert eine wie vorstehend beschriebe ne Konjugate umfassende Zusammensetzung. Eine mindestens neunzig Prozent Mono-PEG-Konjugate enthaltende Zusammenset zung, d. h. worin n 1 ist, kann wie in Beispiel 5 gezeigt zu bereitet werden. Gewöhnlich sind Mono-PEG-Konjugate von Erythropoietinglycoproteinen erwünscht, da sie in der Regel eine höhere Aktivität als Di-PEG-Konjugate aufweisen. Der Prozentsatz von Mono-PEG-Konjugaten sowie das Verhältnis von Mono- und Di-PEG-Arten kann durch Zusammenfügen breiterer Fraktionen um den Elutionspeak zur Senkung des Prozentsatzes von Mono-PEG oder engerer Fraktionen zur Erhöhung des Pro zentsatzes von Mono-PEG in der Zusammensetzung gesteuert wer den. Etwa neunzig Prozent Mono-PEG-Konjugate sind ein guter Ausgleich von Ausbeute und Aktivität. Manchmal können Zusam mensetzungen, in denen beispielsweise mindestens zweiundneun zig Prozent oder mindestens sechsundneunzig Prozent der Kon jugate Mono-PEG-Arten (n gleich 1) sind, erwünscht sein. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Prozentsatz an Konjugaten, worin n 1 ist, von neunzig Prozent bis sechs undneunzig Prozent.

Die Erfindung betrifft auch die entsprechenden phar mazeutischen Zusammensetzungen, die ein Konjugat oder eine Zusammensetzung wie vorstehend beschrieben und einen pharma zeutisch verträglichen Exzipienten umfassen.

Die Konjugate und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind besonders zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten, die mit Anämie bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF) ein hergehen, AIDS und zur Behandlung von Krebspatienten, die mit einer Chemotherapie behandelt werden, geeignet.

Eine zusätzliche Ausführungsform der vorliegenden Er findung betrifft ein Verfahren zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Erkrankungen, die Anämie bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF) einbezie hen, AIDS und Krebspatienten, die mit einer Chemotherapie be handelt werden, umfassend den Schritt der Verabreichung einer vorstehend beschriebenen Zusammensetzung an einen Patienten.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von vorstehend beschriebenen Verbindungen, wobei das Verfahren die Kondensation der Verbindung der Formel II

mit einem Erythropoietinglycoprotein umfaßt und worin R, m und x wie vorstehend definiert sind.

Die Erfindung betrifft auch wie vorstehend definierte Verbindungen zur Behandlung von Krankheiten, die mit Anämie einhergehen, bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF), AIDS und Krebspatienten, die mit einer Chemotherapie behandelt werden.

Die Erfindung wird durch Hinweis auf die nachstehen den Beispiele besser verständlich, die die hierin beschriebe ne Erfindung erläutern, aber nicht begrenzen.

BEISPIELE BEISPIEL 1 Fermentation und Reinigung von Human-EPO a) Inoculumzubereitung und Fermentation

Ein Fläschchen von Working Cell Bank, Ursprung einer EPO-erzeugenden CHO-Zellinie (ATCC CRL8695, veröffentlicht in EP 411 678 (Genetics Institute) kann verwendet werden) wird aus der Gasphase des Lagertanks mit flüssigem Stickstoff ge nommen. Die Zellen werden in Glasgefäße (glass spinner flask) überführt und in einem Hydrogencarbonat-gepufferten Medium in einem feuchtgehaltenen CO₂-Inkubator gezüchtet. Typische serumfreie Medien, die für die Inoculumzubereitung und die Fermentation verwendet werden, sind in EP-A-513 738, Koch, veröffentlicht am 12. Juni 1992, oder WO 96/35718, Burg, ver öffentlicht am 14. November 1996, offenbart und enthalten beispielsweise als Medium DMEM/F12 (z. B. JRH Biosciences/ Hazleton Biologics, Denver, US, Order Nr. 57-736) und zusätz lich Natriumhydrogencarbonat, L+Glutamin, D+Glucose, rekombi nantes Insulin, Natriumselenit, Diaminobutan, Hydrocortison, Eisen(II)sulfat, Asparagin, Asparaginsäure, Serin und einen Stabilisator für Säugerzellen, wie Polyvinylalkohol, Methyl cellulose, Polydextran, Polyethylenglycol, Pluronic F68, Plasmaexpander, Polygelin (HEMACCEL®) oder Polyvinylpyrroli don (WO 96/35718).

Die Kulturen werden mikroskopisch hinsichtlich Abwe senheit von kontaminierenden Mikroorganismen geprüft und die Zelldichten werden bestimmt. Diese Tests werden bei jedem Splittingschritt ausgeführt.

Nach einem anfänglichen Wachstumszeitraum wird die Zellkultur mit frischem Medium zu der Ausgangszelldichte ver dünnt und unterliegt einem weiteren Wachstumszyklus. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis ein Kulturvolumen etwa 2 l pro Glasgefäß erhalten wurde. Nach etwa 12 Duplizierungen sind 1 bis 5 Liter dieser Kultur verfügbar, die dann als Inoculum für den 10 l-Inoculumfermenter verwendet wird.

Nach 3-5 Tagen kann die Kultur in dem 10 l-Fermenter als Inoculum für den 100 l-Fermenter verwendet werden.

Nach zusätzlichen 3-5 Tagen Züchtung kann die Kultur in dem 100 l-Fermenter als Inoculum für den 1000 l-Produkti onsfermenter verwendet werden.

b) Ernten und Zelltrennung

Ein Batch-Refeed-Verfahren wird verwendet, d. h., wenn die gewünschte Zelldichte erreicht ist, werden etwa 80% der Kultur geerntet. Die zurückbleibende Kultur wird mit frischem Kulturmedium aufgefüllt und bis zur nächsten Ernte gezüchtet. Ein Produktionslauf besteht aus maximal 10 aufeinanderfolgen den Ernten: 9 Teilernten und 1 Gesamternte am Ende der Fer mentation. Das Ernten findet alle 3-4 Tage statt.

Das bestimmte Erntevolumen wird in ein gefülltes Ge fäß überführt. Die Zellen werden durch Zentrifugation oder Filtration entfernt und verworfen. Der EPO enthaltende Über stand aus dem Zentrifugationsschritt wird in-line filtriert und in einem zweiten gekühlten Gefäß gesammelt. Jede Ernte wird während der Reinigung getrennt verarbeitet.

Ein typisches Verfahren zur Reinigung von EPO-Protein ist in WO 96/35718, Burg, veröffentlicht am 14. November 1996, offenbart. Der Reinigungsschritt wird nachstehend er läutert.

a) Blue Sepharose-Chromatographie

Blue Sepharose (Pharmacia) besteht aus Sepharosekü gelchen, an deren Oberfläche Cibacron Blau-Farbstoff kovalent gebunden ist. Da EPO stärker an Blue Sepharose bindet als die meisten nicht proteinischen Verunreinigungen, können einige proteinische Verunreinigungen und PVA entfernt werden und EPO kann in diesem Schritt angereichert werden. Die Elution von der Blue Sepharose-Säule erfolgt durch Erhöhen der Salzkon zentration sowie des pH-Werts.

Die Säule wird mit 80-100 l Blue Sepharose gefüllt, mit NaOH regeneriert und mit Konditionierungspuffer ins Gleichgewicht gebracht (Natrium/Calciumchlorid und Natrium acetat). Der angesäuerte und filtrierte Fermenterüberstand wird aufgetragen. Nach Abschluß des Auftragens wird die Säule zuerst mit einem Puffer ähnlich dem Konditionierungspuffer, der allerdings eine höhere Natriumchloridkonzentration ent hält, und anschließend mit einem Tris-Base-Puffer gewaschen. Das Produkt wird mit Tris-Base-Puffer eluiert und in einer einzigen Fraktion gemäß dem Masterelutionsprofil gesammelt.

b) Butyl Toyopearl-Chromatographie

Butyl Toyopearl 650 C (Toso Haas) ist eine Matrix auf Polystyrolbasis, an die aliphatische Butylreste kovalent ge kuppelt sind. Da EPO stärker an diesem Gel bindet als die meisten Verunreinigungen und PVA, muß es mit einem Isopropa nol enthaltenden Puffer eluiert werden.

Die Säule wird mit 30-40 l Butyl Toyopearl 650 C ge füllt, mit NaOH regeneriert, mit Tris-Basepuffer gewaschen und mit einem Isopropanol enthaltenden Tris-Basepuffer ins Gleichgewicht gebracht.

Das Blue Sepharose-Eluat wird auf die Konzentration an Isopropanol in dem Säulenkonditionierungspuffer einge stellt und auf die Säule gegeben. Dann wird die Säule mit Konditionierungspuffer mit steigender Isopropanolkonzentrati on gewaschen. Das Produkt wird mit Elutionspuffer (Tris- Basepuffer mit hohem Isopropanolgehalt) eluiert und in einer einzigen Fraktion gemäß dem Masterelutionsprofil gesammelt.

c) Hydroxyapatit Ultrogel-Chromatographie

Das Hydroxyapatit Ultrogel (Biosepra) besteht aus Hy droxyapatit, das in eine Agarosematrix eingearbeitet ist, um die mechanischen Eigenschaften zu verbessern. EPO weist eine geringe Affinität für Hydroxyapatit auf und kann daher bei geringeren Phosphatkonzentrationen eluiert werden als Pro teinverunreinigungen.

Die Säule wird mit 30-40 l Hydroxyapatit Ultrogel ge füllt und mit Kaliumphosphat/Calciumchlorid-Puffer und NaOH, gefolgt von Tris-Basepuffer, regeneriert. Dann wird mit Tris- Basepuffer, der eine geringe Menge Isopropanol und Natrium chlorid enthält, ins Gleichgewicht gebracht.

Das EPO enthaltende Eluat aus der Butyl Toyopearl- Chromatographie wird auf die Säule aufgetragen. Anschließend wird die Säule mit Konditionierungspuffer und einem Tris- Basepuffer ohne Isopropanol und Natriumchlorid gewaschen. Das Produkt wird dann mit einem Tris-Basepuffer, der eine geringe Konzentration an Kaliumphosphat enthält, eluiert und in einer einzigen Fraktion gemäß dem Masterelutionsprofil gesammelt.

d) Umkehrphasen-HPLC an Vydac C4

Das RP-HPLC-Material Vydac C4 (Vydac) besteht aus Kieselgelteilchen, deren Oberfläche C4-Alkylketten tragen. Die Abtrennung von EPO von den proteinischen Verunreinigungen basiert auf dem Unterschied in der Stärke der hydrophoben Wechselwirkungen. Die Elution wird mit einem Acetonitrilgra dienten in verdünnter Trifluoressigsäure ausgeführt.

Präparative HPLC wird unter Verwendung einer Edel stahlsäule (gefüllt mit 2,8 bis 3,2 Liter Vydac C4 Kieselgel) ausgeführt. Das Hydroxyapatit Ultrogel-Eluat wird durch Zuga be von Trifluoressigsäure angesäuert und auf die Vydac C4- Säule aufgegeben. Zum Waschen und zur Elution wird ein Aceto nitrilgradient in verdünnter Trifluoressigsäure verwendet. Die Fraktionen werden gesammelt und sofort mit Phosphatpuffer neutralisiert. Die EPO-Fraktionen, die innerhalb der IPC- Grenzen liegen, werden zusammengeführt.

e) DEAE Sepharose Chromatographie

Das DEAE-Sepharosematerial (Pharmacia) besteht aus Diethylaminoethyl (DEAE)-Gruppen, die kovalent an der Ober fläche der Sepharosekügelchen gebunden sind. Die Bindung von EPO an DEAE-Gruppen wird durch ionische Wechselwirkungen ver mittelt. Acetonitril und Trifluoressigsäure gelangen durch die Säule, ohne daß sie zurückgehalten werden. Nachdem diese Stoffe fortgewaschen wurden, werden Spurenverunreinigungen durch Waschen der Säule mit Acetatpuffer bei einem geringen pH-Wert entfernt. Die Säule wird dann mit neutralem Phosphat puffer gewaschen und EPO wird mit einem Puffer bei steigender Ionenstärke eluiert.

Die Säule wird mit Fast-Flow-DEAE-Sepharose gefüllt. Das Säulenvolumen wird eingestellt, um zu gewährleisten, daß eine EPO-Beladung im Bereich von 3-10 mg EPO/ml Gel vor liegt. Die Säule wird mit Wasser und mit Konditionierungspuf fer (Äquilibrierungspuffer) (Natrium/Kaliumphosphat) gewa schen. Die gesammelten Fraktionen des HPLC-Eluats werden auf getragen und die Säule wird mit Konditionierungspuffer gewa schen. Dann wird die Säule mit Waschpuffer gewaschen (Natri umacetatpuffer), gefolgt von Waschen mit Konditionierungspuf fer. Anschließend wird EPO von der Säule mit Elutionspuffer (Natriumchlorid, Natrium/Kaliumphosphat) gewaschen und in ei ner einzigen Fraktion gemäß dem Masterelutionsprofil gesam melt.

Das Eluat der DEAE Sepharose-Säule wird auf eine spe zifische Leitfähigkeit eingestellt. Der erhaltene Arzneistoff wird in Teflonflaschen steril filtriert und bei -70°C gela gert.

BEISPIEL 2 Pegylierung von EPO mit mPEG-SBA

EPO, gereinigt gemäß dem serumfreien Verfahren von Beispiel 1 (EPOsf), war homogen, bestimmt durch analytische Verfahren, und zeigte das typische Isoformmuster, das aus 8 Isoformen bestand. Es hatte eine spezifische biologische Ak tivität von 190000 IU/mg, ermittelt durch das normozythämi sche Mausassay. Das verwendete Pegylierungsreagenz war ein Methoxy-PEG-SBA, nämlich eine Verbindung der Formel II, worin R Methyl ist, x 3 ist und m von 650 bis 750 beträgt (im Durchschnitt etwa 680 entsprechend einem mittleren Molekular gewicht von etwa 30 kDa).

Pegylierungsumsetzung

Zu einhundert Milligramm EPOsf (9,71 ml einer 10,3 mg/ml EPOsf-Stammlösung, 5,48 µmol) wurden 10 ml 0,1 M Ka liumphosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 506 mg eines 30 kDa Methoxy-PEG-SBA (16,5 µmol) (erhalten von Shearwater Poly mers, Inc., Huntsville, Alabama) gegeben und 2 h bei Raumtem peratur (20-23°C) vermischt. Die Proteinendkonzentration be trug 5 mg/ml und das Verhältnis von Protein : PEG-Reagenz be trug 1 : 3. Nach zwei Stunden wurde die Reaktion durch Einstel len des pH auf 4,5 mit Eisessig gestoppt und bei -20°C bis zur Reinigung gelagert.

Reinigung

1. Konjugatgemisch: etwa 28 ml von SP-SEPHAROSE FF (Sulfopro pyl-Kationenaustauschharz) wurden auf eine AMICON-Glassäule (2,2 × 7,5 cm) gefüllt und mit 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5, bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 50 ml/h ins Gleichge wicht gebracht. Sechs Milliliter des Reaktionsgemisches, ent haltend 30 mg Protein, wurden 5mal mit dem Konditionierungs puffer verdünnt und auf die Säule aufgetragen. Nicht adsor bierte Materialien wurden mit dem Puffer fortgewaschen und das adsorbierte PEG-Konjugat-Gemisch wurde von der Säule mit 0,175 M NaCl in dem Konditionierungspuffer eluiert. Nicht mo difiziertes EFOsf, das noch auf der Säule verblieb, wurde mit 750 mM NaCl eluiert. Die Säule wurde in dem Startpuffer re äquilibriert. Proben wurden durch SDS-PAGE analysiert und de ren Pegylierungsgrad wurde ermittelt. Es wurde gefunden, daß das 0,175 M NaCl-Eluat sowohl mono- als auch di- und Spuren mengen von tripegylierten Arten enthielt, wobei das 750 mM NaCl-Eluat nicht modifiziertes EPOsf enthielt.
2. Di-PEG und Mono-PEG-EPOsf: Das gereinigte Konjugatgemisch, das von der Säule im vorstehenden Schritt eluiert wurde, wur de 4fach mit dem Puffer verdünnt und wieder auf eine Säule aufgetragen und wie beschrieben gewaschen. Di-PEG-EPOsf und Mono-PEG-EPOsf wurden getrennt von der Säule mit 0,1 M NaCl bzw. 0,175 M NaCl eluiert. Die Elution wurde auch mit 750 mM NaCl ausgeführt, um verbliebenes nicht modifiziertes EPOsf zu eluieren.

Alternativ wurde das Reaktionsgemisch 5fach mit Ace tatpuffer verdünnt und auf eine SP-Sepharose-Säule (~0,5 mg Protein/ml Gel) aufgetragen. Die Säule wurde gewaschen und adsorbierte Mono-PEG-EPOsf, Di-PEG-EPOsf und nicht modifi ziertes EPOsf wurden wie im vorstehenden Abschnitt beschrie ben eluiert.

Ergebnisse

PEG-EPOsf wurde durch chemische Konjugation eines li nearen PEG-Moleküls mit einem zahlenmittleren Molekularge wicht von 30 kDa synthetisiert. PEG-EPOsf stammte aus der Um setzung zwischen primären Aminogruppen von EPOsf und dem Succinimidylesterderivat einer 30 kDa PEG-Buttersäure, was zu einer Amidbindung führt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Ge reinigtes Konjugatgemisch umfaßte Mono- und Di-PEG-EPOsf und war frei von nicht modifiziertem EPOsf, wie durch SDS-PAGE- Analyse ermittelt. Das konjugiertes Gemisch machte 23,4 mg oder 78% des Ausgangsmaterials aus. Trennung durch Kationen austauschchromatographie von Mono- und Di-PEG-EPOsf zeigte an, daß das Mono- zu Di-PEG-Verhältnis in dem Konjugatgemisch fast 1 : 1 war. Nach Ablauf der Reaktion war das Verhältnis der einzelnen Komponenten Mono : Di : nicht modifiziert 40 : 38 : 20 (%). Die Gesamtausbeute war fast quantitativ.

Tabelle 1

Zusammenfassung der Ergebnisse von EPOsf-Pegylierung

BEISPIEL 3 Pegylierung von EPO mit mPEG-SPA

Eine andere aliquote Menge von EPOsf, das in Beispiel 2 verwendet wurde, wurde mit 30 kDa Methoxy-PEG-SPA (Shearwa ter Polymers, Inc., Huntsville, Alabama) umgesetzt. Die Reak tion wurde bei einem Verhältnis von Protein : Reagenz von 1 : 2 ausgeführt und die Reinigungsvorgänge erfolgten gemäß Bei spiel 2. Vorwiegend wurden monopegylierte Arten erzeugt.

BEISPIEL 4 In vivo Aktivität von pegyliertem EPO, ermittelt durch das normozythämische Mausassay

Das normozythämische Mausbioassay ist auf dem Fachge biet bekannt (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)) und ein Verfahren in der Monographie von Erythropoietin von Ph. Eur. BRP. Die Proben wurden mit BSA- PBS verdünnt. Normale gesunde Mäuse, 7-15 Wochen alt, wurden s. c. mit 0,2 ml der EPO-Fraktion mit nicht pegyliertem EPO oder tri-, di- oder monopegyliertem EPO von Beispiel 2 oder 3 behandelt. Über einen Zeitraum von 6 Tagen wurde durch Punk tur der Schwanzvene Blut entnommen und so verdünnt, daß 1 µl Blut in 1 ml einer 0,15 µmol Acridinorange-Färbelösung vor lag. Die Färbezeit betrug 3 bis 10 Minuten. Die Reticulo zyten-Zählung wurde mikrofluorometrisch in einem Flowcytome ter durch Analyse des roten Fluoreszenzhistogramms ausge führt. Die Reticulozyten-Zählungen wurden in bezug auf abso lute Zahlen (pro 30000 analysierten Blutzellen) angegeben. Für die vorliegenden Daten bestand jede Gruppe aus 5 Mäusen pro Tag und den Mäusen wurde nur einmal Blut entnommen.

In getrennten Versuchen wurde eine einzige Dosis von nicht modifiziertem EPO (25 ng EPO), das PEG(SPA)-EPO-Gemisch von Beispiel 2 (10 ng Konjugat), mono- und dipegylierte EPO von Beispiel 2 (10 ng Konjugat), das PEG(SPA)-EPO von Bei spiel 3 (10 ng Konjugat) und Pufferlösung den Mäusen verab reicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Er gebnisse zeigen die ausgezeichnete Aktivität und die längere Halbwertszeit der pegylierten EPO-Spezies, angezeigt durch die wesentlich höhere Mengen an Reticulozyten und der Ver schiebung des Maximums der Reticulozyten-Zählung unter Ver wendung derselben Dosis pro Maus (10 ng), verglichen mit ei ner Dosis von 25 ng für nicht modifiziertes EPO.

Tabelle 2

BEISPIEL 5 Herstellung von hauptsächlich Mono-PEG-EPO Pegylierungsumsetzung

Ausgehend von 100 mg (5,48 µmol) EPOsf in 100 mM Ka liumphosphatpuffer, pH 7,5, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurden 329 mg (10,96 µmol) 30 kDa PEG-SBA-Reagenz, gelöst in 3 ml 1 mM HCl, zugegeben. Genügend 100 mM Kaliumphosphatpuf fer, pH 7,5, wurde zugegeben, um das Volumen des Reaktionsge misches auf 20 ml aufzufüllen. Die letztliche Proteinkonzen tration betrug 5 mg/ml und das Verhältnis von Protein : PEG- Reagenz betrug 1 : 2. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei Raum temperatur (20-22°C) gemischt. Nach 2 h wurde die Reaktion durch Einstellen des pH-Werts auf 4,5 mit Eisessig gestoppt und bis zur Reinigung bei -20°C gefroren gelagert.

Reinigung

Das Reaktionsgemisch aus dem vorangehenden Schritt wurde mit 10 mM Natriumacetat, pH 4,5, 1 : 5 verdünnt und auf 300 ml SP-Sepharose FF (Sulfopropyl-Kationenaustauschharz), gefüllt in eine 4,2 × 19 cm-Säule, aufgetragen. Die Säule wurde vorher mit demselben Puffer ins Gleichgewicht gebracht. Der Säulenabstrom wurde mit einem UV-Monitor von Gilson bei 280 nm verfolgt und mit einem Bandschreiber von Kipp und Zo nen aufgezeichnet. Die Säule wurde mit 300 ml oder 1 Bettvo lumen Konditionierungspuffer gewaschen, um überschüssige Rea genzien, Reaktionsnebenprodukte und oligomeres PEG-EPO zu entfernen. Dem folgte Waschen mit 2 Bettvolumen von 100 mM NaCl, um Di-PEG-EPO zu entfernen. Mono-PEG-EPO wurde dann mit 200 mM NaCl eluiert. Während der Elution des Mono-PEG-EPO wurden die ersten 50 ml des Proteinpeaks verworfen und das Mono-PEG-EPO wurde als 150 ml-Fraktion gesammelt. Nicht modi fiziertes EPOsf, das auf der Säule verblieb, wurde mit 750 mM NaCl eluiert. Alle Elutionspuffer wurden in dem Konditionie rungspuffer hergestellt. Alle eluierten Proben wurden durch SDS-PAGE und durch High Performance Size Exclusion Chromato graphie (SEC) analysiert. Der aus der 150 ml-Fraktion erhal tene Mono-PEG-EPO-Pool, bei dem kein nicht modifiziertes EPOsf nachgewiesen wurde, wurde dann auf ~4,5-7,5 mg/ml konzentriert und in den Vorratspuffer, 10 mM Kaliumphosphat, 100 mM NaCl, pH 7,5, diafiltriert. Konzentrierung/Diafil tration erfolgte mit einem Millipore Labscale^TM TFF-System, ausgestattet mit einer 50 kDa Cut Off Millipore Pellicon XL Biomax 50-Membran, bei Umgebungstemperatur. Konzentriertes Mono-PEG-EPO wurde steril filtriert und bei -20°C gefroren gelagert.

Etwa 75% des EPOsf waren pegyliert. Nach der Reini gung betrug die Gesamtausbeute ~30% Mono-PEG-EPO ohne nach weisbaren nicht modifiziertes EPOsf und etwa 25% Di-PEG-EPO. Oligomere und nicht pegyliertes EPOsf machte das übrige Pro tein aus. Der Mono-PEG-EPO-Pool, erhalten aus der 150 ml- Fraktian, enthielt etwa 90% Mono-PEG-EPO und etwa 10% Di-PEG- EPO.

SEQUENCE LISTING

Claims

1. Konjugat, wobei das Konjugat ein Erythropoietinglycopro tein mit mindestens einer freien Aminogruppe umfaßt und die biologische in vivo-Aktivität aufweist, um Knochen markzellen zur gesteigerten Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutzellen zu veranlassen, und ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Humanerythropoietin und Analo gen davon, die eine Sequenz von Humanerythropoietin, mo difiziert durch die Addition von 1 bis 6 Glycosylie rungsstellen oder eine Umlagerung mindestens einer Gly cosylierungsstelle, aufweisen, wobei das Glycoprotein kovalent an "n" Poly(ethylenglycol)gruppen der Formel
-CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR
gebunden ist, wobei die Gruppe -CO jeder Po ly(ethylenglycol)gruppe eine Amidbindung mit einer der Aminogruppen bildet; wobei
R Niederalkyl bedeutet;
x 2 oder 3 bedeutet;
m etwa 450 bis etwa 900 bedeutet;
n 1 bis 3 bedeutet; und
n und m so ausgewählt sind, daß das Molekulargewicht des Konjugats abzüglich des Erythropoietinglycopro teins 20 Kilodalton bis 100 Kilodalton beträgt.

2. Konjugat nach Anspruch 1 der Formel:
P-[NHCO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR]_n (I)
worin x, m, n und R wie in Anspruch 1 definiert sind und P der Rest des Glycoproteins ohne die n Aminogruppe(n), die Amidbindung(en) mit der/den Poly(ethylenglycol)grup pe(n) bildet/bilden, ist.

3. Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch, wobei R Me thyl ist.

4. Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch, wobei m etwa 650 bis etwa 750 ist.

5. Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch, wobei n 1 ist.

6. Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch, wobei R Me thyl ist; m etwa 650 bis etwa 750 ist und n 1 ist.

7. Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch der Formel
[CH₃O(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂CH₂CO-NH]_n-P
worin m 650 bis 750 ist, n 1 ist und P wie in Anspruch 1 definiert ist.

8. Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch, wobei das Glycoprotein Humanerythropoietin ist.

9. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Hu manerythropoietinglycoprotein durch endogene Genaktivie rung exprimiert wird.

10. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Glycoprotein die Sequenz SEQ ID NR.: 1 aufweist.

11. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Glycoprotein die Sequenz von Humanerythropoietin, modi fiziert durch die Addition von 1 bis 6 Glycosylierungs stellen, aufweist.

12. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Glycoprotein die Sequenz von Humanerythropoietin, modi fiziert durch eine Modifizierung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
Asn³⁰Thr³²;
Asn⁵¹Thr⁵³;
Asn⁵⁷Thr⁵⁹;
Asn⁶⁹;
Asn⁶⁹Thr⁷¹;
Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹;
Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰;
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²;
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²;
Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;
Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;
Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹;
Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹;
Asn¹³⁶Thr¹³⁸;
Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰;
Thr¹²⁵; und
Pro¹²⁴Thr¹²⁵
aufweist.

13. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Glycoprotein eine Sequenz aufweist, die die Sequenz von Humanerythropoietin und eine zweite Sequenz am Carb oxyterminus der Humanerythropoietin-Sequenz umfaßt, wo bei die zweite Sequenz mindestens eine Glycosylierungs stelle enthält.

14. Konjugat nach Anspruch 13, wobei die zweiten Sequenzen eine Sequenz, abgeleitet von der Carboxy-endständigen Sequenz von Humanchorion-Gonadotropin, umfaßt.

15. Konjugat nach Anspruch 13, wobei das Glycoprotein eine Sequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

a) der Sequenz von Humanerythropoietin und der Sequenz von SEQ ID NR.: 3 am Carboxyterminus der Humanery thropoietin-Sequenz;
b) der Sequenz in (a), modifiziert durch Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰; und
c) der Sequenz in (a), modifiziert durch Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰.

16. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Glycoprotein die Sequenz von Humanerythropoietin, modi fiziert durch eine Umlagerung mindestens einer Glycosy lierungsstelle, aufweist.

17. Konjugat nach Anspruch 16, wobei die Umlagerung die De letion von beliebigen der N-gebundenen Glycosylierungs stellen in Humanerythropoietin und Addition einer N- gebundenen Glycosylierungsstelle in Position 88 der Se quenz von Humanerythropoietin umfaßt.

18. Konjugat nach Anspruch 17, wobei das Glycoprotein die Sequenz von Humanerythropoietin, modifiziert durch eine Modifizierung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;
Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰; und
Gln⁸³Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰
aufweist.

19. Zusammensetzung, umfassend Konjugate, wobei jedes der Konjugate ein Erythropoietinglycoprotein mit mindestens einer freien Aminogruppe umfaßt und die biologische in vivo-Aktivität aufweist, um Knochenmarkzellen zur ge steigerten Erzeugung von Reticulozyten und roten Blut zellen zu veranlassen, und ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Humanerythropoietin und Analogen davon, die eine Sequenz von Humanerythropoietin, modifiziert durch die Addition von 1 bis 6 Glycosylierungsstellen oder eine Umlagerung mindestens einer Glycosylierungs stelle, aufweisen, wobei das Glycoprotein in jedem Kon jugat kovalent an "n" Poly(ethylenglycol)gruppen der Formel -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR gebunden ist, wobei die Gruppe -CO jeder Poly(ethylenglycol)gruppe eine Amidbin dung mit einer der Aminogruppen bildet; wobei in jedem der Konjugate R Niederalkyl bedeutet; x 2 oder 3 bedeu tet; m von etwa 450 bis etwa 900 bedeutet; n 1 bis 3 be deutet; und n und m so ausgewählt sind, daß das Moleku largewicht von jedem Konjugat abzüglich des Erythropoie tinglycoproteins 20 Kilodalton bis 100 Kilodalton be trägt, wobei der Prozentsatz der Konjugate, wenn n 1 ist, mindestens neunzig Prozent beträgt.

20. Zusammensetzung, umfassend Konjugate nach einem der An sprüche 1 bis 18, wobei der Prozentsatz der Konjugate, wenn n 1 ist, mindestens neunzig Prozent beträgt.

21. Zusammensetzung nach Ansprüchen 19 oder 20, wobei der Prozentsatz der Konjugate, wenn n 1 ist, mindestens zweiundneunzig Prozent beträgt.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei der Prozentsatz der Konjugate, wenn n 1 ist, mindestens sechsundneunzig Prozent beträgt.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 19 oder 20, wobei der Pro zentsatz der Konjugate, wenn n 1 ist, von neunzig Pro zent bis sechsundneunzig Prozent beträgt.

24. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Konjugat oder eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 23 und einen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten.

25. Verwendung eines Konjugats oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 23 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung oder Prophylaxe von Krank heiten, die mit Anämie bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF) in Beziehung stehen, AIDS oder zur Behandlung von Krebspatienten, die mit einer Chemo therapie behandelt werden.

26. Verfahren zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Erkrankungen, die Anämie bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF) einbeziehen, AIDS und Krebspatienten, die mit einer Chemotherapie be handelt werden, umfassend den Schritt der Verabreichung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 23 an einen Patienten.

27. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 23, umfassend die Kondensation der Verbindung der Formel II
mit einem Erythropoietinglycoprotein und worin R, m und x wie für einen der Ansprüche 1 bis 6 definiert sind.

28. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wenn im mer durch das Verfahren von Anspruch 27 hergestellt.

29. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 23 zur Be handlung von Krankheiten, die mit Anämie bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF) verbunden sind, AIDS und Krebspatienten, die mit einer Chemotherapie be handelt werden.

30. Neue Verbindungen, Verfahren und Vorgehensweisen sowie die Verwendung solcher Verbindungen im wesentlichen, wie vorstehend beschrieben.