CZ304020B6 - Vodorozpustná léciva bránených fenolu - Google Patents

Abstract

Farmaceutické preparáty obsahující vodorozpustné fosfonoxymethylové deriváty fenolu obecného vzorce I, kde R-O- je zbytek farmaceutické slouceniny obsahující definovanou fenolovou skupinu, R.sup.1 .n.je vodík nebo ion alkalického kovu nebo protonizovaný amin nebo protonizovaná aminokyselina, R.sup.2.n..sub. .n.je vodík nebo ion alkalického kovu nebo protonizovaný amin nebo protonizovaná aminokyselina, n je celé císlo 1 nebo 2 nebo její farmaceuticky prijatelné soli. Tyto vodorozpustné proléky farmak lze vyuzít pri príprave farmaceutických preparátu se zvýsenou rozpustností ve vode a tedy i lepsími farmakokinetickými vlastnostmi.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká farmak obsahujících nové vodorozpustné proléky alifatických nebo aromatických bráněných hydroxylových skupin. Obzvláště se tento vynález týká farmak obsahujících nové vodorozpustné fosfonoxymethylethery bráněných fenolů. Vynález se také týká intermediátů užívaných pro výrobu finálních proléků stejně jako farmaceutických přípravků obsahujících nové sloučeniny.

Dosavadní stav techniky

Úspěšné dodání farmaka pacientovi je zásadně důležité při léčení onemocnění. Ovšem, použití mnoha klinických léčiv se známými vlastnostmi je limitováno jejich nízkou vodorozpustností. Jako následek nízké rozpustnosti těchto léků ve vodě musí být tato léčiva formulována ve farmaceutickém vehiculu zahrnujícím korozpouštědlo, včetně surfaktantu. Bylo prokázáno, že tyto surfaktanty vedou k vážným postranním efektům u lidí, což omezuje klinickou bezpečnost těchto léčiv a tedy i léčení vážných onemocnění.

Například, camptothecin je přírodní produkt izolovaný z kůry čínského stromu Camtotheca accuminata. Bylo prokázáno, že má silnou protinádorovou aktivitu u několika in vivo zvířecích modelů včetně hlavních nádorových typů jako je rakovina plic, rakovina prsu, rakovina vaječníků, rakovina slinivky břišní, rakovina tlustého střeva a rakovina žaludku a maligní melanom. Camptothecin inhibuje buněčný enzym DNA topoizomeráza I a spouští kaskádu událostí vedoucích k apoptoze a programové buněčné smrti. Topoizomeráza I je esenciální enzym jádra odpovědný za organizaci a modulaci topologických lysů DNA, takže buňka může replikovat, transkribovat a opravovat genetickou informaci.

Vážným nedostatkem camptothecinu je jeho velmi omezená rozpustnost ve vodě. Pro biologické studie je nezbytné rozpustit sloučeninu v silném organickém rozpouštědle (DMSO) nebo formulovat léčivo jako suspenzi ve směsi Tween 80 : solanka, což je nežádoucí formulace léčiva pro humánní terapii. V nedávné době byly ve Spojených Státech schváleny dva nové analogy camptothecinu se středně dobrou rozpustností ve vodě pro léčení pokročilé rakoviny vaječníků (Hycamtin) a rakoviny tlustého střeva (Camptosar).

Další léčiva, mající stejné problémy jako camptothecin, jsou cyklosporin A (CsA), propofol, etoposid a vitamín E (alfa-tocopherol). Podobně jako camptothecin má CsA ve své struktuře bráněný alkohol, v tomto případě sekundární alkohol. CsA je formulován ve směsi CremophorEL/ethanol.

-1 CZ 304020 B6

Příkladem stericky bráněného, ve vodě špatně rozpustného fenolu, je anestetikum propofol.

Propofol (2,6-diisopropylfenol)

Propofol je formulován pro in vivo klinické použití jako emulze olej ve vodě. Nejenže je propofol špatně rozpustný ve vodě, ale také způsobuje bolest jako vedlejší účinek injekce. Tato bolest musí být vylepšována použitím lídokainu. Vzhledem k tomu, že je formulován jako emulze, je těžké a problematické přidávat do formulace další léčiva a fyzikální změny formulace, jako je zvětšení velikosti olejových částeček, mohou vést např. k embolii plic. Vodorozpustný a chemicky stabilní prolék propofolu by zajišťoval vážné výhody. Formulace by mohla být obyčejným vodným roztokem, který by mohl být smíchán s dalšími léčivy. Je-li samotný prolék bezbolestný, prolék by byl vhodnější pro pacienty, a konečně nebyla by zde žádná toxicita způsobená vehikulem. Další špatně ve vodě rozpustné stericky bráněné fenoly, které jsou protinádorová léčiva, jsou etoposid a vitamín E (alfa-tokoferol).

Tento vynález zajišťuje vodorozpustnou formu léčiv obsahujících alkohol nebo fenol, jako jsou camptothecin a propofol. S ohledem na camptothecin, sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou fosfonooxymethylové ethery camptothecinu ve formě volné kyseliny a jeho farmaceuticky přijatelné soli. Vodorozpustnost kyseliny a jejich solí usnadňuje přípravu farmaceutických formulací. Všechny proléky podle tohoto vynálezu vykazují zvýšenou rozpustnost ve vodě ve srovnání s jejich odpovídajícími matečnými léčivy. Způsoby výroby sloučenin podle tohoto vynálezu mohou být užitečné při konverzi mnoha jiných ve vodě nerozpustných medicinálních činidel, majících aliatické nebo aromatické bráněné hydroxylové skupiny, na vodorozpustné deriváty.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje nové farmaceutické preparáty obsahující vodorozpustné fosfonoxymethylové deriváty fenolu obecného vzorce I,

-2CZ 304020 B6

kde R-O-je zbytek farmaceutické sloučeniny obsahující fenolovou skupinu, vybraný ze skupiny sestávající z propofolu, etoposidu, vitamínu E a alfa-tokoferolu,

R¹ je vodík nebo ion alkalického kovu nebo protonizovaný amin nebo protonizovaná aminokyselina,

R² je vodík nebo ion alkalického kovu nebo protonizovaný amin nebo protonizovaná aminokyselina, a n je celé číslo 1 nebo 2, nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

Výše uvedený vzorec I je derivátem ROH, kde ROH reprezentuje léčivo obsahující fenolickou skupinu, jako je propofol, etoposid, vitamín E a nebo obsahuje α-tokoferol. Když n je 2, ROH je s výhodou farmaceutický přípravek obsahující fenol, jako je propofol. Po intravenosním nebo orálním podání jsou deriváty obecného vzorce I převedeny zpátky na léčiva pomocí hydrolýzy a/nebo fosfatázy.

Předmětem tohoto vynálezu je vývoj derivátů ve vodě nerozpustných léčiv, které vykazují dobrou aktivitu a rozpustnost ve vodě.

Další předmět tohoto vynálezu je vývoj farmaceutických přípravků těchto vodorozpustných sloučenin, které zahrnují množství sloučeniny obecného vzorce I a farmaceuticky přijatelný nosič.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je zajištění derivátů léčiv, majících dobrou stabilitu při úrovních pH vhodných pro tvorbu farmaceutických přípravků, ovšem které se v in vivo fyziologických podmínkách rychle rozpadají aby tak případně fungovaly jako proléky.

Krátký popis vyobrazení

Dále jsou vysvětleny obrázky v tomto vynálezu:

Obrázek 1 ilustruje in vivo enzymatickou konverzi proléku propofolu na propofol.

Obrázek 2 ilustruje koncentrační změny propofolu v krvi v závislosti na době podání proléku propofolu nebo Diprivanu® u studie na psech.

Obrázek 3 ilustruje in vitro enzymatickou konverzi proléku camptothecinu na camptothecin.

Obrázek 4 ilustruje závislost mezi koncentrací camptothecinu v plasmě z proléku camptothecinu a z camptothecinu v organických korozpouštědlech u studie na krysách.

Detailní popis vynálezu

V této přihlášce pokud není uvedeno jinak platí následující definice.

-3CZ 304020 B6 „Fosfono-,, označuje skupinu -P(O)(OH)₂ a „fosfonooxymethoxy“ nebo „fosfonooxymethylether“ označují obecně skupinu -OCH₂OP(O)(OH)2. „Methylthiomethyl“ označuje skupinu -CH₂SCH₃. Tento vynález také obsahuje sloučeniny, kde n = 2 jako je „fosfonodi(oxymethyl)ether“ obecně označující skupinu -OCH₂OCH₂OP(O)(OH)2.

„Camptothecinová skupina“ označuje skupinu obsahující dvacet uhlíkových atomů a čtyři atomy kyslíku jak je vyjádřeno níže uvedeným strukturním vzorcem s absolutní konfigurací.

Systém číslování použitý výše je systém používaný u konvenčních derivátů camptothecinu a je dodržován v celé této přihlášce. Například, označení C20 odkazuje na tom uhlíku označený jako „20“.

„Camptothecinový analog“ označuje sloučeninu mající základní camptothecinovou strukturu. Mělo by být chápáno, že camptothecinová analoga zahrnují sloučeniny obsahující následující sloučeniny (výběr není úplný): Topotecan, dostupný od firmy SmithKline Beecham, Irinotecan (CPT-11), dostupný od firmy Pharmacia & Upjohn, 9-aminocamptothecin (9AC), 9-nitrocamptothecin (9NC), GI 147211C, dostupný od firmy Glaxo Wellcome a DX-8951f (předchozích šest camptothecinových analogů jsou v současné době v klinickém výzkumu ajsou popsány v review provedeném v Pacific West Cancer Fund autorem Claire McDonald (prosinec 1997).

Několik dalších camptothecinových analogů je popsáno v Sawada et al., Current Pharmaceutical Design, Vol. 1, č.l, str. 113-132, stejně jako v US patentech 5 646 159, 5 559 235, 5 401 747, 5 364 858, 5 342 947, 5 244 903, 5 180 722, 5 122 606, 5 122 526, 5 106 742, 5 053 512, 5 049 668,4 981 968 a 4 894 456, které jsou zde zahrnuty jako reference.

Několik farmaceutických sloučenin zahrnujících jejich odpovídající deriváty camptothecinu obsahují více než jednu hydroxylovou skupinu, např. 10-hydroxycamptothecin, topotecan a několik dalších popsaných ve výše uvedených referencích. Mělo by být chápáno, že tento vynález může být aplikován na více než jednu hydroxylovou skupinu. To může být provedeno chráněním další hydroxylové skupiny před derivatizací.

„Fosfino chránící skupina“ označuje skupiny, které mohou být použity k blokování nebo chránění fosfonové funkční skupiny. S výhodou jsou těmito chránícími skupinami takové, které mohou být odstraněny způsoby, které významně neovlivňují zbytek molekuly. Vhodné fosfonooxy chránící skupiny zahrnují například benzylovou (označovaná jako „Bn“), terc-butylovou a allylovou skupinu.

„Farmaceuticky přijatelná sůl“ označuje sůl kovu nebo aminu s kyselou fosfonovou skupinou, ve které kation významně nepřispívá k toxicitě nebo biologické aktivitě aktivní sloučeniny. Vhodné soli kovů zahrnují lithium, draslík, sodík, vápník, barium, hořčík, zinek a soli hliníku. Preferované soli jsou sodné a draselné soli. Vhodné aminové soli jsou například soli amoniaku, tromethaminu, triethanolaminu, ethylendiaminu, glukaminu, N-methylglukaminu, glycinu, lysinu, omithinu, argininu, ethanolaminu, abychom jmenovali alespoň některé. Preferované aminové soli jsou soli lysinu, argininu, N-methylglukaminu a tromethaminu.

-4CZ 304020 B6

V popisu a v nárocích je termín -OCH2OP(O)(OH)₂ zamýšlen pro označení jak volné kyseliny tak i pro označení farmaceuticky přijatelné soli, pokud z kontextu nevyplývá, že je zamýšlena pouze volná kyselina.

Jeden aspekt vynálezu zajišťuje farmaka obsahující deriváty alkoholu nebo fenolu jak je ukázáno ve vzorci I:

Deriváty obecného vzorce I mohou být připraveny podle následující reakční sekvence, zobrazené na Schématu 1:

Schéma 1

O /\

OP(OZ)(OZ) (H) kde ROH reprezentuje léčivo obsahující alkohol nebo fenol, jako je camptothecin, propofol, etoposid, vitamín E, cyklosporin A. Mělo by být chápáno, že výše zmíněná reakční cesta je pouze jedna z alternativních cest. Tyto alternativní cesty budou evidentní po přečtení následujícího popisu a příkladů provedení vynálezu.

Příklad výše uvedeného Schématu 1 může být ilustrován pomocí sloučeniny camptothecin. Mělo by být chápáno, že tato schémata jsou aplikovatelná na další sloučeniny obecného vzorce I podle tohoto vynálezu, které jsou uvedeny výše. Dalším aspektem tohoto vynálezu je zajištění campto25 thecinových derivátů podle obecného vzorce II:

O z⁺

-5CZ 304020 B6 které zahrnují volné kyseliny zde Z je vodík a jejich farmaceuticky přijatelné soli, kde Z je kov nebo amin. Alternativně, vzorec II zahrnuje dikyseliny, kde Z je kov nebo amin v obou výskytech.

Preferované farmaceuticky přijatelné soli sloučeniny obecného vzorce II jsou soli alkalických kovů jako jsou lithné, sodné nebo draselné soli, aminové soli zahrnující soli triethylaminu, triethanolaminu, ethanolaminu, argininu, lysinu a N-methylglukaminu.

Nejpreferovanější provedení camptothecinových derivátů obecného vzorce II zahrnují následující sloučeniny: (20)-O-fosfonooxymethylcamptothecin, (20)-O-fosfonooxymethylcamptothecin mono- nebo disodná sůl, (20)-O-fosfonooxymethylcamptothecin mono- nebo didraselná sůl, (20)-O-fosfonooxymethylcamptothecin mono- nebo di—sůl argininu, (20)-O-fosfonooxymethylcamptothecin mono- nebo di—sůl lysinu, (20)-O-fosfonooxymethylcamptothecin mononebo dí-sůl N-methylglukaminu a (20)-O-fosfonooxymethylcamptothecin mono- nebo di-sůl triethanolaminu.

Sloučeniny obecného vzorce II mohou být připraveny přímo z camptothecinu (označený jako ©OH) podle následující reakční sekvence ukázané ve schématu 2:

Schéma 2

SMe

OP(O)(OR), (III)

OP(OZ)(OZ)

(II)

Sloučenina obecného vzorce III (methylthiomethyl ether, MTM ether) může být připravena reak25 cí camptothecinu se směsí dimethylsulfoxid/acetanhydrid/kyselina octová.

Ve druhém kroku zobrazeném na Schématu 2 je methylthiomethyl ether převeden na odpovídající chráněný fosfonooxymethyl ether (sloučenina obecného vzorce IV). To se provádí reakcí MTM etheru s N-jodsukcinimidem a chráněným fosfátem HOP(O)(OR)2. Ve třetím kroku se odstraní fosfonová chránící skupina za vzniku sloučeniny obecného vzorce II. Například, vhodnou fosfonochránicí skupinou je benzylová skupina, která může být odstraněna katalytickou hydrogenolýzou.

Obecný způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I podle schématu 2 je konkrétněji ilustro35 ván ve Schématu 3:

-6CZ 304020 B6

NBZHOPfORh

V prvním kroku se volná hydroxyskupina camptothecinu převádí na odpovídající methylthiomethyl etherovou skupinu (-OCH₂SCH₃). Tato konverze může být provedena reakcí s dimethylsulfoxidem v přítomnosti acetanhydridu a kyseliny octové. Tato metoda, obecně známá jako Pummerova reakce, byla úspěšně aplikována Bristol-Myers Squibb na methylthiomethylaci taxolu (Europ. Pat. 0 604 910 Al, Biiorg. Med. Chem. Lett., 6, 1837, 1996). Reakce se obvykle provádí za laboratorní teploty a po dobu 24 až 72 hodin za vzniku methylthiomethyl etheru.

ío Ve druhém kroku reakční sekvence se methylthiomethyl ether převádí na odpovídající chráněný fosfonooxymethyl ether. Tato velmi dobře známá transformace byla úspěšně aplikována BristolMeyers Squibb na fosfonooxymethylaci taxolu (Europ. Pat. 0 604 910 Al, Biiorg. Med. Chem. Lett., 6, 1837, 1996). Sloučenina obecného vzorce III se tak nechá reagovat s N-jodsukcinamidem a chráněnou fosforečnou kyselinou jako třeba dibenzylfosfátem. Reakce se provádí v inertním rozpouštědle jako je tetrahydrofuran a halogenovaný uhlovodík jako je methylenchlorid a v přítomnosti molekulových sít. Reakce se provádí za laboratorní teploty. N-jodsukcinimid a chráněná kyselina fosforečná se používá v přebytku (3 až 5 ekvivalentů) vůči methylthiomethyl etheru.

Ve třetím kroku reakční sekvence se odstraňuje fosfonochránicí skupina. Odchránění se provádí konvenčními postupy dobře známými v oboru jako je kysele nebo bazicky katalyzovaná hydrolý-7CZ 304020 B6 za, hydrogenolýza, redukce a pod. Například, katalytická hydrogenolýza může být použita pro odstranění benzylfosfonochránicí skupiny. Metodologie odchránění může být nalezena ve standardních textech, jako třeba v T. W. Green a P. G. M. Wutz, Protective groups in organic synthesis, J. Wiley publishers, New York, NY 1991, str. 47-67.

Bazické soli sloučeniny obecného vzorce II mohou být vytvořeny konvenčními technikami zahrnující reakci volné kyseliny sloučeniny obecného vzorce II s kovovou bází nebo s aminem. Vhodné kovové báze zahrnují hydroxidy, uhličitany a hydrogenuhličitany sodíku, draslíku, lithia, vápníku, baria, hořčíku, zinku a hliníku, a vhodné aminy zahrnují triethylamin, amoniak, lysin, ío arginin, N-methylglukamin, ethanolamin, prokain, benzathin, dibenzylamin, tromethamin (TRIS), chlorprokain, cholin, diethanolamin, triethanolamin a pod. Bazické soli mohou být dále čištěny chromatografií následovanou lyofilizací nebo krystalizací.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou fosfonooxymethyl etherová farmaka jako jsou campto15 thecin, propofol, etoposid, tokoferol a pod. Farmaceuticky akceptovatelné soli vykazují zvýšenou rozpustnost ve vodě ve srovnání s matečnými sloučeninami, čímž dovolují výrobu užitečných farmaceutických přípravků. Bez toho, aniž bychom se cítili býti vázáni teorií, máme za to, že fosfonooxymethylové ethery podle tohoto vynálezu jsou proléky matečných farmak; přičemž fosfonooxyethylová skupina se štěpí po kontaktu s fosfatázou in vivo za následného vzniku matečné sloučeniny. Jak bylo ukázáno výše, sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou účinná farmaka nebo terapeutická činidla.

Například, sloučeniny obecného vzorce II podle tohoto vynálezu mohou být použity podobným způsobem jako camptothecin. Struktura camptothecinového proléku byla ukázána výše. Onkolog, který je odborníkem v oboru léčení rakoviny tedy bude schopen rozhodnout bez dalších zbytečných experimentů, o příslušném způsobu podávání sloučeniny podle tohoto vynálezu. Dávkování, způsob podávání a časový rozvrh podávání sloučenin podle tohoto vynálezu není nijak zvláštně omezeno a bude se lišit podle konkrétní použité sloučeniny. Tak sloučenina obecného vzorce II může být podávána libovolným způsobem podávání, s výhodou parenterálně, dávka může být například v rozsahu od asi 0,1 do asi 100 mg/kg hmotnosti těla nebo od 5 do 500 mg/m². Sloučeniny obecného vzorce II mohou být také podávány orálně, orální dávky mohou být v rozsahu od 5 do asi 500 mg/kg hmotnosti těla. Skutečná dávka se bude lišit v závislosti na konkrétním složení přípravku, způsobu podávání a konkrétním místu, hostiteli a typu tumoru, který má být léčen. Mnoho faktorů, které modifikují působení léku je třeba vzít do úvahy při určování dávky, včetně pohlaví, stravy a fyzické kondice pacienta.

Další příklad je propofolový prolék podle tohoto vynálezu obecného vzorce I. Struktura propofolového proléku je uvedena níže:

Propofolový prolék

Ve výše uvedeném vzorci propofolového proléku Z je stejný jako ve výše uvedené definici obecného vzorce II. Anesteziolog, odborník v oboru anesteze, tedy bude schopen rozhodnout bez dalších zbytečných pokusů o správném způsobu podávání sloučeniny podle tohoto vynálezu.

Dávkování, způsob podávání a časový rozvrh podávání sloučenin podle tohoto vynálezu nejsou

-8CZ 304020 B6 nějak konkrétně omezeny a budou se lišit v závislosti na konkrétní použité sloučenině. Sloučenina obecného vzorce I, jako třeba propofolový prolék, může být podávána libovolnou vhodnou cestou, s výhodou parenterálně, dávkování může být např. v rozsahu od 0,1 do 10 mg/kg hmotnosti těla podávané podle procedury vyvolání celkové anesteze nebo udržení v celkové anestezi. Alternativně mohou být sloučeniny obecného vzorce I podle tohoto vynálezu podávány parenterální infuzí, dávkování může být např. v rozsahu od 2 pg/kg/min do 800 pg/kg/min, podávané podle procedury na udržení celkové anesteze, vyvolání nebo udržení uklidnění při monitorované anesteziologické péči (MAC) nebo vyvolání a udržení zklidnění na jednotce intenzivní péče (ICU).

Tento vynález také zajišťuje farmaceutické přípravky obsahující farmaceuticky účinná množství sloučeniny obecného vzorce I v kombinaci s jedním nebo více farmaceuticky přijatelných nosičů, excipientů, ředidel nebo adjuvantů. Například, sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být formulovány ve formě tablet, pilulek, prachových směsí, kapslí, injekcí, roztoků, čípků, emulzí, disperzí, přimíšenin do jídla a v dalších vhodných formách. Mohou být také vyráběny ve formě sterilních tuhých přípravků, např. lyofilizovaných je-li to potřeba, kombinovaných s dalšími farmaceuticky přijatelnými excipienty. Tyto tuhé přípravky mohou být opětně konstituovány se sterilní vodou, fyziologickým roztokem nebo směsí vody a organického rozpouštědla jako je propylenglykol, ethanol a pod., nebo nějakým jiným sterilním médiem těsně před parenterálním podáním.

Typickým farmaceuticky přijatelným nosičem je např. mannitol, močovina, dextrany, laktóza, neredukující cukry, bramborový a kukuřičný škrob, stearát hořečnatý, talek, rostlinný olej, polyalkylenglykoly, ethylcelulóza, poly(vinylpyrrolidon), uhličitan vápenatý, ethyloleát, isopropylmyristát, benzylbenzoát, uhličitan sodný, želatina, uhličitan draselný, kyselina křemičitá. Farmaceutické přípravky mohou také obsahovat netoxické přídavné látky jako jsou emulgátory, konzervační sloučeniny, smáčedla a pod., kde příklady jsou sorbitan monolaurát, triethanolamin oleát, polyoxyethylen monostearát, glyceryl tripalmitát, dioktylsulfosukcinát sodný a pod.

V následujících experimentálních procedurách jsou všechny teploty uvedeny ve stupních Celsia (C), pokud není uvedeno jinak. Charakteristiky spekter nukleární magnetické resonance (NMR) se vztahují k chemickému posunu (δ) vyjádřenému v parts per milion (ppm) vůči tetramethylsilanu (TMS) coby referenčním standardu. Relativní plocha popisovaná pro různé hodnoty chemického posunu v protonovém NMR spektru odpovídá počtu vodíkových atomů konkrétního funkčního typu v molekule. Způsob štěpení signálů je označován jako široký singlet (bs), široký dublet (bd), široký triplet (bt), široký kvartet (bq), singlet (s), multiplet (m), dublet (d), triplet (t), kvartet (q), dublet dubletu (dd), dublet tripletu (dt) a dublet kvartetu (dq). Rozpouštědla použitá pro měření NMR spektra jsou aceton-de (deuterovaný aceton), DMSO-dé (perdeuterodimethylsulfoxid), D2O (deuterovaná voda), CDC1₃ (deuterochloroform) a další konvenčně deuterovaná rozpouštědla.

Zkratky zde používané jsou běžně používány v oboru. Některé z nich jsou např.: MS (hmotnostní spektroskopie), HRMS (vysoce rozlišovací hmotnostní spektroskopie), Ac (acetyl), Ph (fenyl), FAB (bombardování rychlými atomy), min (minuta), h (hodina), NIS (N-jodsukcinimid), DMSO (dimethylsulfoxid), THF (tetrahydrofúran).

Následující příklady jsou zde uvedeny pro ilustraci syntézy reprezentativních sloučenin podle tohoto vynálezu a nejsou v žádném ohledu konstruovány jako limitující pro rozsah vynálezu. Odborník v oboru bude schopen adaptovat tyto metody, bez nutnosti dalších experimentů, na syntézy sloučenin, které jsou v rámci tohoto vynálezu ovšem nejsou zde specifikovány. Například, v následujících příkladech jsou použity konkrétní soli, ovšem tyto soli nebyly konstruovány jako limitující. Příkladem takovéto situace je opakované použití stříbrné soli dibenzylfosfátu. Tetraalkylamonné soli, jako jsou tetramethylamonné soli nebo další soli alkalických kovů, mohou být použity namísto stříbrné soli.

-9CZ 304020 B6

Příklady provedení vynálezu

I. Syntéza O-fosfonooxymethylpropofolu

la. Syntéza O-methylthiomethylpropofolu:

K míchané suspenzi hydridu sodného (150 mg, 6,2 mmol) v suchém HMPA (10 ml) byl během 15 minut pod argonovou atmosférou přikapán propofol (1,1 ml, 97% čistota, 5,7 mmol). Reakční ío směs byla poté míchána dalších 30 minut při laboratorní teplotě. Ktéto směsi byl přikapán chlormethylmethylsulfid (550 μΐ, 95% čistota, 6,2 mmol) a poté míchána při laboratorní teplotě.

Po 20 hod byla reakční směs rozdělena mezi vodu (10 ml) a benzen (20 ml). Vodná vrstva byla oddělena a promyta s 10 ml benzenu. Benzenové podíly byly spojeny, promyty vodou (2x3 ml), sušeny nad síranem sodným a odpařeny za sníženého tlaku. Vzniklý olejovitý zbytek byl podro15 ben sloupcové chromatografíí (silikagel, hexan, poté 4 : 1 hexan/chloroform) za vzniku 1,15 g (85% výtěžek) titulní sloučeniny ve formě bezbarvého oleje.

EIMS: [M+], m/z 238.

'H NMR (300 MHz, CDC1₃, δ): 1,24 (d, J = 6,9 Hz, 12H), 2,37 (s, 3H), 3,37 (hept, J = 6,9 Hz, 2H), 4,86 (s, 2H), 7,12 (s, 3H). ¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃, δ): 15,40, 23,98, 26,68, 78,12,

124,04, 125,05, 141,74, 152,20.

K míchanému roztoku O-methylthiomethylpropofolu (3,00 g, 12,5 mmol) ve 30 ml suchého methylenchloridu pod atmosférou argonu byl při 5 °C během 5 minut přidán roztok SO₂C1₂ v suchém methylenchloridu (12,2 ml, 12,2 mmol). Reakční směs byla míchána 10 minut při stejné teplotě a poté míchán 3 hodiny při laboratorní teplotě. Rozpouštědlo bylo odpařeno za

-10CZ 304020 B6 sníženého tlaku a hnědý olejovitý zbytek byl čištěn pomocí flash chromatografie na silikagelu (1:20 hexan/ethylacetát) za vzniku 2,36 g (83 % výtěžek) titulní sloučeniny ve formě žlutého oleje.

CIMS (NH₃): [M+], m/z 226, [MH+NH₃]⁺, m/z 244.

’HNMR (300 MHz, CDC1₃, δ): 1,22 (d, J = 6,9 Hz, 12H), 3,35 (hept, J = 6,9 Hz, 2H), 5,76 (s, 2H), 7,15 (m, 3H). ’³C NMR (75 MHz, CDC1₃, δ): 23,84, 26,84, 83,34, 124,34, 125,95, 141,34, 150,93.

Ic. Syntéza O-fosfonoxymethylpropofol dibenzylesteru (cesta-1)

Směs O-chlormethylpropofolu (2,20 g, 9,7 mmol), dibenzylfosfátu stříbrného (3,85 g, 10,0 mmol) a suchého toluenu (50 ml) byla zahřívána k varu pod atmosférou argonu po dobu 45 minut. Směs byla poté ochlazena na pokojovou teplotu a zfiltrována. Po odpaření ve vakuu byl olejovitý zbytek čištěn pomocí flash chromatografie na silikagelu (9:1 hexan/ethylacetát a poté 1:1 hexan/ethylacetát) za vzniku 4,43 g (98 % výtěžek) titulní sloučeniny ve formě žlutého oleje.

CIMS (NH₃): [MH+], m/z 469, [MH+NH₃]⁺, m/z 486.

’H NMR (300 MHz, CDC1₃, δ): 1,17 (d, J = 6,8 Hz, 12H), 3,33 (hept, J = 6,9 Hz, 2H), 5,00 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 5,01 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 5,42 (d, J = 9,9 Hz, 2H), 7,12 (m, 3H), 7,32 (m, 10H), ^,3C NMR (75 MHz, CDC1₃, δ): 23,79, 26,57, 69,15, 69,23, 94,14, 94,20, 124,07, 125,62, 127,70, 128,44, 135,42,135,51, 141,50,151,07.

Ic. Syntéza O-fosfonoxymethylpropofol dibenzylesteru (alternativní cesta-1):

K míchanému roztoku O-methylthiomethylpropofolu (1,45 g, 6,08 mmol) v 15 ml suchého dichlormethanu byl při 5 °C pod dusíkovou atmosférou přikapán 1M roztok SO2CI2 v suchém methylenchloridu (6,5 ml, 6,5 mmol) během 5 minut. Reakční směs byla míchána 10 minut při stejné teplotě a potom 3 hod při laboratorní teplotě. Rozpouštědlo bylo poté odpařeno za sníženého tlaku. Zbylý olej byl rozpuštěn v toluenu (ACS-čistota, 20 ml), byl přidán dibenzylfosfát stříbrný (3,50 g, 9,1 mmol) a vzniklá směs byla refluxována 45 minut. Hnědá reakční směs byla poté ochlazena na laboratorní teplotu a zfiltrována. Po odstranění rozpouštědla ve vakuu byl olejovitý zbytek čištěn flash chromatografií na silikagelu (9:1 hexan/ethylacetát, potom 1:1 hexan/ethylacetát) za vzniku 2,41 g (85 % výtěžek) titulní sloučeniny ve formě žlutého oleje. Tento produkt měl stejné Rf (TLC) a *HNMR spektrum (300 MHz, CDC1₃) jako autentický vzorek.

- 11 CZ 304020 B6

Ic. Syntéza O-fosfonoxymethylpropofol dibenzylesteru (alternativní cesta -2):

K míchané suspenzi hydridu sodného (41 mg 60% disperze v minerálním oleji, 1,02 mmol) v 1,5 ml suchého dimethoxyethanu pod atmosférou argonu byl přidán během 5 minut propofol (200 μΐ, 97% čistota, 1,04 mmol) a vzniklá směs byla míchána dalších 15 minut. Vzniklý homogenní roztok byl přikapán k míchanému roztoku chlorjodmethanu (4,0 ml, 53 mmol) ve 4 ml suchého dimethoxyethanu během 15 minut. Tato reakční směs byla míchána 2 hod, zfíltrována a ío poté bylo rozpouštědlo a přebytek chloqodmethanu odpařeno. Vzniklý olejovitý zbytek byl rozpuštěn v toluenu (HPLC čistota, 10 ml). K tomuto roztoku byla přidána stříbrná sůl dibenzylfosfátu (400 mg, 1,04 mmol) a vzniklá směs byla zahřívána k refluxu 10 minut. Poté byla reakční směs ochlazena na laboratorní teplotu a zfíltrována, rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu. Olejovitý zbytek byl čištěn flash chromatografií na silikagelu (9:1 hexan/ethylacetát a poté 1:1 hexan/15 ethylacetát) za vzniku 205 mg (42 % výtěžek) titulní sloučeniny ve formě oleje. Tento produkt měl stejné Rf (TLC) a ’H NMR spektrum (300 MHz, CDC1₃) jako autentický vzorek.

Pokud jde o výše uvedenou reakci Ic (alternativní cesta 2) mělo by být zřejmé, že mohou být použity další činidla v závislosti na požadované sloučenině. Například, je-li požadována slouče20 nina obecného vzorce I, kde n = 2, může být chloijodmethan nahrazen se sloučeninou jako XCH₂-OCH₂-C1, kde X je dobrá odstupující skupina.

Ic. Syntéza O-fosfonoxymethylpropofol dibenzylesteru (alternativní cesta 3):

K. míchanému roztoku O-methylthiomethylpropofolu (91 mg, 0,38 mmol) v suchém dichlormethanu (2 ml) pod atmosférou argonu byla přidána práškovaná aktivovaná 4Á molekulární síta (100 mg) a poté byl přidán roztok dibenzylfosfátu (127 mg, 0,45 mmol) a N-jodsukcinimidu (102 mg, 95% čistota, 0,43 mmol) ve 2 ml tetrahydrofuranu. Reakční směs byla míchána 1 h při laboratorní teplotě, zfíltrována a naředěna s 30 ml dichlormethanu. Vzniklý roztok byl promyt s nasyceným roztokem thiosíranu sodného (2 ml 1M roztoku), nasyceném roztokem hydrogenuhličitanu sodného (3 ml), solanky (5 ml), sušen nad směsí síranu sodného a síranu hořečnatého, zfíltrována a zkoncentrována ve vakuu. Olejovitý zbytek byl čištěn flash sloupcovou chromato35 grafu na silikagelu (1:1 hexan/ethylacetát) za vzniku 120 mg (67 % výtěžek) titulní sloučeniny ve formě žlutého oleje. Tento produkt měl stejné R_f (TLC) a 'H NMR spektrum (300 MHz, CDCh) jako autentický vzorek.

Ic. Syntéza O-fosfonoxymethylpropofol dibenzylesteru

- 12CZ 304020 B6

(alternativní cesta 4):

K roztoku propofolu (38 mg, 97% čistota, 0,21 mmol) v 1 ml dichlormethanu byl přidán tetrabutylamonium bromid (10 mg, 0,03 mmol) a roztok hydroxidu sodného (40 mg, 1 mmol) ve vodě (0,2 ml). Heterogenní směs byla míchána 15 minut. Pak byl přidán roztok chlormethyldibenzylfosfátu (104 mg, 0,32 mmol) v 1 ml methylenchloridu a reakční směs byla intenzivně míchána 8 hod. Směs byla poté naředěna s 10 ml methylenchloridu, promyta vodou (2 ml), sušena nad šíralo nem sodným, zfíltrována a odpařena ve vakuu. Olejovitý zbytek byl čištěn flash kolonovou chromatografíí (hexan, 20:1 hexan/ethylacetát a 10:1 hexan/ethylacetát) za vzniku 44 mg (45 % výtěžek) titulní sloučeniny ve formě žlutého oleje. Tento produkt měl stejné Rf (TLC) a 1H NMR spektrum (300 MHz, CDCl·?) jako autentický vzorek. is Ve výše uvedené reakci lc (alternativní cesta 4) by mělo být chápáno, že činidlo:

O

II^OBn

Cl—

OBn může být obecně reprezentován následujícím vzorcem:

kde X reprezentuje odstupující skupinu, R³ a R⁴ jsou každý vodíkový atom, organická skupina nebo anorganická skupina a Y je fosfátová chránící skupina. Příklady odstupující skupiny zahr25 nují chlorid, bromid, jodid, tosylát nebo jinou libovolnou odstupující skupinu. Příklady fosfátové chránící skupiny zahrnují chránící skupiny, které dočasně blokují reaktivitu fostátové skupiny a dovolují selektivní nahrazení s nukleofílní substituční reakcí. Příklady těchto blokujících skupin zahrnují (ovšem nejsou limitovány) benzyl, allyl, terciální butyl a isopropyl, ethyl a β-kyanoethyl.

lc. Syntéza O-fosfonoxymethylpropofol dibenzylesteru (alternativní cesta 5)

- 13CZ 304020 B6

K míchanému roztoku hydridu sodného (36 mg, 60% suspenze v minerálním oleji, 0,91 mmol) v suchém dimethoxyethanu (2 ml) pod argonovou atmosférou byl přikapán propofol (172 μΐ, 97 % čistota, 0,90 mmol) během 5 minut. Vzniklý roztok byl míchán při laboratorní teplotě dal5 ších 20 minut. Ke směsi byl poté přidán formaldehyd bis(dibenzylfosfono)acetal (500 mg, 0,88 mmol) v suchém dimethoxyethanu (3 ml). Reakční směs byla míchána 20 hodin při laboratorní teplotě a poté 2,5 h při 70 °C. Směs byla poté zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu. Olejovitý zbytek byl čištěn flash chromatografií na silikagelu (hexan, 10:1 hexan/ethylacetát a poté 1:1 hexan/ethylacetát) za vzniku 29 mg (7 % výtěžek) titulní sloučeniny io ve formě žlutého oleje. Tento produkt měl stejnou hodnotu R_f (TLC) a ’H NMR spektrum (300

MHz, CDC1₃) jako autentický vzorek.

Id. Syntéza O-fosfonoxymethylpropofol:

K roztoku O-fosfonoxymethylpropofol dibenzylesteru (115 mg, 0,245 mmol) v 10 ml methanolu bylo přidáno palladium na uhlí (10%, 20 mg). Tato směs byla poté míchána v atmosféře vodíku (1 atm) po dobu 1,5 hod. Katalyzátor byl poté odstraněn filtrací přes Celit a filtrát byl odpařen za sníženého tlaku za vzniku 70,5 mg (100 % výtěžek) titulní sloučeniny ve formě bezbarvého oleje, nestabilního při stání za laboratorní teploty.

FABMS-(GLY): [M-H]~, m/z 287 'H NMR (300 MHz, aceton-d* δ): 1,19 (d, J = 6,8 Hz, 12H), 3,46 (sext, J = 6,8 Hz, 2H), 5,45 (d, J = 9,7 Hz, 2H), 7,15 (m, 3H). ¹³C NMR (75 MHz, aceton-de, 5): 24,2178, 27,1496, 94,63, 94,65,

124,08, 126,30, 142,46, 152,32.

Ie. Syntéza O-fosfonoxymethylpropofol disodné soli:

K roztoku O-fosfonoxymethylpropofol dibenzylesteru (1,05 mg, 2,24 mmol) ve 100 ml tetrahydrofuranu bylo přidáno 5 ml vody a palladium na uhlíku (10%, 300 mg). Tato směs byla míchána v atmosféře vodíku (1 atm) 1 hodinu. Katalyzátor byl odstraněn filtrací přes Celit a filtrát byl nechán reagovat s roztokem hydrátu uhličitanu sodného (263 mg ve 3 ml vody, 2,12 mmol). THF byl odpařen za sníženého tlaku a zbylý vodný roztok byl extrahován s etherem (3x3 ml). Vodná vrstva byla odpařena do sucha (proud argonu v odparce) a vzniklá tuhá látka byla sušena přes noc ve vakuu, promyta etherem (4x4 ml), hexanem (2x4 ml) a opět sušena ve vakuu za vzniku 655 mg (93 % výtěžek) titulní sloučeniny ve formě bílého prášku.

- 14CZ 304020 B6

FABMS-{GLY): [M-2Na+H]’, m/z 287 'H NMR (300 MHz, D₂O, δ): 1,22 (d, J = 7,0 Hz, 12 H), 3,46 (hept, J = 6,9 Hz, 2H), 5,27 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,28 (m, 3H).

II. Syntéza O-fosfonoxymethyl-alfa-tokoferolu

Ha. Syntéza O-fosfonoxymethyl-alfa-tokoferol dibenzylesteru

K roztoku chlormethyldibenzylfosfátu (323 mg, 0,98 mmol), alfa-tokoferolu (409 mg, 97% čistota, 0,92 mmol) a tetrabutylamonium bromidu (301 mg, 0,92 mmol) v 5 ml benzenu byl přidán vodný roztok hydroxidu sodného (150 mg v 0,2 ml vody, 3,7 mmol). Vzniklá reakční směs byla intenzivně míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě pod atmosférou argonu. Směs byla poté naředěna s 10 ml benzenu, promyta vodou (3x3 ml), sušena nad síranem hořečnatým, zfiltrována a odpařena za sníženého tlaku. Hnědý olejovitý zbytek byl čištěn flash chromatografií na sloupci silikagelu (10:1 hexan/ethylacetát) za vzniku 336 mg (51 % výtěžek) titulní sloučeniny ve formě žlutého oleje.

FABMS+(NBA): [M]⁺, m/z 720.

’H NMR (500 MHz, CDC1₃, δ): 0,85 (m, 12H), 1,21 (s, 3H), 1,27 (m, 24H), 1,75 (m, 2H), 2,06 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 2,14 (s, 3H), 2,54 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 4,97 (m, 4H), 5,20 (d, J = 9,3 Hz, 2H), 7,31 (m, 10H).

lib. Syntéza O-fosfonoxymethyl-alfa-tokoferolu:

- 15CZ 304020 B6

K roztoku O-fosfonoxymethyl-alfa-tokoferol dibenzylesteru (88 mg, 0,12 mmol) v 10 ml tetrahydrofuranu bylo přidáno palladium na uhlíku (10%, 15 mg). Směs byla míchána v atmosféře vodíku (1 atm) po dobu 10 minut (reakce byla skončena po 5 minutách podle TLC). Katalyzátor byl odstraněn filtrací přes Celit, filtrát byl odpařen za sníženého tlaku a poté sušen ve vakuu. Titulní sloučenina byla získána v množství 70 mg (100 % výtěžek) ve formě hnědavého oleje, který byl nestabilní za laboratorní teploty.

FABMS-{NBA): [M]~, m/z 540, [M+Na]⁺, m/z 563, (NBA + Li): [M+Li]⁺, m/z 547. líc. Syntéza disodné soli O-fosfonoxymethyl-alfa-tokoferolu:

K roztoku O-fosfonoxymethyl-alfa-tokoferol dibenzylesteru (100 mg, 0,14 mmol) v 10 ml tetrahydrofuranu bylo přidáno palladium na uhlíku (10%, 18 mg). Směs byla míchána v atmosféře vodíku (1 atm) 5 minut. Katalyzátor byl odstraněn filtrací přes Celit, filtrát byl odpařen za sníženého tlaku při laboratorní teplotě a vzniklý zbytek byl rozpuštěn ve 2 ml etheru. Etherový roztok byl poté smíchán s roztokem hydroxidu sodného (11,2 mg ve 100 ml vody, 0,28 mmol) a vzniklá směs byla míchána za laboratorní teploty 10 minut. Etherová fáze byla odstraněna a vodná fáze byla promyta etherem (3x3 ml) a poté sušena ve vakuu 20 hodin za vzniku 73 mg (89 % výtěžek) titulní sloučeniny ve formě šedé tuhé látky.

FABMS+(TG/G): [MH]⁺, m/z 585, [M+Na]⁺, m/z 607

Syntéza ve vodě rozpustných derivátů camptothecinu bude dále detailně popsána:

III. Syntéza 20-O-fosfonoxymethylcamptothecinu

lila. Syntéza 20-O-methylthiomethylcamptothecinu:

-16CZ 304020 B6

K suspenzi camptothecinu (5,0 g, 14,3 mmol) ve 250 ml dimethylsulfoxidu byl přidán acetanhydrid (125 ml) a octová kyselina (35 ml). Heterogenní směs byla intenzivně míchána 24 hodin při laboratorní teplotě, poté byla nalita do ledu (800 ml), míchána 30 minut a poté extrahována s dichlormethanem (4 x 100 ml). Spojené dichlormethanové extrakty byly promyty vodou (2 x 100 ml) a sušena nad síranem hořečnatým. Dichlormethan byl odstraněn za sníženého tlaku za vzniku hnědavé tuhé látky. Tuhá látka byla rozpuštěna v minimálním objemu dichlormethanu. Tento roztok byl zfiltrován a naředěn s lOnásobným množstvím hexanu a poté nechána přes noc v lednici. Vysrážená tuhá látka byla odfiltrována, promyta několikrát s hexanem a sušena za vzniku 5,38 g (92 % výtěžek) titulní sloučeniny ve formě světle hnědého prášku. a^D2o -123,6 ° (c 0,55, CHC1₃).

’H NMR (400 MHz, CDC1₃, 6): 0,93 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 2,11 (sext, J = 7,6 Hz, IH), 2,29 (sext, J= 7,6 Hz, IH), 2,30 (s, 3H), 4,58 (s, 2H), 5,33 (s, 2H), 5,40 (d, J = 17,2 Hz, IH), 5,62 (d, J= 17,3 Hz, IH), 7,48 (s, IH), 7,69 (t, J = 7,1 Hz, IH), 7,86 (t, J = 7,l Hz, IH), 7,96 (d, J = 8,1 Hz, IH), 8,25 (d, J = 8,5 Hz, IH), 8,42 (s, IH).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃, 6): 7,76, 14,89, 33,90, 49,92, 66,68, 71,02, 76,57, 97,51, 122,63 128,02, 128,09, 128,30, 129,71, 130,64, 131,11, 145,14, 146,10, 148,88, 152,37, 157,43, 169,34, 169,73

Illb. Syntéza 20-O-fosfonoxymethylcamptothecin dibenzylesteru:

OBn

K. dobře míchané suspenzi 20-O-methylthiomethylcamptothecinu (1,00 g, 2,44 mmol) a práškových aktivovaných 4A molekulových sít (5 g) ve 20 ml tetrahydrofuranu byla přidána suspenze N-iodsukcinimidu (2,00 g, 98% čistota, 8,44 mmol) a dibenzylfosfátu (2,20 g, 7,83 mmol) ve 12 ml methylenchloridu. Vzniklá směs byla intenzivně míchána 30 minut při laboratorní teplotě, zfiltrována a naředěna s 300 ml ethylacetátu. Roztok byl poté promyt s vodným roztokem thiosíranu sodného (10%, 2x15 ml), vodou (2 x 20 ml), solankou (50 ml) a sušen nad síranem hořečnatým. Směs byla zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku. Hnědý olejovitý zbytek byl čištěn flash sloupcovou chromatografií na silikagelu (98:2 ethylacetát/methanol) a sušen ve vakuu přes noc za vzniku 1,19 g (76% výtěžek) titulní sloučeniny ve formě žluté pěny.

a^D2o -43,1 °C (c 0,55, CHC1₃).

FABMS+(NBA): [MH]⁺, m/z 639.

’H NMR (400 MHz, CDC1₃, 5): 0,91 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 2,09 (sext, J = 7,4 Hz, IH), 2,26 (sext, J = 7,4 Hz, IH), 5,06 (m, 4H), 5,28 (m, 3H), 5,35 (d, J = 17,0 Hz, IH), 5,48 (2xd, J = 10,5 Hz,

- 17CZ 304020 B6

1H), 5,64 (d, J = 17,3 Hz, 1H), 7,59 (s, 1H), 7,67 (t, J = 7,0 Hz, 1H), 7,80 (t, J = 7 Hz, 1H), 7,94 (d, J = 8,0 Hz, 1H), S, 13 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 8,35 (4, 1H).

13,

C NMR (100 MHz, CDC1₃, 5): 7,73, 29,53, 32,49, 49,86, 66,74, 69,37, 69,44, 78,48, 88,99, 89,04, 98,09, 121,55, 127,65, 127,70, 127,90, 12S,01, 128,25, 128,35, 12S,36, 129,62, 130,48, 130,97,135,45, 135,55, 145,47,145,82, 148,76,152,15, 157,18, 168,67.

IIIc. Syntéza 20-O-fosfonoxymethylcamptothecin:

K roztoku 20-O-fosfonoxymethylcamptothecin dibenzylesteru (500 mg, 0,78 mmol) ve 100 ml tetrahydrofuranu a 5 ml vody bylo přidáno palladium na uhlíku (10%, 500 mg). Tato směs byla míchána pod atmosférou vodíku (1 atm. tzn. 101325 Pa) 35 minut. Katalyzátor byl odstraněn filtrací přes Celit. Celit byl poté promyt s tetrahydrofuranem (300 ml) a spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku. Vzniklá zelená tuhá látka byla promyta s etherem (2 x 20 ml), hexanem (50 ml), sušena ve vakuu a poté rozpouštěna v horkém methanolu (60 ml). Roztok byl zfiltrován, zakoncentrován za sníženého tlaku na přibližně 10 ml objem. Po stání 1 h při laboratorní teplotě byl roztok umístěn přes noc do lednice. Krystalická sraženina byla odfiltrována a sušena ve vakuu za vzniku 155 mg titulní sloučeniny ve formě žluté tuhé látky. Filtrát byl zkon20 centrován na 1 ml objem a nechán 1 h v lednici za vzniku dalších 28 mg produktu. Celkový výtěžek: 183 mg (51 %).

FABMS+(NBA): [MH]⁺, m/z 459, [M + Na]⁺, m/z 481.

’H NMR (400 MHz, D₂O, 5): 0,95 (t, J = 7,5 Hz, 3H), 2,25 (m, 2H), 4,98 (d, J= 5,0 Hz, 2H), 5,14 (2xd, J= 9,3 Hz, 1H), 5,22 (2xd, J = 8,9 Hz, 1H), 5,48 (d, J= 17,0 Hz, 1H), 5,60 (d,

J= 16,9 Hz, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,56 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 7,77 (t, J= 7,2 Hz, 1H), 7,86 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 8,01 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 8,44 (s, 1H).

Chemická struktura a čistota produktu byla také potvrzena pomocí ’H NMR spektroskopie její disodné soli, vzniklé z volné kyseliny a dvou ekvivalentů hydrogenuhličitanu sodného v D₂O.

IIIc. Syntéza 20-O-fosfonoxymethylcamptothecinu (alternativní cesta):

OH

K roztoku 20-O-fosfonoxymethylcamptothecin dibenzylesteru (500 mg, 0,78 mmol) ve 100 ml tetrahydrofuranu a 5 ml vody bylo přidáno paladium na uhlíku (10%, 500 mg). Tato směs byla míchána pod atmosférou vodíku (1 atm) 30 minut. Katalyzátor byl odstraněn filtrací přes Celit.

-18CZ 304020 B6

Celit byl poté promyt s tetrahydrofuranem (2 x 100 ml) a spojené filtráty byly nechány reagovat s vodným roztokem hydrátu uhličitanu sodného (97 mg ve 2 ml vody, 0,78 mmol). THF byl odpařen za sníženého tlaku a heterogenní vodný zbytek byl naředěn s 10 ml vody a extrahován s ethylacetátem (2x3 ml). Vzniklý žlutý homogenní roztok byl okyselen s kyselinou chlorovodí5 kovou (10%) na pH = 1. Vzniklá sraženina byla odfiltrována a sušena ve vakuu přes noc za vzniku 145 mg (41 % výtěžek) titulní sloučeniny ve formě žluté tuhé látky.

Illd. Syntéza disodné soli 20-O-fosfonooxymethylcamptothecinu:

K suspenzi 20-O-fosfonooxymethylcamptothecinu (5 mg, 10,9 mmol) v deuteriumoxidu (0,5 ml) byl přidán roztok hydrogenuhličitanu sodného v deuteriumoxidu (50 μΐ, 0,44M roztoku = 22 pmol). Heterogenní směs byla několik minut sonifikována za vzniku homogenního žlutého roztoku titulního produktu.

'H NMR (400 MHz, D₂O, po 10 min, 96% lakton, 4% karboxylát, δ): 1,05 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 2,27 (m, 2H), 4,57 (d, J = 18,8 Hz, IH), 4,70 (d, J = 18,9 Hz, IH), 5,06 (dd, J = 8,3, J = 5,4 Hz, IH), 5,18 (dd, J = 7,6, J = 5,5 Hz, IH), 5,45 (d, J = 16,7 Hz, IH), 5,59 (d, J = 16,8 Hz, IH), 7,34 (t, J = 7,1 Hz, IH), 7,41 (s, IH), 7,60 (m, 2H), 7,81 (d, J = 8,3 Hz, IH), 8,17 (s, IH).

Illd. Syntéza disodné soli 20-O-fosfonooxymethylcamptothecinu (alternativní cesta 1):

K roztoku 20-O-fosfonooxymethylcamptothecinu dibenzylesteru (78 mg, 0,122 mmol) v 10 ml tetrahydrofuranu a 3 ml vody bylo přidáno paladium na uhlíku (10%, 80 mg). Směs byla míchána v atmosféře vodíku (1 atm) po dobu 30 minut. Katalyzátor byl odstraněn filtrací přes Celit a filtrát byl nechán reagovat s vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (20 mg v 0,5 ml vody, 0,237 mmol). Žlutá sraženina byla odfiltrována, promyta s dichlormethanem a sušena ve vakuu za vzniku 35 mg (57% výtěžek) titulní sloučeniny (světle hnědá tuhá látka) jako směs jejího laktonu (82 %) a její karboxylátové formy (18 %) (měřeno pomocí NMR). lid. Syntéza disodné soli 20-O-fosfonooxymethylcamptothecinu (alternativní cesta 2)

-19CZ 304020 B6

OBn

K roztoku 20-O-fosfonooxymethylcamptothecin dibenzylesteru (500 mg, 0,78 mmol) ve 100 ml tetrahydrofuranu a 5 ml vody bylo přidáno paladium na uhlíku (10%, 500 mg). Tato směs byla míchána v atmosféře vodíku (1 atm) po dobu 30 minut. Katalyzátor byl odstraněn filtrací přes Celit. Celit byl poté promyt s 50 ml tetrahydrofuranu a spojené filtráty byly nechány reagovat s vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (90 mg ve 2 ml vody, 0,72 mmol). Tetrahydrofuran byl odpařen za sníženého tlaku a zbytek byl rozpuštěn ve vodě (15 ml). Heterogenní směs byla extrahována s ethylacetátem (2x15 ml) a etherem (20 ml) a vzniklý homogenní vodný roz10 tok byl odpařen do sucha pod proudem argonu za laboratorní teploty. Zbytek byl sušen ve vakuu přes noc za vzniku 290 mg (80 % výtěžek) titulní sloučeniny (oranžová tuhá látka) jako směsi laktonové formy (60%) a karboxylátové formy (40%) a malého množství vedlejších produktů (Měřeno pomocí 'H NMR).

Hle. Syntéza monosodné soli 20-O-fosfonooxymethylcamptothecinu:

Ke kontinuálně sonifikované suspenzi 20-O-fosfonooxymethylcamptothecinu (5 mg, 10 pmol) v deuteriumoxidu (0,5 ml) byl přikapán roztok hydrogenuhličitanu sodného v deuteriumoxidu až bylo dosaženo úplné homogenizace (21 μΐ 0,44 M roztoku = 9,2 pmol). Byl získán žlutý homogenní roztok titulní sloučeniny.

*H NMR (400 MHz, D₂O, 5): 1,00 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 2,23 (m, 2H), 4,40 (d, J = 18,8 Hz, 1H), 4,50 (d, J = 18,8 Hz, 1H), 5,10 (dd, J = 9,7, J = 5,9 Hz, 1H), 5,25 (dd, J = 9,0, J = 6,1 Hz, 1H),

5,39 (d, J = 16,7 Hz, 1H), 5,50 (d, J = 16,7 Hz, 1H), 7,20 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 7,28 (s, 1H), 7,46 (m, 2H), 7,66 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,02 (s, 1H).

Illf. Syntéza lysinové soli 20-O-fosfonooxymethylcamptothecinu:

-20CZ 304020 B6

Ke kontinuálně sonifikované suspenzi 20-O-fosfonooxymethylcamptothecinu (5 mg, 10 gmol) v deuteriumoxidu (0,5 ml) byl přikapán roztok L-lysinu v deuteriumoxidu až bylo dosaženo úpl5 né homogenizace (25 μΐ 0,43 M roztoku = 10,7 μιηοΐ). Byl získán žlutý homogenní roztok titulní sloučeniny.

’H NMR (400 MHz, D₂O, 94% lakton, 6% karboxylát, 5): 1,02 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 1,49 (m, 2H), 1,73 (m, 2H), 1,88 (m, 2H), 2,25 (m, 2H), 3,03 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 3,76 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 4,43 (d, J= 19,0 Hz, 1H), 4,52 (d, J = 18,9 Hz, 1H), 5,11 (dd, J = 9,7, J= 5,8 Hz, 1H), 5,27 (dd,

J =9,2, J = 5,8 Hz, 1H), 5,41 (d, J = 16,7 Hz, 1H), 5,53 (d, J = 16,7 Hz, 1H), 7,23 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,30 (s, 1H), 7,49 (m, 2H), 7,68 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,04 (s, 1H).

II Ig. Příprava argininové soli 20-O-fosfonooxymethylcamptothecinu:

Ke kontinuálně sonifikované suspenzi 20-O-fosfonooxymethylcamptothecinu (5 mg, 10 pmol) v deuteriumoxidu (0,5 ml) byl přikapán roztok L-argininu v deuteriumoxidu až bylo dosaženo úplné homogenizace (27 μΐ 0,40 M roztoku = 10,8 μιηοΐ). Byl získán žlutý homogenní roztok titulní sloučeniny.

’H NMR (400 MHz, D₂O, δ): 1,02 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 1,66 (m, 2H), 1,89 (m, 2H), 2,25 (m, 2H), 3,20 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 3,77 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 4,40 (d, J = 19,0 Hz, 1H), 4,49 (d, J = 18,8 Hz, 1H), 5,12 (dd, J = 9,7, J = 6,0 Hz, 1H), 5,29 (dd, J = 8,8, J = 6,1 Hz, 1H), 5,40 (d, J = 16,7 Hz, 1H), 5,51 (d, J= 16,7 Hz, 1H), 7,20 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 7,29 (s, 1H), 7,47 (m, 2H), 7,66 (d,

J = 8,3Hz, lH),8,03(s, 1H).

Illh. Příprava N-methylglukaminové soli 20-O-fosfonooxymethylcamptothecinu:

-21 CZ 304020 B6

Ke kontinuálně sonifikované suspenzi 20-O-fosfonooxymethylcamptothecinu (5 mg, 10,9 pmol) v deuteriumoxidu (0,5 ml) byl přikapán roztok (D}-N-methylglukaminu v deuteriumoxidu až bylo dosaženo úplné homogenizace (21 μΐ 0,51 M roztoku = 10,7 μτηοΐ). Byl získán žlutý homogenní roztok titulní sloučeniny.

'H NMR (400 MHz, D₂O, δ): 1,02 (t, J = 7,3 Hz, IH), 2,25 (m, 2H), 2,78 (s, 3H), 3,20 (m, 2H),

3,65 (m, 2H), 3,80 (m, 3H), 4,11 (m, IH), 4,44 (d, J = 18,9 Hz, IH), 4,53 (d, J = 19,0 Hz, IH),

5,12 (dd, J = 9,8, J = 5,9 Hz, IH), 5,27 (dd, J =9,2, J = 5,9 Hz, IH), 5,41 (d, J = 16,7 Hz, IH), ío 5,53 (d, J = 16,7 Hz, IH), 7,23 (t, J = 7,4 Hz, IH), 7,49 (m, 2H), 7,69 (d, J = 8,4 Hz, IH), 8,05 (s,

IH).

IV. Syntéza 4'-0-fosfonooxymethyletoposidu:

-22CZ 304020 B6

IVa. Syntéza 4'-0-fosfonooxymethyletoposid dibenzylesteru:

OBn

K roztoku chlormethyl dibenzylfosfátu (670 mg, 2,05 mmol), etoposidu (300 mg, 0,51 mmol) a tetrabutylamonium bromidu (164,4 mg, 0,51 mmol) v 0,5 ml tetrahydrofuranu byl přidán práškovaný uhličitan draselný (352,4 mg, 2,55 mmol). Vzniklá reakční směs byla intenzivně míchána 35 minut při laboratorní teplotě. Směs byla poté přímo čištěna sloupcovou flash chromatografií na silikagelu (30:1 dichlormethan/methanol) za vzniku 272 mg (61% výtěžek) titulní sloučeniny ve formě bílé tuhé látky s více než 95 % zachováním trans stereochemie.

FABMS+(NBA): [MH]⁺, m/z 879.

’H NMR (400 MHz, CDC1₃, δ): 1,41 (d, J = 5,0 Hz, 3H), 2,79 (br s, 1H), 2,86 (m, 1H), 2,97 (br s, 1H), 3,30 (dd, J = 14,2, J = 5,3 Hz, 1H), 3,35 (m, 2H), 3,45 (t, J = 8,5, J = 8,0 Hz, 1H), 3,59 (m, 1H), 3,66 (s, 6H), 3,74 (m, 1H), 4,19 (m, 1H), 4,20 (t, J = 8,5, J = 8,0 Hz, 1H), 4,42 (dd, J = 10,3, J = 9,1 Hz, 1H), 4,60 (d, J = 5,2, 1H), 4,64 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,76 (q, J = 5,0 Hz, 1H), 4,92 (d, J = 3,4 Hz, 1H), 5,03 (dd, J = 7,3, J = 4,3 Hz, 4H), 5,54 (dd, J = 11,7, J = 5,1 Hz, 1H), 5,59 (dd, J = 11,3, J = 5,1 Hz, 1H), 5,99 (d, J = 3,5 Hz, 2H), 6,26 (s, 2H), 6,51 (s, 1H), 6,84 (s, 1H), 7,33 (m, 10H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃, δ): 20,21, 37,49, 41,00, 43,78, 56,07, 66,32, 67,87, 67,97, 69,06, 69,14, 73,01, 73,29, 74,47, 79,70, 92,55, 92,62, 99,70, 101,57, 101,72, 107,89, 109,13, 110,55, 127,82, 127,97, 128,15, 128,35, 128,43, 132,40, 133,08, 135,68, 135,78, 136,49, 147,14, 148,73, 152,18, 174,90.

-23CZ 304020 B6

IVb. Syntéza 4'-O-fosfonooxymethyletoposidu:

K roztoku 4'-O-fosfonooxymethyletoposid dibenzylesteru (20,5 mg, 0,023 mmol) ve 2 ml tetrahydrofiiranu bylo přidáno paladium na uhlíku (10%, 5 mg). Směs byla míchána pod atmosférou vodíku (1 atm) 10 minut. Katalyzátor byl odstraněn filtrací přes Celit a tetrahydrofuranu byl odpařen za sníženého tlaku. Vzniklý zbytek byl sušen ve vakuu za vzniku 16 mg (100% výtěžek) io titulní sloučeniny ve formě bílé tuhé látky.

FABMS+(NBA): [MH]⁺, m/z 699.

’H NMR (400 MHz, CDClj / DMSO-d₆, δ): 1,29 (d, J = 5,0 Hz, 3H), 2,78 (m, 1H), 3,21 (m, 2H), 3,29 (t, J = 8,6, J = 7,8 Hz, 1H), 3,37 (dd, J = 14,0, J = 5,3 Hz, 1H), 3,52 (m, 2H), 3,62 (s, 6H), 4,09 (m, 1H), 4,17 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 4,38 (dd, J = 8,8, J = 8,7 Hz, 1H), 4,44 (d, J = 7,6 Hz, 1H),

4,48 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 4,66 (q, J = 5,0 Hz, 1H), 4,88 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 5,05 (br s, 7H), 5,40 (dd, J = 10,7, J = 7,8 Hz, 1H), 5,43 (dd, J = 10,4, J = 7,5, 1H), 5,89 (dd, J = 8,8 Hz, 1H), 6,18 (s, 2H), 6,41 (s, 1H), 6,78 (s, 1H),

-24CZ 304020 B6

IVc. Syntéza disodné soli 4'-0-fosfonooxymethyletoposidu

K roztoku 4'-0-fosfonooxymethyletoposid dibenzylesteru (200 mg, 0,227 mmol) v 10 ml tetrahydrofuranu bylo přidáno paladium na uhlíku (10%, 45 mg). Směs byla míchána pod atmosférou vodíku (1 atm) 25 minut. Katalyzátor byl odstraněn filtrací přes Celit. Filtrát byl odpařen za sníženého tlaku a zbytek byl sušen ve vakuu. Vzniklá bílá tuhá látka byla rozpuštěna ve vodném roztoku hydrogenuhličitanu sodného (2,9 ml 0,136 M = 0,394 mmol). Vzniklá heterogenní směs byla smíchána s aktivním uhlíkem, míchána několik minut a poté zfiltrována přes 40 pm filtrační jednotku. Homogenní bezbarvý filtrát byl lyofilizován za vzniku 140 mg (96% výtěžek) titulní sloučeniny ve formě bílé tuhé látky s více než 95% zachovanou trans stereochemií.

FABMS+(NBA): [MH]⁺, m/z 743, [N - Na + 2H]⁺, m/z 721, [M - 2Ma + 3H]⁺, m/z 699.

’H NMR (400 MHz, D₂O, δ): 1,37 (d, J = 5,1 Hz, 3H), 3,10 (m, 1H), 3,37 (dd, J = 8,9, J = 8,0 Hz, 1H), 3,48 (m, 2H), 3,65 (m, 3H), 3,75 (s, 6H), 4,29 (dd, J = 10,4, J = 4,5 Hz, 1H), 4,41 (t, J = 8,3, J = 8,0 Hz, 1H), 4,49 (dd, J = 10,5, J = 8,9 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,74 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,91 (g, J = 5,0 Hz, 1H), 5,13 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 5,26 (2xd, J = 5,3, J = 3,3 Hz, 1H), 5,28 (2xd, J = 5,3, J = 3,3, 1H), 5,98 (d, J = 10,5 Hz, 2H), 6,40 (s, 2H), 6,58 (s, 1H), 7,00 (s, 1H).

¹³C NMR (125 MHz, D₂O, δ): 22,13, 40,74, 43,56, 46,11, 59,12, 68,70, 70,41, 72,40, 75,46, 75,95, 76,95, 82,46, 94,87, 102,88, 103,66, 104,62, 111,14, 112,82, 113,23, 130,73, 135,45, 135,74, 140,22,149,56,151,43, 154,94, 166,36,181,61.

³¹P NMR (200 MHz, D₂O, δ): s (2, 19).

V. Syntéza fosfonooxymethylačních činidel

Va. Syntéza chlormethyldibenzylfosfátu

O

Ag⁺O-P-(OBn)₂

Cl

62%

O

II

Cl—C-O-P—(OBn)₂ ^H2

-25CZ 304020 B6

K refluxovanému roztoku chlorjodmethanu (25 g 97% čistoty, 0,14 mol) v toluenu (HPLC čistota, 30 ml) byl přidán dibenzylfosfát stříbrný (7,0 g, 0,018 mol) v několika porcích během 20 minut. Reakce byla zahřívána k varu další hodinu. Poté byla reakční směs ochlazena na pokojovou teplotu a zfíltrována, rozpouštědlo bylo odpařeno za sníženého tlaku. Olejovitý zbytek byl čištěn flash chromatografií na sloupci silikagelu (7:3 hexan/ethylacetát) za vzniku 3,63 g (62 % výtěžek) titulní sloučeniny ve formě žlutého oleje.

FABMS+(NBA): [MH]⁺, m/z 327.

'H NMR (300 MHz, CDC1₃, δ): 5,10 (d, J = 8,0 Hz, 4H), 5,63 (d, J = 15,7 Hz, 2H), 7,36 (s, 10H). ¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃, δ): 69,68, 69,75, 73,33, 73,42, 127,93, 128,51, 128,63,135,07. Syntéza dibenzyl(p-toluensulfonmethyl)fosfátu:

O /—\ °

Cl—C-O-P—(OBn)₂ -|Me—V V-SQp Ag* -- TsO-C-O-P—(OBn), ^H2 \=/ 99% H₂

K míchanému roztoku p-toluensulfonátu stříbrného (600 mg, 2,15 mmol) ve 3 ml suchého acetonitrilu byl přidán chlormethyldibenzylfosfát (150 mg, 0,46 mmol) pod atmosférou argonu. Reakční směs byla míchána 21 hodin při laboratorní teplotě, rozpouštědlo bylo odpařeno a zbytek byl extrahován s etherem (3x3 ml). Spojené extrakty byly zfiltrovány a sušeny ve vakuu za vzniku 210 mg (99% výtěžek) titulní sloučeniny ve formě bílé tuhé látky.

EIMS: [MH]⁺, m/z 463.

*H NMR (300 MHz, CDC1₃, δ): 2,37 (s, 3H), 4,91 (2 x d, J = 7,9 Hz, 4H), 5,61 (d, J = 14,2 Hz, 2H), 7,29 (m, 12H), 7,78 (d, J = 8,4 Hz, 2H).

S ohledem na výše uvedenou reakci Vb, jak je vysvětleno také výše v lb, činidlo:

II

Cl—C-O-P—(OBn)₂ H₂ může být obecně reprezentováno následujícím vzorcem:

kde všechny symboly mají stejný význam jak bylo definováno dříve. Vc. Syntéza formaldehydbis(dibenzyloxyfosfono)acetalu:

O

II

Ag⁺ O—P—(OBn)₂

O

II

90% (BnO)—P-O-C-P—(OBn) H,

-26CZ 304020 B6

K. roztoku dijodmethanu (4 ml, 50 mmol) v 15 ml suchého toluenu byl přidán dibenzylfosfát stříbrný (3,0 g, 7,8 mmol). Vzniklá směs byla refluxována po dobu 15 minut pod atmosférou argonu. Směs byla poté ochlazena na laboratorní teplotu a zfiltrována. Rozpouštědlo bylo poté odpařeno za vakua. Olejovitý zbytek byl čištěn flash sloupcovou chromatografíí na silikagelu (1:1 hexan/5 ethylacetát a poté ethylacetát) za vzniku žlutavého oleje, který poté vykrystalizoval za vzniku 1,97 g (90% výtěžek) titulní sloučeniny ve formě bílé tuhé látky, bod tání 39 až 42 °C.

CIMS (NH₃): [MH]⁺, m/z 569.

*H NMR (300 MHz, CDC1₃, δ): 5,03 (d, J = 7,9 Hz, 8H), 5,49 (t, J = 14,3 Hz, 2H), 7,30 (m, 20H).

¹³CNMR(75 MHz, CDC1₃, δ): 69,54, 69,61, 86,48,127,88,128,48,128,55,135,10, 135,20. io

VI. Syntéza O-Fosfonooxymethylcyklosporinu A:

Via. Syntéza O-methylthiomethylcyklosporin A:

cyklosporin A

DMSO

Ac^O

K suspenzi cyklosporinu A v dimethylsulfoxidu (250 ml) byl přidán acetanhydrid (125 ml) a 20 kyselina octová (35 ml). Heterogenní směs byla intenzivně míchána 24 hodin při laboratorní teplotě, nalita do 800 ml ledu, míchána 30 minut a poté extrahována s dichlormethanem (4 x 100 ml). Spojené dichlormethanové extrakty byly promyty vodou (2 x 100 ml) a sušeny nad síranem hořečnatým. Dichlormethan byl odstraněn za sníženého tlaku za vzniku produktu. Produkt byl dále čištěn pomocí sloupcové ehromatografie na silikagelu.

-27CZ 304020 B6

VIb. Syntéza O-fosfonooxymethylcyklosporin A dibenzylesteru:

K dobře míchané suspenzi O-methylthiomethylcyklosporinu A a práškovaných aktivovaných 4A molekulárních sít (5 g) ve 20 ml tetrahydrofuranu byla přidána suspenze N-jodsukcinimidu (2,00 g, 95% čistota, 8,44 mmol) a dibenzylfosfátu (2,20 g, 7,83 mmol) ve 12 ml methylenchloridu. Vzniklá směs byla intenzivně míchána 30 minut při laboratorní teplotě, zfiltrována a naředěna s 300 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt svodným roztokem thiosíranu sodného (10%, 2 x io 15 ml), vodou (2 x 20 ml), solankou (50 ml) a sušen nad síranem hořečnatým. Směs byla zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno za sníženého tlaku. Zbytek byl čištěn flash chromatografií na koloně silikagelu.

Víc. Syntéza O-fosfonooxymethylcyklosporinu A:

K roztoku O-fosfonooxymethylcyklosporinu A dibenzylesteru ve 100 ml tetrahydrofuranu a 5 ml vody bylo přidáno paladium na uhlíku (10%, 500 mg). Tato směs byla míchána pod atmosférou vodíku (1 atm) po dobu 35 minut. Katalyzátor byl odstraněn filtrací přes Celit. Celit byl promyt 300 ml tetrahydrofuranu a spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku. Vzniklá tuhá látka byla promyta s etherem (60 ml). Roztok byl zfiltrován, zakoncentrován při sníženém tlaku na přibližně 10 ml objem. Poté roztok stál 1 h za laboratorní teploty a byl dán přes noc do lednice. Krystalická sraženina, která se přes noc vytvořila, byla zfiltrována a sušena ve vakuu za vzniku titulní sloučeniny ve formě tuhé látky. Filtrát byl zakoncentrován na přibližně 1 ml objem a byl držen v lednici 1 h za vzniku dalšího produktu.

-28CZ 304020 B6

Biologické hodnoceni

Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou novými farmaceutickými činidly, reprezentativní sloučeniny obecného vzorce I byly vyhodnoceny v in vitro a in vivo studiích. Ve všech těchto studiích byly proléky převedeny na jejich farmaceuticky aktivní matečné sloučeniny.

(I) Odhad rozpustnosti propofolového proléku ve vodě

Rozpustnost propofolového proléku ve vodě je přibližně 500 mg/ml založeno na HPLC analýze nasycených vodných roztoků.

(II) in vitro konverze propofolového proléku na propofol

In vitro konverze propofolového proléku na propofol byla prováděna s využitím alkalické fosfatázy v glycinovém pufru pH 10,4. Bylo připraveno 25 ml 100 pg/ml roztoku propofolového proléku v glycinovém pufru. Jeden mililitr byl odebrán jako nulový časový bod a zbývajících 24 ml bylo umístěno do vodní lázně při 37 °C. Pak bylo ke 24 ml roztoku přidáno 960 μΐ 0,1 mg/ml alkalické fosfatázy v glycinovém pufru, roztoky byly smíchány a vráceny do vodní lázně. Pak byly odebírány 1,5 ml vzorky po 5, 10, 20, 30, 40, 60, 90,120, 180, 240 a 360 minutách. Ke každému vzorku bylo přidáno ihned 10 μΐ ledové kyseliny octové pro zastavení enzymatické reakce. Vzorky byly určovány HPLC na koncentraci propofolového proléku a propofolu. Výsledky in vitro konverse jsou shrnuty na Obrázku 1. Tyto výsledky demonstrují, že propofolový prolék je substrátem pro alkalickou fosfatázu.

(3) Vyhodnocení celkové toxicity u krys

Propofolový prolék byl připraven pro intravenosní injekci v koncentraci 68 mg/ml v 0,9% roztoku chloridu sodného, USP. Tato koncentrace je ekvivalentní 36 mg/ml propofolu. Roztok propofolového proléku byl před podáním zfiltrován přes 0,22 μιη nylonovou membránu.

Vyhodnocení propofolového proléku u krys bylo provedeno se dvěma krysami Harlen SpragueDawley (samice) o váze 820 a 650 g. Kiysa vážící 820 g dostala 200 μΐ propofolového proléku

i.v. formulace (ekvivalentní 9 mg/kg propofolu) do ocasní žíly. Vzorek krve byl odebrán z ocasní žíly (pomocí heparinizované stříkačky) po přibližně šesti minutách. Krevní vzorky od obou krys byly analyzovány na přítomnost propofolu pomocí HPLC.

Výsledky injekcí propofolového proléku byly u obou krys podobné. Obě krysy se staly nestabilními po několika minutách, ovšem nikdy neztratily jejich vzpřimovací reflex. Na základě vizuálního pozorování se obě krysy vzpamatovaly z injekce propofolového proléku. Krev odstraněná z obou krys potvrdila přítomnost propofolu prostřednictvím HPLC analýzy. Krysy nevykazovaly známky nepokoje vyvolané propofolovým prolékem.

(4) Farmakokinetické vyhodnocení u psů

Farmakokinetické studie včetně Diprivanu® nebo propofolového proléku byly provedeny u psa s dostatečně dlouhou klidovou dobou mezi studiemi. Koncentrace v krvi byly určovány pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem, zatímco mozková aktivita byla monitorována se dvěma olověnými elektrodami (EEG). Před nadávkováním psa byly psovi zavázány oči a nohy psa byly svázány aby byl omezen jeho pohyb a další vnější stimuly, takže efekt propofolu na psí mozkovou aktivitu mohl být co nejefektivněji sledován.

Vyhodnocení závislosti koncentrace propofolu v krvi na čase bylo provedeno se psem vážícím 13 kg. Před injekcí bylo odebráno přibližně 8 ml krve, která byla použita pro přípravu standardní křivky a úrovně koncentrace v čase nula. Pes dostal objem Diprivanu® nebo propofolového proléku ekvivalentní 7 mg/kg propofolu prostřednictvím injekce do cefalické žíly.

-29CZ 304020 B6

Dvoumililitrové vzorky krve byly odebrány buď z hlavové (nebyla to ta samá jaká byla použita pro injekci), krční nebo safenosní žíly (pomocí heparinizované stříkačky) po 1,3, 5, 10, 15, 20 a 30 minutách po injekci. Krevní vzorky byly také odebrány po 60, 90, 120, 180, 240, 300, 360,

480 a 1440 minutách. Krevní vzorky byly extrahovány aby byl odstraněn propofol bezprostředně po odebrání ze psa. Pes byl svázán po dobu přibližně 20 hod před obdržením Diprivanu® nebo formulace propofolového proléku. Po 120 minutách byl odebrán vzorek a pes byl ponechán aby se napil. Pes obdržel stravu 480 min po získání krevního vzorku. Pes měl pravidelnou stravu Hill's Science Diet Maintaince a byl denně na dvanáctihodinovém cyklu světlo/tma.

Koncentrace propofolu ve vzorcích krve byla určována pomocí HPLC s fluorescenční detekcí. Výsledky jsou shrnuty v obrázku 2. Extrakce krve a použité HPLC metody byly založeny na práci popsané Plummerem (1987) s mírnými modifikacemi. Příprava vzorku a použitá procedura stanovení je popsána dále:

K 1 ml vzorku krve bylo přidáno 10 μΐ thymolového vnitřního standardu (20 pg/ml) a 1 ml fosfátového pufru (0,1 M, pH 7,2), přičemž po každém přídavku bylo vzorkem zamícháno. Pak bylo přidáno 5 ml cyklohexanu a vzorek byl míchán při 75 otáčkách za minutu po dobu 20 až 30 minut. Organická vrstva byla oddělena 1 minutovou centrifugací při přibližně 2000 otáčkách za minutu. Přibližně 4,5 ml organické vrstvy bylo převedeno do zkumavky obsahující 50 μΐ roztoku ředěného hydroxidu tetramethylamonného (TMAH) o koncentraci přibližně 1,8% (w/v). Rozpouštědlo bylo odpařeno do sucha pod proudem dusíku a zbytek byl rekonstituován s 200 μΐ Mobilní fáze A. Vzorky byly centrifugovány při 15 000 otáčkách za minutu po dobu 30 sekund kvůli odstranění všech částeček a kapalina byla injektována do HPLC. Standardní křivka byla připravena s propofolem o koncentracích 5, 1, 0,5, 0,1 a 0,01 pg/ml. Tyto standardy byly zpracovány stejně jako vzorky.

HPLC systém se skládal z následujících komponent firmy Shimadzu: LC-10AT pumpa, SCL10A řídicí jednotka, RF 353 fluorescenční detektor a SIL-10A autodávkovač. HPLC parametry byly následující: excitace při vlnové délce 275 a emise při 320 nm, rychlost toku 1 ml/min, objem injekce byl 3 až 30 μΐ v závislosti na koncentraci propofolu. HPLC kolona byla Zorbax RX-C 18, cm x 4,6 mm vnitřní průměr, 5 μΐ, velikost částic. Mobilní fáze A byla 60:40 (v/v) acetonitril: 25 mM fosfát, 15 mM TBAP pufr pH 7,1. Mobilní fáze B byla 80:10:10 (v/v/v) acetonitril:voda:THF. Mobilní fáze B byla používána pro čištění kolony po eluování thymolu a propo35 folu s pomocí Mobilní fáze A (4,2 a 7,4 minut).

Pes vykazoval známky anesteze po injekci obou formulací vizuálně i na základě EEG. Pes se uzdravil s anesteze po obou formulacích během 20 až 30 minut. Koncentrace propofolu v krvi po injekci propofolového proléku byly přibližně stejné jako po injekci Diprivanu®.

(5) Odhad rozpustnosti camptothecinového proléku ve vodě

Rozpustnost camptothecinového proléku ve vodě je vyšší než 50 mg/ml podle vizuální a HPLC analýzy.

(6) Enzymatická studie camptothecinového proléku (p-cpt) pg/ml p-cpt bylo rozštěpeno s kyselou fosfatázou (0,02 jednotek/ml p-cpt roztoku). Médiem byl 0,09 M citrátový pufr, pH 4,8 a teplota byla 37 °C. Konverze p-cpt na camptothecin byla monitorována pomocí HPLC.

HPLC parametry:

MP: 24% pufr fosfátu draselného pH 4, 76% acetonitril

Kolona: Zorbax RX-C18, 15 cm x 4,6 mm vnitřní průměr, 5 pm velikost částic

-30CZ 304020 B6

Detekce: 370 nm UV

Rychlost toku: 1 ml/min

Kyselá fosfatáza z hovězí prostaty (Sigma). Výsledky jsou ukázány na obrázku 3. Výsledky ukazují, že camptothecinový prolék je substrátem pro fosfatázy.

(7) Farmakokinetická studie camptothecinového proléku u krys

Byly provedeny farmakokinetické experimenty včetně dávkování samic Sprague-Dawley krys s formulacemi camptothecinového proléku a camptothecinu. Dvě formulace camptothecinového proléku, které byly zkoušeny se skládaly z proléku rozpuštěného v 15 mM fosfátu, pH 4,0 a camptothecinu rozpuštěného v organickém korozpouštědle. Následuje souhrn farmakokinetických experimentů:

Objem formulace camptothecinového proléku nebo formulace camptothecinu byl připraven tak, aby při použité koncentraci byl ekvivalentní 1 mg camptothecinu na kg hmotnosti krysy. Formulace byla krysám podána s využitím kanuly zavedené do levé krční žíly krysy. Krevní vzorky byly odebrány prostřednictvím kanuly zavedené do pravé ocasní žíly krysy. Obě kanuly byly promyty heparinizovaným roztokem chloridu sodného před použitím a obsahovaly heparinizovaný roztok chloridu sodného během studií.

Krysy byly anestetikovány s pentobarbitalem sodným před zavedením kanul a byly udržovány pod anestezí pomocí pentobarbitalu sodného během studií. Krysy byly během studie umístěny na zahřívanou plotnu o teplotě 37 °C a tracheotomizovány. Krevní vzorky přibližně 150 μΐ byly odebírány před dávkováním a po 1, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60 a 90 minutách po podání formulací krysám.

Krevní vzorky byly umístěny do mikrocentrifugačních zkumavek a centrifugovány po dobu 20 sekund při rychlosti 15 000 otáček za minutu. Alikvot krevní plazmy (50 μΐ) z každého krevního vzorku byl převeden do druhé mikrocentrifugační zkumavky. K plazmě byl přidán 150 μΐ alikvot studeného acetonitrilu a preparát byl míchán 5 sekund. Pak byl přidán 450 μΐ alikvot studeného fosfátu sodného (0,1 M, pH 7,2). Obsah v mikrocentrifugačních zkumavkách byl míchán 5 sekund a centrifugován 20 sekund při rychlosti přibližně 15 000 otáček za minutu. Kapalina byla převedena do HPLC autodávkovaěe při 4 °C a analyzována (50 μΐ nástřiky).

HPLC systém se skládal z následujících komponent firmy Shimadzu: LC-10AT pumpa, SCL10A řídicí jednotka, RF 353 fluorescenční detektor a SIL-10A autodávkovač (nastavený na 4 °C) a CTO-10A kolonového pláště (teplota nastavena na 30 °C). HPLC parametry byly následující: excitace při vlnové délce 370 a emise při 435 nm, rychlost toku 2 ml/min. HPLC kolona byla Hypersil ODS, 15 cm x 4,5 mm vnitřní průměr, 5 pm velikost částic. Mobilní fáze byla 75% 25 nM fosfát sodný, pH 6,5/25% acetonitril (v/v) s 25 mM tetrabutylamonium dihydrogenfosfátu přidaném jako činidlo na vyrovnávání iontů.

Jak může být vidět z grafu (Obrázek 4) prolék zajišťuje koncentrace camptothecinu v krvi které jsou ekvivalentní s koncentracemi, které byly získány injekcí camptothecinu v organickém korozpouštědle. Graf poskytuje střední hodnotu se standardní odchylkou pro pět krys, které dostávaly prolék a šest krys, které dostávaly camptothecin.

Průmyslová využitelnost

Nové vodorozpustné proléky farmak obsahujících alifatickou nebo aromatickou hydroxylovou skupinu lze využít při přípravě farmaceutických preparátů se zvýšenou rozpustností ve vodě a tedy i lepšími farmakokinetickými vlastnostmi.

Claims (25)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sloučenina obecného vzorce I:

   kde R-O- je zbytek farmaceutické sloučeniny obsahující fenolovou skupinu, vybraný ze skupiny sestávající z propofolu, etoposidu, vitamínu E a alfa-tokoferolu,

   R¹ je vodík nebo ion alkalického kovu nebo protonizovaný amin nebo protonizovaná aminokyselina,

   R² je vodík nebo ion alkalického kovu nebo protonizovaný amin nebo protonizovaná aminokyselina, a n je celé číslo 1 nebo 2, nebo její farmaceuticky přijatelné soli.
2. 2. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1, kde farmaceutická sloučenina obsahující fenolovou skupinu je vybrána ze skupiny obsahující propofol, etoposid, vitamín E a a-tokoferol.
3. 3. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 2, kde farmaceutická sloučenina obsahující fenolovou skupinu je propofol.
4. 4. Sloučenina obecného vzorce I podle některého z nároků 1 až 3, kde R¹ a R² je nezávisle na sobě ion alkalického kovu vybraný ze skupiny sestávající ze sodíku, draslíku a lithia.
5. 5. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1 vybraná ze skupiny sestávající z:

   -32CZ 304020 B6 její farmaceuticky přijatelné soli.
6. 6. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 5, kde oba substituenty R¹ a R² jsou nezávisle na sobě vybrány ze skupiny sestávající ze sodíku, tromethaminu, triethanolaminu, triethylaminu, argininu, lysinu, ethanolaminu a N-methylglukaminu.
7. 7. Sloučenina obecného vzorce IV:

   kde R-O-je zbytek farmaceutické sloučeniny obsahující fenolovou skupinu, vybraný ze skupiny sestávající z propofolu, etoposidu, vitamínu E a alfa-tokoferolu,

   Y je fosfonochránicí skupina, a n je celé číslo 1 nebo 2, nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

   -33CZ 304020 B6
8. 8. Sloučenina obecného vzorce IV podle nároku 7, kde sloučenina je vybrána ze skupiny sestávající ze sloučenin;
9. 9. Sloučenina obecného vzorce IV podle nároku 7 nebo 8, kde fosfonochránicí skupina je vybrána ze skupiny sestávající z benzylové skupiny, t-buty,ové skupiny, allylové skupiny a dalších přijatelných fosfonochránicích skupin.
10. 10 10. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství sloučeniny podle nároků 1 až 9 a farmaceuticky přijatelný nosič.
11. 11. Sloučenina podle obecného vzorce (II)

    O —

    Crz* o-z* (Π)

    -34CZ 304020 B6 kde Z je vybráno ze skupiny složené z vodíku, iontu alkalického kovu a aminu, n je celé číslo 1 nebo 2 a její farmaceuticky přijatelné soli.
12. 12. Sloučenina podle nároku 11, kde oba substituenty Z jsou nezávisle na sobě vybrány ze sku piny sestávající ze sodíku, tromethaminu, triethanolaminu, triethylaminu, argininu, lysinu, etha nolaminu a N-methylglukaminu.
13. 13. Sloučenina podle nároku 11, kde Z je ion alkalického kovu.
14. 14. Sloučenina podle nároku 11, kterou je
15. 15. Sloučenina obecného vzorce IV

    R“O (IV) kde R-O je zbytek propofolu,

    Y je fosfonochránicí skupina, a n je celé číslo 1 nebo 2, nebo její farmaceuticky přijatelné soli.
16. 16. Sloučenina obecného vzorce V podle nároku 15 (V)

    -35CZ 304020 B6 kde Y je fosfonochránicí skupina.
17. 17. Sloučenina obecného vzorce IV podle nároku 15, kde fosfonochránicí skupina je vybrána ze skupiny sestávající z benzylové skupiny, t-butylové skupiny a allylové skupiny.
18. 18. Sloučenina obecného vzorce IV podle nároku 8, která je vybrána ze skupiny sestávající z Ofosfonoxymethylpropofol dibenzylesteru, O-fosfonoxymethyl-alfa-tokoferol dibenzylesteru, a 4'-O-fosfonoxymethyletopsid dibenzyl esteru.

    io
19. 19. Sloučenina podle nároku 5, která je vybrána ze skupiny sestávající z O-fosfonoxymethylpropofol disodné soli, O-fosfonoxymethyl-alfar-tokoferol disodné soli a 4'-O-fosfonoxymethyletopsid disodné soli.
20. 20. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje anti-tumorově účinné

    15 množství sloučeniny podle některého z nároků 11 až 17 a farmaceuticky přijatelný nosič.
21. 21. Sloučenina obecného vzorce III:

    (m) kde R-O- je zbytek farmaceutické sloučeniny obsahující fenolovou skupinu, vybraný ze skupiny sestávající z propofolu, etoposidu, vitamínu E a alfa-tokoferolu, nebo její farmaceuticky přijatelné soli.
22. 22. Sloučenina podle nároku 21, kde sloučenina je vybrána ze skupiny sestávající z

    -36CZ 304020 B6
23. 23. Způsob výroby sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 5, vyznačující se tím že se odstraní fosfochránicí skupina ze sloučeniny některého z následujících vzorců,

    -37CZ 304020 B6 kde Y je fosfonochránicí skupina,

    5 za vzniku produktu.
24. 24. Způsob výroby sloučeniny podle nároku 21, vyznačující se tím, že: sloučenina obecného vzorce R-O-H, kde R-O- je zbytek farmaceutické sloučeniny obsahující fenolovou skupinu, vybraný ze skupiny sestávající z propofolu, etoposidu, vitamínu E a alfaío tokoferolu, nebo její farmaceuticky akceptovatelná sůl, reaguje s dimethylsulfoxidem v přítomnosti acetanhydridu a kyseliny octové, za vzniku produktu.

    15 25. Způsob výroby sloučeniny podle nároku 7, vyznačující se tím, že sloučenina obecného vzorce III

    R (III)

    -38CZ 304020 B6 kde R-O-je zbytek farmaceutické sloučeniny obsahující fenolovou skupinu, vybraný ze skupiny sestávající zpropofolu, etoposidu, vitamínu E a alfa-tokoferolu, nebo její farmaceuticky akceptovatelné soli, reaguje s N-iodosukcinimidem a s chráněnou kyselinou fosforečnou vzorce HOP(O)(OY)₂, kde Y je fosfonochránicí skupina, za vzniku produktu.

    26. Způsob výroby sloučeniny podle nároku 25, vyznačující se tím, že se použije fosfonochránicí skupina vybraná ze skupiny obsahující benzylovou skupinu, t-butylovou skupinu ío a allylovou skupinu.

    27. Použití sloučeniny podle nároků 1 až 9, 11 až 19 pro přípravu léčiva.

    28. Použití podle nároku 27, kde léčivo je určeno pro orální podání.

    29. Použití podle nároku 27, kde léčivo je určeno pro parenterální podání.

    30. Použití podle některého z nároků 27 až 29, kde sloučenina je propofol a léčivo má anestetický účinek.

    31. Použití podle nároku 27, kde léčivo má anti-tumorovou aktivitu.

    32. Použití podle nároku 27, kde léčivo způsobuje celkovou anestézii, zahájení a udržování zklidnění při monitorované anesteziologické péči nebo zahájení a udržení zklidnění na jednotce
25. 25 intenzivní péče.