CZ327297A3

CZ327297A3 - Kódové DNA pro aspartokinázu a způsob výroby L-aminokyseliny

Info

Publication number: CZ327297A3
Application number: CZ973272A
Authority: CZ
Inventors: Yoshimi Kikuchi; Kazuo Nakanishi; Hiroyuki Kojima
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 1996-10-15
Filing date: 1997-10-15
Publication date: 1998-06-17
Also published as: RU2204604C2; HUP9701652A3; SK139297A3; EP0837134A2; HU9701652D0; KR19980032831A; CN1110560C; BR9705038A; MX9707921A; ID18631A; PE44399A1; PL322611A1; HU225538B1; BR9705038B1; AU4096597A; AU725935B2; HUP9701652A2; JP4088982B2; PL192391B1; EP0837134A3

Description

Vynález se dotýká oblasti biotechnologické výroby. Přesněji vynález popisuje postup výroby L-aminokyseliny za použití fermentace, DNK a mikroorganizmu.

Dosavadní stav techniky

Při produkci L-lysinu pomocí fermentace se za účelem zvýšeni produktivity používají přirozené izoláty nebo jejich syntetické formy. Je znám velký počet syntetických mutant, které produkuji L-lysin. Řada z nich jsou mutanty rezistentní na aminoetylcystein (AEC) a patři k rodu Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus nebo Escherichia. Dále se používají transformanti získáni použitím rekombinantni DNK (U.S. patent č. 4,278,765). Popisuje se řada různých technologií vhodných ke zvýšení produktivity aminokyselin.

V publikacích v japonském Laid-Open (Kokai) č. 18,596/1981, v U.S. patentu č. 4,346,170 a v Applied Microbioiogy and Biotechnology 15, 227 (1982) se popisuje postup produkce L-lysinu zvýšením syntetázy dihydrodipicolinové kyseliny (zde se používá zkratka DDPS) za použití mikroorganizmů rodu Escherichia.

Syntetáza dihydrodipicolinové kyseliny (DDPS) je enzym, který katalyzuje dehydrokondenzaci aspartosemialdehydu a kyseliny pyrohroznové za vzniku kyseliny dihydrodipicolinové. Do této reakce vstupuje biosyntetický systém L-lysinu v podobě biosyntézy aminokyseliny typu aspartové kyseliny. O tomto enzymu se ví, že spolu se aspartokinázou slouží jako důležité regulační místo biosyntézy L-lysinu v bakteriích rodu Escherichia.

DDPS je v bakteriích Escherichia coli (E.coli) kódován genem, který se nazývá dapA. Tento gen dapA byl už klonován a • · stanovila se jeho základní sekvence (Richaud, F. et al., J.Bacteriol. 297 (1986).

Aspartokináza (AK) je enzym, který katalyzuje reakci, při které kyselina aspartová přechází na kyselinu βfosfoaspartovou a je hlavni regulační enzym systému biosyntézy aminokyseliny typu aspartové kyseliny. Aspartokináza (AK) bakterií E.coli zahrnuje tři typy (AKI, AKII, AKIII)*. Dva z nich jsou enzymy konjugované s homoserinovou dehydrogenázou (HD). Jeden z těchto konjugovaných enzymů je AKI-HDI a je kódován genem thrA. Další konjugovaný enzym je AKII-HDII a je kódován genem metLM. AKI se podrobuje současně probíhající supresi threoninem a izoleucinem a inhibici threoninem. AKII se podrobuje supresi methioninem.

AKIII je enzym, který má jedinou funkci a je produktem genu lysC. Je známo, že se podrobuje supresi a zpětnovazebně inhibici s L-lysinem. Poměr aktivit enzymů AKI:AKII:AKIII je v buňkách přibližně 5:1:4.

Gen lysC v bakteriích E.coli se už klonoval a určila se jeho základní sekvence (Cassan,M., Parsot,C., Cohen, G.N., a Patte, J.C., J.Biol.Chem. 261, 1052 (1986).

V publikaci International Laid-Open Pamphlet WO95/16042 se popisuje postup produkce L-lysinu za použití E.coli obsahující gen dapA, který má mutace, jež umožňují zpětnovazebnou inhibici lysinem a gen lysC, který má také mutace umožňující zpětnovazebnou inhibici lysinem.

V případě produkce L-threoninu fermentací se používají přirozené mikroorganizmy nebo jejich syntetické mutanty. Je známo velké množství syntetických mutant, které produkují Lthreonin. Řada z nich je rezistentních na a-amino-βhydroxyvalerovou kyselinu a patří k rodu Escherichia, Serratia, Brevibacterium nebo Corynebacterium. V publikacích v japonském Laid-Open (Kokai) č. 131,397/1980, 31,691/1984 a • 9

15,696/1981 a v japonském Patent Announcement č. 501,682/1991 se popisuje, s ohledem na rod Escherichia, postup produkce Lthreoninu za použití kmene transformovaného rekombinantním plazmidem, který obsahuje operon pro threoninjZ.

V publikaci International Laid-Open Pamphlet WO94/11517 se dokládá postup produkce L-threoninu za použití E.coli obsahující gen lysC, který má mutaci, jež umožňuje uvolnění zpětnovazebně' inhibice lysinem.

Podstata vynálezu

Cílem vynálezu je získat AKIII z bakterií rodu Escherichia, kde se dobře uvolňuje zpětnovazebně inhibice Llysinem, a poskytnout postup pro produkci L-aminokyseliny použitím zdokonalené fermentace.

Vynález vede k řešení dříve uvedených problémů. Podařilo se získat DNK kódující AKIU z bakterií rodu Escherichia, ve kterých se dobře uvolňuje zpětnovazebně inhibice L-lysinem. DNK kódující AKIII ziskaně z bakterií rodu Escherichia, ve kterých se dobře uvolňuje zpětnovazebně inhibice L-lysinem, se nazývě mutantní gen lysC nebo mutantní gen AKIII.

DNK kódující DDPS získaný z bakterii E.coli, ve kterých se dobře uvolňuje zpětnovazebně inhibice L-lysinem, se nazývě mutantní gen dapA nebo mutantní gen DDPS.

*

Vynělezci produkovaly bakterie rodu Escherichia, které obsahují v buňkěch mutantní gen lysC, a zjistilý, že v kultuře se může produkovat a akumulovat značné množství Llysinu nebo L-threoninu.

Vynělez se týkě DNK kódující aspartokinězu III bakterií, které patří do rodu Escherichia a mají v kódující oblasti mutaci, kterou se uvolňuje zpětnovazebně inhibice zmíněné aspartokinězy III lysinem. Zmíněnou mutaci je:

• · • · mutace, při niž 318 zbytek methioninu aspartokinázy III je nahrazen jiným zbytkem aminokyseliny a 323 zbytek glycinu je nahrazen jiným zbytkem aminokyseliny;

mutace, při níž 325 zbytek leucinu je nahrazen jinouaminokyselinou a 347 zbytek valinu je nahrazen jiným zbytkem aminokyseliny,

	mutace, při níž	323	zbytek	glycinu	je	nahrazen	zbytkem
j iné	aminokyseliny a	347	zbytek	valinu	je	nahrazen	zbytkem
j iné	aminokyseliny,
	mutace, při níž	325	zbytek	leucinu	je	nahrazen	zbytkem
j iné	aminokyseliny a	345	zbytek	šeřinu	je	nahrazen	zbytkem
j iné	aminokyseliny,
	mutace, při níž	323	zbytek	glycinu	je	nahrazen	zbytkem
j iné	aminokyseliny a	358	zbytek	šeřinu	je	nahrazen	zbytkem

jiné aminokyseliny, mutace, při niž 344 zbytek threoninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při níž 250 zbytek glutamové kyseliny je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 346 zbytek glutamové kyseliny je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 347 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem jiné aminokysliny, mutace, při které 250 zbytek glutamové kyseliny je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 346 zbytek threoninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 202 zbytek aspartové kyseliny je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 283 zbytek argininuje nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, 333 zbytek alaninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, 338 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, 346 zbytek glutamové kyseliny je nahrazen • · • · • · • · · • · · · • · • · · · zbytek asparaginu je nebo • · ·· · • · · · ·· • · ·· • ·· · • · · · zbytkem jiné aminokyseliny a 414 nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny,

mutace,	při které 318	zbytek methioninu	je
zbytkem	j iné	amino kyseliny,	321	zbytek	šeřinu	je
zbytkem	j iné	aminokyseliny,	328	zbytek	valinu	je
zbytkem	j iné	aminokyseliny,	349	zbytek	valinu	je
zbytkem	j iné	aminokyseliny a	405	zbytek glutamové	k?
nahrazen	zbyťkem jiné aminokyseliny.

nahrazen nahrazen nahrazen nahrazen eliny je

Vynález se týká bakterií, patricí k rodu oblasti mutaci, kterou

DNK kódující asapartokinázu III Escherichia. Tato DNK má v kódující se uvolňuje zpětnovazebná inhibice zmíněné aspartokinázy III lysinem. Zmíněná mutace je:

které 318 zbytek methioninu aspartokinázy zbytkem izoleucinu a 323 zbytek glycinu je aspartové kyseliny, mutace, při III je nahrazen nahrazen zbytkem

mutace,	při	které	325	zbytek	leucinu je	nahrazen
fenylalaninu	a	347	zbytek valinu je nahrazen
methioninu,
mutace,	při	které	323	zbytek	glycinu je	nahrazen
kyseliny aspartové a	347	zbytek	valinu je	nahrazen
methioninu,
mutace,	při	které	325	zbytek	leucinu je	nahrazen
fenylalaninu	a 345 zbytek	šeřinu	je nahrazen	zbytkem
mtace,	při	které	323	zbytek	glycinu je	nahrazen
kyseliny aspartové a	358	zbytek	šeřinu je	nahrazen

leucinu, zbytkem leucinu, zbytkem zbytkem zbytkem zbytkem zbytkem zbytkem

mutace, při	které	344	zbytek	threoninu	je nahrazen
zbytkem methioninu,
mutace, při	které	250	zbytek	kyseliny	glutamové je
nahrazen zbytkem	lysinu,
mutace, při	které	346	zbytek	glutamové	kyseliny je
nahrazen zbytkem	lysinu	a	347 zbytek leucinu	je nahrazen

zbytkem fenylalaninu,

mutace, při které 250 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem lysinu a 364 zbytek threoninu je nahrazen zbytkem methioninu, mutace, při které 202 zbytek aspartové kyseliny je nahrazen zbytkem glycinu a 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem prolinu, mutace, při které 283 zbytek argininu je nahrazen zbytkem šeřinu, 333 zbytek alaninu je nahrazen zbytkem threoninu, 338 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem threoninu, 346 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem kyseliny aspartové a 414 zbytek asparaginu je nahrazen zbytkem šeřinu, nebo mutace, při které 318 zbytek methioninu je nahrazen zbytkem lysinu, 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem prolinu, 328 zbytek valinu je nahrazen zbytkem fenylalaninu, 349 zbytek valinu je nahrazen zbytkem glycinu a 405 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem valinu.

Vynález se týká shora uvedené rekombinantní DNK, která vzniká ligací DNK, která je popsaná v nároku 1, a vektorové DNK, která je schopná se replikovat v buňkách bakterii rodu Escherichia. Dále se vynález týká mikroorganizmu rodu Escherichia, který obsahuje uvedenou DNK.

Vynález popisuje postup produkce L-aminokyseliny, jež zahrnuje inkubaci shora zmíněného mikroorganizmu, který má schopnost produkovat L-aminokyselinu ve fermentačním médiu, dále zahrnuje produkci a akumulaci L-aminokyseliny v kultuře a izolaci L-aminokyseliny z kultury.

DNK kódující DDPS nebo AKIII nebo DNK nesoucí uvedené geny a promotor se nazývá gen DDPS nebo gen AKIII. Dále mutantni enzym, ve kterém je uvolněná zpětnovazebně inhibice L-lysinem, se nazývá mutantni enzym. DNK kódující stejný enzym nebo DNK obsahující stejný gen a promotor se nazývá mutantni gen. Termín uvolnit zpětnovazebnou inhibice L-

lysinem znamená, že inhibice je značně uvolněná a není nezbytné, aby se uvolnila zcela.

<1> DNK kódující mutantní aspartokinázu (AKIII) podle vynálezu.

DNK kódující mutantní aspartokinázu (AKIII) podle vynálezu je DNK kódující divoký typ AKIII, který má mutaci, jež uvolňuj e ~ zpětnovazebnou inhibici AKIII L-lysinem. AKIII je AKIII získaná z bakterií rodu Escherichia, zvláště AKIII získaná z E.coli. Mutace, jež uvolňuje zpětnovazebnou inhibici AKIII lysinem, v aminokyselinové sekvenci AKIII reprezentované sekvencí č.l počítané z N-konce zahrnuje (a) mutaci, při které 318 zbytek methioninu aspartokinázy III je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek leucinu, a 323 zbytek glycinu je substituován zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek kyseliny aspartové.

(b) mutace, při které 325 zbytek leucinu je substituován jinou aminokyselinou, upřednostňuje se zbytek fenylalaninu, a 347 zbytek valinu je substituován zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek methioninu.

(c) mutace, při které 323 zbytek glycinu je substituován zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek kyseliny aspartové, a 347 zbytek valinu je substituován zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek methioninu.

(d) mutace, při které 325 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek fenylalaninu, a 345 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek leucinu.

·· ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · • · · ··· · · ·'·· · · · · · · ···· ·· ·· ···· ·· ·· (e) mutace. Při které 323 zbytek glycinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek kyseliny aspartové, a 358 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek leucinu.

(f) mutace, při které 344 zbytek threoninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek methioninu.

(g) mutace, při které 250 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek lysin.

(h) mutace, při které 346 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek lysinu, a 347 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek fenylalaninu.

(i) mutace, při které 250 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkemjiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek lysinu, a 346 zbytek threoninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek methioninu.

(j) mutace, při které 202 zbytek kyseliny aspartové je substituován zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek glycinu, a 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek prolinu.

(k) mutace, při které 283 zbytek argininu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek šeřinu, 333 zbytek alaninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek threoninu, 338 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek threoninu, 346 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek kyseliny aspartové, a 414 zbytek asparaginu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek šeřinu, nebo (1) mutace, při které 318 zbytek methioninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek lysinu, 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek prolinu, 328 zbytek valinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek fenylalaninu, 349 zbytek valinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek glycinu, a 405 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek valinu.

DNK kódujicidivoký typ AKIII není v podstatě limitována. Zmiňuje se DNK, která kóduje AKIII a získala se z bakterií rodu Escherichia, například E.coli. Přesněji se zmiňuje DNK kódující aminokyselinovou sekvenci, kterou představuje sekvence č. 1 a dále sekvenci, kterou představují báze čísla 584 až 1930 v základní sekvenci reprezentovanou sekvencí č.

1. AKIII z E.coli se kóduje genem lysC.

Sekvence, která má mutaci v základní sekvenci, jež způsobuje substituci zbytku aminokyseliny, je DNK kódující mutantní AKIII podle vynálezu. Typ kodónu, který odpovídá substituovanému aminokyselinovému zbytku, není zvláště omezen pokud kóduje uvedený aminokyselinový zbytek. Aminokyselinová sekvence AKIII divokého typu se liší v závislosti na druhu bakterií nebo druhu kmenů. Gen mutantní AKIII také zahrnuje sekvenci, která má substituci, deleci nebo inzerci zbytku aminokyseliny v poloze, jež se nepodílí na enzymatické aktivitě.

Například základní sekvence (sekvence č. 1) genu lysC divokého typu získaná v příkladu 1 se na šesti místech liší

K-12 JC411,

C., Cohen, ·· ·· ·· ·· • · · · _ · • · · · · * ··«* ·· ·· ···· od základní sekvence genu lysC z E.coli kmene který byl již zpřístupněn (Cassan, M., Parsot.

G.N. and Patte, J.C., J. Biol. Chem. 261, 1052 (1986)).

Kódované aminokyselinové zbytky se liší na dvouch místech ze šesti (v genu lysC kmene JC411; v aminokyselinové sekvenci genu lysC, kterou tvoří sekvence č. 1, je 58 zbytek glycinu, počítáno z N-konce, nahrazen zbytkem cysteinu a 401 zbytek glycinu je nahrazen zbytkem alaninu. V případě, že se v genu lysC, který má stejnou sekvenci jako gen lysC E.coli kmene K12 JC411, uplatní libovolné dříve uvedené mutace a) až 1), očekává se, že se získá gen lysC mající mutace, které uvolnily zpětnovazebnou inhibici L-lysinem..

Popis získání DNK kódující mutantní AKIII, ve kterém je uvolněna zpětnovazebně inhibíce lysinem následuje. Nejdříve se DNK obsahující gen AKIII divokého typu nebo gen AKIII mající jiné mutace in vitro matagenizuje. Mutagenizovaná DNK je ligována do vektoru DNK, který je použitelný ve vhodném hostiteli, za účelem vytvořit rekombinantní DNK. Za účelem získat transformant se do hostitele zavedla rekombinantní DNK. Izolovaný transformant, který má exprimovat mutantní AKIII, obsahuje mutantní gen. Dále, DNK kódující gen AKIII divokého typu nebo gen AKIII obsahující jinou mutaci se liguje do vektoru DNK, který je použitelný ve vhodném hostiteli, za účelem vytvořit rekombinantní DNK. Rekombinantní DNK se pak in vitro mutagenizuje a mutagenizovaná DNK se vnáší do hostitelských mikroorganizmů za účelem získat transformant. Izolovaný transformant, který má exprimovat mutantní AKIII, obsahuje mutantní gen. V jiném případě je také možné, mutagenizovat mikroorganizmus, který produkuje enzym divokého typu, za účelem vytvořit mutantní kmen, který produkuje mutantní enzym. Mutantní gen je pak možné získat z tohoto mutantního kmene.

• φ ··· φ φ · ···· · • φ · · · · φφφ ···· φφ ·· · · ·· φ· ··

Jako činidlo pro přímou mutagenezi DNK se může použít hydroxylamin a podobně. Hydroxylamin je chemické mutagenizačni činidlo, které způsobuje mutagenezi z cytosinu na tymin změnou cytosinu na N⁴-hydroxycytosin. K mutagenizaci samotného organizmu je možné použit ozáření ultrafialovým světlem nebo aplikaci mutagenizačniho činidla, které se obyčejně používá v případě umělé mutace. Je to například Nmetyl-N'-nitrO-N-nitrosoguanidin (NTG). Jako dárce DNK obsahující gen AKIII divokého typu nebo gen AKIII obsahující jinou mutaci se mohou použít libovolné mikroorganizmy patřící do rodu Escherichia. Přesněji ty organizmy, které se popisuji v dokumentech autora F.C. Neidhardt et al. (Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, Američan Society for Microbiology, Washington D.C., p. 1208, Tabulka

1.) . Příkladem takového organizmu je kmen JM109 E. coli a kmen MC1061 E.coli.

(1) Získání genu AKIII divokého typu

Přiklad produkce DNK obsahující gen AKIII se popisuje dále. Nejdříve se vytvoří kultura například E.coli kmene MC1061 divokého typu nesoucí gen lysC. Ke kultivaci tohoto organizmu se může použít postup obvyklý pro kultivaci na pevné půdě. Lepši výtěžek se dosáhne za použití kapalné kultury. V tomto případě se kultivační médium může například získat přidáním ke zdroji uhlíku jednoho nebo více druhů anorganických solí ze skupiny, která zahrnuje hydrogenfosforečnan draselný, dihydrogenfosforečnan draselný, síran amonný, chlorid sodný, chlorid hořečnatý, chlorid železnatý, síran železnatý a síran hořečnatý. Jako zdroj uhlíku se může použit jedna nebo více půd ze skupiny, která zahrnuje kvasinkový extrakt, pepton, extrakt z masa, kukuřičný sirup a tekutý odpad vznikající při zpracování sóji nebo obili. Dále se do média musí přidat vhodné množství sacharidů, vitaminů a podobných látek, které jsou nutné.

•c · • · · · • ·· • ·· • · · · · ·

Počáteční pH kultury by se mělo upravit na hodnotu mezi 6 a 8. Inkubace probíhá při teplotě od 30°C do 42°C. Upřednostňuje se kultivace při teplotě přibližně 37°C po dobu 4 až 24 hodin, míchaná vzduchem, míchaná mechanicky nebo stacionární kultivace.

Takto získaná kultura se separuje například centrifugací při 3 000 ot/min po dobu 5 minut. Tak je možné získat kmen MC1061 E.coli. Chromozomální DNK je možné získat z buněk tohoto kmene například způsoby, které popisuje Saito a Miura (Biochem. Biophys. Acta. 72, 619, (1963)) nebo K.S.Kirby (Biochem. J. 64, 405, (1956)).

Za účelem izolovat gen AKIII z výsledné chromozomální DNK se připravila knihovna chromozomální DNK. Nejdříve se chromozomální DNK částečně štěpila vhodnou restrikční endonukleázou za účelem získat směsi různých fragmentů. Jestliže stupeň štěpení je řízen časem štěpení nebo podobně, tvoří se velké množství různých fragmentů. Například chromozomální DNK se inkubuje s restriktázou Sau3A, která je přítomna v koncentraci 1 až 10 jednotek/ml, při teplotě 30°C a vyšší. Upřednostňuje se inkubace při teplotě 37°C po dobu od 1 minuty do 2 hodin.

Pak fragmenty vzniklé štěpením chromozomální DNK se ligovaly do vektoru, který je schopný se replikovat v buňkách bakterií rodu Escherichia a vytvářet rekombinantní DNK. Přesněji, vektor DNK se štěpí restrikční endonukleázou, která umožní vytvoření stejné terminální sekvence jako restrikční endonukleáza Sau3A použitá ke štěpení chromozomální DNK. Může se použít enzym BamHI v koncentraci od 1 do 100 jednotek/ml při teplotě 30°C nebo vyšší. Inkubace trvá po dobu 1 hodiny nebo více, upřednostňuje se doba trvání od 1 do 3 hodin, kdy dochází k úplnému štěpení. V podstatě shora zmiňovaná směs fragmentů chromozomální DNK je smíchána se štěpeným vektorem. Ke směsi se přidá DNK ligáza, upřednostňuje se T4 DNK ligáza • · ···· · · · ♦ · · · ······ ♦»····· ······ · · · ···· ·· ·· ···· ·· ·· v koncentraci od 1 do 100 jednotek/min, a směs se inkubuje při teplotě od 4°C do 116°C po dobu jedné hodiny nebo více, upřednostňuje se doba inkubace od 6 do 24 hodin. Tvoři se rekombinantní DNK.

Mikroorganizmus rodu Escherichia, například kmen E.coli K-12, upřednostňuje se kmen, který nenese gen kódující AKI, AKII a AKIII, například kmen E.coli GT3 (který je možné získat z instituce Genetic Stock Center for E.coli, Connecticum, U.S.A), se transformoval za účelem připravit knihovnu chromozomální DNK. Transformace proběhla způsobem popsaným D.M.Morrison (Methods in Enzymology 68, 326, (1979)) nebo způsobem, kde pravděpodobnost prostupnosti DNK se zvýší chloridem vápenatým, který se aplikuje na buňky (Mandel, M. and Higa, A., J.Mol.Biol. 53, 159 (1970).

Kmen nesoucí rekombinantní DNK s genem AKIII se získal z kmene, který má zvýšenou aktivitu AKIII nebo z kmene, kde auxotrofie způsobená delecí genu AKIII je vyrovnána výslednou knihovnou chromozomální DNK. V případě, že se jako host použije mutant, který je zcela deficientní v produkci AK, je možné získat rekombinantní kmen, který může růst na médiu bez L-lysinu, L-threoninu, L-methioninu a kyseliny diaminopimelové. Z tohoto kmene je možné získat rekombinantní DNK, což umožňuej získat fragment DNK obsahující gen AKIII. Z vhodného kmene se připraví buněčný extrakt, z něhož se připravý roztok surového enzymu. Pak se určí aktivita AKIII. Enzymatická aktivita AKIII se může měřit způsobem podle

E.R.Stadtmana (Stadtman, E. R., Cohen, G.N., LeBras, G. and Robichon-Szulmajster, H., J.Biol. Chem. 236, 2033 (1961)).

Rekombinantní DNK získaná inzercí DNK obsahující gen AKIII do vektoru DNK, který se může izolovat způsobem podle P.Guerry et al. (J.Bacteriol. 116, 1064, (1973)) nebo podle

D.B.Clewell (Bacteriol. 110, 667 (1972)).

• ·· · · ·· · • 9 · · · ·· • · · · · · · · · • · · · · · • · · · · · ·· ··

Gen AKIII divokého typu je také možné získat tak, že se izoluje chromozomálni DNK z kmene, který má na chromozómu gen kódující AKIII, způsobem podle Saito a Miura. Tento gen se amplifikuje polymerázovou řetězovou reakci (PCR, White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185, (1989)). Primer DNK používaný při amplifikaci je komplementární s oběma 3'konci dvouřetězové DNK, která obsahuje celou oblast genu AKIII nebo její část. V~ případě, že se amplifikuje pouze část oblasti genu AKIII, je nezbytné vybrat fragment DNK obsahující celou oblast z knihovny chromozomálni DNK za použiti fragmentu DNK, který obsahuje část oblasti AKIII jako primer. Když se amplifikuje celá oblast genu AKIII, roztok PCR obsahující fragment DNK, který nese amplifikovaný gen AKIII, se analyzuje elektroforézou na agarózovém gelu. Požadovaný fragment se pak extrahuje, přičemž se může izolovat fragment DNK obsahující gen AKIII.

Primer DNK se může přesně vytvořit na základě známé sekvence kmenu E.coli. (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and Patte, J.C., J.Biol. Chem. 261, 1052 (1986)). Vhodný je primer, který je schopný amplifikovat oblast obsahující 1 347 bázi a nesoucí gen lysC. Vhodné jsou například dva typy primerů, které jsou reprezentovány sekvencemi číslo 2 a 3. Primer DNK se může syntetizovat obvyklým způsobem, například fosfoamidovou metodou (Tetrahedron Letters 22, 1859 (1981)) za použití obecně dostupného syntezátoru DNK (například syntezátor DNK Model 380B vyrobený firmou Applied Biosystems). PCR může probíhat způsobem, který určí dodavatel, za použiti komerčně dostupných PCR zařízeni (DNK Thermal Cycler Model PJ2000, který vyrobila firma Takara Shuzo Co., Ltd.) a Taq DNK polymerázy (Takara Shuzo Co., Ltd.).

Amplifikovaný gen AKIII se liguje s vektorem, který je schopný se replikovat v buňkách bakterii, které patři do rodu • · ···· · · · · ··· ·· · · · · · * ···· · ······ ··· ······ ······ ·· ··

Escherichia. Tento vektor se zavede do buněk bakterií rodu Escherichia, přičemž je jednoduché provést mutaci genu AKIII. Vektor DNK, transformace a určení přítomnosti genu AKIII jsou shora popsány.

(2) Zavedení mutace do genu AKIII.

Gen AKIII získaný shora popsaným způsobem je mutován substitucí, inzercí nebo delecí aminokyselinového zbytku způsobem rekombinantního PCR (Higuchi, R. 61, in PCR Technology (Erlich, H.A. Eds., Stockton Press (1989)), způsobem mutace na specifickém místě (Kramer, W. and Frits,

H.J., Methods in Enzymology 154, 350 (1987); Kunkel, T.A. et al., Methods in Enzymology 154, 367 (1987)) a podobně. Tyto metody mohou způsobit požadované mutace v požadovaných místech.

Mutace nebo náhodné mutace se mohou zavést do požadovaného místa způsobem, při kterém se chemicky syntetizuje požadovaný gen.

Existuje způsob, při kterém se přímo na gen AKIII, nacházející se na chromozómu nebo na plazmidu, aplikuje hydroxylamin (Hashimoto, T. a Sekiguchi, M., J. Bacteriology 159, 1039 (1984)). Dále se může použít způsob, při kterém bakterie rodu Escherichia obsahující gen AKIII, jsou ozářeny ultrafialovým světlem nebo způsob, kde se aplikuje chemické činidlo, jako je N-metyl-N'-nitrosoguanidin nebo kyselina dusitá. Tyto metody mohou zavést náhodnou mutaci.

Způsob selekce mutantního genu AKIII se popisuje dále. Rekombinantní DNK obsahující gen AKIII, který se nejdříve mutagenizuje, se transformuje do kmene, který je zcela AK deficientní. Je to například kmen E.coli GT3. Transformant se pak inkubuje na minimálním médiu, například na médiu M9, které obsahuje podstatné množství L-lysinu. Přestože pouze AK se inhibuje L-lysinem v kmenu, který zahrnuje rekombinantní DNK obsahující gen AKIII divokého typu, L-threonin, L16 • · • · · • ·

99 9 izoleucin, L-methionin a kyselina diaminopimerová (DAP) se nemůže syntetizovat, protože řídí růst tohoto kmene. Kmen nesoucí rekombinantní DNK, jež kterém je uvolněna inhibice minimálním médiu obsahující základě tohoto jevu je ve obsahuje mutantní gen AKIII, L-lysinem, se musí podstatné množství možné vybrat kmen, kultivovat

L-lysinu. který je rezistentní na L-lysin nebo S-2-aminoetylcystein (AEC), který je růstovým analogem L-lysinu. Jde o kmen, který obsahuje rekombinantní DNK nesoucí mutantní gen AKIII, ve kterém je uvolněna inhibice.

na

Na

Takto získaný

DNK rekombinantní rekombinantní gen vhodného zaveden do (hostitele) a exprimován.

AKIII, je obsahuj lei je v podobě mikroorganizmu možné získat

Takto je ve kterém je uvolněna mikroorganizmus zpětnovazebně inhibice.

Jako hostitel se preferují mikroorganizmy, kejtré patří do rodu Escherichia, například E.coli.

se může použít látka získaná izolací z rekombinantní DNK a inzercí

Dále mutantniho genu AKIII do j iného fragmentu uvedeného vektoru.

vektoru.

pBR322, preferuj e

Podle vynálezu se

Mezi tyto plazmidové vektory pHSG299, pHSG298, pHSG398, fragmentu použití plazmidového patří pUC19, pUC18,

RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 a pMW218. Mohou se použít také fágové vektory nebo transpozónový vektor.

Za účelem účinné exprese mutantniho genu AKIII se může proti směru transkripce DNK oblasti kódující mutantní AKIII ligovat jiný promotor, který je ve zmíněných mikroorganizmech funkční. Takovým promotorem může být lac, trp a PL. Nebo se může použít promotor obsažený v genu AKIII, tak že je amplifikován.

DNK získaná inzercí mutantniho genu do DNK vektoru, který je schopný se replikovat, se může vnést do hostitele. V buňce zůstává jako extrachromozomální DNK v podobě plazmidu.

• · • · • · · · · · · · ···· · ······ ··· ···· ·· ·· ·♦·♦ ·♦ ··

Nebo mutantní gen se může začlenit do chromozómu hostitelského mikroorganizmu pomocí transdukce transpozonem (Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol. 1, 417 (1983)), Mu fágem (japanese Laid-Open (Kokai) č. 109 985/1990) nebo komplementární rekombinací (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Lab. (1972)).

<3> Produkce L-aminokyseliny podle vynálezu.

L-amino~kyselina se může účinně produkovat inkubací bakterií rodu Escherichia, které jsou transformovány dříve získaným mutantním genem AKIII, ve vhodném bakteriálním kultivačním médiu. L-aminokyseliny se produkují a akumulují do kultury a je možné je získat.

Bakterie rodu Escherichia obsahující AK, ve kterém je uvolněna zpětnovazebně inhibice L-lysinem, zahrnují bakterie rodu Escherichia, které jsou transformovány inzercí DNK kódující AKIII s mutací, jež uvolňuje zpětnovazebnou inhibicí L-lysinem, do chromozómu a dále zahrnují bakterie rodu Escherichia, které jsou transformovány rekombinantní DNK tvořenou ligací dříve zmiňované DNK s DNK vektorem, který je schopný se replikovat v buňkách bakterií rodu Escherichia. Dostupné jsou také mutanty bakterií rodu Escherichia, které produkují mutantní AKIII a které vznikly mutagenezí buněk bakterií rodu Escherichia.

Jako hostitel pro transformaci se mohou použít libovolné bakterie, kde je funkční promotor mutantního genu AKIII nebo jiný promotor, který umožňuje expresi tohoto genu. Nebo mutantní gen AKIII je začleněn do plazmidu a zůstává jako extrachromozomální DNK. V tomto případě se může jako hostitel použít libovolná bakterie, kde počátek replikace DNK vektoru je funkční ve zmíněných buňkách a extrachromozomální DNK se může replikovat.

Kultivační médium používané pro inkubaci mikroorganizmu, který nese mutantní gen podle vynálezu, je běžné kultivační • · • · • · · • · · • · · · médium obsahující zdroj uhlíku, dusíku, anorganické ionty a jiné organické látky, je-li to nutné.

Jako zdroj uhlíku slouží například sacharidy, jako je glukóza, laktóza, galaktóza, fruktóza a hydrolyzát škrobu; alkoholy, jako je glycerol a sorbitol; a organické kyseliny, jako je kyselina fumarová, kyselina citrónová a kyselina j antarová.

Mezi zdroj dusíku patří anorganické amonné sole, jako jsou síran amonný, chlorid amonný a fosforečnan amonný; sojový hydrolyzát; plynný amoniak a vodný roztok amoniaku.

Pro kultivaci je vhodné, aby půda obsahovala vhodné množství organických mikronutrientů, jako je vitamin B_T nebo L-izoleucin nebo kvasinkový extrakt. Dále se může přidat malé množství fosforečnanu draselného, síranu amonného, iontů železa a hořčíku.

Inkubace se provádí za anaerobních podmínek po dobu 16 až 72 hodin. Inkubační teplota je mezi 25°C a 45°C. Hodnota pH se během kultivace pohybuje mezi 5 a 8. Pro úpravu pH se mohou použít anorganické nebo organické, kyselé nebo alkalické látky a nebo plynný amoniak.

L-aminokyselina se může obvykle získat z kapalné fermentace ligací na iontoměničovou pryskyřici, srážením a jinou známou metodou.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Získání mutantního genu AKIII (1) <1> Klonování genu AKIII divokého typu

Základní sekvence genu AKIII E.coli (lysC) byla již publikována (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N., and Patte, J.C., J. Biol. Chem. 261, 1052 (1986)). Je známo, že otevřený čtecí rámec (ORF) se skládá z 1 347 párů baží, které kódují protein zahrnující 449 zbytků aminokyselin. Tento gen má operátor a může být potlačen L-lysinem. Za účelem odstraněni oblasti jeho operátoru se amplifikovala pomoci PCR SD sekvence a samotná oblast obsahující ORF. Tato amplifikovaná DNK se pak se klonovala.

Způsobem podle Saito a Miura (Biochem. Biophys. Acta. 72, 619 (1963) ) se připravila celá genomová DNK kmene K-12

MC1061 E.coli a vytvořily se dva typy primerů mající sekvence, které jsou tvořeny sekvencemi číslo 2 a 3. PCR amplifikace genu AKIII se uskutečnila způsobem podle H.A. Erlicha et al. (PCR Technology, Stockton Press (1989)). Výsledná DNK se štěpila restriktázami BamHI a Asel, pak se upravily konce na tupé konce a fragment se vnesl do Smál místa vektoru pMW119 s nízkým počtem kopií a vznikla konstrukce pMLYSC2. Uvedené Smál místo se nachází po směru transkripce promotoru lacZ, který je přítomen ve vektoru. V případě, že rekombinantní DNK získaná inzercí fragmentu DNK do restrikčního místa Smál vektoru pMW119 je zaveden do

E.coli, fragment je přepisován transkripcí za řízení promotorem lacZ (Obr.l).

<2> Klonování mutantního genu AKIII.

Plazmidy, které nesou mutantní gen AKIII, jmenovitě pLYSCl*80, pLYSCl*117 a pLYSCl*126 popsané v International Laid-OpenPamphlets WO94/11517 a WO95/16042 se štěpily restriktázami EcoRI a HindlII, aby se získaly fragmenty obsahující mutantní gen AKIII. Tyto frasgmenty se začlenily do EcoRI-HindlII místa vektoru pMW119, za účelem vytvořit plazmidy s označením pLYSC2*80 a pLYSC2*126.

Plazmid pLYSC2*80 se může vytvořit z pLLC’8 podle popisu v publikaci International Laid-Open Pamphlet WO94/11517. Kmen. Tento plazmid se získal zavedením pLLC*80 do kmene HB101 E.coli se označil AJ12750. Tento kmen se uložil v National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (č. 1-3, Higashi • · • · · ·

1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, 305) pod číslem FERM P13136 ke dni 1. září 1992. Tento kmen byl zařazen do mezinárodní sbírky podle Budapešťské úmluvy 4. listopadu 1993, je uložen pod číslem FERM BP-4462. Plazmidy pLYSC2’117 a pLYSC2*126 není ještě uložen. Ale protože místa mutace jsou doloženy v publikaci International Laid-Open Pamphlet WO94/11517, mohou se připravit z plazmidu pLYSCl*80, který se používá jako-počátečný materiál.

<3> Studie podmínek selekce nového mutantního genu AKIII.

Transformant získaný zavedením pMLYSCl do kmene E.coli GT3, který je zcela deficientní na AK (thrA1016b, metLM1005, lysC1004), se označil GT3/pMLYSC2. Tímto způsobem vznikly GT3/pMLYSC2*80, GT3/pMLYSC2*117 a GT3/pMLYSC2*126. Kmen GT3/pMLYSC2 má plazmid, který obsahuje divoký typ lysC a AKIII kódovaná tímto genem lysC je samotný AK. Protože divoký typ AKIII, který je samotný AK, je inhibován L-lysinem, Lthreoninem, L-isoleucinem, L-methioninem v přítomnosti dostatečného množství L-lysinu v minimálním médiu a nemůže se syntetizovat kyselina diaminopimeronová, která potlačuje jeho růst. Kmen obsahující plazmid s mutantním lysC, ve kterém se může uvolnit inhibice L-lysinem, může růst v minimálním médiu, které obsahuje potřebné množství L-lysinu. Izoloval se kmen, který je rezistentí na L-lysin a kmen nesoucí plazmid s mutantním genem lysC, ve kterém se uvolnila inhibice Llysinem. Kmeny GT3/pMLYSC 2, GT3/pMLYSC2’80, GT3/pMLYSC2’117 a GT3/pMLYSC2*126 se inkubovaly na minimálním agarovém médiu, které obsahuje různé koncentrace L-lysinu. Účelem této inkubace bylo stnovit koncentraci inhibice růstu a podmínky selekce kmenů nesoucích plazmid. V Tabulce č. 1 je znázorněn růst transformantů na minimálním agarovém médiu, které obsahuje L-lysin v různých koncentracích. V tabulce č.l jsou • · ,21 + označeny transformanty, které rostou, +/- transformanty, které rostou slabě, a - označuje, že transformanty nerostou.

Tabulka č. 1: koncentrace L-lysinu a růst

	0	0, 2 0,4 0, 6 0, 8 (M)
GT3/pMLYSC2	+ /-	_ _ _ _
GT3/pMLYSC2*80	+	+ +/- -
GT3/pMLYSC2*T17	+	+ /- -
GT3/pMLYSC2*126	+	+ /-

Růst kmene GT3/pMLYSC2, který má divoký typ lysC byl zcela potlačen při koncentraci L-lysinu vyšší než je 0,2M. Kmeny GT3/pMLYSC2*80, GT3/pMLYSC2*117 a GT3/pMLYSC2*126, které nesou mutantní lysC, byly skoro potlačeny přidáním L-lysinu v koncentraci vyšší než 0,4M. To naznačuje, že mutant mající stále vyšší stupeň uvolnění inhibice ve srovnání s mutantním lysC, je možné získat selekcí za přítomnosti 0,4M L-lysinu. Zjistilo se, že tato inhibice růstu se eliminovala současným přidáním homoserinu a kyseliny diaminopimerinové.

Při zavádění mutací se použilo pro selekci kmene nesoucího plazmid s mutantním lysC minimální agarové médium M9 obsahující 0,4M L-lysin. Toto médium se v příkladu 1 nazývá selektivní médium.

<4> Mutageneze genu AKIII a vytvoření mutantního AKIII genu.

Při zavádění mutací do plazmidu pMLYSCl se používají dvě metody. Je to in vitro mutageneze, při které je plazmid přímo ošetřen hydroxylaminem a způsob PCR mutageneze, který poskytuje různé mutace. Očekávají se i mutace jiné než mutace z cysteinu na thymin.

Dva mikroorganizmy s plazmidem pMLYSC2 byly ošetřeny 0,4M hydroxylaminem (objem roztoku obsahující ΙΟΟμΙ směsi 0,1M KH₂PO₄ a lmM EDTA (ρΗβ,Ο) a směs 1M hydroxylaminu a lmM • · • ·

EDTA (ρΗβ,Ο) a 2 pg DNK byl upraven přidáním vody na 200 μΐ) při teplotě 75°C po dobu 1 až 4 hodin. Takto skleněným prachem upravená DNK byla zavedena do kmene E.coli GT3, který je zcela AK deficientní. Vzniklý transformant se nanesl na médium (obsahující 1% L-půdu, 0,5% kvasinkový extrakt, 0,5% NaCl, 50mg/l ampicilinu a 1,5% agar), aby mohly vzniknout kolonie. Kolonie se replikovaly na selektivním médiu a kmeny schopné růst na selektivním médiu se vybraly jako kandidáti.

Náhodná mutageneze pomocí PCR se provedla metodou

C.Cadwell et al. (Cadwell, C. and G.F. Joyce, PCR methods Applic. 2, 28, (1982) ) . To znamená, že fragment lysC se amplifikoval shora zmiňovaným způsobem, za použití univerzálních primerů pro pMLYSC2 a M13. Tento fragment se štěpil s restrikčnimi enzymy Eco RI a Hind III a pak se začlenil do EcoRI-HindlII místa pMW119. Vzniklý vektor se zavedl do kmene E.coli GT3, který je zcela AK deficientní. Transformant se nanesl na médium (obsahující 1% L-půdu, 0,5% kvasinkový extrakt, 0,5% NaCl, 50mg/l ampicilinu a 1,5% agar), aby mohly vzniknout kolonie. Kolonie se replikovaly na selektivním médiu a kmeny schopné růst na selektivním médiu se vybraly jako kandidáti. Z 47 kandidátních kmenů se získaly plazmidy. Přesněji 44 kmenů vzniklo mutagenezí hydroxylaminem, 3 kmeny vznikly náhodnou mutagenezí pomoci PCR. Určily se základní mutantni sekvence lysC a místa jejich mutace. Určení základních sekvencí se provedlo obvyklým způsobem za použití sekvenátoru DNK ABI model 373A( poskytla firma ABI). Výsledkem mutageneze hydroxylaminem byl mutantni kmen AKIII, který má čtyři typy (číslo 1, 6, 14 a 21) míst mutace. Výsledkem náhodné mutageneze pomocí PCR je mutantni kmen AKIII, který má tři typy míst mutace (čísla 28, 29 a 30) (tabulka č. 2).

Tabulka č. 2

mutant lysC	způsob mutageneze	místo mutace (aminokyselina)
č. 1	hydroxylamin	ACG—>ATG (34 4Thr^Met)
č. 6	hydroxylamin	GAG—>AAG (250Glu^Lys)
č.14	hydroxylamin	GAA—>AAA (34 6Glu->Lys) CTT->TTT (374Leu->Phe)
č.21	hydroxylamin	GAG—>AAG (2 5 OGlu—>Lys) ACG—>ATG (3 64Thr—>Met)
č.28	PCR	GAT—>GGT (2 02Asp—>Gly) TCT->CCT (321Ser->Pro)
č.29	PCR	CGC—>AGC (283Arg—>Ser) GCG—>ACG (333Ala—»Thr) TCG—>ACG (338Ser^Thr) GAA—»GAT (34 6Glu-»Asp) AAC^AGC (414Asn->Ser)
č.30	PCR	ATG^AAG (318Met—>Lys) TCT->CCT (321Ser—>Pro) GTT—>TTT

• · ···· · · · · ··· • ··· · · · ···· * ····· · · ·

(328Val—>Phe) GTG—>GGG (349Val—>Gly) GAG-»GTG (450G1U—>Val)

Těchto sedm plazmidů (pMLYSC2*Yl, pMLYSC2*Y6, pMLYSC2’Y14, pMLYSC2*Y21, pMLYSC2*Y28, pMLYSC2*Y29 a pMLYSC2*Y30) bylo zavedeno do kmene GT3, který je zcela AK deficientní. Z transformantů se připravil bezbuněčný extrakt. Enzymatická aktivita AKIII se měřila použitím stejného shora popsaného způsobu. Produkce bezbuněčných extraktů a měření enzymatické aktivity AKIII se provedla podle způsobu E.R.Stadtman et al. (Stadtman, E.R., Cohen, G.N., LeBras, G., and Robichon-Szulmajster, H., J.Biol.Chem. 236, 2033 (1961)). Při měření enzymatické aktivity AKIII se přidal do roztoku enzymatické reakce L-lysin v různých koncentracích, za účelem zjistit stupeň uvolnění inhibíce L-lysinem. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 3. Stupeň uvolnění inhibíce ukazuje poměr zbytkové aktivity AK v přítomnosti 0,4M L-lysinu a aktivity AK bez přítomnosti L-lysinu.

Tabulka č. 3

Kmen	Stupeň uvolnění zpětnovazebně inhibíce
GT3/pMLYSC2‘80	75 (%)
GT3/pMLYSC2‘117	76
GT3/pMLYSC2’Yl	56
GT3/pMLYSC2*Y6	127
GT3/pMLYSC2*Y14	87
GT3/pMLYSC2*Y21	117
GT3/pMLYSC2*Y28	114
GT3/pMLYSC2*Y29	99
GT3/pMLYSC2*Y30	116

• · · · • · · · · · · · ···· · · · · ······ ·· ······ ··· ···· ·· ·· ···· ·· ··

Ze shora uvedených výsledků je zřejmé, že mutantni AKIII, který vykazuje vyšší stupeň uvolněni inhibice, než běžný typický mutantni AKIII (mutantni AKIII kódovaný v GT3/pMLYSC2*80 a GT3/pMLYSC2*117) by mohl být získán způsobem selekce používané v tomto případě. Specifická aktivita založená na celkovém proteinu je obvykle ovlivněna podmínkami růstu buněk nebo přípravou vzorků. Specifická aktivita byla ekvivalentní^- specifické aktivitě divokého typu a běžným mutantům. Po zavedení mutace se nepozoroval skoro žádný pokles aktivity. Proto se očekávalo, že centrum aktivity AKIII a řídící místo pro L-lysin jsou na sobě nezávislé.

Příklad 2: Získání mutantního genu (2) AKIII.

Gen lysC, kde 358 Ser byl nahrazen Leu se připravil zavedením místně specifické mutace za použití LA PCR in vitro mutagenizačni soupravy (poskytla Takara Shuzo Co., Ltd.). Jako templát se použil plazmid pLYSCl popsaný v publikacích International Laid-Open Pamphlet WO94/11517 a WO95/16042. Jako primer pro zavedení mutace se použil primer popsaný v v tabulce sekvencí č. 4. Oba konce PCR amplifikovaného fragmentu se štěpily restrikčními endonukleázami EcoRI a HindlII a fragment se dále ligoval s fragmentem získaným štěpením pUC19 restriktázami EcoRI a HindlII, vznikl pLYSC358L. Shora uvedeným způsobem se připravil mutantni gen AKIII, ve kterém 354 Ser se mutagenizovala na Ile nebo Val. Pro tuto mutagenizaci se použil primer popsaný v tabulce č. 5 nebo 6. Tento gen se ligoval s fragmentem získaným štěpením pUC19 restriktázami EcoRI a HindlII. Touto cestou vznikly plazmidy pLYSC345I a pLYSC354V.

Fragmenty nesoucí gen lysC, které vznikly štěpením plazmidů pLYSCl‘48, pLYSCl‘117, pLYSCl*126, pLYSCl*150 a pLYSCl*158 restriktázami EcoRI a HindlII se začlenily do restrikčního místa Eco-HindlII plazmidu pUC19 a výsledné • · fragmenty se označily pLYSC2*48, pLYSC2*117, pLYSC2 126, pLYSC2‘150 a pLYSC2*158. Publikace International Laid-Open Pamphlets WO94/11517 a WO95/16042 uvádí strukturu plazmidu pLYSCl a mutačních míst plamidů pLYSCl*48, pLYSCl 117, pLYSCl’126, pLYSC2*150 a pLYSC2*158. Tyto plazmidy se mohou připravit ze shora zmiňovaného plazmidu pLYSCl*80.

V podstatě se připravil mutantní gen lysC, který má dva typy mutaci- za použiti restrikčního místa SspI, jež je přítomné v blízkosti centra bodů mutace takto získaného monobazického mutantu lysC a SspI restrikčního místa, které se nachází po směru transkripce lysC v plazmidu pUC19.

Plazmid pU2547M se připravil ligací fragmentu SspI, který obsahuje gen lysC v oblasti proti směru transkripce plazmidu pLYSC2’48 s SspI fragmentem obsahující gen lysC v oblasti po směru transkripce plazmidu pLYSC2*158. Plazmid pU2347M se připravil ligací fragmentu SspI obsahujícícho gen lysC v oblasti po směru transkripce plazmidu pLYSC2*126 s fragmentem SspI, který obsahuje gen lysC v oblasti po směru transkripce plazmidu pLYSC2*158; plazmid pU2545L se připravil ligací fragmentu SspI obsahujícícho gen lysC v oblasti proti směru transkripce plazmidu pLYSC2*48 s fragmentem SspI obsahujícím gen lysC v oblasti po směru transkripce plazmidu pLYSC2*117. Plazmid pU2358L se připravil ligací fragmentu SspI obsahujícícho gen lysC v oblasti proti směru transkripce plazmidu pLYSC2126 s fragmentem SspI obsahujícím gen lysC v oblasti po směru transkripce plazmidu pLYSC358L. Plazmid pU234V se připravil ligací fragmentu SspI obsahujícího gen lysC v oblasti proti směru transkripce plazmidu pLYSC2*126 s fragmentem SspI obsahujícím gen lysC v oblasti po směru transkripce plazmidu pLYSC345V. Plazmid pU2345I se připravil ligací fragmentu SspI obsahujícího gen lysC v oblasti proti směru transkripce plazmidu pLYSC2*126 s fragmentem SspI obsahujícím gen lysC v oblasti po směru transkripce plazmidu • · »4 • 9 4 ·

4 9

4 •4 4444 • 4 ·· • 9 9 • 44 · • 4 · » 4 · »444 4* ·· ·· • 4 49

444

44 4·

44

4444 pLYSC345I. Protože místa mutace se nacházejí v plazmidech pLYSC2*150 a pLYSC2'‘126 více proti směru transkripce než restrikční místa Ssp, dibazický mutant lysC, který má tyto dvě místa mutace se připravil následujícím způsobem. Fragment DNK, který má dvě místa mutace, se amplifikoval za použití plazmidu pLYSC2*126 jako templátu. Jako primer se použil oligonukleotid popsaný v tabulce sekvencí č. 7, dále se použila shora uvedená souprava. Oba konce výsledného fragmentu DNK se štěpily restriktázami EcoRI a HindlII a ligoval se s fragmentem získaným štěpením plazmidu pUC19 s restriktázou EcoRI a HindlII. Takto získaný produkt se označil pU1823D.

Stupeň uvolnění inhibice takto získaného dibazického lysC genového produktu (AKIII) ve srovnání s Lys se měřil způsobem, který se popisuje v příkladu 1. Stupeň uvolnění inhibice libovolného dibazického mutantního AKIII byl vyšší než stupeň uvolnění inhibice monobazického mutantního AKIII (tabulka č. 4) . Mutantní lysC v plazmidech pLYSC582L, pLYSC345I a pLYSC345V je nový mutantní gen. Zpětnovazebně inhibice L-lysinem je uvolněna v každém genovém produktu. Ligace s jinými mutacemi zvyšuje stupeň uvolnění inhibice. Produkt je také použitelný jako prostředník pro konstrukci dibazického mutantního AKIII.

Tabulka č. 4

Kmen	Místo mutace (aminokyselina)	Stupeň uvolnění zpětnovazebně inhibice (%)
GT3/pLYSC2*48	325Leu-Phe	12
GT3/pLYSC2*117	345Ser—Leu	75
GT3/pLYSC2*126	323Gly—Asp	5
GT3/pLYSC2*150	318Met—Ile	8
GT3/pLYSC2*158	347Val—Met	3

• · • · • · · · ·· ♦· • · · · · · · • · · · · 9 · ······ * • · · · · · ···· ·· ·· ····

GT3/pU345I	345Ser-»Ile	108
GT3/pU345V	345Ser—Val	98
GT3/pU358L	358Ser-»Leu	3
GT3/pU2547M	325Leu—Phe, 347Val-Met	90
GT3/pU2347M	323Gly—Asp, 347Val->Met	94
GT3/pU2545L	325Leu->Phe, 345Ser—Leu	172
GT3/pU2358L	323Gly-Asp, 358Ser-Leu	18
GT3/pU2345V	323Gly—Asp, 345Ser-Val	109
GT3/pU2345l -	323Gly—Asp, 345Ser^Ile	152
GT3/pU1823D	318Met-Ile, 323Gly-Asp	91

Přiklad 3: Produkce L-lysinu pomoci fermentace za použiti kmene, který má zavedený mutantni gen DDPS a mutantní gen AKIII.

Účinek produkce L-lysinu s ohledem na mutantni gen DDPS a mutantní gen AKIII se popisuje v publikaci International Laid-Open Pamphlet W095/16042. Za účelem zlepšit tento účinek mutantní gen AKIII získaný v přikladu 1 se dal dohromady s mutantním genem DDPS.

Kmen E.coli JM109, do kterého se zavedl plazmid RSF24P s mutantním genem DDPS se popisuje v publikaci International Laid-Open Pamphlet WO95/16042, se označil AJ12395. Tento kmen byl uložen v instituci National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (č. 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragiken, 305) pod číslem uložení FERM P-13935 28. října 1993. Tento kmen se převedl do mezinárodní sbírky na základě Budapešťské dohody 1. listopadu 1994 pod novým číslem uložení FERM BP-4858 .

Plazmidy RSFDY1, RSFDY6, RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30, RSFDY2547M, RSFDY2347M, RSFDY2545L, RSFDY2358L, RSFDY2345I a RSFDY1823D, jak se uvádí na obrázku č. 2., se připravily z jednoho typu, který se vybral ze skupiny plazmidů obsahující mutantni gen AKIII pMLYSC2*Yl, pMLYSC2*Y6, pMLYSC2*Y14, pMLYSC2*Y21, pMLYSC2*Y28, • 44 4 4 4 4 · · ·· ···· 4 · · ·· 4 4

4 4 · · · · 44444

4 · 4 · ·444 ···· 44 ·· ···· ···· pMLYSC2*Y29, pMLYSC2*Y30, pU2547M, pU2347M, pU2545L, pU2358L, pU2545V, pU2345I a pU1823D.

Plazmid RSFD80 popsaný v publikaci International LaidOpen Pamphlet WO95/16042 se používal jako kontrola. Kmen získaný zavedením plazmidu RSFD80 do kmene E.coli JM109 se označil jako AJ12396. Tento kmen se uložil v instituci National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (č. 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, 305) pod depozitním číslem FERM P-13936 28. října 1993. Uvedený kmen se přenesl do mezinárodní sbírky na základě Budapešťské dohody 1. listopadu 1994 pod depozitním číslem FERM BP-4859.

Plazmidy získané shora popsaným způsobem RSFDY1, RSFDY6, RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30, RSFDY2547M, RSFDY2347M, RSFDY2545L, RSFDY2358L, RSFDY2345V, RSFDY2345I a RSFDY1823D se zavedly do kmene B-399 obvyklým způsobem a vznikly kmeny, které produkují L-lysin. Hodnotila se produktivita L-lysinu shora uvedených kmenů. Hodnocení produktivity lysinu se provedlo s ohledem na kmen B399/RSFD80, který se používal jako kontrola. Způsob získání kmene B-399 se popisuje v publikaci International Laid-Open Pamphlet WO95/16042.

Inkubace se provedla v kultivačním médiu, které je vhodné pro produkci lysinu, při teplotě 37°C po dobu 48 hodin, za stálého míchání při rozmezí otáček 114 až 116, podle způsobu, který se popisuje v publikaci International Laid-Open Pamphlet W095/16042. Výsledky se uvádějí v tabulce č. 5.

Tabulka č. 5 • · · «· · · ·· • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · e · · · ·· ·· ····

Kmen	Množství vytvořeného hydrochloridu L-lysinu (g/1)
B-399/RSFD80	9,2
B-399/RSFDY1	9,4
B-399/RSFDY6	9, 6
B-399/RSFDY14	9,6
B-399/RSFDY21	9,5
B-399/RSFDY28-	9,6
B-399/RSFDY29	9,5
B-399/RSFDY30	9,3
B-399/RSFD2547M	9,6
B-399/RSFD2347M	9,5
B-399/RSFD2545L	9, 6
B-399/RSFD2358L	9,3
B-399/RSFD2345V	9,4
B-399/RSFD2345I	9,3
B-399/RSFD1823D	9, 6

Přiklad 4: Produkce L-lysinu fermentací za použití kmene, do kterého se zavedl mutantní gen DDPS a mutantní gen AKIII.

V přikladu 3 se určilo, že produktivita L-lysinu by mohla být vylepšena, tak že bakterie rodu Escherichia ponesou mutantní gen DDPS a mutantní gen AKIII. Tento test se provedl a zjistilo se, že se může za tímto účelem použít i jiný hostitel.

Kmen E.coli W3110 (tyrA) se použil jako hostitel. Kmen

W3110 (tyrA) se detailně popisuje v publikaci European Patent Laid-Open No. 488, 424/1992. Tato publikace popisuje velké množství kmenů, které se získaly zavedením plazmidu do kmene W3110 (tyrA). Například kmen, jež se získal zavedením plazmidu pHATerm se označil jako kmen E.coli W3110 (tyrA)/pHATerm. Byl uložen v instituci National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (č. 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, 305) 18 listopadu 1991, na základě Budapešťské ···· · · · · ··· ·· ·»· · · · ···· · ······ · · · «··· ·· ·· ···· ♦· ·· dohody pod depozitním číslem FERM BP-3653. Kmen W3110 (tyrA) se může také získat ztrátou plazmidu pHATerm z kmene E.coli W3110 (tyrA)/pHATerm. Ztráta plazmidu se může uskutečnit obvyklým způsobem.

Plazmidy obsahující mutantní gen DDPS a mutantní gen AKIII, popis jejich začlenění se uvádí v příkladu 3, jmenovitě RSFDY1, RSFDY6, RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30, RSFDY2547M, RSFDY2347M, RSFDY2545L, RSFDY2358L, RSFDY2345I, RSFDY2345V a RSFDY1823D byly zavedeny do kmene W3110 (tyrA). Produktivita L-lysinu se hodnotila jako v příkladu 3. Jako kontrola se použila kmen W3110(tyrA), do kterého se zavedl plazmid RSDF80. Výsledky se uvádí v tabulce č. 6.

Tabulka č. 6

Kmen	Množství vytvořeného hydrochloridu L-lysinu (g/1)
W3110(tyrA)/RSFD80	8,9
W3110(tyrA)/RSFDY1	9,1
W3110(tyrA)/RSFDY6	9,3
W3110(tyrA)/RSFDY14	9,3
W3110(tyrA)/RSFDY21	9,2
W3110(tyrA)/RSFDY28	9,3
W3110(tyrA)/RSFDY29	9,2
W3110(tyrA)/RSFDY30	9,0
W3110(tyrA)/RSFD2547M	9,3
W3110(tyrA)/RSFD2347M	9,2
W3110(tyrA)/RSFD2545L	9,3
W3110(tyrA)/RSFD2358L	9,0
W3110(tyrA)/RSFD2345V	9,1
W3110(tyrA)/RSFD2345I	9,0
W3110(tyrA)/RSFD1823D	9,3

Příklad 5: Produkce L-threoninu fermentací za použití kmene, do kterého se zavedl mutantní gen AKIII.

• · • · • 9

Kmen E.coli B-3996 produkuje threonin a jeho produktivita je nejvyšší z kmenů, které jsou doposud známy. Proto kmen B-3996 se použil jako hostitel k hodnoceni mutantniho genu AKIII. Uvedený kmen B-3996 se popisuje v americkém patentu č. 5,175,107 a je uložen v instituci Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding pod depozitním číslem BKIIM B-3996. Mezi mutantnimi geny, které mají vysokou produktivitu L-lysinu, se vybraly tři typy mutantnich genů (mutantni AKIII geny RSFDY6, RSFE254M a RSFD1823D) a podrobily se testu. Za účelem zvýšit expresi mutantniho AKIII genu, mutantni AKIII gen přítomný v plazmidu pMLYSC*Y6 se ligoval s oblastí ležící po směru transkripce od promotoru lacZ plazmidu pUC19 (poskytla Takara Shuzo Co., Ltd.). Takto nově vytvořený plazmid se označil pLLC*Y6 (Obr.č.3). Protože v plazmidech pU2547M a pU1823D je mutantni gen AKIII původně umístěn po směru transkripce od promotoru lacZ plazmidu pUC19 (poskytla Takara Shuzo Co., Ltd.), použil se v této formě.

Tyto plazmidy se zavedly do kmene B-3996 obvyklým způsobem a provedlo se hodnocení. Inkubace proběhla způsobem popsaným v publikaci International Laid-Open Pamphlet WO94/11517.

Plazmidy pLLC*Y6, pU2547M a pU1823D se transformovaly do kmene B-3996 a transformanty se inkubovaly v přítomnosti a v nepřítomnosti lysinu o koncentraci lg/1. Hostitelský kmen B3996 samotný a B-3996/pLLC*80, který se popisuje v publikaci International Laid-Open Pamphlet WO94/11517, se použily jako kontrolní kmeny.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 7. Poměr výtěžek spotřebovaného cukru v přítomnosti lysinu ku výtěžek spotřebovaného cukru bez přítomnosti lysinu ukazuje citlivost na lysin, což se uvádí v tabulce č. 7. V případě kmene B-3996 pokles výtěžku spotřebovaného cukru při inkubaci v • ·

přítomnosti lysinu je přibližně 0,74, vztaženo k výtěžku spotřebovaného cukru při inkubaci bez přítomnosti lysinu. V případě kmene B-3996/pLLC*80 pokles výtěžku spotřebovaného cukru při inkubaci v přítomnosti lysinu je přibližně 0,9, vztaženo k výtěžku spotřebovaného cukru při inkubaci bez přítomnosti lysinu. Nově získané mutantní geny AKIII mají o málo vyšší produktivitu threoninu a citlivost na lysin.

Tabulka č. 7

Kmen	Množství přidaného L- lysinu (g/1)	Výtěžek spotřebovaného cukru (%)	Citlivost na lysin
B-3996	0 1	30, 7 22, 6	0,74
B-3996/pLLC*80	0 1	39, 7 35, 6	0, 90
B-3996/pLLC’Y6	0 1	40, 5 39, 2	0, 97
B-3996/pU2547M	0 1	40,7 39, 5	0, 97
B-3996/pU1823D	0 1	41,4 40, 5	0, 98

Claims

1. DNK bakterii patřících do rodu Escherichia, která kóduje aspartokinázu III a má v kódující oblasti mutaci, která uvolňuje zpětnovazebnou inhibici zmíněné aspartokinázy III lysinem, přičemž zmíněná mutace je:

mutace, při které 318 zbytek methioninu aspartokinázy III je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 323 zbytek glycinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 325 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 347 zbytek valinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 323 zbytek glycinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 347 zbytek valinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 325 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 345 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 323 zbytek glycinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 358 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 344 zbytek threoninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 250 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 346 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 347 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 250 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 364 zbytek threoninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · ···· ·· · · ♦··· • · mutace, při které 202 zbytek kyseliny aspartové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 283 zbytek argininu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 333 zbytek alaninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, 338 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, 346 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 414 zbytek asparaginu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny nebo mutace, při které 318 zbytek methioninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, 328 zbytek valinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, 349 zbytek valinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 405 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny.

2. DNK podle nároku 1, kde mutace je mutace, při které 318 zbytek methioninu aspartokinázy III je nahrazen zbytkem isoleucinu a 323 zbytek glycinu je nahrazen zbytkem kyseliny aspartové, mutace, při které 325 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem fenylalaninu a 347 zbytek valinu je nahrazen zbytkem methioninu, mutace, při které 323 zbytek glycinu je nahrazen zbytkem kyseliny aspartové a 347 zbytek valinu je nahrazen zbytkem methioninu, mutace, při které 325 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem fenylalaninu a 345 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem leucinu, mutace, při které 323 zbytek glycinu je nahrazen zbytkem kyseliny aspartové a 358 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem leucinu, mutace, při které 344 zbytek threoninu je nahrazen zbytkem methioninu, mutace, při které 250 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem lysinu, mutace, při které 346 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem lysinu a 347 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem fenylalaninu, mutace, při které 250 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem lysinu a 364 zbytek threoninu je nahrazen zbytkem methioninu, mutace, při které 202 zbytek kyseliny aspartové je nahrazen zbytkem glycinu a 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem prolinu, mutace, při které 283 zbytek argininu je nahrazen zbytkem šeřinu, 333 zbytek alaninu je nahrazen zbytkem threoninu, 338 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem threoninu, 346 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem kyseliny aspartové a 414 zbytek asparaginu je nahrazen zbytkem šeřinu nebo mutace, při které 318 zbytek methioninu je nahrazen zbytkem lysinu a 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem prolinu, 328 zbytek valinu je nahrazen zbytkem fenylalaninu, 349 zbytek valinu je nahrazen zbytkem glycinu a 405 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem valinu.

3. Rekombinantní DNK, která vznikla ligací DNK podle nároku 1 s vektorem DNK, jež je. schopný se samostatně replikovat v buňkách bakterií rodu Escherichia.

4. Mikroorganizmus rodu Escherichia, vyznačující se tím, že nese DNK podle nároku

1.

5. Způsob výroby L-aminokyseliny, vyznačující se tím, že zahrnuje inkubaci mikroorganizmu podle nároku 4, který má schopnost produkovat L-aminokyselinu ve fermentačním médiu, produkci a akumulaci L-aminokyseliny ve zmíněné kultuře a získání L-aminokyseliny z kultury.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačuj lei se tím, že L-aminokyselina je L-lysin nebo L-threonin.