CZ20031340A3 - Laktamová sloučenina - Google Patents

Description

Laktamová sloučenina

Oblast techniky

Vynález se týká oblasti farmaceutické a organické chemie a zabývá se sloučeninou, která inhibuje uvolňování β-amyloidního peptidu a/nebo inhibuje jeho syntézu.

Dosavadní stav techniky

Určité laktamy, které inhibují uvolňování β-amyloidního peptidu a/nebo inhibují jeho syntézu, a současně jsou užitečné pro léčení Alzheimerovy choroby, jsou popsány v PCT přihlášce č.

PCT/US97/22986.

Tento vynález popisuje nový krystalický (N)-((S)-2-hydroxy-3methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5, 6, 7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrát, jeho složení, způsoby jeho použití, způsoby jeho výroby a způsoby výroby jeho meziproduktů. Krystalický dihydrát podle vynálezu jsou použitelný pro inhibici uvolňování β-amyloidního peptidu a/nebo inhibici jeho syntézy, a současně je použitelný pro léčení Alzheimerovy choroby.

Jelikož (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on je použitelný pro léčení Alzheimerovy choroby, existuje potřeba vyrábět ho v čisté, stabilní, krystalické formě za účelem splnění náročných farmaceutických požadavků a specifikací. Nový krystalický dihydrát podle vynálezu má vhodné vlastnosti, aby byl

obvyklým způsobem vpraven do běžných komerčních směsí, kterými jsou například tablety pro orální podávání.

Způsob, kterým se (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin2-on se vyrábí, musí být také vhodný pro výrobu v průmyslovém měřítku. Kromě toho by produkt měl být ve formě, která je snadno zfiltrovatelná, snadno sušitelná a pohodlně skladovatelná. A kromě toho má uvedený krystalický dihydrát vhodné vlastnosti pro výrobu a skladování.

Bylo zjištěno, že (N)-((S)-2-hydroxy-3- methylbutyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin2-on může být připraven ve formě dihydrátu, který .má výhodné vlastnosti a výrobní proces pro novou formu splňuje shora popsané vlastnosti.

Podstata vynálezu

Vynález řeší (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-l-amino~3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin2-on dihydrát.

V jiném provedení vynález řeší farmaceutickou kompozici obsahující (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrát a její farmaceuticky přijatelné rozpouštědlo.

V jednom z hledisek vynálezu je vynález zaměřen na způsob inhibice uvolňování β-amyloidního peptidů a/nebo inhibice jeho syntézy, při které se podává pacientovi, který to potřebuje, účinné množství (N) ((S)-2-hydroxy-3~methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on

dihydrátu. V konkrétním provedení vynález řeší způsob léčení Alzheimerovy choroby, při kterém se pacientovi, který to potřebuje, podává účinné množství (N)-((S)-2-hydroxy-3methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5, 5, 7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrátu. Tento vynález také řeší způsob prevence nebo inhibice rozvoje Alzheimerovy choroby, při které se podává pacientovi, který to potřebuje, účinné množství (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3methyl-4,5,6,-7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrátu.

To znamená, že vynález řeší použití (N)-((S)-2-hydroxy-3methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrátu pro výrobu léčiva pro inhibici uvolňování β-amyloidního peptidu a/nebo inhibici jeho syntézy, včetně léčení Alzheimerovy choroby.

V další provedení řeší vynález způsob výroby (N)-((S)-2hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrátu.

V ještě dalším provedení řeší vynález způsob výroby laktamů, mezi které patří (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2-H-3benzazepin-2-on a způsoby výroby jeho meziproduktů.

Podrobný popis vynálezu

Termín, jak se zde používá, znamená:

Termín ee nebo enantiomerní přebytek znamená procenta, o které je jeden enantiomer, Ei, v přebytku ve směsi obou enantiomerů (Ei + E₂) , počítáno podle rovnice ( (E_x - E₂) / (Ei + E₂) ) x 100 % = ee. Jak je v dosavadním stavu techniky dostatečně známo,

·· ·· .··.···:

. · · · · · · • · · ; ϊ .

·· ♦ · · · i • · · · · · · ······ ·· ·· enantiomerní přebytek může být definován kapilární eletroforézou a chirální HPLC sloučenin nebo jejich derivátů.

Pro označení konkrétních isomerů se používá Cahn-PrelogIngoldovo označení (R)— a.(S)~ a označení L- a D- pro stereochemické rozlišení ve vztahu k isomerům glyceraldehydu.

Vynález řeší (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin2-on dihydrát, a konkrétně krystalický (N)-((S)-2-hydroxy-3methyl- butyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5, 6,Ίtetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrát.

Pro získání krystalických forem organických sloučenin je známo mnoho metod. Například metody diferenční skenovací kalorimetrie, NMR spektrometrie v pevné fázi, infračervené spektroskopie a práškové rentgenové difrakce. Mezi těmito metodami jsou pro identifikaci a rozlišení krystalických modifikací velmi dobře použitelné NMR spektrometrie v pevné fázi a prášková rentgenová difrakce.

Prášková rentgenová difrakce byla provedena následujícím způsobem. Buď bez rozdrcení nebo s lehkým rozdrcením vzorku v achátovém hmoždíři s tloučkem byl vzorek naplněn do vzorkovače, v němž bylo provedeno měření práškové rentgenové difrakce. Obrazce práškové rentgenové difrakce byly měřeny pomocí Siemens D5000 rentgenového práškového difraktometru vybaveného zdrojem CuK_a (λ = 1,54056 Á) pracujícím na 50 kV a 40 mA používající divergenční štěrbinu o velikosti 1 mm, přijímající štěrbinu 1 mm, a detekční štěrbinu 0,1 mm. Každý vzorek byl skenován mezi 4° a 35° (2Θ) s krokem o velikosti 0,02° a maximální skenovací rychlostí 3 sek/krok. Data byla zjišťována s použitím detektoru Kevex na bázi křemíku a lithia v pevné fázi. Optimálně se křemíkový • · • « · • ·· · <

standard se provádí rutinním způsobem pro kontrolu nastavení přístroj e.

V oboru krystalografie je dobře známo, že pro každou danou krystalickou formu se relativní intenzita a šířka píku u difrakčních píků mění v závislosti na mnoha faktorech, včetně vlivu výhodné orientace a/nebo velikosti částice. Tam, kde je přítomen vliv výhodné orientace a/nebo velikosti částice, intenzity píku se mohou měnit, ale charakteristické pozice píku polymorfu jsou nezměněny. Viz, například The United States Pharmacopoeia #24, National Formulary #19,strany 1843-1844, 2000.

Aby bylo dosaženo minimalizace změn intenzity u píků některých zde uvedených difraktogramů, bylo použito drcení. Nicméně, jestliže se po drcení výrazně změnil difraktogram nebo se změnil krystalický stav vzorku, se musí použít difraktogram nedrceného vzorku. Drcení bylo provedeno v malém achátovém hmoždíři s tloučkem. Hmoždíř byl v průběhu drcení držen a na tlouček bylo použito mírného tlaku.

Místo píku bylo získáno na hodnotě 2Θ a intenzity píku u nejvýraznějších znaků (relativní intenzita vyšší než 20 %) byly měřeny s použitím metody dvojité derivace píku.

V souladu s tím je vynález zaměřen na krystalický (N)—((S)—2— hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrát, charakterizovaným difraktogramy rentgenové práškové difrakce, uvedenými v tabulce 1, která vyjmenovává 2Θ hodnoty a relativní intenzity (I_o/Ii₀o) vyšší než 20 %, měřeno pro nedrcený vzorek a pro vzorky po 5 a 10 minutách drcení a s použitím shora uvedené metodologie s využitím CuK_a radiace:

• · • ····

Tabulka 1

nedrcený		5 min.	drcení	10 min.	drcení
2θ(°) Io/I	loo ( % )	2Θ (°)	Io/Iloo(%)	2Θ (°)	Ιο/ Iloo ( %
8,361	100	8,349	87, 6	8,367	88, 7
12,433	51,4	12,429	78,5	12,424	91, 6
		13, 24	27,9	13,254	30, 4
15,344	49, 8	15,336	100	15,352	100
		16,858	28,5	16, 88	28, 3
19,224	27,9	19,233	47,8	19, 24	52
20,495	27,5	20, 48	44,4
20, 63	38, 8	20,644	43	20,601	48, 9
		22,254	19, 5	22,045	21, 6
		22, 63	27, 6	22,654	34,9
		24,388	26, 4	23,388	19, 7

24,387 28,2

27,744 19

22,237 21,2

Intenzity vzorků drcených po dobu 5 a 10 minut jsou reprezentativnější pro difrakční obrazec tam, kde bylo dosaženo minimalizace vlivu výhodné orientace a/nebo velikosti částic. Je třeba také poznamenat že v této tabulce jsou uváděny hodnoty pro nedrcené vzorky, generované počítačem.

Správně připraveny krystalický (N)-((S)-2-hydroxy-3methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5, 6, 7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrát je charakterizován obrazci rentgenové difrakce ve 2Θ hodnotách s použitím CuKa radiace, která mí píky uvedené v tabulce 1, a konkrétně mají píky 8,36, 12,43, 15,34, 19,22, 20,50, nebo 20,63; konkrétněji mají píky 8,36, 12,43, nebo 15,34; píky 8,36 a 12,43; 8,36 a 15,34;

• · · ·

·. ........ *·

8, 36, 12,43, a 15,34; nebo 8,36, 12,43, 15, 34, 19, 22, 20, 50, a 20,63.

Krystalický (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(Lalaninyl) - (S) -l-amino-3-irtethyl-4, 5, 6, 7-tetrahydro-2H-3-benzazepin2-on dihydrát je rovněž charakterizován NMR spektroskopií v pevné fázi. Chemické posuny ¹³C v pevné fázi odrážejí nejen molekulární strukturu, ale také stav elektronů v molekule krystalu.

s' '

Analýza NMR (¹³C) v pevné fázi se může provádět s použitím metody ¹³C křížové polarizace/spin magického úhlu(CP/MAS). Spektra NMR (NMR v pevné fázi nebo SSNMR) byla získána s použitím spektrometru Varian Unity 400 MHz pracujícím na uhlíkové frekvenci 100,580 MHz, vybaveného kompletním přídavným zařízením pevné látky a sondou Varian 7 mm VT CP/MAS. Parametry pro měření byly následující: 90° protonová r.f. pulsní šířka 4.0 ps, doba kontaktu 1.0 ms, pulsní opakovači doba 5 s, MAS frekvence 7.0 kHz, spektrální šířka 50 kHz, doba shromažďování dat 50 ms. Chemické posuny byly zjištěny jako methylová skupina externího hexamethylbenzenu (5=17,3 ppm), to je, například nahrazení hexamethylbenzenem.

Hodnoty chemického posunu pro (N)-((S)-2-hydroxy~3methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6, 7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrátu (založeno na vyhodnocení plků, dále) jsou uvedeny v tabulce 2.

·· ···· • · • · · • ·· · ·

Pozice	Roztok v DMSO	Dihydrát (pevný)
2, 13, 16	69,27,	171,73, 172,89	169, 9*, 174,1*, 176, 7*
3, 11, 14	51,45,	47,05, 47,72	46,9, 51,3
4	134,14		134,8*
5, 6	124,18,	125,99	124,0
7	127,19		127,9, 128,9
8	130,38		132,1
9	135,32		136,9*
10, 18	30,73,	31,29	31,1
17	75, 01		75, 6
19, 20, 22	15, 99,	18,66, 19,13	16,6*, 21,4*
21	34, 18		35, 3*

Hvězdička (*) označuje píky objevující se v přerušeném.

spektru.

Krystalický (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4, 5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin

2-on dihydrát tedy je charakterizován chemickým posunem ¹³C nukleární magnetické resonance v pevné fázi (ppm) 16,6; 176,7,

174.1, 169,9, 136, 9, 134, 8, 132,1, 127, 9, 128,9, 124,0, 75,6,

51.3, 46, 9, 35, 3, 31,1, 21,4, nebo 16,6; nebo přesněji 75, 6, 35,3

21.4, nebo 16,6; kterékoliv dvě 75,6, 35, 3, 21,4, a 16,6; 75,6, 35,3, 21,4, a 16,6; nebo na 176, 7, 174,1, 169, 9, 136, 9, 134, 8,

132.1, 127,9, 228,9, 124,0, 75,6, 51,3, 46,9, 35,3, 31,1, 21,4, a 16, 6.

V jiném provedení vynálezu je způsob výroby (N)—((S)—2— hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrátu zahrnující krystalizaci (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu z • · ·· ···· vodných rozpouštědel za podmínek, při nichž vzniká (N)-((S)-2hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrát.

Přesné podmínky, za nichž vzniká (N)-((S)-2-hydroxy-3methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4, 5, 6, 7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrát lze empiricky specifikovat a existuje řada metod, které lze nalézt a jsou použitelné v praxi.

Například za kontrolovaných podmínek se dá krystalizací připravit (N)-((S)-2-hydróxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)1- amino-3-methyl-4,5,6,7- tetrahydro-2-H-3-benzazepin-2-on dihydrát. V tomto procesu se například používá krystalizace z roztoku a techniky pro získávání kalů. V konkrétním provedení se může připravit dihydrát podle vynálezu krystalizací z vodného rozpouštědla. Vhodným rozpouštědlem, umožňujícím získání dihydrátu, je jedno z těch, které jsou schopny obsahovat při používaných koncentracích dostatek vody. Výhodnými rozpouštědly jsou ty, které jsou mísitelné s vodou, jako je aceton, nižší alkoholy (jako je methanol, ethanol, a isopropanol), kyselina octová a acetonitril. V skutečnosti bylo zjištěno, že nejlepší je vodný aceton. Množství vody pro daná vodná rozpouštědla závisí na relativní rozpustnosti (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin

2- onu v rozpouštědle v porovnání s vodou a dále závisí na tom, zda je použita krystalizační nebo kalová metoda.

Krystalizace se obvykle provádí rozpuštěním (N)—((S)—2— hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl4,5, 6, 7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu ve vodném rozpouštědle následným umožnění roztoku, aby se ochladil, s nebo bez přídavku další vody, aby vznikla pevná látka. Obvykle se krystalizace ·· ···· • · · • ···· provádí při počáteční teplotě přibližně- 40°C k teplotě refluxu zvoleného vodného rozpouštědla. Směs se pak nechá ochladit, aby poskytla krystalický dihydrát. Očkování může být výhodné. Výhodně se ochlazování krystalizačního roztoku provádí pomalu.

Nejpohodlnější je ochlazování krystalovaného roztoku na teplotu okolí až do teploty asi -20°C.

V ještě dalším provedení vynálezu se řeší způsoby výroby laktamů, včetně (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4, 5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin

2-onu a způsobů výroby jeho meziproduktů.

Přesněji se v jednom způsobu provedení vynálezu řeší způsob výroby laktamů obecného vzorce I

Vzorec I kde

Ri je alkyl, alkenyl, alkinyl, cykloalkyl, cykloalkenyl, substituovaný alkyl, substituovaný alkenyl, substituovaný alkinyl, substituovaný cykloalkyl, substituovaný cykloalkenyl, aryl, heteroaryl a heterocyklus;

99

9 9

9

9 9

9 9 •w ····

9

R₂ je alkyl, substituovaný alkyl, alkenyl, substituovaný alkenyl, alkinyl, substituovaný alkinyl, cykloalkyl, aryl, heteroaryl a heterocyklus;

R₃ je alkyl,

Xi je vodík, hydroxy nebo fluor,

X₂ je vodík, hydroxy nebo fluoro, nebo

Xi a X₂ společně tvoří oxoskupinu; a

V je zvoleno z 1 až 3 skupin samostatně vybraných ze skupiny zahrnující vodík, hydroxy, acyl, acyloxy, alkyl, substituovaný alkyl, alkoxy, substituovaný alkoxy, alkenyl, substituovaný alkenyl, alkinyl, substituovaný alkinyl, amino, aminoacyl, alkaryl, aryl, aryloxy, karboxyl, karboxylalkyl, kyano, halogen, nitro, heteroaryl, thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy, a trihalomethyl;

zahrnuj ící:

(al) rozklad laktamu obecného vzorce (4)

kde R₃ a V byly již popsány pro sloučeninu obecného vzorce I, frakční krystalizací jejich dibenzoylvinanu, (R)-(-1012 ·· ·<

» · · · • · · • · · • · · «· ···* «· ···· « · • · • · · ♦ · · ♦ · ·· · • · » • · · · • · ··«« • · · ·· * kafrsulfonové kyseliny, a solí kyseliny (D)—(—)— mandlové poskytnou sloučeninu obecného vzorce (10)

(b) kopulaci s vhodnou aminokyselinou chráněnou amonoskupinou obecného vzorce PgNH-CHR₂-C (0)-A, kde R₂ má význam uvedený v obecném vzorci I a A je aktivační skupina, například -OH, -Br, nebo -Cl, a Pg je chránící aminoskupina, přičemž se tvoří sloučenina obecného vzorce

(c) odstranění chránící skupiny sloučeniny obecného vzorce (11), přičemž vzniká sloučenina obecného vzorce (12); a h₂n

(12) 0' • · (d) kopulaci sloučeniny obecného vzorce (12) s vhodnou sloučeninou obecného vzorce RiCXiX₂-C (0) Ai kde Ri, Xi, a X₂ jsou již popsány pro sloučeninu obecného vzorce I a Αχ je aktivační skupina, například -OH, -Br, nebo -Cl; nebo (a2) kopulaci sloučeniny obecného vzorce (10) se sloučeninou obecného vzorce RiCXiX₂-C (0) NH-CHR₂-C (0)-A, kde

Ri, R₂, Xi a X₂ mají význam uvedený ve sloučenině obecného vzorce I a A je aktivační skupina, například -OH, -Br nebo -Cl.

Jak je zde uvedeno, zde použité výrazy mají následující významy:

Alkyl znamená jednovaznou alkylovou skupinu, které má výhodně od 1 do 10 atomů uhlíku a ještě výhodněji od 1 do 6 atomů uhlíku. Příkladem tohoto výrazu jsou skupiny jako methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, iso-butyl, n-hexyl a pod.

Termín C1-C4 alkyl znamená jednovaznou alkylovou skupinu, která má výhodně od 1 do 4 atomů uhlíku. Příkladem jsou skupiny jako methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, iso-butyl, secbutyl a terc-butyl.

Substituovaný alkyl znamená alkylovou skupinu, která má výhodně od 1 do 10 atomů uhlímá od 1 do 5 substituentů, výhodně od 1 do 3 substituentů, vybraných ze skupiny zahrnující alkoxy, substituovaný alkoxy, cykloalkyl, substituovaný cykloalkyl, cykloalkenyl, substituovaný cykloalkenyl, acyl, acylamino, acyloxy, amino, aminoacyl, aminoacyloxy, kyano, halogen, hydroxyl, karboxyl, keto, thioketo, karboxylalkyl, thiol, thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy, aryl, aryloxy, heteroaryl, • · heteroarvloxy, heterocyklickou, hydroxyamino, alkoxyamino, |H|alkyl, -SO-substituovaný alkyl, -SO-aryl, -SO-heteroaryl, -S0₂alkyl, -S0₂-substituovaný alkyl, -SO₂-aryl, S0₂-heteroaryl, a monoa di-alkylamino, mono- a di-(substituovaný alkyl)amino, mono- a di-arylamino, mono- a di-heteroarylamino, mono- a diheterocyklickou aminoa nesymetrický disubstituovaný amin který má jinou substituci, zvolenou z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, heteroarylu a heterocyklického arylu.

Alkylen znamená dvojvaznou alkylenovou skupinu, která má výhodně od 1 do 10 atomů uhlíku a ještě výhodněji od 1 do 6 atomů uhlíku. Příkladem jsou skupiny jako methylen (-CH₂-) , ethylen (CH₂CH₂-) , izomery propylenu (např.: -CH₂CH₂CH₂- a -CH (CH₃) CH₂-) a pod.

Substituovaný alkylen znamená alkylenovou skupinu, která má výhodně od 1 do 10 atomů uhlíku, která má od 1 do 3 substituentů vybraných ze skupiny obsahující alkoxy, substituovaný alkoxy, acyl, acylamino, acyloxy, amino, aminoacyl, aminoacyloxy, kyano, halogen, hydroxyl, karboxyl, keto, thioketo, karboxylalkyl, thiol, thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy, aryl, heteroaryl, heterocyklus, nitro, a mono- a di-alkylamino, mono- a di(substituovaný alkyl) amino, mono- a di-arylamino, mono- a diheteroarylamino, mono- a di-heterocyklickou aminoskupinu, a nesymetrický di-substituovaný amin, který má jinou substituovanou skupinu vybranou z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, heteroarylu a heterocyklického arylu. Kromě toho, takovéto substituované alkylenové skupiny zahrnují ty skupiny, ve kterých jsou 2 substituenty na alkylenových skupinách kondenzovány, takže tvoří jeden nebo více cykloalkylů, arylu, heterocyklických nebo heteroarylových skupin kondenzovaných k alkylenové skupině.

Výhodně takovéto cykloalkylové skupiny obsahují 1 až 3 kondenzované struktury.

•· ···· • ·

Alkenylen znamená dvojvaznou alkenylenovou skupinu, která má výhodně 2 až 10 atomů uhlíku a ještě výhodněji 2 až 6 atomů uhlíku. Příkladem takových skupin jsou skupiny jako ethenylen (CH-CH-), izomery propenylenu (např. -CH₂CH-CH- a -C(CH₃)-CH-) a podobně.

Substituovaný alkenylen znamená alkenylenovou skupinu, výhodně s 2 až 10 atomy uhlíku, která má 1 až 3 substituenty vybrané ze skupiny zahrnující alkoxy, substituovaný alkoxy, acyl, acylamino, acyloxy, amino, aminoacyl, aminoacyloxy, kyano, halogen, hydroxyl, karboxyl, keto, thioketo, karboxylalkyl, thiol, thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy, aryl, heteroaryl, heterocyklo, nitro, a mono- a di-alkylamino, mono- a di(substituovaný alkyl) amino, mono- a di-arylamino, mono- a diheteroarylamino, mono- a di-heterocyklický amin, a nesymetrické di-substituované aminy, které mají odlišné substituenty vybrané ze skupiny zahrnující alkyl, substituovaný alkyl, aryl, heteroaryl a heterocyklus. Kromě toho, takovéto substituované alkylenové skupiny zahrnují ty skupiny, ve kterých 2 substituenty na alkylenových skupinách jsou kondenzovány, takže tvoří jeden nebo více cykloalkylů, arylů, heterocyklických nebo heteroarylových skupin kondenzovaných k alkylenové skupině.

Alkaryl znamená -alkylen-aryl skupiny, které mají výhodně od 1 do 8 atomů uhlíku v alkylenové skupině a od 6 do 10 atomů uhlíku v arylové skupině. Příkladem takových alkaryl skupin jsou benzyl, fenethyl a podobně.

Alkoxy znamená alkyl-O- skupinu. Výhodně alkoxylové skupiny zahrnují například methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, terc-butoxy, sek-butoxy, n-pentoxy, n-hexoxy,

1,2-dimethylbutoxy a podobně.

• · · ·

Substituovaný alkoxy znamená skupinu substituovaný alkyl0-, kde byl substituovaný alkyl byl shora definován.

Alkylalkoxy znamená skupinu -alkylen-O-alkyl, která zahrnuje například methylenmethoxy (-CH₂OCH₃) , ethylenmethoxy (CH2CH2OCH3) , n-propylen-isopropoxy (-CH₂CH₂CH₂OCH (CH₃) ₂) , methylen-t butoxy (--CH2-O-C (CH₃) ₃) a podobně.

Alkylthioalkoxy znamená skupinu -alkylen-S-alkyl, která zahrnuje například methylenthiomethoxy (-CH₂SCH₃) , ethylenthiomethoxy (-CH₂CH₂SCH₃) , n-propylen-thio-iso-propoxy (-CH₂CH₂CH₂SCH (CH₃) ₂) , methylenthio-t-butoxy (~CH₂SC (CH₃) ₃) a podobně.

Alkenyl znamená alkenylové skupiny, které mají výhodně 2 a: 10 atomů uhlíku a výhodněji 2 až 6 atomy uhlíku, které mají nejméně 1, výhodně 1-2 nenasycená alkenylová místa. Výhodné alkenylové skupiny zahrnují ethenyl (-CH-CH₂) , n-propenyl (~CH₂CH CH₂) , iso-propenyl (-C (CH₃) -CH₂) a podobně.

Substituovaný alkenyl znamená alkenylovou skupinu, jak byl; definována shora, která má 1 až 3 substituenty vybrané ze skupiny zahrnující alkoxy, substituovaný alkoxy, acyl, acylamino, acyloxy amino, aminoacyl, aminoacyloxy, kyano, halogen, hydroxyl, karboxyl, keto, thioketo, karboxylalkyl, thiol, thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy, aryl, heteroaryl, heterocyklus, nitro, · SO-alkyl, -SO-substituovaný alkyl, -SO-aryl, -SO-heteroaryl, -SO₂alkyl, -S0₂-substituovaný alkyl, -SO₂-aryl, -S0₂-heteroaryl, a mono- a di-alkylamino, mono- a di-(substituovaný alkyl) amino, mono- a di- arylamino, mono- a di-heteroarylamino, mono- a diheterocyklo amino, a nesymetrické di-substituované aminy, které • · mají odlišné substituenty vybrané ze skupiny zahrnující alkyl, substituovaný alkyl, aryl, heteroaryl a heterocyklus.

Alkinyl znamená alkinylové skupiny, které mají výhodně 2 až 10 atomů uhlíku a výhodněji 2 až 6 atomů uhlíku, které mají alespoň 1, výhodně 1-2 nenasycená alkinylová místa. Výhodné alkinylové skupiny zahrnují ethynyl (-CH=CH₂) , propargyl (-CH₂CsCH'j a podobně.

Substituovaný alkinyl znamená alkinylovou skupinu, jak byla definována shora, která má 1 až 3 substituenty vybrané ze skupiny zahrnující alkoxy, substituovaný alkoxy, acyl, acylamino, acyloxy, amino, aminoacyl, aminoacyloxy, kyano, halogen, hydroxyl, karboxyl, keto, thioketo, karboxylalkyl, thiol, thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy, aryl, heteroaryl, heterocyklus, nitro, SO-alkyl, -SO-substituovaný alkyl, -SO-aryl, -SO-heteroaryl, -SO₂alkyl, -S0₂-substituovaný alkyl, SO₂-aryl, -S0₂-heteroaryl, a monoa di-alkylamino, mono- a di-(substituovaný alkyl) amino, mono- a di- arylamino, mono- a di-heteroarylamino, mono- a diheterocyklo amino, a nesymetrické di-substituované aminy, které mají odlišné substituenty vybrané ze skupiny alkyl, substituovaný alkyl, aryl, heteroaryl a heterocyklus.

Acyl znamená skupiny alkyl-C(O)-, substituovaný alkylC(O)—, cykloalkyl-C(O)-, substituovaný cykloalkyl-C(0)-, arylC(0)-, heteroaryl-C(O)- a heterocyklo-C(0)-, kde alkyl, substituovaný alkyl, cykloalkyl, substituovaný cykloalkyl, aryl, heteroaryl a heterocyklus mají význam uvedený shora.

Acylamino znamená skupinu -C(0)NRR, kde každý R nezávisle znamená vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, heteroaryl, nebo heterocyklus, kde alkyl, substituovaný alkyl, aryl, heteroaryl a heterocyklus mají význam uvedený shora.

kde každý R nezávisle aryl, heteroaryl, nebo

• · · · · · • · ·· ·· ♦ ·· ·· • · · · • · · • · · · • · · ·· ····

Aminoacyl znamená skupinu -NRC(O)R, znamená vodík, alkyl, substituovaný alkyl, heterocyklus, kde alkyl, substituovaný alkyl, aryl, heteroaryl a heterocyklus mají význam uvedený shora.

Aminoacyloxy znamená skupinu -NRC(O)OR, kde každý R nezávisle znamená vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, heteroaryl, nebo heterocyklus, kde alkyl, substituovaný alkyl, aryl, heteroaryl a heterocyklus mají význam uvedený shora.

Acyloxy znamená skupiny alkyl-C(0)0-, substituovaný alkylC(0)0-, cykloalkyl-C(0)0-, aryl-C(0)0-, heteroaryl-C(0)0-, a heterocyklo-C(0)0-, kde alkyl, substituovaný alkyl, cykloalkyl, aryl, heteroaryl, a heterocyklus mají význam uvedený shora.

Aryl znamená nenasycenou aromatickou karbocyklickou skupinu s 6 až 14 atomy uhlíku, která má jednoduchý kruh (např. fenyl) nebo vícekrát kondenzované (kondenzované) kruhy (např. naftyl nebo anthryl). Výhodné aryly zahrnují fenyl, naftyl a podobně. Pokud není uvedeno jinak v definici pro arylové substituenty, takové arylové skupiny mohou být případně substituovány 1 až 5 substituenty vybranými ze skupiny zahrnující acyloxy, 1 až 5, a výhodně 1 až 3 substituenty vybranými ze skupiny zahrnující hydroxy, acyl, alkyl, alkoxy, alkenyl, alkinyl, substituovaný alkyl, substituovaný alkoxy, substituovaný alkenyl, substituovaný alkinyl, amino, aminoacyl, acylamíno, alkaryl, aryl, aryloxy, azido, karboxyl, karboxylalkyl, kyano, halogen, nitro, heteroaryl, heterocyklo, aminoacyloxy, oxyacylamino, thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy, thioaryloxy, thioheteroaryloxy, -S0alkyl, -SO-substituovaný alkyl, -SO-aryl, -SO-heteroaryl, -S0₂alkyl, -S0₂-substituovaný alkyl, S0₂-aryl, -S0₂-heteroaryl, trihalogenmethyl, mono- a di-alkylamino, mono- a di-(substituovaný ·· · ·· ·· β 9 · · • 9 · 9·· 9···

9 ♦ · · ···· ····

999 9··· · · ·

99999· ·· ·· *· * alkyl) amino, mono- a di-arylamino, mono- a di-heteroarylamino, mono- a diheterocyklo amino, a nesymetrické di-substituované aminy, které mají odlišné substituenty, vybrané ze skupiny zahrnující alkyl, substituovaný alkyl, aryl, heteroaryl a heterocyklus a podobně. Výhodné substituenty zahrnují alkyl, alkoxy, halogen, kyano, nitro, trihalogenmethyl, a thioalkoxy.

Aryloxy znamená skupinu aryl-Ο-, kde arylová skupina má význam uvedený shora, včetně případně substituované arylové skupiny rovněž popsané shora.

Karboxyal.kyl znamená skupinu -C(0)0 alkyl, kde alkyl má význam uvedený shora.

Cykloalkyl znamená cyklické alkyl skupiny se 3 až 12 atomy uhlíku, které mají jeden cyklický kruh nebo vícenásobně kondenzované kruhy, kondenzovaných, můstkových a spiro bicyklických nebo multicyklických sloučenin. Takové cykloalkylové skupiny zahrnují například struktury s jednoduchým kruhem, jako jsou cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklooktyl a podobně nebo struktury s vícenásobným kruhem, jako je adamantanyl a podobně.

Substituovaný cykloalkyl znamená cykloalkylové skupiny, které mají 1 až 5 (výhodně 1 až 3) substituenty vybrané ze skupiny zahrnující hydroxy, acyl, acyloxy, alkyl, substituovaný alkyl, alkoxy, substituovaný alkoxy, alkenyl, substituovaný alkenyl, alkinyl, substituovaný alkinyl, amino, amínoacyl, alkaryl, aryl, aryloxy, keto, thioketo, karboxyl, karboxylalkyl, kyano, halogen, nitro, heteroaryl, thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy, trihalogenmethyl a podobně.

·· 0

Cykloalkenyl znamená cyklické alkenylové skupiny s 4 až 8 atomy uhlíku, které mají jeden cyklický kruh a alespoň jedno místo vnitřního nenasycení. Příklady vhodných cykloalkenylových skupin jsou například cyklobut-2-enyl, cyklopent-3-enyl, cyklookt-3-enyl a podobně.

Substituovaný cykloalkenyl znamená cykloalkenylové skupiny, které mají 1 až 5 substituentů vybraných ze skupiny zahrnující hydroxy, acyl, acyloxy, alkyl, substituovaný alkyl, alkoxy, substituovaný alkoxy, alkenyl, substituovaný alkenyl, alkinyl, substituovaný alkinyl, amino, aminoacyl, alkaryl, aryl, aryloxy, karboxyl, keto, thioketo, karboxylalkyl, kyano, halogen, nitro, heteroaryl, thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy, trihalogenmethyl a podobně.

Halo nebo halogen znamená fluor, chlor, brom a jod, výhodně fluor nebo chlor.

Heteroaryl znamená aromatickou karbocyklickou skupinu s 1 až 15 atomy uhlíku a 1 až 4 heteroatomy vybranými ze skupiny zahrnující kyslík, dusík a síru alespoň na jednom kruhu (pokud má více než jeden kruh).

Pokud není v definici pro heteroarylové substituenty uvedeno jinak, mohou být takové heteroarylové skupiny případně substituovány 1 až 5 substituenty vybranými ze skupiny zahrnující alkyl, substituovaný alkyl, alkoxy, substituovaný alkoxy, aryl, aryloxy, halogen, nitro, heteroaryl, thiol, thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy, thioaryloxy, trihalogenmethyl a podobně. Takové heteroarylové skupiny mohou mít jednoduchý kruh (např. pyridyl nebo furyl) nebo vícenásobně kondenzované kruhy (např. indolizinyl nebo benzothienyl), včetně kondenzovaných, můstkových

0000

0 0 0 • 0 · 00000 a spiro bicyklických nebo multicyklických sloučenin. Výhodné heteroaryly zahrnují pyridyl, pyrrolyl a furyl.

Heterocyklus nebo heterocyklický znamená jednovaznou nasycenou nebo nenasycenou skupinu, která má jednoduchý kruh nebo vícenásobně kondenzované kruhy, včetně kondenzovaných, můstkových a spiro bicyklických nebo multicyklických sloučenin, které mají 1 až 15 atomů uhlíku a od 1 do 4 heteroatomů, vybraných z ze skupiny zahrnující dusík, síru nebo kyslík uvnitř kruhu

Pokud není v definici heterocyklického substituentu uvedeno jinak, mohou být takové heterocyklické skupiny popřípadě substituovány 1 až 5 substituenty vybranými ze skupiny zahrnující alkyl, substituovaný alkyl, alkoxy, substituovaný alkoxy, aryl, aryloxy, halogen, nitro, heteroaryl, thiol, thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy, thioaryloxy, trihalogenmethyl, a podobně. Takové heterocyklické skupiny mohou mít jednoduchý kruh nebo vícenásobně kondenzované kruhy. Výhodné heterocykly zahrnují morfolin, piperidinyl, a podobně.

Příklady dusíkatých heterocyklů a heteroarylů jsou pyrrol, imidazol, pyrazol, pyridin, pyrazin, pyrimidin, pyridazin, indolizin, isoindol, indol, indazol, purin, chinolizin, isochinolin, chinolin, fthalazin, naftylpyridin, chinoxalin, chinazolin, cinnolin, pteridin, karbazol, karbolin, fenanthridin, akridine, fenantrolin, isothiazol, fenazin, isoxazol, fenoxazin, fenothiazin, imidazolidin, imidazolin, piperidin, piperazin, indolin, morfolin, piperidinyl, tetrahydrofuranyl, a podobně, stejně jako heterocykly obsahující N-alkoxy-dusíkovou skupinu, ale nejsou na ně omezeny.

Oxyacylamino znamená skupinu -OC(O)NRR, kde každý R znamená nezávisle vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, ·· ···· ·· ·· • · · · · • · · · • · · · · • · · · ·· ·· ·· • · • · · • »··· ²² heteroaryl, nebo heterocyklus, kde alkyl, substituovaný alkyl, aryl, heteroaryl a heterocyklus mají význam uvedený shora.

Thiol znamená skupinu -SH.

Thioalkoxy znamená skupinu -S-alkyl.

Substituovaný thioalkoxy znamená skupinu -S-substítuovaný alkyl.

Thioaryloxy znamená skupinu aryl-S-, kde arylová skupina má význam uvedený shora, včetně popřípadě substituované aryl skupiny s významem rovněž uvedeným shora.

Heteroaryloxy znamená skupinu heteroaryl-o-, kde heteroarylová skupina, jak byla popsána shora, případně substituovaná arylovými skupinami, jak byly rovněž popsány shora.

V určitých provedeních vynález popisuje způsob výroby sloučeniny vzorce (4), jak je popsáno v schématu 1 a 2. V dále uvedených schématech, byly všechny substituenty popsány shora, pokud není uvedeno jinak a všechna činidla jsou dobře známa v dosavadním stavu techniky.

Schéma 1 krok 1

o ň \ krok 3

t -x k ·« ·· • · · • · · « • · ♦ · · • 9 · · ·· ···· ·· ··*· ·· · • · · • ···· • ·

Ve schématu 1, krok 1, je vhodný N-alkylfenethylamin vzorce (1) acylován vhodným bisalkoxykarbonylacetatovým přenosovým činidlem za vzniku sloučeniny vzorce (2). Vhodný Nalkylfenethylamin vzorce (1) je takový, ve kterém V a R₃ jsou takové, jaké jsou požadovány v konečném produktu vzorce I.

Takové N-alkylfenethylaminy jsou snadno připravovány reakcí

2-brom nebo 2-chlorethylbenzenu, za podmínek známých v dosavadním stavu techniky, s aminem vzorce H₂N-R₃. Vhodné bisalkoxykarbonylacetatové přenosové činidlo je takové, ve kterém R₄ je C1-C4 alkyl a přenáší bisalkoxykarbonylacetylovou skupinu na sloučeninu vzorce (1), jako jsou bisalkoxykarbonyloctové kyseliny bisalkoxykarbonylacyl chloridy, (viz Ben-Ishai, Tetrahedron, 43, 439-450 (1987)).

Například vhodný N-alkylfenethylamin vzorce (1) je uváděn do kontaktu s vhodnou bisalkoxykarbonyloctovou kyselinou za vzniku sloučeniny vzorce (2). Tyto kopulace jsou běžné u syntézy peptidů a postupy syntézy, které jsou přitom používány, mohou být využity i zde. Například pro provedení této acylace mohou být použita známá kopulační činidla, jako jsou karbodiimidy s nebo bez použití známých aditiv, jako jsou N-hydroxysukcinimid, 1-hydroxybenzotriazol, atd. Tyto kopulace často využívají pro vymytí kyseliny vzniklé během reakce vhodnou zásadu. Vhodné zásady zahrnují například triethylamin, N,N-iisopropylethylamin, N-methylmorfolin a podobně. Reakce je obvykle prováděna v inertním aprotickém polárním rozpouštědle, jako je dimethylformamid, methylenchlorid, chloroform, acetonitril, tetrahydrofuran a podobně. Reakce je obvykle prováděna při teplotách od přibližně 0°C do přibližně 60°C a potřebuje obvykle od přibližně 1 do přibližně 24 hodin. Po dokončení reakce je produkt vzorce (2) získáván běžnými metodami zahrnujícími • · · · • · φφ * φ · · • ΦΦΦ φφ φ · · φ φφ φ «φφ φφφφ φ φ φ φ · φ φφφ φφφφφ • ΦΦ φφφφ · · φ φφφφφφ φφ φ'» φ ® φ extrakci, vysrážení, chromatografii, filtraci, trituraci, krystalizací a podobně.

Alternativně je například vhodný N-alkylfenethylamin vzorce (1) uváděn do kontaktu s vhodným bisalkoxykarbonylacyl chloridem za vzniku sloučeniny vzorce (2). Takové acylchloridy se snadno připravují z odpovídajících kyselin postupy dobře známými v dosavadním stavu techniky, jako účinkem fosfortrichloridu, fosforoxychloridu, fosforpentachloridu, thionylchloridu, nebo oxalylchloridu, s malým množstvím dimethylformamidu nebo bez něj, v inertním rozpouštědle jako je toluen, methylenchlorid nebo chloroform; při teplotách přibližně 0-80°C. Reakce je typicky prováděna v časovém údobí pohybujícím se od 1 hodiny do 24 hodin. Acylchlorid může být izolován a vyčištěn nebo může být často používán přímo, tzn. s izolací a čištěním, nebo bez něj. Tyto acylační reakce obecně používají vhodnou zásadu pro vymytí kyseliny vznikající během reakce. Vhodné zásady zahrnují například pyridin, triethylamin, N,N-diisopropylethylamin, Nmethylmorfolin a podobně. Reakce je obyvkle prováděna v inertním aprotickém polárním rozpouštědle, jako je methylenchlorid, chloroform, tetrahydrofuran a podobně. Typicky je reakce prováděna při teplotách od přibližně -20°C do 80°C a typicky potřebuje od přibližně 1 do přibližně 24 hodin. Po dokončení reakce se produkt vzorce (2) izoluje běžnými metodami, zahrnujícími extrakci, vysrážení, chromatografii, filtraci, trituraci, krystalizací a podobně.

Ve Schématu 1, krok 2, se sloučenina vzorce (2) se cyklizuje za vzniku sloučeniny vzorce (3).

Například sloučenina vzorce (2) je uváděna do kontaktu s kyselinou, jako je trifluoromethansulfonová kyselina nebo • φ • · · · · · φ • φ · · · • 0 · · · · • · · Φ ΦΦΦΦΦ

Φ Φ Φ Φ Φ Φ kyselina sírová, reakce je typicky prováděna s použitím vybrané kyseliny jako rozpouštědla. Obvykle jsou reakční činidla nejdříve smíšena při teplotě od přibližně -20°C do přibližně 0°C a po ponechány ohřát na pokojovou teplotu až přibližně 60°C. Cyklizační reakce obvykle potřebují od přibližně 12 do přibližně 72 hodin. Po dokončení reakce je produkt vzorce (2) izolován běžnými metodami, zahrnujícími extrakci, vysrážení, chromatografii, filtraci, trituraci, krystalizaci a podobně.

Ve Schématu 1, krok 3, je ze sloučeniny vzorce (3) odstraněna chránící skupina za vzniku sloučeniny vzorce (4).

Odstranění takových alkoxykarbonylaminových chránících skupin je dobře známo v dosavadním stavu techniky. Například viz Protecting Groups in Organic Synthesis, Theodora Greene (1. a 2. vydání, Wiley-Interscience) a Ben-Ishai, Tetrahedron, 43, 439-450 (1987) .

···· ·· · · · · 9» · * · « · β * » « » · ·» · ·*· ···· »«· »··· ··· *··»·· · · · · · · *

HO,

Ve Schématu 2, krok 1, je vhodný derivát fenyloctová kyseliny vzorce (5) kopulován s vhodným acetalem vzorce (6) za vzniku sloučeniny vzorce (7). Vhodný derivát fenyloctová kyseliny vzorce (5) je jeden z těch, v nichž V je takový, jaký je požadován v konečném produktu vzorce I a A₂ je aktivovaná skupina, například -OH, -Cl, nebo Br. Vhodný acetal vzorce (6) je jedním z těch, . v nichž R₃ je takový, jaký je požadován v konečném produktu vzorce I a R5 je C1-C4 alkyl. Takové kopulační reakce jsou běžné při syntéze peptidů a používané syntetické metody mohou být použity zde, jak je ukázáno v Schématu 1, krok 1.

• · • · • © © · ··· ·© * ·«· t© · · · ···© « ·· · ··· ····© ··· · · © · ·· · ·>··©·· ·'» ·· ·© ©

Kopulace zobrazená ve Schématu 2, krok 2, může být provedena za Schotten-Baumannových podmínek s použitím halogenidu vhodné fenyloctové kyseliny vzorce (5) a vhodného acetalu vzorce (6) ve smíšeném rozpouštědle, jako je methyl terc-butyléter, ethyl acetát, tetrahydrofuran, aceton, nebo diethyléter a voda. Tato reakce je prováděna s použitím vhodné zásady, jako je hydroxid sodný, hydroxid draselný, uhličitan sodný, uhličitan draselný, hydrogenuhličitan sodný a hydrogenuhličitan draselný. Obvykle se reakční směs intenzivně míchá a je prováděna při teplotách od přibližně -20°C do přibližně 80°C a obvykle potřebuje od přibližně 1 do přibližně 24 hodin. Po dokončení reakce je produkt reakce vzorce (7) izoluje pomocí běžných postupů, zahrnujících extrakci, vysrážení, chromatografií, filtraci, trituraci, krystalizaci a podobně.

Ve Schématu 2, krok 2, se sloučenina vzorce (7) cyklizuje za vzniku sloučeniny vzorce (8). Tato cyklizační reakce se provádí v kyselině, jako je kyselina sírová. Obvykle je kyselina používána jako rozpouštědlo. Obvykle se reakce provádí při teplotách od přibližně -20°C do přibližně 150°C a obvykle potřebuje od přibližně 1 do přibližně 24 hodin. Po dokončení reakce se produkt reakce vzorce (8) izoluje pomocí běžných postupů, zahrnujících extrakci, vysrážení, chromatografií, filtraci, trituraci, krystalizaci a podobně.

Ve Schématu 2, krok 3, sloučenina vzorce (8) podstupuje přenos aminu za vzniku sloučeniny vzorce (9). Ve Schématu 2 je zobrazena oximace. Tato oximace se docílí uvedením enolátu sloučeniny vzorce (8) do kontaktu s činidly pro přenos oximu, jako je alkylnitritester. Enolát sloučeniny vzorce (8) může být připraven reakcí sloučeniny vzorce (8) s vhodnou zásadou, jako je • · 9 · · · • · · « · · · « · * • · 9 · · 9 9 9 9 9 • · 9 99 9 9 9 · 99999 • 4 9 999 9 999

9999 99 9 9 · · 9 terc-butoxid draselný, diisopropylamid lithný, hexamethyldisilazid lithný, hexamethyldisilazid sodný, hexamethyldisilazid draselný, a podobně. Příklady takových oximací nalezneme v Wheeler, a kol., Organic Syntheses, Coll. sv. VI, str. 840, který popisuje přípravu žádaného oximu reakcí isoamylnitritu s ketonem. Reakce se obvykle provádí v rozpouštědle, jako je tetrahydrofuran. Obvykle se reakce provádí při teplotách od přibližně -20°C do přibližně 50°C a obvykle potřebuje od přibližně 1 do přibližně 24 hodin. Po dokončení reakce je produkt reakce vzorce (8) izoluje pomocí běžných postupů, zahrnujících extrakci, vysrážení, chromatografii, filtraci, trituraci, krystalizaci a podobně.

Alternativně se tento přenos aminu docílí pomocí azidu. Azid se připraví reakcí enolátu sloučenina vzorce (8) z činidlem pro přenos azidu, jako je toluensulfonylazid a triisopropylbenzensulfonylazid. Příklad takové reakce nalezneme v Evans, a kol., J. Am. Chem: Soc., 112:4011-4030 (1990)41. Reakce se obvykle provádí v rozpouštědle, jako je tetrahydrofuran. Obvykle se reakce provádí při teplotě od přibližně -20°C do přibližně 50°C a obvykle potřebuje přibližně od 1 do přibližně 24 hodin. Po dokončení reakce se produkt reakce vzorce (8) izoluje pomocí běžných postupů, zahrnujících extrakci, vysrážená, chromatografii, filtraci, trituraci, krystalizaci a podobně.

Jak je ukázáno ve Schématu 2, krok 4, oxim se redukuje na sloučeninu vzorce (4). Takové redukce se docílí působením vodíku a vhodného katalyzátoru, jako je Raneyův nikl nebo palladiové katalyzátory, jako je palladium na uhlíku. Reakce se obvykle provádí v rozpouštědle, jako je tetrahydrofuran, ethylacetát, nebo nižší alkoholy, jako je methanol, ethanol, a isopropanol, kyselina octová, voda, amoniak ve vodném roztoku a jejich směsi.

• · ΦΦΦΦ

Reakce se provádí obvykle při tlaku vodíku v rozmezí od atmosférického tlaku do přibližně 4137 kPa (600 psi). Reakce se obvykle provádí při teplotě od přibližně 20°C do přibližně 100°C a obvykle potřebuje od přibližně 1 do přibližně 24 hodin. Po dokončení reakce se produkt reakce vzorce (4) izoluje pomocí běžných postupů, zahrnujících extrakci, vysrážení, chromatografii, filtraci, trituraci, krystalizaci a podobně.

Tam, kde se amin přenáší pomocí azidu, se azidová skupina alternativně redukuje. Tyto redukce se provádějí pomocí hydrogenace, jak bylo popsáno shora.

V dalším provedení vynález řeší stereospecifické reakce pro výrobu laktamových sloučenin vzorce I, mezi které patří (N)((S)-2-hydroxy-3-methyl-butyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3methyl-4,5, 6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on, a reakce pro výrobu jeho chirálních meziproduktů. Tyto reakce jsou popsány ve Schématu A.

• » ·· · · ♦

Schéma A

Schéma A, krok 1, zobrazuje stereochemický rozklad vhodného laktamu vzorce (4) za vzniku laktamu vzorce (10). Jak je zřejmé zkušenému odborníkovi v oboru, tento postup není nutně omezen na výrobu jednoho izomeru. Těmito reakcemi je možno připravit buď specifické enantiomery laktamů a zvláště je vhodný pro výrobu izomerů l-amino-3-alkyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onů.

♦ 0 0 0 ·000 • ( 0 9 0 0 000 00000 «00 0000 *0 0 000000 0« «0 0 * ·

Z důvodu větší biologické aktivity spojené s (S)-izomerem v

4.5.6.7- tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onové skupině je vynález nejužitečnější pro přípravu v podstatě čistého (S)-izomeru.

Termín v podstatě čistý znamená enantiomerní čistotu (R) - nebo (S)-laktamu, a zejména (R)- a (S)-l-amino-3-methyl4.5.6.7- tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu. Podle vynálezu může být v podstatě čistý (S)-l-amino-3-alkyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-on vyroben z (S)-enantiomeru, jehož čistota je vyšší než 80 %, výhodně než 90 %, ještě výhodněji než 95 %, nej výhodněji než 97 %.

Například jednotlivé izomery sloučeniny vzorce (4) mohou být děleny frakční krystalizací dibenzoylvinanu, (R)-(-)-10kafrsulfonové kyseliny, a solí (D)(-)-mandlové kyseliny. Očekává se, že pro tento účel je vhodná celá řada těchto dibenzolyvinanů. Zejména jsou výhodné dibenzoylestery, které mají para substituent vybraný ze skupiny, zahrnující vodík, halogen, C1-C4 alkyl, a CiC₄ alkoxy, s nejvýhodnějším di-p-toluoylvinanem. Pro výrobu (S) -isomeru se používá di-p-toluoyl-L-vinan.

Ve výhodném provedení Schématu A, krok 1, je sloučenina vzorce (4) je jedna z těch, v nichž V je vodík a R₃ j e C1-C4 alkyl, zahrnující methyl, ethyl, propyl, iso-propyl, butyl, isobutyl, a sek-butyl; nejvýhodnější je použití sloučenin vzorce (4), v nichž V je vodík a R₃ je methyl.

Podle uvedených postupů se sloučenina vzorce (4) uvádí do kontaktu s vybranou kyselinou. Obecně se používá od přibližně 0,4 molárních ekvivalentů do velkého přebytku vybrané kyseliny, výhodně od 0,4 do 1,5 molárních ekvivalentů, ještě výhodněji od přibližně 0,5 do 1,1 molárních ekvivalentů.

• · · fc ·»···· · · · • ••fc ·· · · « · fc fc 9 fcfcfc · · · ♦ • · fc fcfc fc fcfcfc · fc · fc · ··· · · · · fcfcfc ····«· · * ·· * · fc

Způsob se obvykle provádí krystalizací adiční soli s kyselinou z roztoku. Zejména rozpouštědla jako nižší alkoholy, zahrnující methanol, ethanoi, n-propanol, isopropanol, butanol, sec-butanol, isobutanol, t-butanol, amylalkohol, iso-amylalkohol, t-amylalkohol, hexanol, cyklopentanol, a cyklohexanol jsou vhodné, výhodné jsou methanol, ethanoi, a isopropanol. Výhodou může být použití anti-rozpouštědla. Termín anti-rozpouštědlo, jak je zde používáno, znamená rozpouštědlo, ve kterém je sůl výrazně méně rozpustná, než v rozpouštědlo. Výhodně se používá anti-rozpouštědlo, které je mísitelné s vybraným rozpouštědlem. Vhodná anti-rozpouštědla zahrnují étery, jako jsou diethyléter, methyl t-butyléter, a podobně, a nižší alkylacetáty, jako jsou methylacetát, ethylacetát, iso-propylacetát, propylacetát, isobutylacetát, sek-butylacetát, butylacetát, amylacetát, isoamylacetát, a podobně, a alkany, jako jsou pentan, hexan, heptan, cyklohexan, a podobně. Když se tento způsob provádí krystalizací adiční soli s kyselinou z racemické směsi, musí se používat antirozpouštědlo opatrně, aby se zabránilo krystalizací nežádoucí diastereomerické soli.

Obvykle se krystalizace provádí při počáteční teplotě od přibližně 40°C do teploty refluxu použitých rozpouštědel a při počáteční koncentraci od přibližně 0,05 mol do přibližně 0,25 mol. Směs se pak ochladí za vzniku soli. Výhodné může být naočkování. Výhodné může být míchání počáteční sraženiny po dobu od přibližně 4 do 48 hodin. Výhodně se nechá krystalizačni roztok ochlazovat pomalu. Pro krystalizací je nejpříhodnější ochlazení na teploty pohybující se od pokojové teploty po přibližně -20°C. Sůl se izoluje s použitím technik dobře známých v dosavadním stavu techniky, zahrnujících filtraci, dekantaci, centrifugaci, odpaření, sušení a podobně. Sloučenina vzorce (10) se používá • · 9 9 « · · · · · · ·«·

9 9 9 9 · 9999 • 9 · 99 9 9 9 9 99999 »·«·«! ♦ · ·· ·· 9 přímo ve formě adiční soli s vybranou kyselinou. Alternativně se před použitím sloučenina vzorce (10) izoluje jako jiná adiční soli s rozdílnou kyselinou nebo může být izolována jako zásada extrakcí za základních podmínek, jak je dobře známo v dosavadním stavu techniky.

Výhodné provedení vynálezu se zabývá dynamickým rozkladem (S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu v podstatě enantiomerně čistého, která zahrnuje krystalizací 1-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu ve formě jeho adiční soli s kyselinou, vybrané ze skupiny zahrnující kyselinu di-p-tolyl-L-vinnou, kyselinu (R)-(-)-10-kafrsulfonovou a kyselinu (D)-(-)-mandlovou, jako dynamický proces v přítomnosti aromatického aldehydu. Dynamický proces má tu výhodu, že l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on podstoupí převedení na jeden izomer během krystalizace, čímž se zlepšuje výtěžek a omezuje se odpadní tok, který obsahuje nežádoucí izomer.

Dá se očekávat, že pro tento způsob existuje řada vhodných aldehydů, zjistili jsme, že řada těchto aldehydů je použitelná v praxi. Konkrétně jsme zjistili, že výhodné jsou kyseliny salicylové a salicylaldehyd, 5-nitrosalicylaldehyd, a v tomto dynamickém způsobu rozkladu je výhodnější 3,5-dichlorsalicylaldehyd.

Podle toho, když je tento způsob prováděn jako dynamický rozklad, uvádí se l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-on do kontaktu s vybranou kyselinou v přítomnosti aldehydu. Obvykle se používá pro dynamický rozklad od 0,9 do 1,2 molárních ekvivalentů kyseliny, výhodně s přibližně 1 molárním ekvivalentem. Aldehyd se obvykle používá v katalytickém • 0 ·»«· ·

• 0 0 * «000 0 0 · ·«» 00 0 00 0 0000 00 0000 0 0 0 0000 <00 0.000 00 0 000000 00 00 «0 <

množství. Obvykle se používá přibližně 0,5 až 0,001 molárních ekvivalentů aldehydu, výhodně přibližně 0,1 až 0,01 molárních ekvivalentů.

Dynamický způsob se obvykle provádí v rozpouštědle nebo v rozpouštědle bez anti-rozpouštědla, jak bylo popsáno shora. Směs l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu, vybrané kyseliny a aldehydu se míchá, aby se umožnila konverze na navrhovaný izomer. Obvykle se konverze provádí při teplotě od teploty pokojové do teploty refluxu rozpouštědlo. Konverze obvykle potřebuje 6 až 48 hodin.

Jak je zřejmé odborníkům v oboru, když se způsob provádí jako dynamický rozklad, může být použití adiční soli (S)-l-amino3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu s kyselinou komplikováno přítomností malého množství aldehydu v izolovaném produktu. Po dynamickém rozkladu je výhodné, aby se (S)-l-amino3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on před použitím nebo vytvořením zásady izoloval iontovou výměnou, výhodně jako hydrochlorid.

Jak je zřejmé odborníkům v oboru, sloučenina vzorce (10) se může použít v řadě způsobů pro přípravu sloučenin vhodných pro léčení Alzheimerovy choroby. Tyto způsoby jsou popsány v PCT dokument PCT/US97/22 986, přihlášené 22. prosince 1997, a jsou popsány dále. Způsoby podle vynálezu se vyznačují tím, že pomocí nich vyrábějí sloučeniny vzorce I, přičemž se používá výhody rozkladu, popsaného ve Schématu A, kroku 1.

Schéma A, krok 2, popisuje kopulační reakci vhodné aminem chráněné aminokyseliny vzorce PgNH-CHR₂-C (O) -A a vhodného laktamu vzorce (10). Vhodné aminokyseliny chráněné aminem jsou

• 9 « 9

9***9 takové, ve kterých je Pg aminová chránící skupina, R₂ je požadovaný v konečném produktu vzorce I, a A je aktivační skupina, například -OH nebo -Cl, schopná kopulace s aminovou skupinou sloučeniny vzorce (10). Takové aminokyseliny chráněné aminem jsou snadno dostupné pro odborníky v oboru.

Výhodná aminem chráněná aminokyselina vzorce PgNH-CHR₂-C(O)A, je ta, ve které Pg je terc-butoxykarbonyl a benzyloxykarbonyl, r₂ je methyl, a sloučenina má stereochemii jako L-aminokyselina.

Kopulace zobrazená v Reakčním schématu A, krok 2, zahrnuje reakci, která se obvykle provádí při syntéze peptidů a používané synthetické reakce je možno použít i zde. Tyto způsoby jsou popsány detailně v Schématu 1, krok 1.

Reační schéma A, krok 3, zobrazuje odstranění chránící skupiny ze sloučeniny vzorce (11) za vzniku sloučeniny vzorce (12) . Takové odstranění aminové chránící skupiny je dobře známo v dosavadním stavu techniky.

Reakční schéma A, krok 4, zobrazuje kopulační reakci vhodné sloučeniny vzorce (13), RiCX]X₂-C(O)Αχ a sloučeniny vzorce (12) za vzniku sloučeniny vzorce I. Vhodné sloučeniny vzorce (13) jsou sloučeniny, v nichž R_x, Χχ, a X₂ jsou navrhovány v konečném produktu vzorce I a jsou dobře známy v dosavadním stavu, včetně PCT dokumentu PCT/LJS97/22986, přihlášeného 22.prosince 1997. Vhodná sloučenina vzorce (13) může rovněž mít stereochemii, jaká je navrhována v konečném produktu sloučeniny vzorce I. Kopulace zobrazená v kroku 3 je prováděna s použitím kyseliny vzorce (13) (sloučeniny, v nichž Αχ je -OH) nebo od nich odvozeného halogenidu kyseliny (sloučeniny, v nichž Αχ je -Cl nebo -Br) , postupy podobnými těm, které jsou popsány ve Schématu 1, krok 1.

vzorce I je kopulační reakci toto * ·· to • to • to • to ♦ • ···· •

to • to

Alternativní způsob pro výrobu, sloučenin zobrazen v Schématu A, krok 5, který ukazuje vhodné sloučeniny vzorce (10) a vhodné sloučeniny vzorce (14), R1.CX1X2-C (O)-NH-CHR-C (O) A₂, kdy přímo vzniká sloučenina vzorce I. Vhodnou sloučeninou vzorce (10), je taková, jaká je popsána v kroku 2. Vhodnou sloučeninou vzorce (14), je taková, kde R_x, -X_x, X₂, a R₂ jsou takové, jaké jsou navrhovány pro konečný produkt vzorce I. Vhodnou sloučeninou vzorce (14) je rovněž ta, která má stereochemii, jaká je navrhována v konečném produktu vzorce I.

Sloučeniny vzorce (14) se snadno vyrobí kopulací aminokyselin s karboxy-chránící skupinou, H₂N-CHR₂-C (O) OPgi, se sloučeninami vzorce (13), jak bylo popsáno shora. Tato kopulace je opět dobře známa v dosavadním stavu techniky a poskytuje produkt, který po odstranění chránící skupiny poskytuje sloučeninu vzorce (14) .

Tento vynález je dále ilustrován následujícími příklady a přípravami. Tyto příklady a přípravy jsou určeny pouze pro ilustraci a nejsou míněny jako omezení vynálezu v jakémkoliv směru.

Pokud není uvedeno jinak, termíny použité v příkladech a přípravách mají obvyklé používané významy. Například °C znamená stupně Celsia; mmol znamená mílimol nebo milimoly, g znamená gram nebo gramy; ml znamená mililitr nebo mililitry; solanka znamená nasycený vodný roztok chloridu sodného; THF znamená tetrahydrofuran; HPLC znamená vysokotlaká kapalinová chromatografie, atd.

φ φ φ φ • φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ •· φφφ· *

« · φφφ

Příklad 1

Syntéza l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin

2-onu

Do kaše hydridu sodného (1.1 ekv.) v 15 ml suchého DMF byl přidán 4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on (0,0042 mol) jako roztok v 10 ml DMF. Pak byl přidán methyljodid (přibližně 2 ekv.). Když bylo ukončeno TLC, reakční směs byla nalita na led a extrahována do ethylacetátu. Organická vrstva byla promyta vodou a poté solankou. Organická vrstva byla poté vysušena nad Na₂SO₄, filtrována, a zahuštěna za sníženého tlaku. Zbytek byl vyčištěn pomocí HPLC (LC 2000), eluce směsí ethylacetát/hexanový systém, čímž byl získán 3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on

3-Methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on (1 ekv.) byl rozpuštěn v THF a pak byl přidán isoamylnitrit (1,2 ekv.). Směs byla ochlazena na 0°C v ledové lázni. Po kapkách byl přidán NaHMDS (1,1 ekv., 1M v THF). Po míchání po dobu 1 hodiny nebo nebyla reakce ukončena, byla směs zahuštěna a pak okyselena IN vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a extrahován ethylacetátem. Organický podíl byl vysušen a zahuštěn s výtěžkem surového produktu, který byl vyčištěn chromatografií na silikagelu, čímž byl získán l-hydroxyimino-3-methyl-4, 5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2on: Hmotnostní spektroskopie(M+H)⁺, 205.1.

l-Hydroxyimino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin2-one byl rozpuštěn v EtOH/NH3 (20:1) a hydrogenován v bombě s pomocí Raneyova niklu a vodíku (500 psi/3447 kPa) při 100°C po dobu 10 hodin. Výsledná směs byla filtrována a zahuštěna za ·» 9 9 • 9 · · 11 • 9 9 9 9

9 1111

1 9 19

1 9 191 9 9 *

• 9* • 9 9 9 9

999 99999

1 9 9

9 9 · 1 vzniku oleje, který byl vyčištěn chromatografií na silikagelu, přičemž byla získána titulní sloučenina.

Příklad 2

Syntéza l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu

Do 20 1 Mortonovy baňky byl přidán MTBE (5.52 1, 7 objemových dílů) a (N-methylamino)acetaldehyd dimethylacetal (614 g, 5 mol), aby se při pokojové teplotě vytvořil roztok. Do Mortonovy reakční baňky byl přidán roztok hydrogenuhličitanu sodného, připravený smísením hydrogenuhličitanu sodného (546 g, 6,5 mol) a vody (6,31' 1, 8 objemových dílů) . Směs byla ochlazena na méně než 10°C a po kapkách byl přidán MTBE (789 ml), roztok fenylacetylchloridu (789 g, 5 mol) a reakční směs se nechala v průběhu 1 hodiny ochladit. Po adici byla reakční směs míchána při pokojové teplotě po 1 h. V tomto stadiu indikovala dokončení reakce HPLC analýza. Po extrakčním zpracování s MTBE (4 objemové díly) a sušení bezvodým síranem sodným následovalo zahuštění na rotační odparce, čímž bylo získáno 1,187 kg (98 %) N-methyl-N(2,2-dimethoxyethyl)fenylacetamidu v kapalné podobě, (M+H)⁺ 237.9. Do 5 1 Mortonovy baňky s dusíkovou atmosférou byla přidána H₂SO₄ ,(1,42 1) a po kapkách byl přidán N-methyl-N-(2,2dimethoxyethyl)fenylacetamid (712 g, 3 mol), což vyvolalo exotermní reakci (22 až 78°C). Výsledná reakční směs byla potom zahřívána na 110°C PO 3 h a potom ochlazena na pokojovou teplotu a převedena do 20 1 Mortonovy baňky. Při méně než 10°C byla reakční směs rychle ochlazena vodným hydroxidem sodným (9,18 1, 5 N). Extrakcí ethylacetátem (2 x 2,85 1), sušením síranem sodným a následujícím zahuštěním na pevnou látku bylo získáno 520 g (73,50 %) 3-methyl-6,7-dihydro-2H-3-benzazepin-2*· ··♦*

4 4 9

4 4 4 « * • « « · ·

9 · · · »

4 4 4 ·

9· 4449 «» * · ♦ 4

4 4 4 • · « «···· • · · · on jako pevná látka. Tento materiál může být rekrystalizován z MTBE pro získání větší čistoty, se ziskem pevné látky, mp = 8182°C; (M+H)⁺ = 174,2.

Roztok 3-methyl-6,7-dihydro-2H-3-benzazepin-2-onu (113,8 g, 0,657 mol) v THF (0.5 1) byl ochlazen na 0°C a po kapkách byl přidán isoamylnitrit (100,75 g, 0,86 mol). Do vzniklé směsi byl přidán LiHMDS (1 N THF roztok, 854 ml, 0,854 mol) takovou rychlostí, aby teplota zůstala pod 10°C. Potom byla reakce míchána při pokojové teplotě po 2-3 h se současným monitoringem postupu reakce pomocí HPLC.. Po dokončení reakce byla směs ochlazena na 0°C, a pH upraveno z 12 na 2-3 s použitím vodného HCl (2N). Před izolací filtrací a sušením byla výsledná sraženina byla míchána po 12-16 h, bylo získáno 86,3 g (64,9 %) 1hydroxyimino-3-methyl-6,7-dihydro-2H-3-benzazepin-2-onu; mp = 225-226°C; (M+H)⁺ = 203.0.

Do autoklávu byl přidán ethanolový roztok (525 ml) 1hydroxyimino-3-methyl-6,7-dihydro-2H-3-benzazepin-2-onu (35 g, 0,173 mol) spolu s paladiem na uhlíku (10 %, 3,5 g) ve formě kaše zředěné HCl (koncentrovaná vodná, 17,5 g v 17 ml vody). Výsledná směs byla hydrogenována při 50°C a 250 psi (1723 kPa) dokud nebyla reakce ukončena. Reakční směs byla filtrována přes celitové lože s použitím ethanolu jako rozpouštědla a filtrát zahuštěn na 90 ml. Do koncentrátu byla přidána voda (350 ml) a výsledný roztok byl dále zahuštěn na přibližně 200 ml. Do vodného roztoku byl přidán dichlormethan (350 ml) a poté bylo upraveno pH na hodnotu 11-11,5 pomocí vodného hydroxidu sodného (1 N). Organický podíl byl separován a vodný podíl byl extrahován dichlormethanem (175 ml). Spojené extrakty byly zahuštěny na zbytek, který krystalizoval poté, co byl ponechán stát, čímž byla získána titulní sloučenina: mp = 69-81°C;

(M+H)₊ = 191,0.

Příklad 3

Syntéza 1-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-H-3-benzazepin2-onu

Do 22 1 Mortonovy baňky byl přidán dichlormethan (4,73 1, 8 objemových dílů), N-methylfenethylamin (591 g, 4,33 mol), a vodný hydrogenuhličitan sodný (436,7 g, 5,2 mol v 4,73 1 vody). Směs byla ochlazena na méně než 5°C a po kapkách byl v průběhu 70 min. přidáván do chlazené reakční směsi roztok chloracetylchloridu (513,7 g, 4,55 mol) v dichlormethanu (887 ml). Poté bylo dokončení reakce sledováno pomocí HPLC analýzy.

Vrstvy byly odděleny a vodná vrstva byla extrahována dichlormethanem. Spojené organické vrstvy byly vysušeny nad bezvodým síranem hořečnatým a zahuštěny na rotační odparce, čímž bylo získáno 915,7 g (99.8 % N-methyl-N-(2-fenylethyl)-1chloracetamidu: (M+H) = 212.1.

Do 12 1 baňky s dusíkovou atmosférou byl přidán N-methylN-(2-fenylethyl)-1-chloracetamid (883,3 g, 4,17 mol) a orthodichlorbenzen (6,18 1). Přídavek chloridu hlinitého (1319 g, 10,13 mol) vyvolalo exotermní reakci (z 22 na 50°C). Výsledná reakční směs byla potom zahřívána na 165°C po dobu 2,5 h, potom ochlazena na pokojovou teplotu po dobu 14 hodin. Reakční směs byla ochlazena na přibližně 0°C, a byla přidána ve čtyřech podílech do studené vody (8,86 1, přibližně 5°C), tak aby teplota nepřestoupila 40°C. Vrstvy byly odděleny, vodná vrstva byla extrahována dichlormethanem (7,07 1) a vrstvy byly odděleny. Organické vrstvy byly spojeny a extrahovány vodnou kyselinou chlorovodíkovou (8,83 1, IN) a potom nasyceným vodným

• * · ♦♦ ··»· ·· · * · • * · • ···· roztokem hydrogenuhličitanu sodného (7,07 1), vysušeny nad síranem sodným spolu se silikagelem (883 g) a naneseny na silikagelovou kolonu (3,53 kg, v spečené skleněné nálevce, jako kaše v dichlormethanu). Kolona byla eluována dichlormethanem, až bylo shromážděno 25 1 a potom ethylacetátem, čímž byl získán produkt. Produkt obsahující frakce byl odpařen, čímž byl získán

3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on jako nahnědlá pevná látka, 608 g (83 %) .

Do 22 1 baňky pod dusíkem byl přidán 3-methyl-4,5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on (606 g, 3,46 mol) a isoamylnitrit (543 g, 4,5 mol) v THF (7,88 1). Směs byla ochlazena na přibližně 0°C předtím, než byl přidán LiHMDS (1 N THF roztok, 4,5 1, 04,5 mol) takovou rychlostí, aby se teplota udržela pod 7°C. Poté se nechala reakčni směs míchat při pokojové teplotě po dobu 2 h za současného sledování postupu reakce pomocí HPLC. UPO dokončení reakce byla směs ochlazena na přibližně 0°C, a pH bylo upraveno z 12 na přibližně 2-1 s použitím vodné HCl (2N). Výsledná sraženina byla míchána po dobu 6 h, poté následovala izolace filtrací a sušení, čímž byl získán l-hydroxyimino-3-methyl4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on 604,7 g (85,6 %).

l-Hydroxyimino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2on (625 g, 3,06 mol) a 3A ethanol (15,6 1), jako kaše zředěná HCl (koncentrovaná vodná kyselina chlorovodíková 312 g v 320 ml vody), kaše byla přidána do autoklávu spolu s paladiem na uhlíku (10 %, 120 g) . Výsledná směs byla hydrogenována při 50°C a 250 psi (1723 kPa) se silným mícháním až do ukončení reakce (přibližně 4 hodin). Reakčni směs byla filtrován přes celitové lože s použitím ethanolu jako rozpouštědla a filtrát byl zahuštěn, čímž byla získána pevná látka. Na ni se působilo dichlormethanem (61) a byl přidáván IN roztok vodného hydroxidu

4 4

4 4

4444 • · · • 0 · • 4 4 4

44444

4 4

0 sodného až bylo pH vodné vrstvy mezi 11-11,5. Směs byla míchána, vrstvy byly odděleny, a vodná vrstva byla extrahována dichlormethanem (2 1). Organické vrstvy byly vysušeny nad síranem hořečnatým, zfiltrovány, a odpařeny na rotační odparce, čímž byla získána titulní sloučenina 477 g (81,9 %).

Příklad 4

Syntéza (S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu l-Amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on (1,544 g, 8,12 mmol) byl opatrně zahříván v 15 ml methanolu až vznikl roztok. V jiné baňce byla rozpuštěna di-p-toluoyl-l-vinná kyselina (3,12 g, 8,08 mmol) v 15 ml methanol a byla pipetou přidána do horkého roztoku aminu. Směs byla zahřívána, až se vysrážely pevné látky. Bylo přidáno dalších 30 ml methanol, až byl získán roztok, který byl refluxován po 30-40 minut a potom pomalu ochlazen na teplotu místnosti, čímž byla získána pevná látka. Po míchání po dobu 18 hodin, byla pevná látka izolována filtrací a promyta malým množství chladného methanol, čímž bylo získáno 2,24 g soli kyseliny (S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on di-p-toluoyl-l-vinné (96 % výtěžek, 94,70 ee) .

Sůl kyseliny (S)-l-Amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-one di-p-toluoyl-l-vinné (11,83 g, 20,5 mmol) byla rozpuštěna v 45 ml vodného roztoku 1,0 N hydroxidu sodného a byla extrahována methylenchloridem (3 X 25ml). Spojené methylenchloridové vrstvy byly promyty 35 ml vodného roztoku 1.0 N hydroxidu sodného, potom roztokem solanky, a vysušeny nad

·· ···· bezvodým MgSO₄. Odstraněním rozpouštědla ve vakuu byla získána titulní sloučenina (3,38 g) jako bezbarvý olej (87 % výtěžek,

93,2 ee) .

Příklad 5

Syntéza (S)~l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu l-Amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2on (6,0 g, 31,5 mmol) byl opatrně zahříván v 75 ml methanolu až vznikl roztok, který byl spojen s roztokem kyseliny di-p-toluoyl-1vinné (12,2 g, 31,5 mmol) v 75 ml horkého methanolu. Roztok byl očkován a vznikla pevná látka. Pak bylo přidáno dalších 100 ml methanolu a směs byla ponechána míchat. Po míchání po dobu přibližně 18 hodin, byla pevná látka izolována filtrací a promyta malým množstvím studeného methanolu, čímž bylo získáno 6,7 g pevné látky. Pevná látka byla smíchána s methanolem (200 ml) a byla míchána. Po 18 hodin byla pevná látka izolována, čímž byla získána sůl kyseliny (S)-l-amino-3-methyl-4,5,6, 7-tetrahydro-2H3-benzazepin-2-on di-p-toluoyl-l-vinné (4,4 g). Izolací zásady způsobem, který byl popsán v Příkladu 4, vznikla titulní sloučenina (96 % ee).

Příklad 6

Syntéza (S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu «· «· ·* ···· ·· · • · · « · « · ··· • · * ·· · ···« « · · * · « · · · ····· ··· · · · » ··· ······ ·· ·♦ ·· ·

Ve 22 1 nádobě pod dusíkovou atmosférou byl zahříván (přibližně 40°C) l-amino-3-methyl- 4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-on (438 g, 2,3 mol) až vznikl roztok v methanolu (4,38 ml). V jiné nádobě byla rozpuštěna kyselina di-p-toluoyl1-vinná (889,7 g, 2,3 mol) v 4,38 1 methanolu a byla zahřívána na přibližně 40°C předtím, než byl přidán roztok l-amino-3-methyl4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on. Zahřívání pokračovalo a pak bylo přidáno dalších 6,13 1 methanolu a poté byla směs refluxována přibližně 45 minut a pak byla ponechána se pomalu ochladit na pokojovou teplotu, čímž byla získána pevná látka. Po míchání po dobu přibližně 18 hodin byla pevná látka izolována filtrací a promyt malým množstvím matečného roztoku a po sušení na vzduchu znovu přibližně 2 1 ethylacetátu, čímž bylo získáno 561,6 g soli kyselina (S)-l-amino-3-methyl-4, 5, 6,7-tetrahydro2H-3-benzazepin-2-on di-p-toluoyl-L-vinné. Sůl kyseliny (S)—l— amino-3-methyl-4,5,6,7- tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on di-ptoluoyl-L-vinné, dichlormethan (6,57 1) a IN vodný roztok hydroxidu sodného (6,57 1) byly smíchány a promíchávány. Vrstvy byly odděleny a organická vrstva byla extrahována dvakrát IN vodným roztokem hydroxidu sodného (3,28 1), jednou solankou (2.46 1), poté byla sušena nad síranem hořečnatým, zfiltrována a odpařena na rotační odparce, čímž byla získána titulní sloučenina 250 g (57,4%, 94,1 ee).

Příklad 7

Syntéza hydrochloridu (S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu

1-Amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2·« ·« ·· ·*·· ·· · ···· ·· · ··« ·· · · · · · » · · • « · * · · · · ····· • · · ···· ·· · *··«·· ·· ·· ·· · on (31,9 g, 168 mmol) byl uveden do stavu kaše v přibližně 300 ml isopropylacetátu a zahříván na 45°C. V jiné nádobě byla zahřívána (R)-(-)-D-mandlová kyselina (25,0 g, 164 mmol) v přibližně 130 ml isopropylalkohol, až se vytvořil roztok a ten pak byl přidán do l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on /isopropylacetátové kaše získané dříve, čímž byl získán roztok, v němž se rychle vytvořila sraženina. Směs byla míchána při 45 °C po přibližně 3 hodiny. Do horkého roztoku byl přidán

5-Nitrosalicylaldehyd (2-hydroxy-5-nitrobenzaldehyd) (1,40 g,

8,38 mmol, 5 mol) a směs byla míchána při 45°C. Po přibližně 14 hodinách byla kaše ochlazena na pokojovou teplotu a míchána po dobu 2 hodin a poté byly pevné látky izolovány filtrací, promyty 70 ml studeného isopropylacetátu, a vysušeny ve vakuové sušárně při 40°C, čímž bylo získáno 46,62 g soli (S)-l-amino-3- methyl4,5, 6, 7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on (R)-mandlové kyseliny (82,9 % výtěžek, 98,4 ee).

Sůl (S)-l-Amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-on (R)-mandlové kyseliny (2,42 g, 7,06 mmol, 98,4 ee) byla uvedena do kaše v 25 ml ethylacetátu při pokojové teplotě. Byla přidána koncentrovaná vodná kyselina chlorovodíková (1,1 ml, přibližně 11,2 mmol) a směs byla za silného míchání po dobu 3,5 hodin zahřívána na 50°C. Kaše byla ochlazena na pokojovou teplotu, zfiltrována a promyta methyl t-butyléterem (přibližně 10 ml), čímž bylo získáno 1,48 g titulní sloučeniny (92,5 výtěžek, 97,9 ee).

Příklad 8

Syntéza(N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)(S)-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2E-3-benzazepin-2-onu • 9 9 9 999999 9 9 9

9 9 9 ·· 9 · · 9

9 9 9 9 9 · · 9 9 • 9 9 99 9 999 99999

999 999 9 99 9

999999 99 99 99 9

Nádoba s kulatým dnem byla naplněna N-t-Boc-L-alaninem (1,0 ekv.), hydrátem hydroxybenzotriazolu (přibližně 1,1 ekv.) a (S) -l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-oněm (1,0 ekv.) v THF pod dusíkovou atmosférou. Do dobře míchané směsi byla přidána Hunigova báze (N,N-diisopropylethylamin, 1.1 ekv.) a poté EDC (1,1 ekv.). Po míchání od 4 do 17 hodin při pokojové teplotě bylo rozpouštědlo odstraněno za sníženého tlaku, zbytek byl převeden do ethylacetátu a vody, promyt nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, 1 N vodnou HC1, solankou, vysušen nad bezvodým síranem sodným, zfiltrován a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku, čímž byl získán 1-(N-t-BocL-alaninyl)amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2on: hmotnostní spektroskopie (M-t-H)⁺, 362,3.

Přes míchaný roztok 1-(N-t-Boc-L-alaninyl)amino-3-methyl4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu v 1,4-dioxanu (0,03-0,09 M) se nechal probublávat proud bezvodého plynného HC1 a pak se nechal ochladit v ledové lázni na přibližně 10°C pod NZ po dobu 10-15 minut. Roztok byl zakryt, potom byla chladící lázeň odstraněna, a roztok se nechal zahřát na pokojovou teplotu za současného míchání po dobu 2-8 hodin, spotřeba vstupního materiálu byla prováděna 1,0 TLC. Roztok byl pak zahuštěn, čímž byl získán 1-(L-alaninyl)-(S)-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro2H-3-benzazepin-2-on, který byl pak použit bez dalšího čistění.

1-(L-Alaninyl)-(S)-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-3methyl-2H-3-benzazepin-2-one (1,0 ekv.), hydroxybenzotriazol hydrát (1,1 ekv.) a (S)-2-hydroxy-3-methyl-máselná kyselina (1,0 ekv.) v THF pod dusíkovou atmosférou. Do dobře míchané směsi byla přidána Hunigova báze (N,N-diisopropylethylamin, 1,1 ekv.) a poté EDC (1,1 ekv.). Po míchání po dobu od 4 do 17 hodin při pokojové ·« *· ···· ·· · ·«·· · · · «·· • · · · * · · · · · • « « ·· · · · · · · · · · «·· · · · · · · · ······ ·· ·· *» · teplotě bylo rozpouštědlo odstraněno za sníženého tlaku a zbytek byl převeden do ethylacetátu (nebo podobného rozpouštědla) a vody, promyt nasyceným vodným roztok hydrogenuhličitanu sodného, 1 N HCl, solankou, vysušen nad bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku, čímž byla získána titulní sloučenina.

Příklad 9

Syntéza(N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)(S)-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3- benzazepin-2-onu

Nádoba s kulatým dnem byla naplněna N-t-Boc-L-alaninem (249,5 g, 1,32 mol), hydroxybenzotriazol hydrátem (232,2 g, 1,52 mol), a (S)-1-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3- benzazepin2-onem 1250,8 g, 1,32 mol) v THF (3,76 1) v dusíkové atmosféře. Směs byla ochlazena méně než 5°C, pak byla přidána Hunigova báze (N,N-diisopropylethylamin, 188,4 g, 1,45 mol) a poté EDC (283,7 g, 1,45 mol). Po míchání 6 hodin byla reakční směs zahřívána na pokojovou teplotu a míchána přibližně 14 hodin. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku, zbytek byl převeden do ethylacetátu (3,76 1) a vodu (1,76 1), vrstvy byly odděleny, organická vrstva byla extrahována vodou (1,76 1), vodné vrstvy byly spojeny a extrahovány ethylacetátem (1,76 1). Organické vrstvy byly spojeny, extrahovány nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (1,76 1), vysušeny nad bezvodým síranem sodným, z filtrovány a odpařeny v rotační odparce, čímž byl získán 1-(N-t-Boc-L-alaninyl)amino-3-methyl-4,5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on 463 g (97,2 %) .

«· ·« ·· ···· ·· · ···· ·· ···· ·· · ·· · ···· ·· «··· · · · · «··· ·«· ···· ··· ····<· ·· · σ ·· «

Průchodem bezvodého plynného HCl přes ethylacetát (1,76 1) ochlazený na přibližně 0°C byl s použitím podpovrchové disperzní trubice připraven ethylacetátový roztok HCl. Připravený ethylacetátový roztok HCl byl přidán do silně míchané kaše

1- (N-t-Boc-L-alaninyl)amino-3-methyl-4,5, 6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu (462 g, 1,28 mol) v ethylacetátu (3,7 1). Pak byla přidán další podíl ethylacetátu (1 1) a reakční směs byla ponechána se ohřát na teplotu místnosti a míchána 22 h. Reakční směs byla zfiltrována, čímž byla získána pevná látka. Pevná látka byla s acetonitrilem (5 1) uvedena do kašovitého stavu, zahřívána do teploty refluxu a potom ochlazena na přibližně 60°C, poté následovala filtrace a sušení, čímž byl získána 1—(L— alaninyl)-(S)-amino-3- methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin2- on 389, 8 g (94,7 %) .

1-(L-Alaninyl)-(S)-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-3methyl-2H-3-benzazepin-2-on (369,5 g, 1,18 mol), hydroxybenzotriazol hydrát (207,6 g, 1,36 mol), Hunigova báze (N,N-diisopropylethylamin, 352,2 g, 2,71 mol), a (S)-2-hydroxy-3methyl-máselná kyselina (140,6 g, 1,18 mol) v THF (4,8 1) byly smíchány pod dusíkem a ochlazeny na méně než 5°C. Pak byl přidán EDC (253,7 g, 1,3 mol) a reakční směs byla ponechána se zahřát na pokojovou teplotu a byla míchána. Přibližně po 25 hodin byla reakční směs zředěna dichlormethanem (5.54 1) a extrahována vodou (2,22 1). Organická vrstva byla extrahována vodou (2,22 1), vodné vrstvy byly spojeny a extrahovány dichlormethanem (5,54 1). Organické vrstvy byly spojeny, extrahovány dvakrát vodou (2,22 1), nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (2,22 1), vysušeny nad bezvodým síranem sodným, zfiltrovány a odpařeny v rotační odparce, čímž byla získána titulní sloučenina 428 g (100 %).

e · ···· • * ·

Příklad 10

Syntéza dihydrátu (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin2-onu (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)(S)-amino3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on ve formě pevné látky byl převeden do acetonu (3,42 1) a vody (0,856 1) s mírným zahříváním (40°C). Roztok byl rozdělen na 2 1 díly a do každého byla přidána voda (7,19 1) a zakalený roztok byl zahříván na 50°C. Do dokončení přidávání vody se zakalený roztok se nechal ochladit na pokojovou teplotu, čímž byla získána pevná látka, která byla míchána ve formě kaše při pokojové teplotě přibližně 14 hodin, poté byla zfiltrována a vysušena, čímž byla získána titulní sloučenina 310,6 g (66,2 %) .

Při farmaceutickém využití se tento vynález obvykle podává ve formě farmaceutické kompozice. V jiném vytvoření vynález poskytuje farmaceutické kompozice obsahující účinné množství krystalického dihydrátu N-((S)-2-hydroxy-3-methyl- butyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-4,5,6,7- tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu a farmaceuticky přijatelného rozpouštědla.

Takové kompozice jsou používány pro inhibicí uvolňování βamyloidního peptidu a/nebo inhibicí jeho syntézy, včetně léčení Alzheimerovy choroby. Vynález zahrnuje použití krystalického dihydrátu (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu pro výrobu léčiv pro inhibicí β-amyloidního peptidu a/nebo inhibicí jeho syntézy, specificky pro léčení Alzheimerovy choroby.

9 •9 9999

9 9 ·

9 9 · ·

9>9 99999 · · ·

O 9 9 ·

Krystalický dihydrát (N) - ( (S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu může být podáván různými postupy. Daná sloučenina podle vynálezu může být podávána v jakékoliv, která činí sloučeninu biologicky dostupnou v účinném množství, včetně cesty orální a parenterální. Například může být sloučenina podávána orálně, inhalací, subkutánně, intramuskulárně, intravenózně, transdermálně, intranasálně, rektálně, nitroočně, povrchově, podjazykově, bukálně a podobně.

Při výrobě kompozic podle vynálezu se aktivní složka obvykle mísí s přísadou, ředěna přísadou nebo uzavřena do bariéry, která může být ve formě tobolky, sáčku, papíru nebo jiného obalu. Sloučenina podle vynálezu může být podávána samostatně nebo ve formě farmaceutické kompozice, to znamená smíšena s farmaceuticky přijatelnými rozpouštědly, jako jsou nosiče nebo přísady, jejich poměry a povaha jsou určeny rozpustností a chemickými vlastnostmi této sloučeniny, vybraným způsobem podávání a obvyklou farmaceutickou praxí. (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, Mack Publishing Co. (1990))

Dané farmaceutické kompozice jsou vyráběny postupy, dobře známými v oboru farmaceutické chemie. Nosičem nebo přísadou může být pevná látka, polopevná látka nebo kapalina, která může sloužit jako nosič nebo prostředí pro účinnou složku. Vhodné nosiče nebo přísady jsou v oboru dobře známy. Farmaceutická kompozice může být upravena do podoby orální, inhalační, parenterální, nebo povrchové a může být podávána pacientovi ve formě tablet, tobolek, aerosolů, inhalačních přípravků, čípků, roztoku, suspenzí a podobně.

• · · ·

• · to (Sto to to to to

Pro potřeby orálního terapeutického podávání mohou být ke sloučeninám přidány přísady a použity ve formě tablet, pastilek, tobolek, lázně, suspenzí, sirupů, vaflí, žvýkaček a podobně.

Tyto přípravky by měly obsahovat alespoň 4 % sloučeniny podle vynálezu, účinné složky, ale mohou být upraveny v závislosti na konkrétní formě a je vhodné, když jsou mezi 2 % až přibližně 90 % hmotnostními jednotky. Množství sloučeniny v kompozicích je takové, aby se dodrželo vhodné dávkování. Výhodné kompozice a přípravky podle vynálezu může osoba zkušená v oboru snadno stanovit.

Tablety, pilulky, tobolky, pastilky a podobně mohou rovněž obsahovat jeden nebo více následujících adjuvantů: nosiče jako mikrokrystalická celulóza, tragantovou gumu nebo želatinu; přísady jako je škrob nebo laktózu, dezintegranty jako je kyselina alginová, Primogel, kukuřičný škrob a podobně; mazadla jako je stearát hořečnatý, silikonový olej nebo Sterotex; glidanty jako je koloidní oxid křemičitý; a sladidla jako je sacharóza nebo sacharin nebo ochucovadla jako je silice máty peprné, methyl salicylát nebo pomerančová příchuť. Když je dávkovači jednotkou tobolka, může obsahovat kromě výše uvedených materiálů kapalný nosič jako je polyethylenglykol nebo mastný olej. Jiné dávkovači jednotky mohou obsahovat jiné různé materiály, které upravují fyzikální formu dávkovači jednotky jako jsou například povlaky. Tablety nebo pilulky mohou být potaženy cukrem, šelakem nebo jinými potahovacími látkami. Sirup může obsahovat kromě výše uvedených materiálů sacharózu jako sladidlo a určité konzervační látky, barviva a příchutě. Materiály používané při výrobě těchto kompozice by měly být farmaceuticky čisté a v použitém množství netoxické.

9 9 9 9 9

9 9 <99

Pro potřeby parenterálního podávání může být sloučenina podle vynálezu zapracována do roztok nebo suspenze. Tyto přípravky typicky obsahují nejméně 0,1 % sloučenina podle vynálezu; ale toto množství se může pohybovat mezi 0.1 a přibližně 90 % hmotnostními. Množství sloučenina v takových kompozicích, je takové, aby se získalo vhodné dávkování. Roztoky nebo suspenze mohou rovněž obsahovat jeden nebo více následujících adjuvantů: sterilní rozpouštědla jako je voda pro injekce, slaný roztok, stabilizované oleje, polyethylenglykoly, glycerin, propylenglykol nebo jiná syntetická rozpouštědla; antibakteriální látky jako je benzylalkohol nebo methylparaben; antioxidanty jako je kyselina askorbová nebo bisulfit sodný; chelatační činidla jako je .kyselina ethylendiamintetraoctová; pufry jako jsou acetáty, citráty nebo fosfáty a činidla pro úpravu tonicity jako je chlorid sodný nebo dextróza. Parenterální přípravky mohou být uzavřeny v ampulích, jednorázových injekčních stříkačkách nebo vícenásobných dávkovačích ampulkách vyrobených ze skla nebo plastů. Výhodné kompozice a přípravky jsou odborníkovi v oboru dostatečně známy.

Sloučenina podle vynálezu může být rovněž podávána povrchově, a když je to takto provedeno, nosič obvykle obsahuje roztok, mast nebo gelový základ. Základ například může zahrnovat jeden nebo více následujících látek: vazelína, lanolin, polyethylenglykoly, včelí vosk, minerální olej, rozpouštědla jako je voda a alkohol, a emulgační činidla a stabilizátory. Přípravky pro povrchovou aplikaci mohou obsahovat látku vzorce I nebo její farmaceutickou sůl v koncentraci od přibližně 0,1 do přibližně 10 % hmotnostních.

Jiná výhodná formulace podle vynálezu využívá zařízení k transdermálnímu podávání (cesty). Tyto transdermální cesty • 9

•9 99·· • 9 • 9 • 9 ίί

9 mohou být použity pro kontinuální nebo diskontinuální infuzi sloučenina v kontrolovaném množství. Konstrukce a použití transdermální cest pro dopravu farmaceutických činidle je v oboru dobře známo viz např. U.S. Patent 5 023 252, udělený 11. 6. 1991, zde vložený formou odkazu. Tyto cesty mohou být konstruovány jako kontinuální, pulzní nebo pro dodání látky v případě potřeby.

Za účelem lepší ilustrace vynálezu je dále popsána typická farmaceutická kompozice. Příklady jsou pouze ilustrativní a nemají za cíl omezovat rozsah vynálezu.

Příklad formulace 1

Byly připraveny tvrdé následující složky.

Složka

Účinná látka Škrob

Stearát hořečnatý želatinové tobolky obsahující

Množství (mg/tobolka)

30,0

305,0

5,0

Uvedené složky byly smíchány a naplněny v množství 340 mg do tvrdých želatinových tobolek.

Příklad formulace 2

Bylo připraveno složení tablet s použitím dále uvedených složek «· ····

Složka

Účinná složka

Celulóza mikrokrystalická Koloidní oxid křemičitý Kyselina stearová

Množství (mg/tobolka) 25, 0

200, 0 10, 0 5, 0

Složky byl smíšeny a slisovány do hmotnosti 240 mg.

formy tablet, každá o

Příklad formulace 3

Byla vyrobena formulace pro inhalaci ve formě suchého prášku, která obsahovala následující složky:

Složka Hmotnost %

Účinná složka 5

Laktóza 95

Účinná složka byla smíchána s laktózou a směs byla do aplikátoru pro inhalaci suchého prášku.

Příklad formulace 4

Tablety, každá o obsahu 30 mg účinné složky, byly připraveny následujícím způsobem:

Složka	Množství (i	mg/tablet
Účinná složka	30, 0	mg
Škrob	45, 0	mg
Mikrokrystalická celulóza	35, 0	mg
Polyvinylpyrrolidon
(jako 10 % roztok ve sterilní	vodě) 4,0	mg

Karboxymethyl sodný škrob	4,5 mg
Stearát hořečnatý	0, 5 mg
Mastek	1,0 mg
Celkem	120 mg

Účinná složka, škrob a celulóza byly prosety přes síto 20 mesh a důkladně smíšeny. Se vzniklým práškem byl smíchán roztok polyvinylpyrrolidonu, a směs byla poté proseta přes síto 16 mesh. Takto vzniklé granule byly vysušeny při 50° až 60°C a prosety přes síto 16 mesh. Karboxymethyl sodný škrob, stearát hořečnatý a mastek, které byly předem prosety přes síto 30 mesh, byly poté přidány do granulí, které byly po promíchání slisovány v lisovacím stroji do tablet, z nichž každá měla hmotnost 150 mg.

Příklad formulace 5

Byly vyrobeny tobolky, každá s obsahem 40 mg léčiva:

Složka	Množství(mg/tobolka)
Účinná složka	4 0,0 mg
Škrob	109,0 mg
Stearát hořečnatý	1,0 mg
Celkem	150,0 mg

Účinná složka, škrob a stearát hořečnatý byly smíchány, prosety sítem 20 mesh a naplněny do tvrdých želatinových tobolek, každá s obsahem 150 mg.

0000

Příklad formulace 6

Byly připraveny čípky, každý o obsahu 25 mg účinné složky:

Složka

Množství

Účinná složka mg

Nasycené glyceridy mastných kyselin do 2000 mg

Účinná složka byla proseta sítem 60 mesh a suspendována v nasycených glyceridech mastných kyselin, které byly předem roztaveny s minimem tepla. Směs byla potom nalita do formy na čípky s nominální kapacitou 2.0 g a ponechána vychladnout.

Příklad formulace 7

Byly vyrobeny suspenze, každá s obsahem 50 mg léčiva na dávku 5,0 ml:

Složka Množství

Účinná složka 50,0 mg

Xanthanová guma 4,0 mg

Karboxymethyl sodná celulóza (11 %)

Mikrokrystalická celulóza (89 %) 50,0 mg

Sacharóza 1,75 g

Benzoát sodný 10,0 mg

Příchutí a barviva q.v.

Čištěná voda do 5,0 ml

Účinná složka, sacharóza a xanthanová guma byly smíchány, prosety přes síto 10 mesh a potom smíchány s předem připraveným roztokem mikrokrystalické celulózy a karboxymethyl sodné celulózy ve vodě. Ke směsi se přidaly benzoát sodný, • · • » · · » · barviva a příchuti rozpuštěné v troše vody. Byl přidán dostatek vody, aby bylo dosaženo požadovaného objemu.

Příklad formulace 8

Byly vyrobeny tobolky, kazda o obsahu 15 mg léčiva:

Složka

Účinná složka

Škrob

Stearát hořečnatý

Celkem

Účinná složka, škrob, a prosety přes síto 20 mesh a tobolek v množství 560 mg.

Množství(mg/tobolka)

15,0 mg

407,0 mg 3, 0 mg

425,0 mg tearát hořečnatý byly smíchány, .aplněny do tvrdých želatinových

Příklad formulace 9

Byla vyrobena subkutánní

Složka

Účinná složka

Kličkový olej formulace:

Množství 1, 0 mg 1 ml

V této formulaci může být použito, pokud je to potřeba, 5,0 mg a více účinné složky v závislosti na její rozpustnosti v kličkovém oleji.

• · * ·

• · · · » · · · • · · ·«···

Příklad formulace 10

Byla vyrobena formulace pro povrchovou aplikaci

Složka

Účinná složka Emulgační vosk Tekutý parafín Bílý měkký parafín do

Množství

1-10 g g 20 g

100 g

Bílý měkký parafín byl zahříván až do roztavení. Byl přidán tekutý parafín a emulgační vosk a směs byla míchána, až se rozpustily. Byla přidána účinná složka a míchání pokračovalo, až se dispergovala. Směs byla potom ochlazena, a ztuhla.

Podle jednoho z aspektů tohoto způsobu je tento vynález zaměřen na způsob inhibice uvolňování β-amyloidního peptidů a/nebo inhibici jeho syntézy, který zahrnuje podávání pacientovi, který ho potřebuje, účinného množství krystalického dihydrátu (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl) 1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu. Podle jednoho z možných vytvoření způsobu vynález řeší způsob léčení Alzheimerovy choroby, zahrnující podávání pacientovi, který ho potřebuje, účinného množství krystalického dihydrátu (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1 (L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu.

V oboru je známo, že odborník v oboru může ovlivnit Alzheimerovu chorobu léčením pacienta postiženého touto chorobou nebo profylaktickým léčením pacienta, u kterého je nebezpečí rozvoje choroby. Termíny léčení a ošetřování

φ « φ

φ « φ « φ ·» ·Φ·Φ znamenají všechny procesy, které mohou zpomalit, přerušit, zadržet, řídit nebo zastavit rozvoj Alzheimerovy choroby, ale nemusí zcela zaručit vymizení všech symptomů. Uvedené způsoby zahrnují prevenci nástupu Alzheimerovy choroby u pacienta, u něhož je nebezpečí rozvoje Alzheimerovy choroby, zpomalení rozvoje Alzheimerovy choroby a léčení pokročilé Alzheimerovy choroby.

Termín pacient, jak je zde používán, znamená teplokrevné zvíře, jako je savec, který je postižen chorobou spojenou se zvýšením uvolňování β-amyloidního peptidu a/nebo jeho syntézy, mezi které patří Alzheimerova choroba. Je jasné, že příkladem zvířat v rozsahu tohoto pojmu to mohou být například morčata, psi, kočky, krysy, myši, koně, skot, ovce a lidé. U pacientů, kteří takové léčení potřebují, je tato diagnóza snadno stanovitelná.

Termín účinné množství sloučeniny vzorce I, jak je zde používán, znamená množství, které je účinné při inhibici uvolňování β-amyloidního peptidu a/nebo inhibici jeho syntézy, a zejména při léčení Alzheimerovy choroby.

Účinné množství snadno určí ošetřující diagnostik, který je odborníkem v oboru, s použitím běžných postupů a výsledků pozorování získaných za analogických podmínek. Při určování účinného množství dihydrátu krystalického N-( (S)-2-hydroxy-3methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4, 5, 6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu musí diagnostik brát v úvahu mnoho faktorů, mezi něž patří, avšak nejsou na tento výčet omezeny: síla a povaha N-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu; druh pacienta; jeho velikost, věk a zdravotní stav; stupeň komplikací nebo závažnosti choroby; odpověď individuálního pacienta; způsob podávání; povaha

• · · « · biologické dostupnosti podávaného preparátu; zvolený režim; souběžné podávání dalších léčiv a jiné relevantní okolnosti.

Účinné množství krystalického dihydrátu N-((S)-2-hydroxy3methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5, 6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu se může pohybovat od přibližně 0,1 miligramu na jeden kilogram hmotnosti těla na den (mg/kg/den) do přibližně 100 mg/kg/den. Výhodné množství je schopen určit odborník v oboru.

Dále jsou uvedeny dále různé biologické systémy, v nichž může být testován dihydrát N-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)1-(L-alaninyl)(S)-l~amíno-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu.

Příklad A

Buněčný screening detekce inhibitorů výroby β-Amyloidu

Množství shora uvedených sloučenin vzorce I bylo testováno na jejich schopnost inhibovat produkci β-amyloidu v buněčné linii se Švédskou mutací. Tento screeningový test využívá buňky (K293 - buněčná linie z lidských ledvin), které byly stabilně transfektovány genem pro prekursor amyloidního proteinu 751 (APP751), který obsahoval dvojitou mutaci Lys65iMet₆52 až Asn₆5iLeu₆₅2 (číslování APP751) způsobem, popsaným v mezinárodní patentové přihlášce č. 94/105 69⁸ a v Citron a kol¹². Tato mutace je obecně nazývána Švédská mutace a buňky, navržené jako 293 751 SWE, byly umístěny na Corning 96jamkovou desku s počtem buněk 2-4 x 109 na jamku v Dulbeccově minimálním základním médiu (Sigma, St. Loins, MO) plus 10 % fetálního hovězího séra. Počet buněk je důležitý,

9999 • ·

9

• · · ♦ • · · * • · · · · • · 9 9 · • · 9 ·

9 9 · · • ·Μ· • · aby bylo dosaženo β-amyloid ELISA výsledků při lineárním rozsahu testu (~0,2 až 2,5 ng na ml).

Po inkubaci přes noc při 37°C v inkubátoru ekvilibrovaném 10 % oxidem uhličitým, byla média odstraněna media a nahrazena 200 ml sloučeniny vzorce I (účinná látka) obsahující médium pro jamku pro dvouhodinovou předzpracovávací periodu a buňky, inkubované způsobem, který byl uveden shora. Zásobní roztoky účinných látek byly připraveny v 100 % dimethylsul-foxidu tak, aby ve výsledné koncentraci účinné látky, použité při zpracování, nepřekročila koncentrace dimethylsulfoxidu 0,5 % a ve skutečnosti byla vyrovnána na hodnotě 0,1 %.

Na konci předzpracovávací periody byla média znovu odstraněna a nahrazena čerstvými roztoky obsahujícími účinnou látku, jak byla popsána shora, a buňky, které byly inkubovány po další dvě hodiny. Po zpracování byly desky centrifugovány v přístroji Beckman GPR při 1200 ot/min. po dobu pět minut při pokojové teplotě, aby se buněčný detrit peletízoval z upraveného roztoku. Z každé jamky se odebralo 100 ml upraveného roztoku nebo jeho odpovídajícího zředění a bylo převedeno na desku ELISA, předem povlečené protilátkou 266 [P. Seubert, Nátuře (1992) 359:325-327] proti aminokyselinám 13-28 β-amyloidního peptidu, jak bylo popsáno v mezinárodní patentové přihlášce č. 94/105 698, která byla uložena přes noc při 4°C. Následující den byl pro zjištění množství vzniklého β-amyloidního peptidu proveden test ELISA, který využíval značkovou protilátku 3D6 [P. Seubert, Nátuře (1992) 359:325327) proti aminokyselinám 1-5 β-amyloidního peptidu.

Cytotoxické účinky sloučenin byly zjišťovány modifikovanou metodou podle Hansena, a kol. Do buňky která zůstala na tkáňové kultivační desce bylo přidáno 25μ1 ·« 000· «· o

0 0 · 0 0 * 0 · · «00 « 0 .0000

0

0 «00 0 0

0 0 0 • 0 0

00·0 0 «

0 zásobního roztoku (5 mg/ml) 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5difenyltetrazolium bromidu (MTT) (Sigma, St. Louis, MO) , na konečnou koncentraci 1 mg/ml. Buňky byly inkubovány při 37 °C po dobu jedné hodiny a buněčná aktivita byla ukončena přídavkem ekvivalentního množství lýzního pufru MTT (20 % hmotnostních dodecylsulfátu sodného v 50% dimethylformamidu, pH 4,7). Úplná extrakce byla dosažena třepáním přes noc při pokojové teplotě. Rozdíly v 0D_5S2nm a OD_650nm byly měřeny v Molekulárním zařízení UV_max pro čtení mikrodesek jako indikátoru buněčné zviditelnění.

Výsledky testu ELISA pro β-amyloidní peptid byly vyneseny do standardní křivky a vyjádřeny jako ng/ml β-amyloidního peptidu. Za účelem normalizace cytotoxicity, byly tyto výsledky poděleny výsledky pro MTT a vyjádřeny jako procenta výsledků kontrolního testu bez účinné látky. Všechny výsledky jsou průměrné hodnoty a bylo použito průměru minimálně ze šesti opakování.

Příklad B

Potlačení uvolňování a/nebo syntézy β-Amyloidu in vivo

Tento Příklad ilustruje, jak sloučeniny podle vynálezu mohou být testovány in vivo na potlačení uvolňování a/nebo syntézu β-amyloidu. Pro tyto experimenty byly použity 3 až 4 měsíce staré myši PDAPP [Games a kol., (1995) Nátuře 373:523527]. V závislosti na tom, jaká sloučenina byla testována, byly sloučeniny obvykle upraveny na koncentraci mezi 1 a 10 mg/ml. Vzhledem k nízké rozpustnosti sloučenin, mohou být formulovány s různými vehikuly, jako jsou kukuřičný olej (Safeway, South San Francisco; CA); 10% ethanol v kukuřičném oleji; 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrin (Research Biochemicals ·· 1111

·· *♦

1 • · · • · · ·

111 1111 111 *

International, Natick ΜΆ); a karboxymethylcelulóza (Sigma Chemical Co., St. Louis MO).

Myším byla látka podávána subkutánně pomocí 26 gage jehly a o tři hodiny později byla zvířata usmrcena narkózou C0₂ a byla srdeční punkcí odebrána krev s použitím tuberkulinové jehly 1 cc 25G 5/8 povlečené roztokem 0,5 M EDTA, pH 8,0. Krev byla umístěna do BectonDickinson vakuové trubice obsahující EDTA a odstřeďována po 15 minut při 1500 G při 5°C. Mozky myší byly poté odstraněny a kortex a hippokampus byl vyjmuty a umístěny na led.

1. Test na mozkovou tkáň

Pro přípravu tkáně hipokampu a kortexu pro enzymově vázaný imunosorbentní test (ELISA) byla každá část mozku homogenizována v 10 objemových dílech ledového guanidinového pufru (5,0 M guanidin-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) s použitím poháněné těrky Kontes (Fisher, Pittsburgh PA). Homogenizované materiály byly jemně rozdrceny na rotační desce po dobu tří až čtyř hodin při pokojové teplotě, uchovány při -20°C a poté byla provedena kvantifikace β-amyloidu.

Homogenáty mozku byly zředěny 1:10 ledově studeným kaseinovým pufrem (0,25% kasein, solanka pufrovaná fosfátem (PBS), 0,05% azid sodný, 20 pg/ml aprotinin, 5 mM EDTA, pH 8,0, 10 pg/ml leupeptin], čímž byla snížena konečná koncentrace guanidinu na 0,5 M, poté byla provedena centrifugace při 16 000 G po dobu 20 minut při 4°C. Pokud to bylo potřeba, vzorky byly dále zředěny přídavkem kaseinového pufru s 0,5 M guanidin hydrochloridem, aby se dosáhl optimální poměr pro měření ELISA. Standardy β-amyloid (1-40 nebo 1-42 aminokyseliny) byly připraveny tak, aby konečné ·· ···· • · · * ···· ·« ♦··· • · · · • · · ♦ í » • · · · · · ·' ·· ♦· v přítomnosti 0,1% složení obsahovalo 0,5 M guanidinu hovězího sérového albuminu (BSA) .

Celkový β-amyloid sendvič ELISA, který kvantifikuje jak βamyloid (aminokyseliny 1-40) , tak β-amyloid (aminokyseliny 142) sestává ze dvou monoklonálních protilátek (mAb) βamyloidu. Zachycovací protilátka 266 [P. Seubert, Nátuře (1992) 359:325-327], je specifická na aminokyseliny 13-28 βamyloidu. Protilátka 3D6 [Johnson-Wood a kol., PNAS USA (1997) 94:1550-1555], která je specifická na aminokyseliny 1-5 βamyloidu, byla biotinylována a sloužila v testu jako hlásící protilátka. Biotinylace 3D6 využívá návod výrobce (Pierce, Rockford IL) pro značení ímunoglobulinů NHS-biotinem, s výjimkou toho, kdy je použit 100 mM hydrogenuhličitan sodný, pufr pH 8,5. Protilátka 3D6 nerozlišuje vyloučený proteinový prekursor amyloidu (APP) nebo APP plné délky, ale detekuje pouze druhy β-amyloidu s amino-koncovou kyselinou aspartovou. Test má nižší hranici citlivosti na ~50 pg/ml (11 pM) a nevykazuje žádnou křížovou reaktivitu vůči endogennímu myšímu β-amyloidnímu peptidu při koncentracích do 1 ng/ml.

Konfigurace sendviče ELISA vyhodnocující úroveň βamyloidu (aminokyseliny 1-42) využívá mAb 21F12 [Johnson-Wood a kol., PNAS USA (1997) 94:1550-1555] (která rozpoznává aminokyseliny 33-42 β-amyloidu) jako zachycující protilátku. Biotinylovaný 3D6 je v tomto testu rovněž hlásící protilátkou, která má nižší hranici citlivosti na 125 pg/ml (28 pM).

266 a 21F12 zachycovací mAbs byly povlečeny při 10 pg/ml na 96 jamkové desky pro imunotest (Costar, Cambidge MA) a ponechány přes noc při pokojové teplotě. Desky byly poté odsáty a zablokovány 0,25 albuminem z lidského séra v PBS pufru po dobu nejméně 1 hodiny při pokojové teplotě, a poté

9999

* • 9 9 9 9

9999 9 9 skladovány vysušené při 4°C až do použití. Poté byly desky rehydratovány promývacím pufrem (tris-pufrovací solanka, 0,05 % Tween 20) a potom použity. Na desky byly přidány vzorky a standardy a inkubovány přes noc při 4°C. Desky byly mezi každým krokem testu třikrát promyty promývacím pufrem. Biotinovaný 3D6, zředěný na 0,5 pg/ml v kaseinovém ínkubačním pufru (0,25 kasein, PBS, 0,05 Tween 20, pH 7,4) byl inkubován v jamce po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Do jamky byl přidáván Avidin-HRP (Vector, Burlingame CA) zředěný 1:4000 v kaseinovém inkubačním pufru po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Pak byl přidán kolorimetrický substrát, Pomalý TMBELISA (Pierce, Cambridge MA), a nechal se reagovat 15 minut, poté byla enzymatická reakce ukončena přidáním 2N H₂SO₄. Reakční produkt byl kvantifikován s použitím Molekulárního zařízení Vmax (Molecular Devices, Menlo Park CA), který měřil rozdíly v absorbanci při 450 nm a 650 nm.

2. Krevní test

EDTA plasma byla zředěna 1:1 ve vzorkovém roztoku (0,2 gm/1 fosfát sodný-H₂0 (jednosystný), 2,16 gm/1 fosfát sodný·7H₂O (dvojsystný), 0,5 gm/1 thimerosal, 8,5 gm/1 chlorid sodný, 0,5 ml Triton X-405, 6,0 g/1 hovězí sérový albumin bez globulinu a voda). Vzorky a standardy ve vzorkovém roztoku byly testovány s použitím testu na celkový β-amyloid (266 zachycovací/3D6 hlásící), který byl popsán shora pro mozkové tkáně, s tou výjimkou, že byl použit vzorkový roztok namísto popsaným kaseinových rozpouštědel.

Z předchozích popisů vyplývají pro odborníky v oboru různé modifikace a změny ve složení a způsobech. Všechny takové obměny spadají do rozsahu přiložených nároků a jsou v nich zahrnuty.

Claims (43)

1. Patentové nároky

   1. (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)(S)l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrát.
2. 2. Krystalický (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(Lalanínyl)-(S)-1-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-on dihydrát podle nároku 1, dále vyznačený obrazcem rentgenové práškové difrakce zahrnující pík na 8,36, 12,43, 15,34, 19,22, 20,50, nebo 20,63 (2Θ ± 0.2°).
3. 3. Krystalický (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-on dihydrát podle nároku 1, dále vyznačený obrazcem rentgenové práškové difrakce zahrnující pík na 8,36 a 15,34 (2Θ ± 0.2°).
4. 4. Krystalický (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-on dihydrát podle nároku 1, dále vyznačený obrazcem rentgenové práškové difrakce zahrnující pík na 8,36 a 12,43 (2Θ ± 0.2°) .
5. 5. Krystalický (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-on dihydrát podle nároku 1, dále vyznačený obrazcem rentgenové práškové difrakce zahrnující pík na 8,36, 12,43, a 15,34 (2Θ ± 0.2°).
6. 6. Krystalický (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-on dihydrát podle nároku 1, dále vyznačený ·· ···· obrazcem rentgenové práškové difrakce zahrnující pík na 8,36, 12,43 15, 34, 19, 22, 20, 50 a 20, 63 (2Θ ± 0.2°).
7. 7. Krystalický(N) - ((S)-2-hydroxy-3~methylbutyryl)-1- (Lalaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-on dihydrát podle nároku 2, dále vyznačený nukleární magnetickou rezonancí v pevné fázi, která má chemický posun (ppm) 75,6, 35,3, 21,4 nebo 16,6 (29 ± 0,2°).
8. 8. Krystalický(N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-on dihydrát podle nároku 2, dále vyznačený nukleární magnetickou rezonancí v pevné fázi, která má chemický posun (ppm) 75, 6, 35, 3, 21,4 a 16,6 (29 ± 0.2°).
9. 9. Farmaceutická kompozice obsahující (N)-((S)-2-hydroxy

   3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrát a farmaceuticky přijatelné rozpouštědlo.
10. 10. Způsob inhibice uvolňování β-amyloidního peptidu a/nebo inhibice jeho syntézy, při kterém se pacientovi, který to potřebuje, podává účinné množství (N)-((S)-2- hydroxy-3methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5, 6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrátu.
11. 11. Způsob léčení Alzheimerovy choroby, při kterém se pacientovi, který to potřebuje, podává účinné množství (N)((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrátu.
12. 12. Způsob léčení Alzheimerovy choroby, při kterém se pacientovi, který to potřebuje, podává účinné množství (N)((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-368

    00 000· ·· ···· methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrátu podle kteréhokoliv z nároků 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7.
13. 13. Způsob prevence Alzheimerovy choroby, při kterém se pacientovi, který to potřebuje, podává účinné množství (N) ((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S) -l-amino-3methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrátu.
14. 14. Způsob prevence Alzheimerovy choroby, při kterém se pacientovi, který to potřebuje, podává účinné množství (N)((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrátu podle kteréhokoliv z nároků 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7.
15. 15. Způsob inhibice rozvoje Alzheimerovy choroby , při kterém se pacientovi, který to potřebuje, . podává účinné množství krystalického (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1(L~alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-on dihydrátu.
16. 16. Způsob inhibice rozvoje Alzheimerovy choroby, při kterém se pacientovi, který to potřebuje, podává účinné množství (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrátu podle kteréhokoliv z nároků 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7.
17. 17. Způsob přípravy krystalického (N)-((S)-2-hydroxy-3methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on dihydrátu podle nároku 1, dále vyznačeného obrazcem rentgenové práškové difrakce, zahrnující pík na 8,36, 12,43, 15, 34, 19,22, 20, 50, nebo 20, 63 (2Θ ± 0.2°), zahrnující krystalizaci (N)-((S)-2-hydroxy-3methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5, 6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu z vodného rozpouštědla.

    99 9999 ·· 9999

    99 9

    9 9 9

    9 9 9 9 • ·«»·*

    9 9 0

    99 9
18. 18. Způsob podle nároku 17, kde vodné rozpouštědlo zahrnuje aceton a vodu.
19. 19. Způsob přípravy laktamů vzorce I vzorec I kde

    Ri je alkyl, alkenyl, alkinyl, cykloalkyl, cykloalkenyl, substituovaný alkyl, substituovaný alkenyl, substituovaný alkinyl, substituovaný cykloalkyl, substituovaný cykloalkenyl, aryl, heteroaryl a heterocyklus;

    R₂ je alkyl, substituovaný alkyl, alkenyl, substituovaný alkenyl, alkinyl, substituovaný alkinyl, cykloalkyl, aryl, heteroaryl a heterocyklus;

    R₃ je alkyl,

    Xi je vodík, hydroxy nebo fluor,

    X₂ je vodík, hydroxy nebo fluor, nebo

    Xi a X₂ společně tvoří oxoskupinu; a

    V je zvoleno z 1 až 3 skupin nezávisle vybraných ze skupiny, která zahrnuje vodík, hydroxy, acyl, acyloxy, alkyl, substituovaný alkyl, alkoxy, substituovaný alkoxy, alkenyl, substituovaný alkenyl, alkinyl, substituovaný alkinyl, amino, aminoacyl, alkaryl, aryl, aryloxy, karboxyl, karboxylalkyl, kyano, halogen, nitro, heteroaryl, thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy a trihalogenmethyl;

    zahrnující (al) rozklad laktamu vzorce (4) \

    R.

    O (4) (4) kde R₃ a V jsou popsány pro sloučeninu vzorce I, krystalizaci jeho adiční soli s kyselinou, vybranou ze skupiny, která zahrnuje kyselinu di-p-tolyl-L-vinnou, (R)-(-) 10-kafrsulfonovou a (D)-(-)mandlovou za vzniku sloučeniny vzorce (10);

    v

    H,N \

    ^R3 (10) o

    (b) kopulaci sloučeniny vzorce (1) s vhodnou aminokyselinnou chráněnou aminoskupinou, vzorce

    PgNH-CHR₂-C (O)-A, kde R₂ má význam definovaný pro sloučeninu vzorce I a A znamená aktivační skupinu, například -OH, -Br, nebo -Cl, Pg znamená aminovou chránící skupinu, čímž se vyrobí sloučenina vzorce (11) (c) odstranění chránící skupiny sloučeniny vzorce (11), čímž se vyrobí sloučeniny vzorce (12); a (d) kopulací sloučeniny vzorce (12) s vhodnou sloučeninou vzorce RiCXiX₂-C (O) Αχ, kde R₂, Xj a X₂ mají význam, uvedený ve sloučenině vzorce I a Ai je aktivační skupina, například -OH, -Br, nebo -Cl; nebo (a2) kopulaci sloučeniny vzorce (10) se sloučeninou vzorce RiCXiX₂-C (0) NH-CHR₂-C (O)-A, kde R_x, R₂, Xi, a X₂ mají ·· ·· ·· ·♦·· • · · e · * * • · · · · « • · · · · * · • · · * · · · •· «··· * · · * význam uvedený ve sloučenině vzorce I a A je aktivační skupina, například -OH, -Br, nebo -Cl.
20. 20. Způsob podle nároku 16, kde V je vodík a R₃ je nižší alkyl.
21. 21. Způsob podle nároku 17, kde adiční sůl s kyselinou je taková sůl, která je vyrobena s kyselinou, vybranou ze skupiny zahrnující kyselinu di-p-tolyl-L-vinnou, (R)-(-)-10kafrsulfonovou a (D)-(-)-mandlovou.

    22. Způsob podle p-tolyl-L-vinná. nároku 18, kde kyselinou je kyselina 23. Způsob podle nároku 18, kde kyselinou je kyselina (D)-(-)-mandlová. 24. Způsob podle nároku 18, kde kyselinou je kyselina (R)-(-)-10-kafrsulfonová.
22. 25. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 17, 18, 19, 20 nebo 21, kde způsob se provádí v přítomnosti aldehydu.
23. 26. Způsob podle nároku 22, kde aldehydem je salicylaldehyd.
24. 27. Způsob podle nároku 23, kde salicylaldehyd je vybrán ze skupiny, která zahrnuje salicylaldehyd, 5-nitrosalicylaldehyd a 3,5-dichlorsalicylaldehyd.
25. 28. Způsob přípravy (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)1-(L-alaninyl)-(S)-amino-3-methyl-4,5,6,7- tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu, zahrnující: krystalizaci • · *999 • 9 *9«

    9 · 9 · · · • 9·9 99999

    9 9 9 · · ·

    9 9 9 9 9 l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu jako adiční soli s kyselinou, přičemž kyselina je vybraná skupiny zahrnující di-p-tolyl-L-vinnou kyselinu, (R)-(-)-10kafrsulfonovou kyselinu a (D)-(-)-mandlovou kyselinu; kopulaci(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-on s L-alaninovým zbytkem chráněným aminoskupinou, aby se získal 1-(L-alaninyl)-(S)-amino-3methyl-4,5,6,7- tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on chráněný aminoskupinou; odstranění chránící skupiny za vzniku 1-(Lalaninyl)-(S)-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu; a kopulaci s kyselinou (S)-2-hydroxy-3methylmáselnou.
26. 29. Způsob přípravy (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)1-(L-alaninyl)-(S)-amino-3-methyl-4,5,6,7- tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu zahrnující: krystalizací l-amino-3-methyl4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on jako adiční soli s kyselinou, přičemž kyselina je vybraná skupiny zahrnující dip-tolyl-L-vinnou kyselinu, (R)-(-)-10-kafrsulfonovou kyselinu a (D)-(-)-mandlovou kyselinu; kopulaci(S)-l-amino-3-methyl4, 5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu se (S)-2-hydroxy-3methylbutyryl)-1-(L-alaninyl) zbytkem.
27. 30. Způsob přípravy v podstatě čistých laktamů vzorce (10) kde *

    R₃ je alkyl, a

    V je zvoleno z 1 až 3 skupin nezávisle vybraných ze skupiny, která zahrnuje vodík, hydroxy, acyl, acyloxy, alkyl, substituovaný alkyl, alkoxy, substituovaný alkoxy, alkenyl, substituovaný alkenyl, alkinyl, substituovaný alkinyl, amino, aminoacyl, alkaryl, aryl, aryloxy, karboxyl, karboxylalkyl, kyano, halogen, nitro, heteroaryl, thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy, a trihalogenmethyl;

    zahrnující: krystalizaci sloučeniny vzorce (4) za vzniku sloučeniny vzorce (10) jako adiční soli s kyselinou, přičemž kyselina je vybraná skupiny zahrnující dip-tolyl-L-vinnou kyselinu, (R)-(-)-10-kafrsulfonovou kyselinu a (D)-(-)-mandlovou kyselinu.
28. 31. Způsob podle nároku 27, kde V znamená vodík a R₃ je nižší alkyl.
29. 32. Způsob podle nároku 28, kde adiční sůl s kyselinou je taková sůl, která je vyrobena s kyselinou, vybranou ze skupiny zahrnující kyselinu di-p-tolyl-L-vinnou, (R)-(-)-10kafrsulfonovou a (D)-(-)-mandlovou.
30. 33. Způsob podle nároku 28, kde kyselinou je di-p-tolylL-vinná kyselina.

    99 ··*· • 9 • · 9

    9 «9 9 4
31. 34. Způsob podle nároku 28, kde kyselinou je (D)-(-)mandlová kyselina.
32. 35. Způsob podle nároku 28, kde kyselinou je (R)-(-)-10 kafrsulfonová kyselina.
33. 36. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 29, 30, 31 nebo 32, kde způsob je prováděn v přítomnosti aldehydu.
34. 37. Způsob podle nároku 33, kde aldehydem je salicylaldehyd.
35. 38. Způsob podle nároku 34, kde salicylaldehyd je vybrán ze skupiny, která zahrnuje salicylaldehyd, 5-nitrosalicylaldehyd a 3,5-dichlorsalicylaldehyd.

    kde

    Ri je alkyl, alkenyl, alkinyl, cykloalkyl, cykloalkenyl, substituovaný alkyl, substituovaný alkenyl, substituovaný alkinyl, substituovaný cykloalkyl, substituovaný cykloalkenyl, aryl, heteroaryl a heterocyklus;

    ·· ·· • · · · · • · · !

    • · · · · • · · · · • · · · <

    • ·· ··

    R₂ je alkyl, substituovaný alkyl, alkenyl, substituovaný alkenyl, alkinyl, substituovaný alkinyl, cykloalkyl, aryl, heteroaryl a heterocyklus;

    R₃ je alkyl,

    Xi je vodík, hydroxy nebo fluor,

    X₂ je vodík, hydroxy nebo fluor, nebo

    Xi a X₂ společně tvoří oxoskupinu; a

    V je zvoleno z 1 až 3 skupin nezávisle vybraných ze skupiny, která zahrnuje vodík, hydroxy, acyl, acyloxy, alkyl, substituovaný alkyl, alkoxy, substituovaný alkoxy,, alkenyl, substituovaný alkenyl, alkinyl, substituovaný alkinyl, amino, aminoacyl, alkaryl, aryl, aryloxy, karboxyl, karboxylalkyl, kyano, halogen, nitro, heteroaryl, thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy, a trihalogenmethyl;

    zahrnuj ící:

    a)kopulaci derivátu kyseliny fenyloctové vzorce (5) kde V má význam, uvedený ve sloučenině vzorce I a A₂ aktivační skupina vybraná ze skupiny, která zahrnuje -OH, -Cl, nebo -Br, s acetalem vzorce (6) • fc fcfcfc· • · · · · · • φ ··· • · · · · · ··· · · ·· ···· ·· kde

    R3 má význam, uvedený ve vzorci I a R₅ je C1-C4 alkyl, za vzniku sloučeniny vzorce (7)

    b) cyklizaci sloučeniny vzorce (7) v kyselině vybrané ze skupiny, která zahrnuje kyselinu sírovou a trifluormethansulfonovou za vzniku sloučeniny vzorce (8) v

    (8) ·« ···· při oximační reakci za

    c) reakci sloučeniny vzorce (8) vzniku sloučeniny vzorce (9)

    d) redukci vzorce (4) sloučeniny vzorce (9) za vzniku sloučeniny

    e) rozklad laktamu vzorce (4) frakcionální krystalizaci za vzniku sloučeniny vzorce (10) jako adiční soli s kyselinou přičemž kyselina je vybraná skupiny zahrnující di-p-tolyl-Lvinnou kyselinu, (R)-(-)-10-kafrsulfonovou kyselinu a (D)-(-) mandlovou kyselinu.

    ·· ·♦♦·

    f) kopulace vhodné aminokyseliny chráněné aminovou skupinou, vzorce PgNH-CHR₂-C (0) -A, kde R₂ má význam, uvedený ve sloučenině vzorce I a A aktivační skupina, například -OH, -Br nebo -Cl, a Pg je aminová chránící skupina, za vzniku sloučeniny vzorce (11)

    h) kopulace sloučeniny vzorce (12) s vhodnou sloučeninou vzorce RiCXiX₂-C (0)A_x kde R_x, X_lf a X₂ mají význam, uvedený ve sloučenině vzorce I a Ai _je aktivační skupina, například -OH, -Br nebo -Cl; nebo

    i) kopulace sloučeniny vzorce (10) se sloučeninou vzorce RiCXiX₂-C (0) NH-CHR₂-C (0)-A, kde R_lř R₂, X_x a X₂ mají význam, uvedený ve sloučenině vzorce I a A je aktivační skupina, například-OH, -Br nebo -Cl.

    ·· ···· • · • ·

    80 *··* · • · · • · · · • · · · ··· ·· «
36. 40. Způsob přípravy laktamů vzorce (4) kde

    R₃ je alkyl

    V je zvoleno z 1 až 3 skupin nezávisle vybraných ze skupiny, která zahrnuje vodík, hydroxy, acyl, acyloxy, alkyl, substituovaný alkyl, alkoxy, substituovaný alkoxy, alkenyl, substituovaný alkenyl, alkinyl, substituovaný alkinyl, amino, aminoacyl, alkaryl, aryl, aryloxy, karboxyl, karboxylalkyl, kyano, halogen, nitro, heteroaryl, thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy, a trihalogenmethyl;

    zahrnující:

    a) kopulaci derivátu fenyloctová kyseliny vzorce (5) v

    *2

    O (5) • · • to · • · · • · · · • · · · · · ··· ·· · kde

    V má význam, uvedený ve sloučenině vzorce I a A₂ je aktivační skupina, vybraná ze skupiny, která zahrnuje -OH, Cl nebo -Br, s acetalem vzorce (6) kde

    R₃ má význam, uvedený ve vzorci I a R₅ je C1-C4 alkyl, za

    b) cyklizací sloučeniny vzorce (7) v kyselině vybrané ze skupiny, která zahrnuje kyselinu sírovou a trifluormethansulfonovou kyselinu za vzniku sloučeniny vzorce (8) (8) • · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · · ·· ···· ·· ·· ·

    c) reakce sloučeniny vzorce (8) při oximové reakci za vzniku sloučeniny vzorce (9)

    d) redukcí sloučeniny vzorce (9).
37. 41. Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro použití jako farmaceutický prostředek.
38. 42. Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro použití při léčení Alzheimerovy choroby.
39. 43. Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro použití při prevenci Alzheimerovy choroby.
40. 44. Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro použití při inhibici uvolňování β-amyloidního peptidu a/nebo inhibici jeho syntézy.
41. 45. Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro použití při inhibici rozvoje Alzheimerovy choroby.
42. 46. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro výrobu léčiva pro inhibici uvolňování β-amyloidního peptidu a/nebo inhibici jeho syntézy, včetně léčení Alzheimerovy choroby.

    ·· ···· • · ···· ·· ····
43. 47. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 pro výrobu léčiva pro prevenci Alzheimerovy choroby a/nebo inhibicí rozvoje Alzheimerovy choroby.