BR9705038B1 - Dna codificador de aspartoquinase iii de bactérias pertencentes a escherichia coli, dna recombinante, microorganismo transgênico, e, processo para produzir um l-aminoácido. - Google Patents

Description

“DNA CODIFICADOR DE ASPARTOQUINASE III DE BACTÉRIAS PERTENCENTES A ESCHER1CHIA COLI, DNA RECOMBINANTE, MICROORGANISMO TRANSGÊNICO, E, PROCESSO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO”.

Descrição detalhada da invenção: Campo da Invenção: A presente invenção refere-se a uma indústria de microorganismo. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um processo para a produção de um L-aminoácido através de fermentação, e a um DNA e a um microorganismo que são empregados neste processo. Conhecimento anterior: Quando L-lisina é produzida através de fermentação, cepas separadas do campo natural ou suas cepas sintéticas são empregadas para melhorar a produtividade. É conhecido um grande número de mutantes sintéticos produtores de L-lisina, e muitos deles são mutantes resistentes a amino-etil-cisteína (AEC) pertencentes aos gêneros Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus ou Escherichia. Em adição, transformantes obtidos empregando DNAs recombinantes também são utilizados (patente U.S. n. 4.278.765). Assim, há a descrição de uma variedade de tecnologias para aumentar a produtividade de aminoácidos.

Por exemplo, com relação ao gênero Escherichia, um processo para produção de L-lisina por meio de melhoramento de uma ácido-di-hidro-dipicolínico-sintetase (daqui por diante abreviada como “DDPS”) está descrito na publicação japonesa (Kokai) n. 18.596/1981, na patente U.S. n. 4.346.170 e em Applied Microbiology and Biotechnology 15, 227 (1982). A ácido-di-hidro-dipicolínico-sintetase (DDPS) é uma enzima que catalisa a desidro-condensação de asparto-semi-aldeído e ácido pirúvico para formar ácido di-hidro-dipicolínico. Esta reação é uma entrada para um sistema de biossíntese de L-lisina na biossíntese de um aminoácido do tipo ácido aspártico. Esta enzima é conhecida por servir como um sítio regulador importante da biossíntese de L-lisina em bactérias do gênero Escherichia juntamente com aspartoquinase. DDPS é codificada em um gene chamado de dapA em Escherichia coli (E. coli). Este dapA já foi clonado, e sua seqüência base foi determinada [Richaud, F. et ai, J. Bacteriol 297 (1986)].

Entrementes, aspartoquinase (daqui por diante referida como “AK”) é uma enzima que catalisa uma reação de conversão de ácido aspártico em ácido b-fosfo-aspártico, e é uma enzima reguladora principal no sistema de biossíntese de um aminoácido do tipo ácido aspártico. AK da Escherichia coli inclui três tipos (AKI, AKII, AKIII); e duas destas são enzimas conjugadas com homo-serina-desidrogenase (daqui por diante abreviada por “HD”). Uma destas enzimas conjugadas é AKI-HDI codificada no gene thrA, e a outra é AKII-HDII codificada no gene metLM. AKI sofre supressão combinada com treonina e isoleucina e inibição com treonina, e AKII sofre supressão com metionina.

Entretanto, AKIII sozinha é uma enzima de uma única função, e ela é um produto de um gene chamado lvsC. Sabe-se que ela sofre supressão e retro-inibição com L-lisina. A razão de suas atividades em células é AKLAKIIrAKIII = aproximadamente 5:1:4.

Este lvsC de Escherichia coli já foi clonado, e sua seqüência base foi determinada [Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N., e Patte, J.C., J. Biol. Chem. 261,1052)1986)].

Um processo para a produção de L-lisina empregando Escherichia coli contendo dapA que apresenta mutação que ativa retro-inibição com lisina e lvsC que apresenta mutação que ativa retro-inibição com lisina está descrito no folheto de publicação internacional WO95/16042.

Quando L-treonina é produzida através de fermentação, cepas separadas do campo natural ou suas mutantes sintéticas são empregadas como microorganismos. É conhecido um grande número de mutantes sintéticas produtoras de L-treonina, e muitas delas são resistentes ao ácido a-amino-b-hidróxi-valérico, pertencentes aos gêneros Escherichia, Serratia, Brevibacterium, ou Corynebacterium. Com relação ao gênero Escherichia, um processo para produção de L-treonina empregando uma cepa transformada com um plasmídeo recombinante contendo um opéron de treonina está descrito nas publicações japonesa (Kokai) nos. 131.397/1980, 31.691/1984 e 15.696/1981 e na publicação de patente japonesa no. 501.682/1991.

Em adição, um processo para a produção de L-treonina empregando Escherichia coli contendo lvsC que apresenta mutação para ativar retro-inibição com lisina está descrito no folheto de publicação internacional WO 94/11517.

Problemas a serem solucionados pela invenção: A presente invenção almeja obter uma AKIII derivada de bactérias do gênero Escherichia nas quais a retro-inibição com L-lisina é bem liberada, e proporcionar um processo para a produção de um L-amino-ácido através de fermentação, que está mais aperfeiçoado do que antes.

Modo para solucionar os problemas: Os presentes inventores realizaram diligentemente investigações para solucionar os problemas acima mencionados, e foram por conseguinte bem sucedidos na obtenção de um DNA codificador de AKIII derivada de bactérias do gênero Escherichia nas quais a retro-inibição com L-lisina é bem liberada. Um DNA codificador de AKIII derivada de bactérias do gênero Escherichia nas quais a retro-inibição com L-lisina é bem liberada é denominado muitas vezes de um gene mutante lysC ou de um gene mutante AKIII no presente relatório descritivo.

Em adição, os presentes inventores produziram bactérias do gênero Escherichia contendo lvsC mutante em células, e eles verificaram que uma quantidade considerável de L-lisina ou de L-treonina pode ser produzida e acumulada na cultura.

Isto é, a presente invenção refere-se a um DNA codificador de aspartoquinase III de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia e possuindo na região codificadora mutação para liberar retro-inibição com lisina da citada aspartoquinase III, sendo a citada mutação: mutação por meio da qual o resíduo 318° de metíonina da aspartoquinase III está substituído por outro resíduo de aminoácido e o resíduo 323° de glicina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, mutação por meio da qual o resíduo 325° de leucina está substituído por um outro resíduo de aminoácido e o resíduo 347° de valina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, mutação por meio da qual o resíduo 323° de glicina está substituído por um outro resíduo de aminoácido e o resíduo 347° de valina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, mutação por meio da qual o resíduo 325° de leucina está substituído por um outro resíduo de aminoácido e o resíduo 345° de serina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, mutação por meio da qual o resíduo 323° de glicina está substituído por um outro resíduo de aminoácido e o resíduo 358° de serina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, mutação por meio da qual o resíduo 344° de treonina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, mutação por meio da qual o resíduo 250° de ácido glutâmico está substituído por um outro resíduo de aminoácido, mutação por meio da qual o resíduo 346° de ácido glutâmico está substituído por um outro resíduo de aminoácido e o resíduo 347° de leucina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, mutação por meio da qual o resíduo 250° de ácido glutâmico está substituído por um outro resíduo de aminoácido e o resíduo 364° de treonina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, mutação por meio da qual o resíduo 202° de ácido aspártico está substituído por um outro resíduo de aminoácido e o resíduo 321° de serina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, mutação por meio da qual o resíduo 283° de arginina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, o resíduo 333° de alanina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, o resíduo 338° de serina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, o resíduo 346° de ácido glutâmico está substituído por um outro resíduo de aminoácido e o resíduo 414° de asparagina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, ou mutação por meio da qual o resíduo 318° de metionina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, o resíduo 321° de serina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, o resíduo 328° de valina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, o resíduo 349° de valina está substituído por um outro resíduo de aminoácido e o resíduo 405° de ácido glutâmico está substituído por um outro resíduo de aminoácido.

De preferência, a presente invenção refere-se a um DNA codificador de aspartoquinase III de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia e possuindo na região codifícadora mutação para liberar retro-inibição com lisina da citada aspartoquinase III, sendo a citada mutação: mutação por meio da qual o resíduo 325° de leucina está substituído por um resíduo de fenil-alanina e o resíduo 347° de valina está substituído por um resíduo de metionina, mutação por meio da qual o resíduo 323° de glicina está substituído por um resíduo de ácido aspártico e o resíduo 347° de valina está substituído por um resíduo de metionina, mutação por meio da qual o resíduo 325° de leucina está substituído por um resíduo de fenil-alanina e o resíduo 345° de serina está substituído por um resíduo de leucina, mutação por meio da qual o resíduo 323° de glicina está substituído por um resíduo de ácido aspártico e o resíduo 358° de serina está substituído por um resíduo de leucina, mutação por meio da qual o resíduo 344° de treonina está substituído por um resíduo de metionina, mutação por meio da qual o resíduo 250° de ácido glutâmico está substituído por um resíduo de lísina, mutação por meio da qual o resíduo 346° de ácido glutâmico está substituído por um resíduo de lisina e o resíduo 347° de leucina está substituído por um resíduo de fenil-alanina, mutação por meio da qual o resíduo 250° de ácido glutâmico está substituído por um resíduo de lisina e o resíduo 364° de treonina está substituído por um resíduo de metionina, mutação por meio da qual o resíduo 202° de ácido aspártico está substituído por um resíduo de glicina e o resíduo 321° de serina está substituído por um resíduo de prolina, mutação por meio da qual o resíduo 283° de arginina está substituído por um resíduo de serina, o resíduo 333° de alanina está substituído por um resíduo de treonina, o resíduo 338° de serina está substituído por um resíduo de treonina, o resíduo 346° de ácido glutâmico está substituído por um resíduo de ácido aspártico e o resíduo 414° de asparagina está substituído por um resíduo de serina, ou mutação por meio da qual o resíduo 318° de metionina está substituído por um resíduo de lisina, o resíduo 32 Γ de serina está substituído por um resíduo de prolina, o resíduo 328° de valina está substituído por um resíduo de fenil-alanina, o resíduo 349° de valina está substituído por um resíduo de glicina e o resíduo 405° de ácido glutâmico está substituído por um resíduo de valina. A presente invenção refere-se ao DNA recombinante mencionado acima que é produzido pela ligação do DNA de acordo com a reivindicação 1 em um DNA vetor capaz de replicação autonômica em células de bactérias do gênero Escherichia, e refere-se também a um microorganismo do gênero Escherichia possuindo este DNA. A presente invenção refere-se a um processo para a produção de L-amino-ácido, que compreende incubar o microorganismo citado acima possuindo uma capacidade para produzir um L-amino-ácido em um meio de fermentação, produzir e acumular um L-amino-ácido na cultura, e colher o L-amino-ácido da cultura.

No presente relatório descritivo, um DNA codificador de DDPS ou de AKIII ou um DNA contendo-a e um promotor é chamado em geral “gene DDPS” ou “gene AKIII”. Em adição, uma enzima mutante na qual a retro-inibição com L-lisina está liberada é chamada em geral simplesmente de “uma enzima mutante”, e um DNA codificador da mesma ou um DNA contendo-a e um promotor é chamado de “um gene mutante”. Mais adicionalmente, o termo “para liberar a retro-inibição com L-lisina” significa que a inibição é substancialmente liberada, e ela não é necessariamente liberada em sua totalidade. A presente invenção é descrita em detalhe abaixo. <1> DNA codificador de aspartoquinase mutante (AKIII) da presente invenção: O DNA codificador de aspartoquinase mutante (AKIII) da presente invenção é um DNA codificador de AKIII de tipo selvagem que apresenta mutação para liberar retro-inibição com L-lisina de AKIII a ser codificada. Como AKIII, AKIII derivada de bactérias do gênero Escherichia, especialmente AKIII derivada de Escherichia coli é mencionada. A mutação para liberar a retro-inibição com L-lisina ou AKIII inclui, a seqüência de aminoácidos de AKIII representada pela seqüência No. 1 da tabela de seqüências, contada a partir da terminação N da AKIII, (a) mutação por meio da qual o resíduo 318° de metionina da aspartoquinase III está substituído por outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de isoleucina, e o resíduo 323° de glicina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de ácido aspártico, (b) mutação por meio da qual o resíduo 325° de leucina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de fenil-alanina, e o resíduo 347° de valina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de metionina, (c) mutação por meio da qual o resíduo 323° de glicina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de ácido aspártico, e o resíduo 347° de valina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de metionina, (d) mutação por meio da qual o resíduo 325° de leucina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de fenil-alanina, e o resíduo 345° de serina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de leucina, (e) mutação por meio da qual o resíduo 323° de glicina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de ácido aspártico, e o resíduo 358° de serina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de leucina, (f) mutação por meio da qual o resíduo 344° de treonina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de metionina, (g) mutação por meio da qual o resíduo 250° de ácido glutâmico está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de lisina, (h) mutação por meio da qual o resíduo 346° de ácido glutâmico está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de lisina, e o resíduo 347° de leucina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de fenil-alanina, (i) mutação por meio da qual o resíduo 250° de ácido glutâmico está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de lisina, e o resíduo 364° de treonina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de metionina, (j) mutação por meio da qual o resíduo 202° de ácido aspártico está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de glicina, e o resíduo 321° de serina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de prolina, (k) mutação por meio da qual o resíduo 283° de arginina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de serina, o resíduo 333° de alanina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de treonina, o resíduo 338° de serina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de treonina, o resíduo 346° de ácido glutâmico está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de ácido aspártico, e o resíduo 414° de asparagina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de serina ou (l) mutação por meio da qual o resíduo 318° de metionina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de lisina, o resíduo 32P de serina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de prolina, o resíduo 328° de valina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de fenil-alanina, o resíduo 349° de valina está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de glicina, e o resíduo 405° de ácido glutâmico está substituído por um outro resíduo de aminoácido, preferivelmente por um resíduo de valina. O DNA codificador de AKIII de tipo selvagem não está particularmente limitado. Um DNA codificador de AKIII derivado de bactérias do gênero Escherichia, por exemplo, Escherichia coli é mencionado. Especificamente, um DNA codificador da seqüência de aminoácidos representada pela Seqüência No. 1, e em adição pela seqüência representada pela Base Nos. 584 a 1930 na seqüência base representada pela Seqüência No. 1 são mencionados. AKIII de Escherichia coli é codificada no gene lvsC.

Das seqüências citadas acima, a seqüência possuindo a mutação da seqüência base para causar a substituição de resíduo de aminoácido é o DNA codificador de AKIII mutante da presente invenção. Um tipo de um códon correspondendo ao resíduo de aminoácido substituído não está particularmente limitado desde que ele codifique aquele resíduo de aminoácido. A seqüência de aminoácidos de AKIII de tipo selvagem varia ligeiramente dependendo das bactérias ou cepas. A seqüência possuindo substituição, eliminação ou inserção de resíduo de aminoácido na posição que não participa da atividade enzimática também está incluída no gene AKIII mutante da presente invenção.

Por exemplo, a seqüência base (Seqüência No. 1) do gene lvsC de tipo selvagem obtida no exemplo 1 é diferente, em termos de 6 sítios, da seqüência base de lvsC de cepa K-12 de Escherichia coli que já foi tomada pública [Cassan, M., Parsot. C., Cohen, G.N., e Patte, J. C., J. Biol. Chem. 261. 1052 (1986)]. Os resíduos de aminoácido a serem codificados são diferentes em termos de 2 sítios dentre os 6 sítios (em lysC da cepa JC411, o 58° resíduo de glicina, contado a partir da terminação N, está substituído por um resíduo de glicina e o resíduo 401° de glicina está substituído por um resíduo de alanina na seqüência de aminoácidos de lvsC representada pela Seqüência No. 1. Se qualquer uma das mutações acima citadas a) a 1) for introduzida no lvsC possuindo a mesma seqüência de lvsC de cepa JC411 de Escherichia coli, espera-se obter lvsC possuindo mutação por meio da qual retro-inibição com L-lisina é liberada. O DNA codificador de AKIII mutante na qual a retro-inibição com lisina está liberada é obtido como segue. Primeiro, um DNA contendo gene AKIII de tipo selvagem ou gene AKIII possuindo outra mutação é submetido à mutação in vitro, e o DNA mutante é ligado em um DNA vetor adaptável em um hospedeiro para formar um DNA recombinante. O DNA recombinante é introduzido dentro de um microorganismo hospedeiro para obter um transformante. Quando o transformante que chega a expressar a AKIII mutante é selecionado, este transformante retém o gene mutante. Em adição, um DNA contendo gene AKIII de tipo selvagem ou gene AKIII possuindo outra mutação é ligado em um DNA vetor adaptável em um hospedeiro para formar um DNA recombinante. O DNA recombinante é depois submetido à mutação in vitro, e o DNA mutante é introduzido dentro de um microorganismo hospedeiro para obter um transformante. Quando o transformante que chega a expressar a AKIII mutante é selecionado, este transformante também retém o gene mutante. Altemativamente, também é possível que um microorganismo produtor de uma enzima de tipo selvagem seja submetido à mutação para formar uma cepa mutante produtora de uma enzima mutante, e um gene mutante é depois obtido desta cepa mutante.

Como um agente para mutação direta de um DNA, é mencionada hidroxil-amina ou semelhante. Hidroxil-amina é um agente de mutação química que causa a mutação de cisteína para timina mudando a citosina para N4-hidróxi-citosina. Em adição, quando um microorganismo for propriamente submetido à mutação, é realizada irradiação com luz ultravioleta ou tratamento com um agente de mutação ordinariamente empregado em mutação artificial, tal como N-metil-N’-nitro-N-nitroso-guanidina (NTG).

Como bactérias doadoras de DNA contendo gene AKIII de tipo selvagem ou gene AKIII possuindo outra mutação, quaisquer microorganismos pertencentes ao gênero Escherichia podem ser utilizados. Especificamente, aqueles descritos nos Documentos de F.C. Neidhardt et al. (Neidhardt, F.C. et al, Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., p. 1208, tabela 1) encontram-se disponíveis. Seus exemplos são cepa JM109 de Escherichia coli e cepa MC1061 de Escherichia coli. (1) Procura de gene AKIII de tipo selvagem: Um exemplo de procura de um DNA contendo gene AKIII é descrito abaixo. Primeiro, por exemplo, cepa MC 1061 de Escherichia coli de tipo selvagem possuindo lvsC é incubada para obter uma cultura. O microorganismo citado acima pode ser incubado através de cultura sólida usual. Tendo em vista uma eficiente coleção de células, é preferível o emprego de cultura líquida. Neste caso, o meio de cultura é, por exemplo, um obtido pela adição de um ou mais tipos de sais inorgânicos selecionados de mono-hidrogeno-fosfato de potássio, di-hidrogeno-fosfato de potássio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, cloreto de magnésio, cloreto ferroso, sulfato ferroso e sulfato de manganês em uma ou mais fontes de carbono selecionadas de extrato de levedura, peptona, extrato de carne, licor de infusão de milho e feijão-soja ou efluente de trigo, e adicionando depois dentro do meio quantidades adequadas de um material inicial de sacarídeo, vitamina e semelhantes de acordo com o desejado. E adequado ajustar o pH inicial do meio de cultura para entre 6 e 8. A incubação é conduzida de 30 a 42°C, preferivelmente em aproximadamente 37°C por 4 a 24 horas através de cultura com agitação aérea submersa, de cultura com agitação ou de cultura estacionária. A cultura assim obtida é separada, por exemplo, a 3.000 rpm por 5 minutos para obter a cepa MC 1061 de Escherichia coli. Um DNA cromossômico pode ser obtido desta cepa, por exemplo, pelo processo de Saito e Miura [Biockem. Biophys. Acta. 22, 619, (1963)] ou pelo processo de K.S. Kirby [Biochim. J. 64,405 (1956)].

Com o objetivo de isolar o gene AKIII do DNA cromossômico resultante, é preparada uma biblioteca de DNA cromossômico.

Primeiro, o DNA cromossômico é parcialmente clivado com uma endonuclease de restrição apropriada para obter misturas de vários fragmentos. Se o grau de divagem for controlado pelo controle de um tempo de divagem ou semelhante, é formada uma ampla variedade de misturas de fragmentos. Por exemplo, o DNA cromossômico é reagido com frau 3AI em uma concentração enzimática de 1 a 10 unidades/mL em uma temperatura de 30°C ou mais elevada, preferivelmente a 37°C por um período de tempo de 1 minuto a 2 horas para digerir o DNA cromossômico.

Depois, o fragmento clivado de DNA cromossômico é ligado em um DNA vetor capaz de sofrer replicação autonômica dentro de células de bactérias do gênero Escherichia para formar um DNA recombinante. Especificamente, um DNA vetor é reagido com uma endonuclease de restrição que permite a formação da mesma seqüência base terminal como a da endonuclease de restrição £au 3AI empregada na divagem do DNA cromossômico, por exemplo, Bam HI em uma concentração enzimática de 1 a 100 unidades/mL em uma temperatura de 30°C ou mais elevada por 1 hora ou mais, preferivelmente de 1 a 3 horas para digerir completamente o DNA vetor, clivando-o. Subseqüentemente, a mistura de fragmentos de DNA cromossômico obtida é misturada com o DNA vetor clivado. A mistura é reagida com uma DNA-ligase, preferivelmente com T4-DNA-ligase em uma concentração enzimática de 1 a 100 unidades/mL em uma temperatura de 4 a 116°C por 1 hora ou mais, preferivelmente de 6 a 24 horas para formar um DNA recombinante.

Um microorganismo do gênero Escherichia, por exemplo, cepa K-12 de Escherichia coli, preferivelmente uma cepa totalmente deficiente em AKI, AKII e AKIII, por exemplo, cepa GT3 de Escherichia coli [que pode ser obtida de Escherichia coli de Genetic Stock Center (Connecticut, U.S.A.)] é transformada para preparar a biblioteca de DNA cromossômico. A transformação pode ser realizada pelo processo de D.M. Morrison [Methods in Enzymology Μ, 326, (1979)] ou por um processo no qual é aumentada a permeabilidade de um DNA pelo tratamento de células de bactérias recipientes com cloreto de cálcio [Mandei, M. e Higa, A., J. Mol. Biol. £2,159 (1970)].

Uma cepa possuindo um DNA recombinante de gene AKIII é obtida de uma cepa possuindo uma atividade AKIII aumentada ou de uma cepa na qual auxotrofia causada pela eliminação de gene AKIII foi iniciada na biblioteca de DNA cromossômico resultante. Por exemplo, quando um mutante completamente deficiente em AK é empregado como um hospedeiro, uma cepa recombinante que pode crescer em um meio livre de L-lisina, L-treonina, L-metionina e ácido diamino-pimélico ou em um meio de cultura livre de homo-serina e de ácido diamino-pimérico, e o DNA recombinante é recuperado desta cepa, tomando possível obter um fragmento de DNA contendo o gene AKIII. Um extrato celular é preparado a partir de uma cepa candidata, e uma solução de enzima bruta é formada a partir do extrato celular. Então, a atividade AKIII é identificada. A atividade enzimática de AKIII pode ser medida pelo processo de E.R. Stadman [Stadman, E. R., Cohen, G.N., LeBras, G., e Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem. 236 (1961)].

Um DNA recombinante obtido pela inserção de DNA contendo o gene AKIII dentro do DNA vetor pode ser isolado por exemplo pelo processo de P. Guerry et al., (J. Bacteriol. 116,1064 (1973)] ou pelo processo de D.B. Clewell (J. Bacteriol. Π0,667, (1972)].

Gene AKIII de tipo selvagem também é obtido pela preparação de um DNA cromossômico de uma cepa possuindo gene AKIII em um cromossoma pelo processo de Saito e Miura, e por amplificação do gene AKIII através de reação de polimerase em cadeia [PCR, White, T., J., et al, Trends Genet. 2, 185 (1989)]. Um iniciador de DNA empregado na amplificação é um complementar de ambas as terminações 3’ de um filamento duplo de DNA contendo a região completa do gene AKIII ou uma sua parte. Quando apenas uma parte da região do gene AKII é amplificada, é necessário selecionar um fragmento de DNA contendo a região completa proveniente da biblioteca de DNA cromossômico empregando o fragmento de DNA possuindo a parte da região de AKIII como um iniciador. Quando a região completa do gene AKIII é amplificada, a solução PCR contendo o fragmento de DNA possuindo o gene AKIII amplificado é submetida à eletroforese em gel de agarose, e um fragmento de DNA desejado é depois extraído, por meio do qual o fragmento de DNA contendo o gene AKIII pode ser recuperado. O iniciador de DNA pode ser formado apropriadamente tendo por base, por exemplo, a seqüência conhecida de Escherichia coli [Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N. e Patte, J. Biol. Chem. 2M, 1052 (1986)]. Um iniciador capaz de amplificar uma região composta de 1.347 bases codificadoras de gene lvsC é apropriado. Por exemplo, dois tipos de iniciadores representados pelas Seqüências Nos. 2 e 3 são apropriados. Um iniciador de DNA pode ser sintetizado por um processo usual, por exemplo, por um processo de fosfoamidida [Tetrahedron Letters 22, 1859 (1981)] usando um sintetizador de DNA comercialmente disponível (por exemplo, um sintetizador de DNA modelo 380B fabricado pela Applied Biosystems).

Depois, PCR pode ser conduzida por um processo indicado por um fornecedor usando um dispositivo de PCR comercialmente disponível (DNA Thermal Cycler Model PJ2000 fabricado pela Takara Shuzo Co., Ltd.) e uma TaqDNA polymerase (fornecida pela Takara Shuzo Co., Ltd.) Gene AKIII amplificado por PCR é ligado em um DNA vetor capaz de sofrer replicação autonômica em células de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia e é introduzido dentro de células de bactérias do gênero Escherichia, por meio do qual a introdução da mutação no gene AKIII pode ser facilmente conduzida. O vetor de DNA, a transformação e a identificação da presença de gene AKIII são os mesmos como os descritos acima. (2) Introdução de mutação no gene AKIII: O gene AKIII obtido acima é submetido à mutação tal como substituição, inserção ou eliminação de resíduo de aminoácido por meio do processo de PCR recombinante [Higuchi, R. 61, em PCR Technology (Erlich, Η. A., Eds., Stockton Press (1989)], de um processo de mutação sítio-específica [Kramer, W. e Frits, H. J., Methods in Enzymology 154, 350 (1987); Kunkel, T.A. et ai, Methods in Enzymology 154, 367 (1987Q, ou semelhante. Estes processos podem causar a mutação desejada no sítio almejado. A mutação ou mutação aleatória pode ser introduzida no sítio desejado por meio de um processo de síntese química de um gene almejado.

Em adição, há um processo no qual o gene AKIII em um cromossomo ou um plasmídeo é diretamente tratado com hidroxil-amina [Hashimoto, T. e Sekiguchi, M., 1 Bacteriol. 152, 1039 (1984)]. Ainda mais, um processo no qual bactérias do gênero Escherichia contendo o gene AKIII são irradiadas com luz ultravioleta ou um processo que emprega um agente químico tal como N-metil-N’-nitroso-guanidina ou ácido nitroso podem ser empregados. A mutação pode ser introduzido aleatoriamente por intermédio destes processos.

Um processo de seleção de gene AKIII mutante é descrito abaixo. Isto é, primeiro, um DNA recombinante contendo gene AKIII mutante é transformado dentro de uma cepa completamente deficiente em AKIII, por exemplo, a cepa G3 de Escherichia coli. Depois, o transformante é incubado em um meio mínimo, por exemplo, M9, contendo uma quantidade considerável de L-lisina. Como apenas a AK é inibida com L-lisina em uma cepa possuindo um DNA recombinante contendo o gene AKIII de tipo selvagem, L-treonina, L-isoleucina, L-metionina e ácido diamino-pimerínico (DAP) não podem ser sintetizados, controlando o crescimento da mesma. Entrementes, uma cepa possuindo um DNA recombinante contendo o gene AKIII mutante no qual inibição com L-lisina está liberada tem que crescer em um meio mínimo constituído de uma quantidade considerável de L-lisina. Por intermédio da utilização deste fenômeno, é possível selecionar uma cepa resistente à L-lisina ou à S-2-amino-etil-cisteína (AEC) análoga à L-lisina no crescimento, a saber, uma cepa possuindo um DNA recombinante contendo o gene AKIII mutante no qual a inibição está liberada. O gene recombinante assim obtido como um DNA recombinante é introduzido em um microorganismo adequado (hospedeiro), e expressado para ser capaz de obter um microorganismo apresentando AKIII no qual retro-inibição está liberada.

Como o hospedeiro, microorganismos pertencentes ao gênero Escherichia são os preferidos. Por exemplo, Escherichia coli (E. coli) é mencionada.

Em adição, pode ser empregada uma substância obtida por meio da obtenção de um fragmento de gene AKIII mutante proveniente de um DNA recombinante e por intermédio da inserção do mesmo dentro de outro vetor. Como o DNA vetor que pode ser empregado na presente invenção, um DNA vetor-plasmídeo é o preferido. Exemplos dos mesmos incluem pUC19, pUC18, pBR322, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 e pMW218. Um vetor de DNA de fago e um vetor transposon também encontram-se disponíveis.

Com o objetivo de expressar eficientemente o gene AKIII mutante, outro promotor que atua dentro de microorganismos tal como kc, irp e PL pode ser ligado em uma região a montante de um DNA codificador de AKIII mutante. Ou, um promotor contido no gene AKIII é usado como tal sendo amplificado.

Como mencionado acima, a substância obtida pela inserção do gene mutante dentro do DNA vetor capaz de sofrer replicação autonômica pode ser introduzida dentro de um hospedeiro, e retida dentro dele como um DNA extracromossômico como um plasmídeo. Ou, o gene mutante pode ser inserido dentro de um cromossomo de um microorganismo hospedeiro por intermédio de transdução, com um transposon (Berg, D.E. e Berg, C.M., Bio/Technol. 1, 417 (1983)], com fago Mu [publicação japonesa (Kokai) No. 109.985/1990] ou através de recombinação complementar [Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Labor Lab. (1972)]. <3> Produção de L-amino-ácido de acordo com a presente invenção: Um L-amino-ácido pode ser produzido com uma boa eficiência pela incubação, em um meio de cultura apropriado, de bactérias do gênero Escherichia que foram transformadas pela introdução de gene AKIII mutante obtido acima, pela produção e pelo acúmulo de um L-amino-ácido na cultura, e pela coleção do L-amino-ácido da cultura.

As bactérias do gênero Escherichia contendo AK nas quais a retro-inibição com L-lisina está liberada, incluem bactérias do gênero Escherichia que estão transformadas pela inserção de um DNA codificador de AKIII possuindo mutação para liberar a retro-inibição com L-lisina em um DNA cromossômico, e bactérias do gênero Escherichia que estão transformadas pela introdução dentro das células de um DNA recombinante formado por intermédio de ligação de DNA mencionado acima em um DNA vetor capaz de sofrer replicação autonômica em células de bactérias do gênero Escherichia. Adicionalmente, mutantes de bactérias do gênero Escherichia que permitem a produção de AKIII mutante por mutação de células de bactérias do gênero Escherichia também encontram-se disponíveis.

Com relação às bactérias do gênero Escherichia que são usadas como um hospedeiro para a transformação, quaisquer bactérias podem ser empregadas se um promotor de gene AKIII mutante ou outro promotor para expressar este gene atuar dentro das células das mesmas. Ou, quando o gene AKIII mutante for introduzido dentro de um plasmídeo como um DNA extracromossômico, quaisquer bactérias podem ser utilizadas se uma origem de replicação de um DNA vetor usado para a introdução puder atuar dentro de suas células e puder ser replicada. 0 meio de cultura empregado para incubar o microorganismo possuindo o gene mutante de acordo com a presente invenção é um meio de cultura comum contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, íons inorgânicos e outras substâncias orgânicas de acordo com o desejado.

Exemplos de fonte de carbono incluem sacarídeos tais como glicose, lactose, galactose, frutose e um hidrolisado de amido; álcoois tais como glicerol e sorbitol; e ácidos orgânicos tais como ácido fumárico, ácido cítrico e ácido succínico.

Exemplos de fonte de carbono [sic] incluem sais inorgânicos de amônio tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio e fosfato de amônio; um hidrolisado de feijão-soja; amônia gasosa e amônia aquosa.

Como uma fonte de nutriente orgânico, é recomendável conter uma quantidade adequada de uma substância necessária tal como vitamina B, ou L-isoleucina, ou um extrato de levedura. Em adição, fosfato de potássio, sulfato de magnésio, íons de ferro e íons de manganês são adicionados em pequenas quantidades de acordo com o desejado. A incubação é conduzida aerobicamente por 16 a 72 horas. A temperatura de incubação se encontra entre 25°C e 45°C. O pH é ajustado para entre 5 e 8 durante a incubação. Uma substância alcalina ou ácida, orgânica ou inorgânica e mais uma amônia gasosa podem ser empregados para ajustar o pH.

Um L-amino-ácido pode ser usualmente colhido do líquido de fermentação por intermédio de um processo de ligação com uma resina trocadora de íons, de processo de precipitação ou de outros processos conhecidos.

Exemplos: A presente invenção é ilustrada mais especificamente tendo por referência os seguintes exemplos.

Exemplo 1: Procura de gene AKIII mutante (1): <1> Clonagem de gene AKIII de tipo selvagem: A seqüência base de gene AKIII de Escherichia coli (lvsC) já foi relatada [Cassan, M, Parsot, C., Cohen, G.N., e Patte, J.C., J. Biol Chem. 261. 1052 )1986)]. E sabido que a fase de leitura aberta (ORF, open reading frame) é composta de 1.347 pares de base, codificadores de uma proteína composta de 449 resíduos de aminoácidos. Este gene apresenta um operador, e sofre supressão com L-lisina. Por conseguinte, com o objetivo de remover esta região operadora, a seqüência SD e a região contendo apenas a ORF foram amplificadas através de PCR, e clonadas. O DNA genômico completo da cepa MC 1061 de Escherichia coli foi produzido pelo processo de Saito e Miura [Biochem. Biophys. Acta. 12, 619, (1963)], e dois tipos de iniciadores possuindo seqüências representadas pelas Seqüências Nos. 2 e 3 foram formados. PCR foi conduzida pelo processo de H.A. Erlich et al, [PCR Technology, Eds., Stockton Press (1989)] usando o mesmo para amplificar o gene AKIII. O DNA resultante foi digerido com Bam HI e Asê I, depois teve sua extremidade igualada [blunt ended], e foi inserido dentro de um sítio de Sma I de um vetor de baixa cópia pMW119 para o constructo pMLYSC2. Este sítio Smâ I está localizado a jusante de um promotor lacZ presente dentro do vetor. Quando um DNA recombinante obtido pela inserção de um fragmento de DNA dentro do sítio Sma I de pMW119 é introduzido dentro de Escherichia coli, o fragmento de DNA inserido é transcrito através de transcrição por meio do controle do promotor lacZ (figura 1). <2> Clonagem de gene AKIII mutante: Plasmídeos possuindo gene AKIII mutante, ou seja, pLYSCl*80, pLYSCl* 117 e pLYSCl*126, como descrito nos folhetos de publicação internacional W094/11517 e WO95/16042 foram digeridos com Eco RI e Hind III para cortar fragmentos de DNA contendo o gene AKIII mutante. Estes fragmentos foram inseridos dentro de um sítio Eco RI - Hind III de pMW119 para construir plasmídeos designados por pMLYSC2*80, pMLYSC2*l 17 e pMLYSC2*126, respectivamente. O plasmídeo pLYSC*80 pode ser produzido a partir de pLLC*8 de acordo com a descrição do folheto de publicação internacional W094/11517. Uma cepa obtida pela introdução de pLLC*80 dentro de cepa HB101 de Escherichia coli foi chamada de AJ12750. Ela foi depositada no National Institute of Bioscience e Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (No. 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, 305) sob o No. de depósito FERM P-13136 de 1 de setembro de 1992. Esta cepa foi transferida para o depósito internacional de acordo com o Tratado de Budapeste de 4 de novembro de 1993 e recebeu o novo número de depósito FERM BP-4462. pLYSC2*117 e pLYSC2*126 ainda não foram depositados. Entretanto, como seus pontos de mutação estão descritos no folheto de publicação internacional W094/11517, eles podem ser facilmente preparados empregando pLYSCl*80 como o material inicial. <3> Estudo sobre as condições de seleção de novo gene ΑΚΙΠ mutante: Um transformante obtido pela introdução de pMLYSCl em uma cepa totalmente deficiente em AK, Escherichia coli GT3 (thrAlOlób. metLM1005. lysC1004) foi designado como GT3/pMLYSC2. Igualmente, GT3/pMLYSC2*80, GT3/pMLYSC2*117 e GT3/pMLYSC2*126 foram obtidos. Cepa GT3/pMLYSC2 apresenta um plasmídeo contendo lvsC de tipo selvagem, e AKIII codificada em lvsC deste plasmídeo é apenas AK. Como AKIII de tipo selvagem que é apenas AK na presença de uma quantidade considerável de L-lisina em meio mínimo está inibida com L-lisina, L-treonina, L-isoleucina, L-metionina e ácido diamino-pimerínico (DAP) não podem ser sintetizados suprimindo seu crescimento. Com a expectativa de que uma cepa contendo plasmídeo possuindo lvsC mutante na qual inibição com L-lisina está liberada, possa crescer em meio mínimo contendo uma quantidade considerada de L-lisina, uma cepa possuindo uma resistência à L-lisina no crescimento foi selecionada, e uma cepa apresentando um plasmídeo contendo lvsC na qual inibição com L-lisina foi liberada, foi assim selecionada. Cepa GT3/pMLYSC2, cepa GT3/pMLYSC2*80, cepa GT3/pMLYSC2*117 e cepa GT3/pMLYSC2*126 foram incubadas em meio mínimo de placa de ágar contendo L-lisina em várias concentrações para examinar a concentração inibidora de crescimento e as condições de seleção de cepas contendo plasmídeo. O crescimento dos transformantes em meio mínimo em placa de ágar contendo L-lisina em várias concentrações está mostrado na tabela 1. Na tabela 1, + indica que um transformante cresceu, ± indica que um transformante cresceu ligeiramente, e - indica que o transformante não cresceu.

Tabela 1: Concentração de L-lisina e crescimento: O crescimento da cepa GT3/pMLYSC2 possuindo lvsC de tipo selvagem foi completamente suprimido na área de adição contendo L-lisina 0,2 M. Adicionalmente, os crescimentos da cepa GT3/pMLYSC2*80, da cepa GT3/pMLYSC2*117 e da cepa GT3/pMLYSC2*126 possuindo lvsC mutante que são bem conhecidas também foram quase completamente suprimidos na área de adição contendo L-lisina 0,4 M. Conseqüentemente, foi sugerido que um mutante possuindo um grau ainda mais elevado de liberação de inibição do que o de lvsC mutante conhecido até agora pareceu provavelmente ser obtido através de seleção na área de adição contendo L-lisina 0,4 M.

Foi identificado que esta inibição de crescimento foi eliminada através da adição simultânea de homo-serina e de ácido diamino-pimerínico.

No teste de introdução da mutação, um meio mínimo de ágar, Μ9, contendo L-lisina 0,4 M foi usado na seleção de uma cepa contendo plasmídeo possuindo lvsC mutante. Este meio é chamado de meio seletivo no exemplo 1. <4> Mutação do gene AKIII e procura de gene ΑΚΠΙ mutante: Dois processos, a saber, um processo de mutação in vitro no qual um plasmídeo é diretamente tratado com hidroxil-amina e um processo de mutação por PCR para proporcionar várias mutações na expectativa de mutações diferentes do que a mutação de citosina para timina com hidroxil-amina foram empregados na introdução de mutação no plasmídeo pMLYSCl.

Dois microgramas de pMLYSC2 foram tratados em hidroxil-amina 0,4 M [uma solução contendo 100 pL de uma mistura de KH2P04 0,1 M e EDTA 1 mM (pH 6,0) e uma mistura de hidroxil-amina 1 M e EDTA 1 mM (pH 6,0) e DNA 2 pg, foi ajustada para um total de 200 pL com adição de água] a 75°C por 1 a 4 horas. O DNA assim tratado foi purificado com um pó de vidro, e depois introduzido dentro de uma cepa GT3 de Escherichia coli completamente deficiente em AK. O transformante resultante foi espalhado sobre um meio completo (contendo caldo L 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCL 0,5%, ampicilina 50 mg/L e ágar 1,5%) para formar colônias. As colônias foram replicadas em um meio seletivo, e as cepas capazes de crescer no meio seletivo foram selecionadas como cepas candidatas.

Mutação aleatória através de PCR foi conduzida pelo processo de C.Cadwell et al. [Cadwell, C., e G.F. Joyce, PCR Methods Applic. 2, 28, (1982)]. Isto é, um fragmento lvsC foi amplificado pelo processo citado acima usando pMLYSC2 e iniciador universal Ml3. Este fragmento foi digerido com Eco RI e Hind III, e depois inserido em um sítio de Eco RI - Hind III de pMW119 para introduzir o mesmo dentro de cepa GT3 de Escherichia coli completamente deficiente em AK. O transformante foi espalhado em um meio completo (contendo caldo L 1%, bacto-triptona 0,5%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 0,5%, ampicilina 50 mg/L e ágar 1,5%) para formar colônias. As colônias foram replicadas no meio seletivo, e as cepas capazes de crescer no meio seletivo foram selecionada como cepas candidatas.

Os plasmídeos foram recuperados de um total de 47 cepas candidatas obtidas acima, ou seja, 44 cepas resultantes de mutação com hidroxil-amina, 3 cepas resultantes de mutação aleatória através de PCR. As seqüências bases de lvsC mutante foram determinadas, e os pontos de mutação foram identificados. A determinação de seqüências bases foi conduzida por um processo usual empregando um DNA sequencer ABI Model 373A (fornecido pela ABI). Como um resultado, cepas AKIII mutantes possuindo 4 tipos (Nos. 1,6, 14 e 21) de pontos de mutação puderam ser obtidas das cepas resultantes da mutação com hidroxil-amina, e cepas AKIII mutantes possuindo 3 tipos (Nos. 28, 29 e 30) de pontos de mutação das cepas resultantes da mutação aleatória através de PCR puderam ser obtidas (tabela 2).

Tabela 2: Estes sete plasmídeos (pMLYSC2*Yl, pMLYSC2*Y6, pMLYSC2*Y14, pMLYSC2*Y21, pMLYSC2*Y28, pMLYSC2*Y29 e pMLYSC2*Y30) foram introduzidos dentro da cepa GT3 completamente deficiente em AK, e os extratos livres de célula foram preparados a partir dos transformantes. A atividade enzimática de AKIII foi medida usando os mesmos. A produção de extratos livres de células e a medição da atividade enzimática de AKIII foram conduzidos pelo processo de E.R. Stadman et al. [Stadman, E. R, Cohen, G.N., LeBras, G., e Robichon-Szulmajster, H., J. Biol Chem. 226 (1961)]. Em adição, na medição da atividade enzimática de AKIII, L-lisina em várias concentrações foi adicionada na solução de reação enzimática para examinar o grau de liberação de inibição com L-lisina. Os resultados são mostrados na tabela 3. O grau de liberação de inibição refere-se a uma razão de uma atividade de AK residual na presença de L-lisina 0,4 M para uma atividade de AK na ausência de L-lisina.

Tabela 3: Como é evidente a partir dos resultados mencionados acima, AKIII mutante que apresentou maior grau de liberação de inibição do que o da AKIII mutante típica convencional (AKIII mutante codificada em pMLYSC2*80 e pMLYSC2*117) pode ser obtida pelo processo de seleção usado nesta vez. Uma atividade específica baseada na proteína total é usualmente influenciada pela condição de crescimento das células ou pela preparação das amostras. A atividade específica delas foi igual àquela do tipo selvagem e àquela dos mutantes convencionais, e não foi observado quase nenhum decréscimo na atividade pela introdução de mutação. Conseqüentemente, era esperado que o centro de atividade de AKIII e o seu sítio de controle com L-lisina fossem mutuamente independentes.

Exemplo-2: Procura do gene AKIII mutante (2): O gene lvsC no qual a 358° Ser foi substituída pela Leu foi preparado introduzindo a mutação sítio-específica empregando um LA PCR in vitro Mutagenesis Kit (fornecido pela Takara Shuzo Co., Ltd.). Nesta vez, pLYSCl, descrito nos folhetos de publicação internacional W094/11517 e WO95/16042, foi utilizado como um molde, e o iniciador, descrito na Tabela de seqüência n. 4, foi empregado como um iniciador para a introdução de mutação, respectivamente. Ambas as terminações de um fragmento de amplificação por PCR foram crivadas com Eefi RI e Hind III, e o fragmento clivado foi ligado em um fragmento obtido pela divagem de pUC19 com Eçp RI e Hind III de pUC19 para formar pLYSC358L. O gene AKIII mutante na qual a 354° Ser foi mudada para Ile ou Vai foi preparado no modo descrito acima exceto que o iniciador mencionado na tabela de seqüência n. 5 ou 6 foi usado como um iniciador. Este gene foi ligado em um fragmento obtido pela divagem de pUC19 com Eco RI e Hind III. Assim, pLYSC345I e pLYSC354V foram formados.

Fragmentos contendo lvsC que foram obtidos pela divagem de pLYSCl*48, pLYSCl*117, pLYSCl*126, pLYSCl*150 e pLYSCl*158 com Eco I e Hind III foram inseridos em um sítio de divagem Eçq - Hind III de pUC19, e os fragmentos resultantes foram chamados de pLYSC2*48, pLYSC2*l 17, pLYSC2*126, pLYSC2*150 e pLYSC2*158, respectivamente. Folhetos de publicação internacional W094/11517 e WO95/16042 descrevem a estrutura de pLYSCl e os sítios dos pontos de mutação de pLYSCl*48, pLYSCl* 117, pLYSCl*126, pLYSCl*150 e pLYSCl*158. Por conseguinte, estes plasmídeos podem ser preparados a partir do pLYSCl*80 mencionado acima.

Subseqüentemente, o gene lvsC mutante possuindo mutação de dois tipos foi preparado empregando um sítio de divagem £sp I presente nas vizinhanças do centro dos pontos de mutação do lvsC mutante monobásico assim obtido e um sítio de divagem £sp I localizado a jusante do lvsC em pUC19. Isto é, pU2547M foi preparado ligando um fragmento Ssp I contendo um gene lvsC a montante da região do pLYSC2*48 em um fragmento SspI contendo um gene lvsC a jusante da região de pLYSC2*158; pU2347M foi preparado ligando um fragmento Ssp I contendo um gene lvsC a montante da região de pLYSC2*126 em um fragmento SspI contendo um gene lysC a jusante da região de pLYSC2* 158; pU2545L foi preparado ligando um fragmento £sp I contendo um gene lvsC a montante da região de pLYSC2*48 em um fragmento SspI contendo um gene lvsC a jusante da região de pLYSC2*117; pU2358L foi preparado ligando um fragmento £sp I contendo um gene lvsC a montante da região de pLYSC2*126 em um fragmento SspI contendo um gene lvsC a jusante da região de pLYSC358L; pU2345V foi preparado ligando um fragmento £sp I contendo um gene lvsC a montante da região de pLYSC2*126 em um fragmento SspI contendo um gene lysC a jusante da região de pLYSC345V; pU2345I foi preparado ligando um fragmento Ssp I contendo um gene lvsC a montante da região de pLYSC2*126 em um fragmento SspI contendo um gene lysC a jusante da região de pLYSC345I. Como os pontos de mutação de pLYSC2*150 e pLYSC2*126 estão localizados mais a montante do que os sítios de divagem £gs I [sic], lysC mutante dibásico possuindo estes dois pontos de mutação foi preparado como segue. Primeiro, um fragmento de DNA possuindo dois pontos de mutação foi amplificado empregando pLYSC2*126 como um molde, um oligonucleotídeo descrito na tabela de sequência n. 7 como um iniciador e o Kit acima mencionado. Depois, ambos os terminais do fragmento de DNA resultante foram clivados com Eefi RI e Hind III, e ligados em um fragmento obtido pela divagem de pUC19 com Eçq RI e Hind III. O produto assim obtido foi chamado de pU1823D. O grau de liberação de inibição do produto de gene lvsC mutante dibásico (AKIII) relativo à Lys foi medido de acordo com o descrito no exemplo 1. Conseqüentemente, o grau de liberação de inibição de qualquer AKIII mutante dibásica foi mais elevado do que o de AKIII mutante monobásica (tabela 4). Incidentalmente, lvsC mutante em pLYSC582L, pLYSC345I e pLYSC345V é um novo gene mutante. Em cada um destes produtos de gene, a retro-inibição com lisina está liberada, e a ligação com outra mutação melhora mais o grau de liberação de inibição. O produto é também útil como um intermediário para a construção de AKIII mutante dibásica.

Tabela 4;

Exemplo 3: Produção de L-lisina através de fermentação usando uma cepa possuindo introduzido dentro dela um gene DDPS mutante um gene AKIII mutante: O efeito sobre a produção de L-lisina em relação ao gene DDPS mutante e ao gene AKIII mutante está descrito no folheto de publicação internacional WO95/16042. Com o objetivo de melhorar este efeito, gene AKIII mutante obtido no exemplo 1 foi submetido à coexistência com gene DDPS mutante.

Uma cepa obtida pela introdução de plasmídeo RSF24P possuindo gene DDPS mutante, descrito no folheto de publicação internacional WO95/16042, dentro de cepa JM109 de Escherichia coli foi chamada de AJ12395. Ela foi depositada no National Institute of Bioscience e Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (n. 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, 305) sob o número de depósito FERM P-13935 em 28 de outubro de 1993. Esta cepa foi transferida para o depósito internacional de acordo com o Tratado de Budapeste de 1 de novembro de 1994, e recebeu o novo número de depósito FERM BP-4858.

Plasmídeos RSFDY1, RSFDY6, RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30, RSFD2547M, RSFD2347M, RSFD2545L, RSFD2358L, RSFD2345V, RSFD2345I e RSFD1823D, foram preparados como o mostrado na figura 2 a partir de um tipo selecionado de plasmídeos contendo gene AKIII mutante, pMLYSC2*Yl, pMLYSC2*Y6, pMLYSC2*Y14, pMLYSC2*Y21, pMLYSC2*Y28, pMLYSC2*Y29, pMLYSC2*Y30, pU2547M, pU2347M, pU2545L, pU2358L, pU2545V, pU2345IepU1823D.

Plasmídeo RSFD80 descrito no folheto de publicação internacional WO95/16042 foi usado como um controle. Uma cepa obtida pela introdução de plasmídeo RSFD80 em cepa JM109 de Escherichia coli foi chamada de AJ12396. Ela foi depositada no National Institute of Bioscience e Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (η. 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, 305) sob o número de depósito FERM P-13936 em 28 de outubro de 1993. Esta cepa foi transferida para o depósito internacional de acordo com o Tratado de Budapeste de 1 de novembro de 1994, e recebeu o novo número de depósito FERM BP-4859.

Os plasmídeos obtidos acima RSFDY1, RSFDY6, RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30, RSFD2547M, RSFD2347M, RSFD2545L, RSFD2358L, RSFD2345V, RSFD2345I e RSFD1823D foram introduzidos na cepa B-399 em um modo usual para formar cepas produtoras de L-lisina. A produtividade de L-lisina das cepas acima citadas foi avaliada. A avaliação da produtividade de L-lisina também foi conduzida em relação à B-399/RSFD80 como um controle. Um processo de obtenção da cepa B-399 está descrito no folheto de publicação internacional WO95/16042. A incubação foi conduzida em um meio de cultura para produção de L-lisina a 37°C por um tempo de incubação de 48 horas através de agitação de 114 a 116 rpm de acordo com o processo descrito no folheto de publicação internacional WO95/16042. Os resultados estão mostrados na tabela 5.

Tabela 5: Exemplo 4: Produção de L-lisina através de fermentação usando uma cepa possuindo introduzido dentro dela um gene DDPS mutante e um gene ΑΚΠΙ mutante (2): Foi verificado no exemplo 3 que a produtividade de L-lisina pode ser melhorada fazendo com que bactérias do gênero Escherichia possuam gene DDPS mutante e gene AKIII mutante. O teste foi conduzido de modo que este efeito pudesse ser mantido até mesmo quando um hospedeiro fosse mudado.

Cepa W3110 (tvrA) de Escherichia coli foi empregada como um hospedeiro. Cepa W3110 (tvrA) está descrita em detalhe na publicação de patente européia n. 488.424/1992. Publicação de patente européia n. 488.424/1992 descreve um grande número de cepas obtidas pela introdução de um plasmídeo dentro da cepa W3110 (tvrA). Por exemplo, uma cepa obtida pela introdução de plasmídeo pHATerm foi chamada de cepa W3110 (tvrAVpHATerm de Escherichia coli. Ela foi depositada no National Institute of Bioscience e Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (n. 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, 305) em 18 de novembro de 1991 de acordo com o Tratado de Budapeste de 1 de novembro de 1994, e recebeu o número de depósito FERM BP-3653. Cepa W3110 (tvrA) também pode ser obtida removendo o plasmídeo pHATerm desta cepa W3110 (tvrAVpHATerm de Escherichia coli. A remoção do plasmídeo pode ser feita em um modo usual.

Os plasmídeo contendo gene DDPS mutante e gene AKIII mutante obtidos no exemplo 3, ou seja, RSFDY1, RSFDY6, RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30, RSFD2547M, RSFD2347M, RSFD2545L, RSFD2358L, RSFD2345V, RSFD2345I e RSFD1823D, foram introduzidos na cepa W3110 (tvrA) acima obtida, e a produtividade de L-lisina foi avaliada de acordo com o exemplo 3. Como um controle, W3110 (tyrA)/RSFD80 foi produzida pela introdução de RSFD80 na cepa W3110 (tvrA). e a produtividade de L-lisina desta cepa também foi avaliada. Os resultados estão mostrados na tabela 6.

Tabela 6: Exemplo 5: Produção de L-treonina através de fermentação usando uma cepa possuindo introduzido dentro dela um gene AKIII mutante: Como cepa de Escherichia coli produtora de L-treonina, a cepa B-3996 apresenta a produtividade mais elevada dentre aquelas das cepas conhecidas até o presente. Por conseguinte, na avaliação de AKIII mutante foi empregada a cepa B-3996 como um hospedeiro. Esta cepa B-3996 está descrita na patente U.S. 5.175.107 e está listada como depositada no Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding sob o número de depósito BKIIM B-3996. Em adição, um gene AKIII mutante para avaliação, três tipos de genes mutantes (genes AKIII mutantes de RSFDY6, RSFE254M e RSFD1823D) dentre os genes mutantes possuindo a mais elevada produtividade de L-lisina no exemplo 4 foram selecionados, e submetidos ao teste. Primeiro, com o objetivo de aumentar a quantidade de expressão do gene AKIII mutante, gene AKIII mutante presente em pMLYSC2*Y6 foi ligado na região a jusante do promotor lacZ de pUC19 (fornecido pela Takara Shuzo Co., Ltd.). O novo plasmídeo assim formado foi chamado de pLLC*Y6 (figura 3). Visto que em pU2547M e em pU1823D, o gene AKIII mutante está originalmente localizado a montante do promotor lacZ de pUC19 (fornecido pela Takara Shuzo Co., Ltd.), ele foi usado como tal.

Estes plasmídeos foram introduzidos na cepa B-3996 em um modo usual, e a avaliação foi conduzida. A incubação foi realizada pelo processo descrito no folheto de publicação internacional W094/116517. pLLC*Y6, pU2547M e pU1823D foram transformados na cepa B-3996, e os transformantes foram incubados na presença ou na ausência de lisina a 1 g/Litro. A cepa hospedeira B-3996 sozinha e B-3996/pLLC*80 descritas no folheto de publicação internacional W094/11517 foram usadas como controles.

Os resultados estão mostrados na tabela 7. A sensibilidade à lisina na tabela 7 refere-se a uma razão de (rendimento de açúcar consumido na presença de lisina) para (rendimento de açúcar consumido na ausência de lisina). Na cepa B-3996, o decréscimo no rendimento de açúcar consumido na incubação na presença de lisina é de aproximadamente 0,74 em relação àquele na área de incubação na ausência de lisina; e na B-3996/pLLC*80, o decréscimo no rendimento de açúcar consumido na incubação na presença de lisina é de aproximadamente 0,90 em relação àquele na área de incubação na ausência de lisina. Genes AKIII mutantes recentemente obtidos nesta vez são ligeiramente superiores em termos de produtividade de treonina e de sensibilidade à lisina.

Tabela 7: Efeitos da invenção: A presente invenção permitiu a produção de gene AKIII mutante derivado de bactérias do gênero Escherichia por meio da qual retro-inibição com L-lisina está bem liberada. Uma cepa produtora de L-aminoácido que está mais melhorada do que antes pode ser formada pela introdução do gene acima citado dentro de bactérias do gênero Escherichia. É possível proporcionar um processo para a produção de um L-aminoácido através de fermentação que é superior em relação aos processos convencionais por meio do emprego desta cepa produtora de L-aminoácido.

Breve descrição dos desenhos: Figura 1 ilustra o processo de preparação de pMLYSC2.

Figura 2 ilustra o processo de preparação de plasmídeos da série RSFD.

Figura 3 ilustra o processo de preparação de pLLC*Y6.

LISTAGEM DE SEOÜÊNCIAS (I) Dados do Requerente: a) AJINOMOTO CO., INC. b) 15-1, KYOBASHI1-CHOME, CHUO-KU, TÓQUIO 104, JAPÃO. (II) Dados da Prioridade Unionista: JP 272114/1996, de 15 de outubro de 1996 (III) Título da Invenção: DNA codificador de aspartoquinase III de bactérias pertencentes a Escherichia coli, DNA recombinante, microorganismo transgênico, e, processo para produzir um L-aminoácido. (IV) Número de Seqüências: 7 (V) Formato para leitura em computador: a) Meio: Disquete b) Computador utilizado: IBM PC compatível c) Sistema operacional: PC-DOS/MS-DOS d) Software: Patentln Lançamento # 1.0, Versão # 1.30 (EPO) (I) SEQ ID NO: 1 (II) Características da Seqüência: a) Tamanho: 2147 pares de base b) Tipo: ácido nucléico c) Conformação da fita:dupla d) Topologia: linear (III) Características da Molécula Seqüenciada: a) Tipo: DNA (genômico) (IV) Outras Informações Relevantes: (i) Hipotética: Não (ii) Fonte original: a) Organismo: Escherichia coli b) Cepa: MC 1061 (iii) Característica: a) Aspecto chave: sinal -35 b) Posição: 242..249 c) Processo de determinação: S (iv) Característica: a) Aspecto chave: sinal -10 b) Posição 265..273 d) Processo de determinação: S (v) Característica: a) Aspecto chave: ligação de iniciador b) Posição 536..555 c) Processo de determinação: E (vi) Característica: a) Aspecto chave: ligação de iniciador b) Posição 2128..2147 c) Processo de determinação: E (vii) Característica: a) Aspecto chave: RBS b) Posição 575..578 c) Processo de determinação: S (viii) Característica: a) Aspecto chave: CDS b) Posição 584..1933 c) Processo de determinação: S (ix) Característica: a) Aspecto chave: terminador b) Posição 1941..1968 c) Processo de determinação: S (V) Descrição da seqüência: TCGAAGTGTT TCTGTAGTGC CTGCCAGGCA GCGGTCTGCG TTGGATTGAT GTTTTTCATT GO AGCAATACTC TTCTGATTTT GAGAATTGTG ACTTTGGAAG ATTGTAGCGC CAGTCACAGA 120 AAAATGTGAT GGTTTTAGTG CCGTTAGGGT AATGTTGAGT GTAAACCCTT AGCGCAGTGA 180 AGGATTTATT AGCTGAACTA CTGACCGOCA GGAGTGGATG AAAAATCCGC ATGACCCCAT 240 CGTTGACAAC CGCCCCGGTC ACCCTTTATT TATAAATGTA C1ACCTGGGC TAGCGCAGGC 300 CAGAAGAGGC GCGTTGCCCA AGTAACGGTG TTGGAGGAGG CAGTCCTGTG ATAACACCTG 360 AGGGGGTGCA TCGCCGAGGT GATTGAACGG CTGGCCACGT TCATCATCGG CTAAGGGGGC 420 TGAATCCCCT GGGTTGTCAC CAGAAGCGTT CGCAGTCGGG CGTTTCGCAA GTGGTGGAGC 480 ACTTÇTGGGT GAAAATAGTA GCGAAGTATC GCTCTGCGCC CACCCGTCTT CCGCTCTTCC 540 CTTGTGCCAA GGCTGAftAAT GGATCCCCTG ACACGAGÇTA GTT ATG TCT GAA ATT 505 Met Ser Glu Ile 1 GTT GTC TCC AAA TTT GGC GGT ACC AGC GTA GCT GAT TTT GAC GCC ATG 643 Vai Vai Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Vai Ala Asp Phe Asp Ala Met S 10 15 20 AAC CGC AGC GCT GAT ATT GTG CTT TCT GAT GCC AAC GTG CGT TTA GTT 691 Asn Arg Ser Alá Asp Ile Vai Leu Ser Asp Ala Asn Vai Arg Leu Vai 25 30 35 GTC CTC TCG GCT TCT GCT GGT ATC ACT AAT CfG CTG GTC GCT TTA GCT 739 Vai Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu Vai Ala Leu Ala 40 45 50 GAA GGA CTG GAA CCT GGC GAG CGA TTC GAA AAA CTC GAC GCT ATC CGC 787 GlU Gly Leu Glu pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu AÉp Ala Ile Arg 55 60 65 AAC ATC CAG TTT GCC ATT CTG GAA CGT ÇTG CGT TAC CCG AAC GTT ATC 835 Asn lie Gin. Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr Pro Asn Vai Ile 70 75 80 CGT GAA GAG ATT GAA CGT CTG CTG GAG AAC ATT ACT GTT CTG GCA GAA 883 Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr Vai Leu Ala Glu 85 90 95 100 GCG GCG GCG CTG GCA ACG TCT CCG GCG CTG AGA GAT GAG CTG GTC AGC 931 Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp Glú Leu Vai Ser 10S 110 115 CAC GGC GAG CTG ATG TCG ACC CTG CTG TTT GTT GAG ATC CTG CGC GAA 979 His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Vai Glu lie Leu Arg Glu 120 125 130 CGC GAT GTT CAG GCA CAG TGG TTT GAT GTA CGT AAA GTG ATG CGT ACC 1027 Arg Asp Vai Gin Ala Gin Trp Phe Asp Vai Arg Lys Vai Met Arg Thr 135 140 145 AAC GAC CGA TTT GGT CGT GCA GAG CCA GAT ATA GCC GCG CTG GCG GAA 1.075 Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ma Glu Pr o Asp He Ala Ma Leu Ma Glu ISO 155 160 CTG GCC GCG CTG CAG CTG CTC CCA CGT CTG AAT GAA GGC TTA GTG ATC 1123 Leu Ma Ma Leu Gin Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu Gly Leu Vai Ile 165 170 175 180 ACC CAG GGA TTT ATC GGT AGC GAA AAT AAA GGT CGT ACA ACG ACG CTT 1171 Thr Gin Gly Phe He Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg Thr Thr Thr Leu 185 190 195 GGC CGT G6A GGC AGC GAT TAT ACG GCA GCC TTG CTG GCG GAG GCT TTA 1219 Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ma Ma Leu Leu Ma Glu Ma Leu 200 205 210 CAC GCA TCT CGT GTT GAT ATC TGG ACC GAC GTC CGG GGC ATC TAC ACC 1267 His Ma Ser Arg Vai Asp Ile Trp Thr Asp Vai Pre Gly He Tyr Thr 215 220 225 ACC GAT CCA GGC GTA GTT TCC GCA GCA AAA CGC ATT GAT GAA ATC GCG 1315 Thr Asp Pro Arg Vai Vai Ser Ala Ma Lys Arg Ile Asp Glu XX® Ma 230 235 240 TTT GCC GAA GCG GCA GAG ATG GCA AGT TTT GGT GCA AAA GTA CTG CAT 1363 Phe Ma Glu Ma Ma Glu Met Ma Thr Phe Gly Ala Lys Vai Leu His 245 250 255 260 CCG GCA ACG TTG CTA CCC GCA GTA CGC AGC GAT ATC CCG GTC TTT GTC 1411 Pro Ma Thr Leu Leu Pro Ma Vai Arg Ser Asp He Pro Vai Phe Vai 265 270 275 GGC TCC AGC AAA GAC CCA CGC GCA GGT GGT ACG CTG GTG TGC AAT AAA 1459 Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Má Gly Gly Thr Leu Vai Cys Asn Lys 280 265 290 ACT GAA AAT CCG CCG CTG TTC CGC GCT CTG GCG CTT CGT CGC AAT CAG 150?

Claims (5)

1. DNA codificador de aspartoquinase III de Escherichia coli, correspondente às posições 584 a 1930 da SEQ ID NO; 1, caracterizado por conter as seguintes mutações que liberam a retro-inibição com lisina, por substituição de: a) metionina por isoleucina no resíduo 318 e de glicina por ácido aspártico no resíduo 323; b) leucina por fenilalanina no resíduo 325 e valina por metionina no resíduo 347; c) glicina por ácido aspártico no resíduo 323 e valina por metionina no resíduo 347; d) leucina por fenilalanina no resíduo 325 e serina por leucina no resíduo 345; e) ácido glutâmico por lisina no resíduo 250; f) ácido glutâmico por leucina no resíduo 346 e leucina por fenilalanina no resíduo 374; g) ácido glutâmico por leucina no resíduo 250 e treonina por metionina no resíduo 364; h) ácido aspártico por glicina no resíduo 202 e serina por prolina no resíduo 321; ou i) arginina por serina no resíduo 283, alanina por treonina no resíduo 333, serina por treonina no resíduo 338, ácido glutâmico por ácido aspártico no resíduo 346, e asparagina por serina no resíduo 414.

2. DNA recombinante, caracterizado pelo fato de ser produzido por meio de ligação do DNA como definido na reivindicação 1 com um DNA vetor capaz de replicação autonômica em células bacterianas do gênero Escherichia,

3. Microorganismo transgênico, caracterizado pelo fato de ser do gênero Escherichia contendo o DNA de acordo com a reivindicação 1.

4. Processo para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: incubar o microorganismo transgênico como definido na reivindicação 3 possuindo uma capacidade para produzir um L-aminoácido em um meio de fermentação, produzir e acumular um L-aminoácido na citada cultura, e colher o L-aminoácido da cultura.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é L-lisina ou L-treonina.