CZ20012708A3

CZ20012708A3 - Heteroarylové acetylenické sulfonamidohydroxamové a fosfinamidohydroxamové kyseliny jako inhibitory TACE

Info

Publication number: CZ20012708A3
Application number: CZ20012708A
Authority: CZ
Inventors: Jeremy Ian Levin; James Ming Chen; Frances Christy Nelson
Original assignee: American Cyanamid Company
Priority date: 1999-01-27
Filing date: 2000-01-27
Publication date: 2002-04-17
Also published as: DK1147102T3; HUP0105434A3; AR022422A1; PL349768A1; CN1144785C; NO20013681D0; ES2215621T3; NO20013681L; EA200100805A1; ZA200104981B; DE60009035D1; NZ512368A; PT1147102E; IL144346A0; EP1147102A2; BR0007726A; WO2000044740A2; EP1147102B1; KR20010101731A; CA2356481A1

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká acetylenických arylových a heteroarylových sulfonamidohydroxamových a fosfinamidhydroxamových kyselin, které působí jako inhibitory enzymu Sloučeniny podle předkládaného k léčení chorobných stavů zprostředkovaných TNF- , jako je například revmatoidní artritida, osteoartritida, sepse, AIDS, ulcerativní kolitida, sclerosis multiplex, Crohnova nemoc a degenerativní poškození chrupavky.

konvertujícího TNF- (TÁCE) vynálezu jsou použitelné

Dosavadní stav techniky

--Enzym—konvertuj ící—TNF---(TÁCE)—katalyzuje—tvorbu—TNF-— z proteinového prekurzoru TNF- vázaného na membránu. TNF- je prozánětlivý cytokin, o kterém se předpokládá, že má úlohu u těchto nemocí: revmatoidní artritida [Shire, M. G., Muller, G. W. , Exp. Opin. Ther. Patents, 8(5), 531, 1998, Grossman, J. M., Brahn, E. J., Women s Health, 6(6), 627, 1997, Isomaki,

P., Punnonen, J. Ann. Med., 29, 499, 1997, Camussi, G. , Lupia, E., Drugs, 55(5), 613, 1998], septický šok [Mathison, et. al.,

J. Clin. Invest. , 81, 1925, 1988, Miethke, et. al. , J. Exp. Med., 175, 91, 1992], rejekce štěpu [Piguet, P. F., Grau, G.

E., et. al. , J. Exp. Med., 166, 1280, 1987], kachexie [Beutler, B., Cerami, A., Ann. Rev. Biochem., 57, 505, 1988], anorexie, zánět [Ksontini, R, MacKay, S. L. D., Moldawer, L. L. Arch. Surg., 133, 558, 1998], městnavé selhání srdeční [Packer, M., Circulation, 92(6), 1379, 1995, Ferrari, R., Bachetti, T., et. al., Circulation, 92(6), 1479, 1995], post• ·

.........

• ······ · · ·· · * ·· ..·· ..·

.. ·· ·· ··· ·· ···· ischemické reperfúzní poškození, zánětlivá onemocnění centrálního nervového systému, zánětlivá onemocněni střev, resistence na inzulín [Hotamisligil, G. S. , Shargill, N. S., Spiegelman, Β. M., et. al. , Science, 259, 87, 1993] a infekce HIV [Peterson, P. Κ. , Gekker, G., et. al. , J. Clin. Invest. , 89, 574, 1992, Pallares-Trujillo, J. , Lopez-Soriano, F. J. , Argiles, J. Μ. , Med. Res. Reviews, 15(6), 533, 1995], kromě jeho dobře doložených protinádorových vlastností [Old, L., Science, 230, 630, 1985]. Například výzkum s protilátkami anti-TNF- a transgenními zvířaty prokázal, že blokáda tvorby TNF- inhibuje progresi arthritidy [Rankin, E.C., Choy, E.H., Kassimos, D., Kingsley, G.H., Sopwith, A.M., Isenberg, D.A., Panayi, G.S., Br. J. Rheumatol. , 34, 334, 1995, Pharmaprojects, Therapeutic Updates, 17 (říj.), aul97-M2Z,

1996] . Toto zjištění bylo nedávno rozšířeno i na člověka, jak bylo popsáno v práci TNF- in Human Diseases, Current Pharmaceutical Design, 2, 662, 1996.

Předpokládá se, že^melá^melekula inhibitorů TACEVby mohla^- mít potenciál pro léčení rozmanitých chorobných stavů. Ačkoliv je známa celá řada inhibitorů TÁCE, mnoho z nich jsou molekuly peptidů a peptidům podobné, takže se vyskytují problémy s biologickou dostupností a farmakokinetické problémy. Navíc mnohé z těchto molekul jsou neselektivní, takže jsou silné inhibitory metaloproteináz mezibuněčné hmoty a obzvláště MMP-1. Předpokládá se, že inhibice MMP-1 (kolagenáza 1) vyvolává bolesti kloubů v klinických zkouškách inhibitorů MMP [Scrip, 2349, 20, 1998]. Dlouhodobě působící, selektivní, perorálně biologicky dostupné nepeptidové inhibitory TÁCE by tedy byly vysoce žádoucí pro léčbu chorobných stavů uvedených výše.

Příklady sulfonamidohydroxamových kyselin jako inhibitorů MMP/TACE, kde řetězec se 2 uhlíky odděluje kyselinu hydroxamovou a dusík sulfonamidu, jak je ukázáno níže, byly popsány ve WIPO mezinárodních publikacích WO9816503, WO9816506, WO9816514 a WO9816520 a patentu Spojených Států č. 5 776 961.

SO2AT

Patenty Spojených Států č. 5 455 258, 5 506 242, 5 552 419, 5 770 624, 5 804 593 a 5 817 822, a také evropská patentová přihláška EP606,046Al a WIPO mezinárodní publikace W09600214 a WO9722587 popisují nepeptidové inhibitory metaloproteináz mezibuněčné hmoty a/nebo TÁCE, ze kterých je arylová sulfonamidohydroxamová kyselina ukázána níže, ve které 1 uhlík odděluje kyselinu hydroxamovou a dusík sulfonamidu, jako příklad. Další publikace popisující MMP založené na sulfonamidech, které jsou sulfonamidhydroxamátu ukázané níže nebo inhibitory varianty analogy suTfonamidkařboxýIatu, jsou evropské patentové přihlášky EP-

757037-A1	a EP-757984-A1	a WIPO	mezinárodní	publikace
WO9535275,	WO9535276, WO9627583,	WO9719068,	WO9727174,
WO9745402,	WO9807697 a	WO9831664,	WO9833768,	WO9839313,
WO9839329,	WO9842659 a WO9843963.	Objev tohoto	typu MMP
inhibitoru	je dále detailně	popsán autory MacPherson, et. al.,
J. Med. Chem., 40, 2525,	1997 a Tamura, et. al.	, , J. Med.
Chem., 41,	640, 1998.

Publikace popisující -sulfonamidohydroxamátové inhibitory MMP a/nebo TÁCE, ve kterých byl uhlík alfa kyseliny • · • · hydroxamové připojen v kruhu k dusíku sulfonamidu, jak je ukázáno níže, zahrnují patent Spojených Států č. 5 753 653, WIPO mezinárodní publikace WO9633172, WO9720824, WO9827069, WO9808815, WO9808822, WO9808823, WO9808825, WO9834918, WO9808827, Levin, et. al., Bioorg. & Med. Chem. Letters, 8, 2657, 1998, a Pikul, et. al., J. Med. Chem., 41, 3568, 1998.

Patentové přihlášky DE19 542 189-A1, WO9718194 a EP803505 popisují další příklady cyklických sulfonamidů jako inhibitorů MMP a/nebo TÁCE. V tomto případě kruh obsahující sulfonamid je fúzován k aromatickému nebo heteroaromatickému kruhu.

Analogy sulfonamidů jsou fosfinamidohydroxamové kyseliny jako inhibitory MMP/TACE, příklad jejich struktury je uveden níže, které byly popsány ve WIPO mezinárodní publikaci WO9808853.

HOs

Sulfonamidové inhibitory MMP/TACE, ve kterých thiol je skupina chelatující zinek, jak je ukázáno níže, byly popsány ve WIPO mezinárodní přihlášce 9803166.

Ri íg Rs Re

Předmětem tohoto vynálezu je popsat arylové a heteroarylové sulfonamidohydroxamové a fosfinamiďohydroxamové kyseliny jako inhibitory MMP/TACE, ve kterých je sulfonylarylová skupina substituována v poloze para substituovanou butinylovou skupinou nebo propargyletherem, aminem nebo sulfidem. Tyto sloučeniny inhibují více aktivitu TACE in vitro a v buněčném testu a/nebo jsou selektivnější než MMP-1. Tyto sloučeniny mohou být tudíž použity pro léčení nemocí zprostředkovaných TNF.

Podstata vynálezu

Arylové a heteroarylové ortho-sulfonamidohydroxamové a fosfinamidohydroxamové kyseliny inhibující TACE a MMP podle předkládaného vynálezu jsou představovány vzorcem:

kde skupina C(=O)NHOH a skupina -NR₅- jsou navázány k sousedním uhlíkům skupiny A, kde

A je heteroarylová skupina s 5 až 6 členy mající 1 až 3 heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, S a 0,

X je skupina SO₂ nebo skupina -P(O)R₁₀,

Y je arylová skupina nebo mono- nebo bicyklická heteroarylová skupina s 5 až 10 členy mající 1 až tři heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, S a O, za podmínky, že X a Z se nevážou k sousedním atomům z Y,

Z je O, skupina NH, skupina CH₂ nebo S,

R₅ je vodík nebo alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, * R₆ a R₇ jsou - každý, nezávisle, vodík,- - alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, skupina -CN, skupina -CCH, «

R₈ je vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, alkenylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, alkinylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, cykloalkylové skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, arylová skupina, heteroarylová skupina s 5 až 10 členy mající 1 až 3 heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, S a O nebo heterocykloalkylová skupina s 5 až 9 členy mající 1 nebo 2 heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, S a

R₉ je vodík, arylová skupina, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo cykloalkylové skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, a Rio je alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, cykloalkylové skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, arylová skupina nebo heteroarylová skupina nebo jejich farmaceuticky přijatelná sůl.

Výhodné sloučeniny podle tohoto vynálezu mají strukturu B, , kde oba uhlíky z A sousedící se skupinou -NR₅- mají jiný substituent než vodík.

Výhodnější sloučeniny podle tohoto vynálezu zahrnují sloučeniny struktury B, ve kterých A je heteroarylová skupina s 5 až 6 členy mající 1 až 3 heteroatomy vybrané z N, skupiny

NR₉, S a O, kde :

• · • ♦ ·· • · · · • · · · • · · · · • · · ·· · · oba uhlíky z A sousedící se skupinou -NR5- mají jiný substituent než vodík, a Y je fenylový kruh substituovaný v poloze 1 a 4 substituenty X a Z, v daném pořadí.

Výhodnější sloučeniny podle tohoto vynálezu zahrnuji sloučeniny struktury B, ve kterých A je fenylová skupina, kde: oba uhlíky z A sousedící se skupinou -NR5- mají jiný substituent než vodík,

Y je--fenylový kruh substituovaný v- poloze -1 a-4- substituenty X a Z, v daném pořadí, a X je skupina S0₂.

Výhodnější sloučeniny podle tohoto vynálezu zahrnují sloučeniny struktury B, ve kterých A je fenylová skupina, kde: oba uhlíky z A sousedící se skupinou -NR5- mají jiný substituent než vodík,

Y je fenylový kruh substituovaný v poloze 1 a 4 substituenty X a Z, v daném pořadí,

Z je kyslík, a R₆ a R₇ jsou vodík.

X je skupina S02,

Z je kyslík,

Rg a R₇ jsou vodík, a R₈ je skupina -CH₂OH nebo methylová skupina.

Heteroarylová skupina, jak se v tomto textu používá, je mono- nebo bicyklický kruh s 5 až 10 členy mající 1 až 3 heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, S a 0

Heteroarylová • · · ·

skupina je výhodně

II II Ή Ί nebo kde K je skupina NR₉, 0 nebo S a R₉ je vodík, fenylová skupina, naftylová skupina, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo cykloalkylová skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku. Výhodné heteroarylové kruhy zahrnují pyrolový kruh, furanový kruh, thiofenový kruh, pyridinový kruh, pyrimidinový kruh, pyridazinový kruh, pyrazinový kruh, triazolový kruh, pyrazolový kruh, imidazolový kruh, isothiazolový kruh, thiazolový kruh, isoxazolový kruh, oxazolový kruh, indolový kruh, isoindolový kruh, benzofuranový kruh, benzothiofenový kruh, chinolinový kruh, isochinolinový kruh, chinoxalinový kruh, chinazolinový kruh, benzotriazolový kruh, indazolový kruh, benzimidazolový kruh, benzothiazolový kruh, benzisoxazolový kruh a benzoxazolový kruh.

Pro účely definice A je ještě výhodnější, heteroarylová skupina vybraná z že A je ·· ··

• ·

Heteroarylové skupiny podle předkládaného vynálezu mohou být volitelně mono- nebo disubstituovány.

Heterocykloalkylová skupina, jak se v tomto textu používá, se týká saturovaného nebo nesaturovaného mono- nebo bicyklického kruhu s 5 až 10 členy, majícího 1 nebo 2 heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, S nebo 0. Heterocykloalkylové kruhy podle předkládaného vynálezu jsou

kde K je skupina NR₉, 0 nebo S a R₉ je vodík, fenylová skupina, naftylová skupina, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo cykloalkylová skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku. Výhodné heterocykloalkylové kruhy jsou: piperidinový kruh, piperazinový kruh, morfolinový kruh, tetrahydropyranový kruh, tetrahydrofuranový kruh nebo pyrolidinový kruh.

Heterocykloalkylové skupiny podle předkládaného vynálezu mohou být volitelně mono- nebo disubstituovány.

Arylová skupina, jak se v tomto textu používá, se týká fenylové skupiny nebo naftylové skupiny, která může být volitelně mono-, di- nebo trisubstituována.

obsahující 2 až obsahující 3 až 6

- - Alkylová skupina, alkenylová skupina, -alkinyl-ová- skupina a perfluoralkylová skupina zahrnují jak skupiny s přímým řetězcem, tak rozvětvené skupiny. Alkylová skupina, alkenylová skupina, alkinylová skupina a cykloalkylová skupina mohou být nesubstituovány (uhlíky vázané k vodíku nebo dalším uhlíkům v řetězci nebo kruhu) nebo mohou být mono- nebo polysubstituovány.

Halogen znamená brom, chlor, fluor a jod.

Vhodné substituenty arylové skupiny, heteroarylové skupiny, alkytové skupiny, al kenyl ové skupiny, u±k±nyiové ~ skupiny a cykloalkylové skupiny jsou bez omezení halogen, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, alkenylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, alkinylová skupina 6 atomů uhlíku, cykloalkylová skupina atomů uhlíku, skupina -OR₂, skupina -CN, skupina -COR₂, perfluoralkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, -O-perfluoralkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, skupina -CONR₂R₃, skupina -S(O)_nR₂, skupina -OPO (OR₂) OR₃, skupina -PO(OR₂)R₃, skupina -OC(O)NR₂R₃, skupina -C(O)NR₂OR₃, skupina -COOR₂, skupina -SO₃H, skupina -NR₂R₃, skupina -N [ (CH₂) ₂] ₂NR₂, skupina -NR₂COR₃, skupina -NR₂COOR₃, skupina -SO₂NR₂R₃, skupina -NO₂, skupina -N(R₂)SO₂R₃, skupina -NR₂CONR₂R₃, skupina -NR₂C (=NR₃) NR₂R₃, skupina -NR₂C (=NR₃) N (SO₂R₂) R₃, skupina NR₂C(=NR₃)N(C=OR₂)R₃, skupina -SO₂NHCOR₄, skupina -CONHSO₂R₄, * · • · · · • · · · • · · · ·

4 * • 4 ··

-tetrazol-5-ylová skupina, skupina -SO₂NHCONR₂R₃, fenylová skupina, heteroarylová skupina nebo heterocykloalkylová skupina, kde -NR₂R₃ mohou tvořit pyrolidinový, piperidinový, morfolinový, thiomorfolinový, oxazolidinový, thiazolidinový, pyrazolidinový, piperazinový nebo azetidinový kruh,

R₂ a R₃ jsou každý, nezávisle, vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, cykloalkylové skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, fenylová skupina, naftylová skupina, heteroarylová skupina nebo heterocykloalkylová skupina,

R₄ je alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, alkenylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, alkinylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, cykloalkylové skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, perfluoralkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, fenylová skupina, naftylová skupina, heteroarylová skupina nebo heterocykloalkylová

-SO₂NHCN, skupina naftylová skupina,

Vhodné substituenty heterocykloalkylových skupin podle předkládaného vynálezu bez omezení jsou alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, cykloalkylové skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, fenylová skupina, naftylová skupina, heteroarylová skupina a heterocykloalkylová skupina.

Když skupina obsahuje více než jeden substituent se stejným určením, každý z těchto substituentů může být stejný nebo odlišný.

Farmaceuticky přijatelné soli mohou být tvořeny z organických a anorganických kyselin, které například jsou: octová, propionová, mléčná, citrónová, vinná, jantarová, fumarová, maleinová, malonová, mandlová, jablečná, ftalová, chlorovodíková, bromovodíková, fosforečná, dusičná, sírová, methansulfonová, naftalensulfonová, benzensulfonová, podobně známé přijatelné tohoto vynálezu obsahuje toluensulfonová, kyseliny, když kafrsulfonová a sloučenina podle bazickou skupinu. Soli mohou být také tvořeny z organických a anorganických bází, výhodně soli alkalických kovů, například sodíku, lithia nebo draslíku, když sloučenina podle tohoto vynálezu obsahuje kyselou skupinu.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou obsahovat asymetrický atom uhlíku a některé sloučeniny podle tohoto vynálezu -mohou obsahovat- -j-ed.no nebo- více asymetrických center a mohou tedy z nich vznikat optické izomery a diastereomery. I když je ukázán bez ohledu na stereochemii, zahrnuje předkládaný vynález tyto optické izomery a diastereomery, a také racemické a rozštěpené, enantiomerně čisté R a S stereoizomery, a také další směsi R a S stereoizomerů a jejich farmaceuticky přijatelné soli. Uznává se, že jeden optický izomer, včetně diastereomerů a enantiomeru nebo stereoizomerů, může mít prospěšnější vlastnosti než druhý. Tudíž při popisu a nárokování—vynálezu,—když- j e popsána—j edna racemická směs , - se jasně předpokládá, že oba optické izomery, včetně diastereomerů a enantiomerů nebo stereoizomerů v podstatě bez výskytu jiného, jsou také popsány a nárokovány.

Je prokázáno, že sloučeniny podle tohoto vynálezu inhibují enzymy MMP-1, MMP-9, MMP-13 a enzym konvertující TNF- (TÁCE), a jsou tudíž použitelné pro léčení arthritidy, nádorových metastáz, tkáňových ulcerací, abnormálního hojení ran, onemocnění periodontu, rejekce štěpu, rezistence na inzulín, onemocnění kostí a infekce HIV. Konkrétně sloučeniny podle vynálezu inhibují více aktivitu TÁCE in vitro a v buněčném testu a/nebo jsou selektivnější než MMP-1 a jsou tedy konkrétně použitelné pro léčení nemocí zprostředkovaných TNF.

Tento vynález také poskytuje způsob přípravy sloučenin vzorce B, jak je definován výše, který zahrnuje jeden z následujících kroků:

• * ·< *·

a) reakci sloučeniny vzorce V:

(V) kde R₅, R₆, R₇, R_s, A, X, Y a Z jsou tak, jak je definováno výše, a Q je skupina COOH nebo její reaktivní derivát, s hydroxylaminem za vzniku odpovídající sloučeniny vzorce B, nebo

b) odstranění chránící skupiny sloučeniny vzorce VI:

Re

ΛΑ r₃₀ohn W X ; ό ^r₇

Ra “(VIT kde R₅, R_s, R_7/ R₈, A, X, Y a Z jsou, jak je definováno výše, a R₃₀ je chránící skupina, jako je například t-butylová skupina, benzylová skupina nebo trialkylsilylová skupina, za vzniku sloučeniny vzorce B,

c) rozštěpení směsi (např. racemátu) opticky aktivních izomerů sloučeniny vzorce B, aby se izoloval jeden enantiomer nebo diastereomer v podstatě bez dalšího enantiomeru nebo diastereomerů, nebo

d) acidifikace bazické sloučeniny vzorce B farmaceuticky přijatelnou kyselinou za vzniku farmaceuticky přijatelné soli.

• 4 ·· · ·· ·· « · · · · · · · · · · ······ · · ·· · · • · ··· · · ·

Co se týče postupu a) , reakce může být prováděna postupy v oboru známými např. reakcí s kyselým chloridem za vzniku reaktivního 'derivátu', 'před reakcí~s hydroxyl aminem.

Odstranění chránících skupin, jak ukázáno postupem b) , může být prováděno postupem v oboru známým.

Co se týče postupu c), k izolaci konkrétních forem enantiomerů nebo diastereomerů mohou být použity standardní separační techniky. Například racemická směs může být konvertována na směs opticky aktivních diastereoizomerů reakcí s jedním enantiomerem štěpícího činidla (například vytvořením diastereomerní soli nebo vytvořením kovalentní vazby). Výsledná směs opticky aktivních diastereoizomerů může být separována standardními technikami (např. krystalizací nebo chromatografii) a jednotlivé opticky aktivní diastereoizomery pak mohou být ošetřeny tak, aby se odstranilo štěpící činidlo, a tím by se uvolnil jeden enantiomer sloučeniny podle vynálezu. Pro přímou separaci enantiomerních směsí může být také použita chirální chromatografie (s použitím chirální fáze, eluentu nebo činidla párujícího ionty).

Sloučeniny vzorce B mohou být izolovány ve formě soli farmaceuticky přijatelné kyseliny, např. organické nebo anorganické kyseliny, působením kyselin, jak jsou například popsány výše.

Vynález se dále týká způsobu výroby sloučenin struktury B zahrnujícího jednu nebo více reakcí, jak následují:

1) alkylace sloučeniny vzorce I nebo její soli či solvátu,

na sloučeninu vzorce II

2) reakci sloučeniny vzorce II uvedeného výše nebo její soli či solvátu s chloračním činidlem, jako je například thionylchlorid, chlorsulfonová kyselina, oxalylchlorid, oxid fosforečný, nebo dalšími halogenačními činidly, jako je například fluorsulfonová kyselina nebo thionylbromid, na —sl-ouěeninu—vzorce ----------------------------------------------

kde J je fluor, brom, chlor.

Výsledný sulfonylchlorid, fluorid nebo bromid, může být dále konvertován na deriváty triazolidu, imidazolidu nebo benzothiazolidu, kde J je 1,2,4-triazolylová skupina, imidazolylová skupina nebo benzotriazolylová skupina, reakcí sloučenin s 1,2,4 -triazolem, imidazolem nebo benzotriazolem, v daném pořadí. R₆, R₇ a R_s jsou jak je definováno výše.

Vynález se ještě dále týká způsobu výroby sloučenin struktury B zahrnující jednu nebo více reakcí, jak následují:

1) alkylace fenolu nebo jeho soli či solvátu na sloučeninu vzorce IV:

IV

2) reakce sloučeniny vzorce IV uvedeného výše nebo její soli či solvátu s chlorsulfonovou kyselinou pro přípravu sloučeniny vzorce II uvedeného výše.

Obzvláště výhodné meziprodukty jsou sloučeniny vzorců B a III, za předpokladu, že R₆ není hydrogen.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou připraveny s použitím obvyklých technik známých odborníkům v oboru organické syntézy. Výchozí látky použité pro přípravu sloučenin podle vynálezu jsou známé, vytvořené známými metodami nebo jsou komerčně dostupné. Následující sloučeniny (V-IX), které mohou být použity pro výrobu sloučenin podle vynálezu jsou známé a odkazy jsou uvedeny dále v tomto textu. Tento seznam je zahrnut pouze pro ilustraci a není zamýšlen omezovat jakýmkoliv způsobem vynález.

CO₂Et

V

VI

Odkazy v literatuře pro tyto látky jsou:

Sloučenina V:______

a) Dolle, RE, Hoyer, DW, Schmidt, SJ, Ross, TM, Rinker, JM, Ator, MA, evropská patentová přihláška EP-628550.

b) Wermuth, C-G, Schlewer, G, Bourguignon, J-J, Maghioros, G, Bouchet, Mu et al., J. Med. Chem, 32, 528-537, 1989.

c) Yutugi, S, et al., Chem. Pharm. Bull, 19, 2354-2364, 1971.

d) Dolle,	RE, Hoyer, D, Rinker, JM, Ross,	TM,	Schmidt, SJ,
Biorg. Med	. Chem. Lett, 7, 1003-1006, 1977.
Sloučenina	VI :
Camparini,	A, Ponticelli, F, Tedeschi, P,	J.	Chem. Soc. ,
Perkin Trans. 1, 10, 2391-4, 1982.
Sloučenina	VII :
Muller, C.	E., Geis, U., Grahner, B., Lanzner,	w.,	Eger, K., J.
Med. Chem.	, 39, 2482, 1996.

Sloučenina VIII:

Muller, C.E., Geis, U. , Grahner, B., Lanzner, W. , Eger, K. , J. Med. Chem. 39, 2482, 1996.

Sloučenina IX:

Komerčně dostupná

Odborníci rozpoznají, že určité reakce jsou nejlépe prováděny, když další potenciálně reaktivní funkční skupiny molekuly -jsou maskovány - nebo -Ghráněny, a tudíž nezpůsobují nežádoucí vedlejší reakce a/nebo nezvyšují výtěžek reakce. Z tohoto důvodu mohou odborníci použít chránící skupiny. Příklady těchto chránících skupin lze nalézt v práci T. W. Greene, P. G. M. Wuts (Protéctive Groups in Organic Synthesis, druhé vydání, Wiley & Sons, New York, 1991) . Je výhodné, když jsou reaktivní funkční řetězců aminokyselin chráněny. Potřeba skupiny postranních a výběr chránících skupin pro konkrétní reakci jsou odborníkovi známy a závisí na

- - povaze-ehráněné-funkění— skupiny {hydroxyskupina , aminoskupina, karboxyskupina, apod.), struktuře a stabilitě molekuly, jejíž částí je substituent, a na reakčních podmínkách.

Když se připravují nebo zpracovávají sloučeniny podle vynálezu obsahující arylový, heteroarylový nebo heterocyklický kruh, odborníci uznávají, že substituenty tohoto kruhu mohou být připraveny před konstrukcí kruhu, po ní nebo současně s konstrukcí kruhu. Z důvodů přehlednosti byly substituenty na těchto kruzích ze schémat uvedených v tomto textu níže vypuštěny.

Odborníci rozpoznají, že povaha a pořadí předložených kroků syntézy se mohou měnit za účelem optimalizace vytvoření sloučenin podle vynálezu.

Sloučeniny kyseliny hydroxamové podle vynálezu, 1, byly připraveny podle schématu 1 konverzí karboxylové kyseliny, 2, na odpovídající kyselý chlorid nebo anhydrid, nebo reakcí s vhodnou peptidovou kondenzační reagencií, pak následovala reakce s hydroxy1aminem za vzniku 1, nebo s chráněným derivátem hydroxylaminu za vzniku 3. Sloučeniny 3, kde R₃₀ je t-butylová skupina, benzylová skupina, trialkylsilylová skupina nebo jiná vhodná maskovací skupina, pak mohou být zbaveny chránící skupiny známými metodami za vzniku kyseliny hydroxamové 1.

Schéma 1:

Karboxylové kyseliny 2 mohou být připraveny tak, jak je ukázáno na schématu 2. Aminokyselinový derivát 4, ve kterém R₄₀je vodík nebo vhodná chránící skupina karboxylové kyseliny, může být sulfonylován nebo fosforylován reakcí se sloučeninami 5, ve kterých J je vhodná odstupující skupina včetně, ale bez omezení, chloru. N-H sloučenina 6 pak může být alkylována R₃J a baží, jako je například uhličitan draselný nebo hydrid sodný, v polárním aprotickém rozpouštědle, jako je například aceton, Ν,Ν-dimethylformamid (DMF) nebo tetrahydrofuran (THF), za vzniku sulfonamidu 7. Sloučeninu 7 lze také získat přímou reakcí 5 s N-substituovaným aminokyselinovým derivátem, 8. Konverze 7 na karboxylovou kyselinu byla prováděna kyselinou, bazickou hydrolýzou nebo jinou metodou konzistentní s výběrem

chránící skupiny R₄₀ a výskytem trojné vazby mezi dvěma atomy uhlíku.

Schéma 2:

Způsoby přípravy sulfonylačních činidel 5 jsou na schématu 3. Tak mohou být soli sulfonové kyseliny 9, kde ZR₅₀ je hydroxyskupina, thiolová skupina nebo substituovaná aminoskupina, alkylovány acetyleny 10, kde J je vhodná odstupující skupina, jako je například halogenmesylát, tosylát nebo triflát za vzniku 11. Acetyleny 10 jsou komerčně dostupné nebo známé sloučeniny nebo mohou být odborníky syntetizovány známým způsobem. Soli sulfonové kyseliny 11 mohou být konvertovány na odpovídající sulfonylchlorid nebo jiné sulfonylační činidlo 5 známým způsobem, jako je například reakce oxalylchloridem nebo jinou reagencií kompatibilní se substituenty R₆, R₇ a R₈ a acetylenem. Nebo disulfid 12 může být konvertován na diacetylen 13 reakcí se sloučeninou 10, pak následuje redukce disulfidové vazby za vzniku analogických ·· ·» ·· » ·· · 4 • ·· · · ··· · ·· · · 4 4 ··· ·· · • Β····· · · · 4 · · ·· · «·· · 4 4 • · · · · · · · · 4 · 4444 thiolů, které mohou být konvertovány na 5 známými metodami. Alkylace fenolu, thiofenolu, anilinu nebo chráněného anilinu 14 s 10 za vzniku 15, následovaná reakci s chlorsulfonovou kyselinou, poskytla sulfonové kyseliny 16, které jsou snadno konvertovány na 5 oxalylchloridem nebo podobnými reagenciemi. Thiofenoly 17 jsou také prekurzory 5 prostřednictvím protekce thiolu, alkylace ZH, kde Z je O, N nebo S a deprotekce síry, po které následuje oxidace sulfonové kyseliny 16.

Schéma 3:

Analogy 8 obsahující fosfor mohou být připraveny s použitím podobné metodologie, jak je ukázáno ve schématu 4. Schéma 4:

Acetylenické postranní řetězce mohou být také připojeny po sulfonylaci nebo fosforylaci aminokyselinového derivátu, jak je ukázáno ve schématu 5. Tedy, aminokyselinové deriváty 4 a 8 mohou být sulfonylovány nebo fosforylovány se sloučeninami 20, kde ZR₅₀ je hydroxyskupina nebo chráněná hydroxyskupina, thiol nebo amin, a je-li nutné, alkylovány s R₇J, jako ve schématu 2, za vzniku 21. Odstranění R₅₀ maskovací skupiny za vzniku 22 a následná alkylace výsledného fenolu, thiolu nebo aminu s 10 poskytuje 7. V případě, kde ZR₅₀ se rovná OH, není pro vznik 22 vyžadován žádný krok pro odstranění chránící skupiny.

Analogy propargylaminu 7 mohou být syntetizovány tak, jak je ukázáno ve schématu 6 vycházeje z aminokyselinových derivátů 4 a/nebo 8. Sulfonylace nebo fosforylace s para-nitro arylovou sloučeninou 23, například 4-nitrobenzensulfonylchloridem, následovaná alkylaci s R₅J (pro 4) s použitím báze, jako je například uhličitan draselný nebo hydrid sodný v DMF, poskytuje 24. Redukce nitroskupiny vodíkem a paladiem na uhlí, chloridem cínatým nebo jinou známou metodou za vzniku anilinu 25 a následná alkylace s 10 pak poskytla 7. Anilin 25 může být derivatizován s vhodnou dusíkovou chránící skupinou, jako je například t-butoxykarbonylová skupina, za vzniku 26 před alkylaci s 10, a poté po alkylaci zbaven chránící skupiny.

Schéma 6:

_

2)RsJ

1) redukce

1) 10

2) deprotekce

Acetylenické deriváty 7 je také možno získat prostřednictvím fluorovaných sloučenin 27, snadno připravených z aminokyselinových derivátů 4 a/nebo 8 reakcí s fluorarylovou skupinou 26, jak je ukázáno ve schématu 7. Nahrazení fluoru z 27 v přítomnosti báze, jako je například hydrid sodný, maskovanou hydroxyskupinou, thiolem nebo aminoskupinou (HZR₇₀, kde R₇₀ je vhodná chránící skupina) v polárním aprotickém rozpouštědle, jako je například DMF, následované odstraněním chránící skupiny, dává 28, která pak může být alkylována s 10 za vzniku 7. Konverze 27 na 28, kde Z je síra, může být také provedena s Na₂S, K₂S, NaSH nebo KS(C=S)OEt. Fluor z 27 může být také přemístěn v polárním aprotickém rozpouštědle derivátem propargylu 29, kde Z je O, S nebo NH, v přítomnosti báze, jako je například hydrid sodný, za přímého vzniku 7.

Schéma 7:

Sloučenina 7, kde Z je methylenová skupina, je dostupná prostřednictvím 30, jak je ukázáno ve schématu 8. Benzylová bromace 30 N-bromsukcinimidem v chlorovaném uhlovodíkovém rozpouštědle poskytuje bromid 31. Toto je pak následováno nahrazením bromidu příslušným propinylkuprátem za vzniku sulfonamidů 8.

• ·

Schéma 8:

Sloučeniny podle vynálezu mohou být také připraveny modifikací substituentů’ na acetylěnickěm postranním řetězci v kterémkoliv stupni po sulfonylaci nebo fosforylaci výchozích aminokyselinových derivátů 4 nebo 8. Funkční skupiny, jako je například halogen, hydroxyskupina, aminoskupina, aldehyd, ester, keton, apod. mohou být manipulovány standardními metodami tak, aby vytvářely skupiny definované Ri-Re ζθ sloučenin 1. Odborníci v oboru organické syntézy rozpoznávají, že úspěšné použití těchto metod závisí na kompatibilitě substituentů s dalšími částmi molekuly. Mohou být požadovány chránící skupiny a/nebo změny v pořadí kroků popsaných v tomto textu.

Některé z metod, které jsou k dispozici pro derivatizaci sloučenin struktury 32 (odpovídající sloučenině 7, kde R_X2 je vodík), jsou ukázány na schématu 9. Metalace terminálního acetylenu 32 následovaná adicí aldehydu nebo alkylhalogenidu, sulfonátu nebo triflatu poskytla deriváty 33 a 34. Reakce 32 • · s formaldehydem a aminem poskytla Mannichův adiční produkt 35. Adice bromkyanu ke 35 poskytla propargylbromid 36, který může být nahrazen celou řadou nukleofilů za vzniku, například, etherů, thioetherů a aminů 37. Kondenzační reakce katalyzované paladiem sloučeniny 32 poskytly arylacetyleny nebo heteroarylacetyleny 38. Odborníci v oboru organické syntézy rozpoznávají, že úspěšné použití těchto metod závisí na kompatibilitě substituentů s dalšími částmi molekuly. Mohou být požadovány chránící skupiny a/nebo změny v pořadí kroků popsaných v tomto textu a R₃₅, R₄₅, R₅₅, R₆₅ a R₇₅ jsou alkylové skupiny, např. methylová skupina.

Ve schématu 10 je ukázána syntéza příkladu vynálezu, kde A je pyridylová skupina. V tomto specifickém příkladu, ukázaném jen pro ilustraci, je syntetizován aminopyridin chráněný BOC ze 3-amino-2,6-dimethoxypyridinu prostřednictvím reakce • · *· · · · ·<· ·« ···· ···· ···· • ···>··* · · · · · · «· ·· ·· ··· ·» ···· s BOC anhydridem. Ortho-aminoester, 40, je pak vytvořen prostřednictvím metalace a následné karboxylace 39. Odstranění BOC chránících skupin z esteru 41 poskytuje ortho-aminoester 42. Zpracování 42 podle schémat 1 až 9 pak poskytlo sloučeniny podle vynálezu. Další pyridylhydroxamáty jsou dostupné stejným způsobem.

Schéma 10:

MeO

OMe

't-Bu nBuLi, TMEDA, Et₂O -.....— >ClCO₂Me, -78 »C·-*-™·

p-TSA

-Následující specifické- - příklady ilustrují přípravu reprezentativních sloučenin podle tohoto vynálezu. Výchozí materiály, meziprodukty a reagencie jsou bud' komerčně dostupné nebo mohou být snadno připraveny odborníky v oboru organické syntézy podle standardních postupů uvedených v literatuře.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Methylester 3-(4-methoxybenzensulfonylamino)thiofen-2-karboxylové kyseliny

K roztoku 5,00 g (0,032 mol) 3-amino-2-karbomethoxythiofenu rozpuštěného ve 40 ml chloroformu bylo přidáno 7,73 ml (0,032 mol) pyridinu, pak následovalo 6,57 g (0,032 mol) p-methoxybenzensulfonylchloridu. Reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 5 hodin, a poté promyta 3N HCI a vodou. Organické vrstvy pak byly usušeny nad Na₂SO₄, filtrovány a koncentrovány ve vakuu. Výsledná pevná látka krémové barvy byla promyta etherem a usušena ve vakuu za vzniku 6,89 g (66 %) požadovaného sulfonamidu.

Elektronsprejová hmotová spektr.: 328,2 (M+H).

Příklad 2

Methylester 4-(4-methoxybenzensulfonylamino)thiofen-3-karboxylové kyseliny

Stejným způsobem, jak bylo popsáno v příkladu 1, 5,00 g (0,026 mol) 3-amino-4-karbomethoxythiofenhydrochloridu poskytlo 3,50 g (41 %) požadovaného sulfonamidu jako hnědé pevné látky po trituraci etherem. Elektronsprejová hmotová spektr. : 32 8,2 (M+H) . -------- Příklad 3

Ethylester 5-(4-methoxybenzensulfonylamino)-1-methyl-lH-pyrazol-4-karboxylové kyseliny

Stejným způsobem, jak bylo popsáno v příkladu 1, 2,00 g (0,012 mol) 1-methyl-2-amino-3-karboethoxypyrazolu poskytlo 0,923 g (23 %) požadovaného sulfonamidu jako bílé pevné látky po rekrystalizaci ze směsi ethylacetátu a hexanu. Elektronsprejová hmotová spektr.: 340,2 (M+H).

r· «· ·* r «· »· • # « « · ·«· · · * · • · * · ··· · · « • ···(<*· » · · » 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

99 «I 999 99 9999

Příklad 4

Methylester 3-(4-methoxybenzensulfonylamino)-4-methylthiofen-karboxylové kyseliny

Stejným způsobem, jak bylo popsáno v příkladu 1, 4,14 g (0,024 mol) 3-amino-4-methyl-2-karbomethoxythiofenu poskytlo 4,89 g (47 %) požadovaného sulfonamidu jako bílé pevné látky po trituraci etherem. Elektronsprejová hmotová spektr.: 340,9 (M⁺) .

Příklad 5

Methylester 3-[benzyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino)-thiofen-2-karboxylové kyseliny místnosti, a benzylbromidu.

K roztoku 2,0 g (6,116 mmol) produktu z příkladu 1 v 25 ml DMF’ bylo přidáno 0,257 g 16,422 mmol) 60% hydridu sodného. Výsledná směs byla míchána po dobu 3 0 minut při teplotě poté bylo přidáno 0,76 ml (6,422 mmol) Reakčni směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti, nalita do vody, a poté extrahována etherem. Spojené organické vrstvy byly promyty vodou a solankou, usušeny nad MgSO₄, filtrovány a koncentrovány ve vakuu. Zbytek byl podroben chromatografií na silikagelu za eluce směsí ethylacetátu a hexanu (1:3) za vzniku 1,62 g (65 %) jako bílých krystalů. Cl hmotová spektr.

požadovaného produktu 418 (M+H).

Příklad 6

Methylester

4-[benzyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino]-thiofen-3-karboxylové kyseliny

Stejným způsobem, jak bylo popsáno v příkladu 5, 1,50 g (4,587 mmol) produktu z přikladu 2 poskytlo 1,257 g (66 %) požadovaného produktu jako hnědého oleje po chromatografii na silikagelu za eluce směsí ethylacetátu a hexanu (1:10). Cl hmotová spektr.: 418 (M+H).

Příklad 7

Ethylester 5-[benzyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino]-1-methyl-lH-pyrazol-4-karboxylové kyseliny

Stejným způsobem, jak bylo popsáno v příkladu 5, 0,843 g (2,484 mmol) produktu z příkladu 3 poskytlo 0,924 g (87 %) požadovaného produktu jako bílé pevné látky po trituraci etherem. Cl hmotová spektr.: 430 (M+H).

Příklad 8

Methyíester 3-[benzyl-(4-methoxybenzensulfonyl}amino]-4-methylthiofen-2-karboxylové kyseliny

Stejným způsobem, jak bylo popsáno v příkladu 5, 2,00 g (4,64 mmol) produktu z příkladu 4 poskytlo 1,648 g (68 %) požadovaného produktu jako bílé pevné látky po trituraci etherem. Cl hmotová spektr.: 432 (M+H).

Přiklad 9

3-[benzyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino]thiofen-2 -karboxylová kyselina

Ke směsi 1,494 g (3,583 mmol) produktu z příkladu 5 rozpuštěného v 15 ml methanolu a 15 ml THF bylo přidáno 15 ml • · roztoku IN NaOH. Reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 36 hodin a organické vrstvy byly odstraněny ve vakuu. Výsledná směs extrahována ethylacetátem.

10% HCI a vrstvy byly filtrovány a byla acidifikována

Spojené organické promyty vodou a solankou, usušeny nad MgSO₄, koncentrovány ve vakuu. Výsledný zbytek byl triturován etherem a filtrován za vzniku 1,327 g (32 %) požadované karboxylové kyseliny jako bílé pevné látky. Cl hmotová spektr.: 404 (M+H).

Příklad 10

4-[benzyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino] thiofen-3-karboxylová kyselina

Stejným způsobem, jak bylo popsáno v příkladu 9, 1,157 g (2,775 mmol) produktu z příkladu 6 poskytlo 0,94 g (84 %) požadované karboxylové kyseliny jako žlutohnědé pevné látky po trituraci etherem. Elektronspre j~ová hmotová spektr.: 404 (M+H).

Příklad 11

5-[benzyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino-1-methyl-IH-pyrazol-4-karboxylová kyselina

K roztoku 0,799 g (1,862 mmol) produktu z příkladu 7 ve 2 0 ml směsi methanolu a THF (1:1) bylo přidáno 9,3 ml IN roztoku hydroxidu sodného a výsledná směs byla zahřívána k varu pod zpětným chladičem po dobu 18 hodin. Reakce pak byla ochlazena na teplotu místnosti a organické vrstvy byly odstraněny ve vakuu. Výsledná směs byla acidifikována 10% HCI a extrahována ethylacetátem. Spojené organické vrstvy byly promyty vodou a solankou, usušeny nad MgSO₄, filtrovány a koncentrovány ve vakuu. Výsledný zbytek byl triturován etherem a filtrován za vzniku 0,697 g (93 %) požadované karboxylové kyseliny jako bílé pevné látky. Elektronsprejová hmotová spektr.: 402 (M+H).

Příklad 12

3-[benzyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino]-4-methylthiofen-2-karboxylové kyselina

Stejným způsobem, jak bylo popsáno v příkladu 11, 1,366 g (2,622 mmol) produktu z příkladu 8 poskytlo 1,16 g (87 %) požadované karboxylové kyseliny jako bílé pevné látky po trituraci etherem. Elektronsprejová hmotová spektr.: 416 (M-H)'

Příklad 13

Methylester 5-brom-4- (4-methoxybenzensulfony-lamino) thiofen-3-karboxylové kyseliny

K roztoku produktu z příkladu 2 v 5,0 ml směsi kyseliny octové a chloroformu (1:1) při teplotě místnosti bylo přidáno 0,299 g (1,682 mmol) N-bromsukcinimidu. Reakce byla míchána po dobu 18 hodin, a poté naředěna etherem, promyta vodou a saturovaným roztokem hydrouhličitanu sodného, usušena nad MgSO₄, filtrována a koncentrována ve vakuu. Žlutohnědý pevný zbytek byl promyt směsí ethylacetátu a hexanu (1:1) za vzniku 0,504 g (81 %) požadovaného produktu jako žlutohnědé pevné látky. Elektronsprejová hmotová spektr.: 406,1 (M+H)⁺

Příklad 14

Methylester 4-[benzyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino]-5-bromthiofen-3-karboxylové kyseliny

Stejným způsobem, jak bylo popsáno v příkladu 5, 0,424 g (1,044 mmol) produktu z příkladu 13 poskytla 0,400 g (77 %) požadovaného N-benzylmethylesteru jako bílé pevné látky. Elektronsprejová hmotová spektr.: 496,1 (M+H)⁺

Příklad 15

4-[benzyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino]-5-bromthiofen-3-karboxylová kyselina

Stejným způsobem, jak bylo popsáno v příkladu 11, 0,356 g (0,718 mmol) produktu z příkladu 14 poskytlo 0,290 g (84 %) požadované karboxylové kyseliny jako bílé pevné látky. Elektronsprejová hmotová spektr.: 482,1 (M+H) ⁺

Příklad 16

Methylester 4-[benzyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino]-5-ethynylthiofen-3-karboxylové kyseliny

K roztoku 0,294 g (0,634 mmol) produktu z příkladu 14 ve 2,5 ml DMF a 2,5 ml triethylamínu bylo přidáno 0,44 8 ml (3,168 mmol) trimethylsilylacetylenu, 0,022 g (0,032 mmol) bis(trifenylfosfin)paladium(II)dichloridu a 3 mg jodidu měďného. Reakční směs pak byla zahřívána na 80 °C po dobu 6 hodin, a poté ochlazena na teplotu místnosti a naředěna etherem. Organické vrstvy byly promyty roztokem 5% HCl, vodou a solankou, usušeny nad MgSO₄, filtrovány a koncentrovány ve • · ·

vakuu. Zbytek byl rozpuštěn v 5 ml THF, byl přidán 1 ml roztoku ÍM tetrabutylamoniumfluoridu-THF a reakce byla míchána po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti, a pak naředěna etherem, promyta roztokem 5% HCI, vodou a solankou, usušena nad MgSO₄, filtrována a koncentrována ve vakuu. Zbytek byl podroben chromatografií na silikagelu za eluce směsí ethylacetátu a hexanu (1:5) za vzniku 0,159 g {61 %) požadovaného produktu jako hnědého oleje.

Elektronsprejová hmotová spektr.: 442,2 (M+H)⁺

Příklad 17

4-[benzyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino]-5-ethynylthiofen-3-karboxylová kyselina

Stejným způsobem, jak bylo popsáno v příkladu 11, 0,136 g (0,333 mmol) produktu z příkladu 16 poskytlo 0,075 g (57 %) požadovaného produktu jako žlutohnědé pevné látky po chromatografií na silikagelu za eluce směsí ethylacetátu a hexanu (1:1). Elektronsprejová hmotová spektr.: 428,1 (M+H)⁺

Příklad 18

Methylester 5-brom-4-[(4-methoxybenzensulfonyl)pyridin-3-ylmethylamino]thiofen-3-karboxylové kyseliny

K roztoku 4,80 g (11,82 mmol) produktu z příkladu 13 rozpuštěného v 5,0 ml DMF byly přidány 2,04 g (12,41 mmol) hydroehloridu 3-pikolylchloridu a 4,89 g (35,46 mmol) uhličitanu draselného. Reakční směs pak byla míchána při teplotě místnosti po dobu 18 hodin, naředěna vodou a extrahována etherem. Organické vrstvy pak byly extrahovány roztokem 6N HCI a vodná kyselá vrstva pak byla alkalizována roztokem 6N NaOH, a poté extrahována etherem. Výsledná etherová vrstva byla usušena nad sulfátem sodným, filtrována a koncentrována ve vakuu za vzniku 4,16 g (71 %) požadovaného produktu jako žlutohnědé pevné látky. Elektronsprejová hmotová spektr.: 498 (M+H).

Příklad 19

5-brom-4-[(4-methoxybenzensulfonyl)pyridin-3ylmethylamino]thiofen-3-karboxylová kyselina

K roztoku 0,40 g (0,860 mmol) produktu z příkladu 18 v 9,0 ml THF-MeOH (1:1) bylo přidáno 0,072 g (1,72 mmol) monohydrátu hydroxidu lithného. Reakční směs byla po dobu 18 hodin zahřívána k varu pod zpětným chladičem, a poté koncentrována ve vakuu. Zbytek byl promyt THF a filtrován. Filtrát byl koncentrován ve vakuu za vzniku 0,388 g (100 %) požadovaného produktu jako bílé pěny. Elektronsprejová hmotová spektr.: 483 (M+H).

Příklad 20 terc-butyl-N-(2,6-dimethoxy-3-pyridyl)karbamát

K suspenzi 1,5 g (7,87 mmol) 3-amino-2,6-dimethoxypyridinu bylo přidáno 3,43 g (15,7 mmol) di-terc-butyldikarbonátu. Roztok byl zahříván pod zpětným chladičem po dobu 36 hodin, ochlazen na teplotu místnosti a naředěn vodou. Vodný roztok byl extrahován 3 krát ethylacetátem, organické extrakty byly spojeny, promyty solankou, usušeny nad MgSO₄, koncentrovány ve vakuu. Zbytek byl purifikován chromatografií na koloně s použitím směsí hexanu a ethylacetátu jako eluentu (gradient 100% až 4/1) za vzniku 2,00 g (100 %) terc-butyl-N-(2,6• · • · · · · * ·« ♦ ·

-dimethoxy-3-pyridyl)karbamátu jako žlutého oleje.

Elektronsprejová hmotová spektr.: 254,9 (M+H) ⁺

Příklad 21 terc-butyl-N-(4-karbomethoxy-2,6-dimethoxy-3-pyridyl)karbamát g (3,93 mmol) produktu z příkladu 20 byl rozpuštěn ve 3 5 ml etheru a 1,7 ml (1,18 mmol) TMEDA a ochlazen na -78 °C. Po kapkách bylo přidáno 4,75 ml (11,87 mmol) n-butyllithia a reakce byla míchána po dobu 15 minut v -78 °C před zahříváním na -10 °C po dobu 2,5 hodiny. Roztok byl ochlazen zpět na -78 °C a po kapkách bylo přidáno 0,6 ml (7,8 mmol) methylchloroformiátu rozpuštěného ve 4,5 ml etheru. Reakce byla ponechána v -78 °C po dobu 10 minut, a poté zahřívána na -10 °C a míchána po dobu 1,5 hodiny před utlumením chloridem amonným (sat.). Reakční směs byla extrahována 3 krát ethylacetátem. Organické vrstvy byly spojeny, promyty solankou, usušeny nad MgSO₄, koncentrovány ve vakuu. Zbytek byl purifikován chromatografií na koloně s použitím směsí hexanu a ethylacetátu jako eluentu (gradient 9/1 až 4/1) za vzniku 0,423 g (34 %) terc-butyl-N-(4-karbomethoxy-2,6-dimethoxy-3-pyridyl)karbamátu jako bílé pevné látky. Elektronsprejová hmotová spektr.: 312,8 (M+H)⁺

Příklad 22

Methyl-3-amino-2,6-dimethoxyisonikotinát

0,282 g (1,48 mmol) hydrátu p-toluensulfonové kyseliny bylo rozpuštěno v 11 ml toluenu a zahříváno přes noc k varu pod zpětným chladičem s azeotropickým odstraněním vody (DeanStarkovo jímadlo). Příští den byla reakce ochlazena na teplotu

• · ··· ·· ···· místnosti a byl přidán produkt z příkladu 21 rozpuštěný ve 4 ml toluenu. Reakce byla zahřívána zpět k varu pod zpětným chladičem po dobu 0,6 hodiny. Reakce byla ochlazena na teplotu místnosti a nalita do hydrouhliČitanu sodného (sat.) a extrahována 3 krát etherem. Organické vrstvy byly spojeny, promyty solankou, usušeny nad MgSO₄, koncentrovány ve vakuu. Zbytek byl purifikován chromatografii na koloně s použitím směsi hexanu a ethylacetátu jako eluentu (gradient 100% až 9/1) za vzniku 0,278 g (97 %) methyl-3-amino-2,6-dimethoxyisonikotinátu jako žluté pevné látky.

Elektronsprejová hmotová spektr.: 212,8 (M+H)⁺

Příklad 23

Methyl-3-(4-methoxybenzensulfonylamino)-2,6-dimethoxy-isonikotinát

K roztoku 0,278 g (1,31 mmol) produktu z příkladu 22 ve 2 ml pyridinu bylo přidáno 0,2 8 g (1,38 mmol) p-methoxybenzensulfonylchloridu. Reakční směs byla přes noc míchána při teplotě místnosti a pak byla ztlumena vodou. Směs byla 3 krát extrahována etherem. Organické vrstvy byly spojeny, promyty solankou, usušeny nad MgSO₄, koncentrovány ve vakuu za vzniku 0,444 g (89 %) methyl 3 -(4—methoxy-benzensulfonylamino)-2,6-dimethoxyisonikotinátu jako pevné látky. Elektronsprejová hmotová spektr.: 382,8 (M+H)⁺

Příklad 24

Methyl-3-[benzyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino]-2,6-dimethoxyisonikotinát • « · · · ·

0,444 g (1,16 mmol) produktu z příkladu 23 bylo rozpuštěno ve 4 ml DMF a ochlazeno na 0 °C. Bylo přidáno 0,18 6 ml (1,6 mmol) benzylbromidu, pak následovalo 56 mg (1,39 mmol) hydridu sodného (60% disperze v minerálním oleji) a reakce byla ponechána zahřát se na teplotu místnosti. Po 1 hodině byla reakce naředěna vodou a extrahována 4 krát etherem. Organické vrstvy byly spojeny, promyty solankou, usušeny nad MgSO₄, koncentrovány ve vakuu za vzniku 0,545 g (100 %) čistého methyl-3-[benzyl-(4-methoxybenzensulfonyl)-amino]-2,6-dimethoxyisonikotinátu jako oleje. Elektronsprejová hmotová spektr.: 472,9 (M+H)⁺

Příklad 25

3-[benzyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino]-2,6-dimethoxyisonikotinová kyselina

Produkt z - příkladu 24 byl hydrolyzován na odpovídající karboxylovou kyselinu s použitím postupu z příkladu 19 za vzniku 3-[benzyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino]-2,6—

-dimethoxyisonikotinové kyseliny. Elektronsprejová hmotová spektr.: 459,0 (M+H)⁺

Příklad 26

Sodná sůl 4-but-2-ynyloxybenzensulfonové kyseliny

K roztoku 52,35 g (0,225 mol) 4-hydroxybenzensulfonátu sodného vil isopropanolu a 225 ml roztoku l,0N hydroxidu sodného bylo přidáno 59,96 g (0,45 mol) l-brom-2-butinu. Výsledná směs byla zahřívána na 70°C po dobu 15 hodin, a poté byl isopropanol odstraněn evaporací ve vakuu. Výsledný bílý precipitát byl sbírán filtrací, promyt isopropanolem a etherem • · • 4 a usušen ve vakuu za vzniku 56,0 g (100 %) butinyletheru jako bílé pevné látky.

Příklad 27

4-but-2-ynyloxybenzensulfonylchlorid

K roztoku 43,8 ml (0,087 mol) 2M roztoku směsi oxalylchloridu a dichlormethanu ve 29 ml dichlormethanu o teplotě 0°C bylo po kapkách přidáno 6,77 ml (0,087 mol) DMF, pak následovalo 7,24 g (0,029 mol) produktu z příkladu 26. Reakční směs byla míchána po dobu 10 minut při teplotě 0°C, pak byla ponechána ohřát se na teplotu místnosti a míchána po dobu 2 dnů. Reakce pak byla nalita do ledu a extrahována 150 ml hexanu. Organické vrstvy byly promyty vodou a solankou, usušeny nad Na₂SO₄, filtrovány a koncentrovány ve vakuu za vzniku 6,23 g (88 %) sulfonylchloridu jako žluté pevné látky, tt 63-65°C. Elektronsprejová hmotová spektr.: 243,9 (M+).

Příklad 28 but-2-ynyloxybenzen

K roztoku 6,14 g (0,023 mol) trifenylfosfinu rozpuštěného ve 100 ml benzenu a 40 ml THF bylo přidáno 1,75 ml (0,023 mol) 2-butin-l-olu. Po pěti minutách bylo do reakce přidáno 2,00 (0,023 mol) fenolu, rozpuštěného v 10 ml THF, pak následovalo 3,69 ml (0,023 mol) diethylazodikarboxylátu. Výsledná reakční směs byla míchána po dobu 18 hodin při teplotě místnosti, a poté koncentrována ve vakuu. Zbytek byl podroben chromatografií na silikagelu za eluce směsí ethylacetátu a hexanu (1:10) za vzniku 2,18 g (700) butinyletheru jako čiré kapaliny. Elektronsprejová hmotová spektr.: 146,0 MH⁺ • ·

Příklad 29

4-but-2-ynyloxybenzensulfonylchlorid

K roztoku 0,146 g (1,0 mmol) produktu z příkladu 28 v 0,3 ml dichlormethanu v lázni s acetonem a ledem v dusíkové atmosféře byl po kapkách přidán roztok 0,073 ml (1,1 mmol) chlorsulfonové kyseliny v 0,3 ml dichlormethanu. Poté, co bylo přidávání ukončeno, byla ledová lázeň odstraněna a reakce byla míchána při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Do reakce pak bylo po kapkách přidáno 0,113 ml (1,3 mmol) oxalylchloridu, pak následovalo 0,015 ml DMF. Reakce byla zahřívána k varu pod zpětným chladičem po dobu 2 hodin, a poté naředěna hexanem a nalita do ledově chladné vody. Organická vrstva byla promyta solankou, usušena nad sulfátem sodným a koncentrována ve vakuu za vzniku 0,130 mg (53 %) požadovaného produktu jako světle hnědé pevné látky.

Příklad 30

Methyl-3-(4-but-2-ynyloxybenzensulfonylamino)-2,6-dimethoxy-isonikotinát

K 0,7 g (3,3 mmol) roztoku produktu z příkladu 22 v 6 ml pyridinu bylo přidáno 0,8 g (3,3 mmol) 4-but-2ynyloxybenzensulfonylchloridu. Reakční směs byla přes noc míchána při teplotě místnosti a pak byla ztlumena vodou. Směs byla 3 krát extrahována etherem. Organické vrstvy byly spojeny, promyty solankou, usušeny nad MgSO₄ a koncentrovány ve vakuu. Zbytek byl podroben chromatografií na silikagelu za eluce směsí ethylacetátu a hexanu (gradient 1:1 až 7:3) za • ·

vzniku 1,15 g butinyloxybenzensulfonamidu jako pevné látky. Elektronsprejová hmotová spektr.: 421,1 (M+H) ⁺

Příklad 31

Methyl-3-[methyl(4-but-2-ynyloxybenzensulfonyl)amino]-2,6-dimethoxyi sonikot inát

0,48 g (1,13 mmol) produktu z příkladu 30 bylo rozpuštěno v 5 ml DMF a ochlazeno na 0 °C. Bylo přidáno 0,1 ml (1,58 mmol) jodmethanu, pak následovalo 0,054 g (1,35 mmol) hydrídu sodného (60% disperze v minerálním oleji) a reakce byla ponechána zahřát se na teplotu místnosti. Po 1 hodině byla reakce naředěna vodou a 4 krát extrahována ethylacetátem. Organické vrstvy byly spojeny, promyty solankou, usušeny nad MgSO₄, koncentrovány ve vakuu za vzniku 0,23 g (48 %) N-methylsulfonamidu jako bílé pevné látky. Elektronsprejová hmotová spektr.: 435,2 (M+H)⁺

Příklad 32

3-[methyl(4-but-2-ynyloxybenzensulfonyl)amino]-2,6-dimethoxyisonikotinová kyselina

0,214 g (0,49 mmol) produktu z příkladu 31 bylo hydrolyzováno na odpovídající karboxylovou kyselinu s použitím postupu z příkladu 19 za vzniku 0,198 g (100 %) 3-[methyl(4-but-2-ynyloxybenzensulfonyl)amino]-2,6-dimethoxy-isonikotinové kyseliny. Elektronsprejová hmotová spektr.:

421,1 (M+H)⁺

Přiklad 33

3-[methyl(4-but-2-ynyloxybenzensulfonyl)amino]-N-hydroxy-2,6 -dimethoxyisonikotinamid

K roztoku 0,15 g (0,35 mmol) produktu z příkladu 32 ve 2 ml DMF bylo přidáno 0,3 9 ml (0,77 mmol) 2M roztoku oxalylchloridu v dichlormethanu a výsledná reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 2 hodin.

V samostatné baňce bylo 0,77 ml (5,6 mmol) triethylaminu přidáno ke směsi 0,24 g (3,5 mmol) hydroxylaminhydrochloridu ve 4 ml THF a 1 ml vody při teplotě 0°C. Pak byla tato směs míchána po dobu 15 minut při teplotě 0°C, byl k ní v jedné části přidán roztok kyselého chloridu a výsledný roztok byl ponechán zahřát se na teplotu místnosti a míchán po dobu dalších 3 hodin. Dichlormethan byl promyt solankou, usušen nad MgSO₄, filtrován a koncentrován ve vakuu. Triturace zbytku etherem poskytla 0,108 g (75 %) - kyselin hydroxamové jako bílého prášku. Elektronsprejová hmotová spektr.: 436,1 (M+H)⁺

Příklad 34

3-(4-but-2-ynyloxybenzensulfonyl)amino-2,6-dimethoxyisonikotinová kyselina

0,400 g (0,95 mmol) produktu z příkladu 30 bylo hydrolyzováno na odpovídající karboxylovou kyselinu s použitím postupu z příkladu 19 za vzniku 0,338 g (100 %) 3-(4-but-2-ynyloxybenzensulfonyl)amino-2,6-dimethoxyisonikotinové kyseliny. Elektronsprejová hmotová spektr.: 407,2 (M+H)⁺

Příklad 35

3-(4-but-2-ynyloxybenzensulfonylamino)-N-hydroxy-2,6-dimethoxyisonikotinamid mg (0,21 mmol) produktu z příkladu 34 bylo rozpuštěno ve 2 ml DMF. K tomuto roztoku bylo přidáno 123 mg (1,88 mmol) hydroxylaminhydrochloridu, 68 mg (0,5 mmol) 1-hydroxybenzotriazolu, 0,3 ml (2,1 mmol) triethylaminu a 113 mg (0,59 mmol) 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidhydrochloridu. Reakční směs byla míchána přes noc, a poté filtrována, aby se odstranil bílý precipitát. Filtrát pak byl naředěn dichlormethanem a promyt vodou, solankou, usušen nad Na₂SO₄, filtrován, koncentrován ve vakuu za vzniku oranžového oleje. Zbytek byl podroben chromatografii na silikagelu za eluce ethylacetátem za vzniku 32 mg (36 %) kyseliny hydroxamové jako bílé pevné látky. Elektronsprejová hmotová spektr.: 422,2 (M+H)⁺.

Farmakologie

Schopnost sloučenin podle vynálezu nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí inhibovat metaloproteinázy mezibuněčné hmoty nebo TÁCE a v důsledku toho prokázat účinnost při léčení nemocí modulovaných metaloproteinázami mezibuněčné hmoty nebo TÁCE je ukázána následujícími in vitro testy.

Postupy testů měření inhibice MMP-1, MMP-9 a MMP-13

Postupy standardních farmakologických testů jsou založeny na štěpení thiopeptidových substrátů, jako je například Ac-Pro-Leu-Gly(2-merkapto-4-methylpentanoyl)Leu-Gly-OEt ·· ·♦ • « 9 • · ·· ··· · metaloproteinázami mezibuněčné hmoty MMP-1, MMP-13 (kolagenázy) nebo MMP-9 (gelatináza), které má za následek uvolnění substrátového produktu, který reagoval kolorimetricky s DTNB (5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoová kyselina)). Enzymová aktivita je měřena rychlostí zesílení intenzity barvy. Thiopeptidový substrát je připraven čerstvý jako 20mM zásobní roztok ve 100% DMSO a DTNB je rozpuštěn ve 100% DMSO jako lOOmM zásobní roztok a uložen ve tmě při teplotě místnosti. Jak substrát tak DTNB jsou před použitím společně naředěny na lmM koncentraci substrátovým pufrem (50mM HEPES, pH 7,5, 5mM CaCl₂) . Zásobní roztok enzymu je naředěn pufrem (50mM HEPES, pH 7,5, 5mM CaCl₂, 0,02% Brij) na požadovanou konečnou koncentraci. Pufr, enzym, vehikulum nebo inhibitor a DTNB/substrát jsou přidány v tomto pořadí na 96 jamkovou destičku (celkový objem reakce 200 1) a zesílení intenzity barvy je monitorováno spektrofotometricky po dobu 5 minut ve 405 nm na přístroji na odečítání destiček a zesílení intenzity barvy v čase je vyneseno do grafu jako lineární přímka.

Nebo je použit fluorescenční peptidový substrát. V tomto testu peptidový substrát obsahuje fluorescenční skupinu a skupinu zhášející fluorescenci. Po štěpení substrátu MMP je vzniklá fluorescence kvantifikována na fluorescenčním přístroji na odečítání destiček. Test probíhá v testovacím pufru HCBC (50mM HEPES, pH 7,0, 5mM Ca⁺², 0,02% Brij , 0,5% cystein) s lidskou rekombinantní MMP-1, MMP-9 nebo MMP-13. Substrát je rozpuštěn v methanolu a uložen zmražený v lmM alikvotech. Pro test byly substrát a enzymy naředěny v pufru HCBC na požadované koncentrace. Sloučeniny byly přidány na 96 jamkovou destičku obsahující enzym a reakce začala přidáním substrátu. Reakce je odečítána (excitace ve 340 nm, emise ve 444 nm) po dobu 10 minut a zvýšení fluorescence v čase je vyneseno do grafu jako lineární přímka.

• · · · · · • 4

Pro každý test, s thiopeptidem nebo fluorescenčním peptidem, je vypočten sklon přímky a představuje rychlost reakce. Je potvrzena lineární rychlost reakce (r² > 0,85) . Je vypočítán průměr (x + sem) rychlosti kontrol a porovnán na statistickou významnost (p < 0,05) s rychlostmi po ošetřeni léčivem s použitím Dunnettova testu pro mnohonásobné srovnání. Vztah závislosti na dávce může být vytvořen s použitím mnohonásobných dávek léčiva a hodnoty IC₅₀ s 95% Cl jsou stanoveny s použitím lineární regrese.

Postup testu pro měření inhibice TÁCE

S použitím 96 jamkových černých mikrotitračních destiček, do každé jamky byl dán roztok složený z 10 1 TÁCE (konečná koncentrace 1 g/ml), 70 1 pufru Tris, pH 7,4, obsahujícího

10% glycerol (konečná koncentrace 10 mM) a 10 1 roztoku testované sloučeniny v DMSO (konečná koncentrace 1 M, DMSO koncentrace <1%) a inkubován po dobu 10 minut při teplotě místnosti. Reakce je zahájena přidáním fluorescenčního peptidylového substrátu (konečná koncentrace 100 M) do každé jamky, a poté je destička třepána na třepačce po dobu 5 sekund.

Reakce je odečítána (excitace ve 340 nm, emise ve 444 nm) po dobu 10 minut a zvýšení fluorescence v čase je vyneseno do grafu jako lineární přímka. Je vypočten sklon přímky a představuje rychlost reakce.

Je potvrzena lineární rychlost reakce (r² > 0,85) . Je vypočítán průměr (x + sem) rychlosti kontrol a porovnán na statistickou významnost (p < 0,05) s rychlostmi po ošetření léčivem s použitím Dunnettova testu pro mnohonásobné srovnání. Vztah závislosti na dávce může být vytvořen s použitím mnohonásobných dávek léčiva a hodnoty IC₅₀ s 95% Cl jsou stanoveny s použitím lineární regrese.

• · • · · · · ··· · ·· · ······· ·· · • ······ · · · · · · ·· · ··· ··· ·· ·· ·· ··· · · · · ·

Diferenciační test rozpustných proteinů lidských monocytárnich buněk THP-1 (test rozpustného proteinu THP-1

Mitogenní stimulace buněk THP-1 způsobuje diferenciaci na buňky podobné makrofágům s doprovodnou sekrecí nádorového nekrotického faktoru (TNF- ) a receptoru TNF (TNF-R p75/80 a TNF-R p55/60) a interleukinu-8 (IL-8), spolu s dalšími proteiny. Kromě toho, nestimulované THP-1 buňky ztrácejí v průběhu času expresi obou receptorů p75/80 a p55/60. Uvolnění na membráně navázaného TNF- a možná TNF-R p75/80 a TNF-R p55/60, ale ne IL-8, je zprostředkováno enzymem nazývaným enzym konvertující TNF- nebo TÁCE. Tento test může být použit pro průkaz buď inhibičního nebo stimulačního účinku sloučenin na enzym TÁCE a jakéhokoliv cytotoxického působení sloučenin.

(z ATCC) jsou z buněčné linie lidských byly získány z periferní krve pacienta starého jeden rok s akutní monocytovou být pěstovány v tkáňové kultuře a buňky podobné makrofágům stimulací

Buňky THP-1 monocytů, které mužského leukémií.

diferenciovány s mitogeny.

Pro provádění pohlaví

Mohou na nasazovaný ze testu byly buňky THP-1 zásobního roztoku z ATCC, který byl pěstován předem, a pak opět zmražen v množství 5 x 10⁶/ml/lahvičku. Jedna lahvička byla nasazena do baňky T25 se 16 ml média RPMI-1640 s glutamaxem (Gibco), obsahujícího 10% fetální bovinní sérum, 100 jednotek/ml penicilinu, 100 g/ml streptomycinu a 5 x 10⁵M 2-merkaptoethanolu (médium THP-1). Každá lahvička buněk byla pěstována přibližně dva týdny před použitím v testu, a poté byly buňky použity pouze 4 až 6 týdnů pro screening sloučenin. Buňky byly dále pěstovány v pondělí a čtvrtky do koncentrace 1 x 10⁵/ml.

• · ·· ·· · · o

Pro provádění testu byly buňky THP-1 inkubovány společně na 24 jamkové destičce s 50 ml/jamku zásobního roztoku 24 mg/ml lipopolysacharidu (LPS) (Calbiochem Lot č. B13189) ve 37°C v 5% CO₂ v koncentraci 1,091 x 10⁶ buněk/ml (1,1 ml/jamku) celkem 24 hodiny. Současně bylo naneseno do příslušných jamek 50 ml/jamku léčiva, vehikula nebo média THP-1 za vzniku konečného objemu 1,2 ml/jamku. Standardy a testované sloučeniny byly rozpuštěny v DMSO v koncentraci 3 6 mM a odtud ředěny na příslušné koncentrace v médiu THP-1 a přidány do jamek na začátku inkubačního období za vzniku konečné koncentrace 100 mM, 30 mM, 10 mM, 3 mM, 1 mM, 300 nM a 100 nM. Expozice buněk DMSO byla omezena 0,1% konečnou koncentrací. Do pokusu byly zahrnuty jamky s pozitivními kontrolami, do kterých bylo přidáno mitogen, ale ne žádné léčivo. Byly také zahrnuty kontrolní jamky s vehikulem, které byly totožné s jamkami pozitivních kontrol, s výjimkou, že bylo přidáno DMSO za vzniku konečné koncentrace 0,083%. Do pokusu byly zahrnuty jamky s negativními kontrolami, které obsahovaly vehikulum, ale k buňkám nebylo přidáno žádný mitogen nebo léčivo. U sloučenin může být hodnocen jejich účinek na bazální (nestimulovanou) ztrátu exprese receptorů nahrazením LPS médiem THP-1 v množství 50 ml/jamku. Destičky byly umístěny do inkubátoru nastaveného na 5% CO₂ a na 3 7 °C. Po 4 hodinách inkubace bylo odstraněno 300 ml/jamku supernatantu tkáňové kultury (TCS) pro použití v testu ELISA s TNF- . Po 24 hodinách inkubace bylo odstraněno TCS v množství 700 ml/jamku a použito pro analýzu v testech ELISA s TNF-R p75/80, TNF-R p55/60 a IL-8.

Kromě toho byly ve 24 hodinových intervalech a v každé ošetřené skupině sbírány buňky resuspendováním v médiu THP-1 v množství 500 1/jamku a přeneseny do zkumavek FACS. Do každé zkumavky byly přidány 2 ml 0,5 mg/ml zásobního roztoku propidiumjodidu (Pl) (Boehringer Mannheim kat. č. 1348639).

srovnaný skupinu (pozitivní s hodnotami stimulovanou kontrola s

Vzorky byly zpracovány na přístroji pro průtokovou cytometrii Becton Dickinson FaxCaliber FLOW a množství barvení vychytané každou buňkou bylo měřeno ve vlnové délce vzdáleného červeného světla (FL3). Pouze buňky s narušenou membránou (mrtvé nebo umírající) mohou vychytávat PI. Procento živých buněk je vypočteno z počtu buněk neobarvených PI, děleného celkovým počtem buněk ve vzorku. Hodnoty životaschopnosti vypočtené pro skupiny ošetřené léčivem byly životaschopnosti vypočtenými pro mitogenem a ošetřenou vehikulem vehikulem), aby se určilo procento změny oproti kontrolní skupině. Tato hodnota procento změny oproti kontrolní skupině je indikátor toxicity léčiva.

Množství rozpustného TNF- , TNF-R p75/80 a TNF-R p55/60 a IL-8 v TCS buněčných kultur THP-1 byla získána s komerčně dostupnými testy ELISA od firmy R&D Systems extrapolací ze standardní křivky vytvořené se standardy ze souprav. Počty buněk, které buď vychytaly nebo vyloučily PI, byly měřeny na přístroji pro průtokovou cytometrii a vizualizovány histogramy s použitím komerčně dostupného software Cytologie pro každou ošetřenou skupinu včetně všech kontrol.

Biologická variabilita velikosti odpovědi buněčných kultur THP-1 vyžadovala, aby pokusy byly srovnány na základě procentové změny oproti pozitivní kontrole s vehikulem pro každou koncentraci léčiva. Procento změny každého rozpustného proteinu vyhodnocené proti pozitivní kontrole s vehikulem bylo vypočteno pro každou koncentraci sloučeniny podle následujícího vzorce:

pg/ml (slouč.) - pg/ml (poz. k. s vehik.) % změny = ,____ pg/ml (poz. kí s vehik.) - pg/ml (neg. kí s vehik.) x 100 « · ·· · · · · » • ···· ·«··

Ve studiích s rozpustnými proteiny (TNF- , p75/80, p55/60, IL-8) za stimulovaných podmínek byly určovány průměry z dvojic jamek v pg/ml a výsledky byly vyjádřeny jako procento změny oproti pozitivní kontrole s vehikulem. Ve studiích s rozpustnými proteiny (receptory p75/80 a p55/60) za nestimulovaných podmínek byly určovány průměry z dvojic jamek v pg/ml a výsledky byly vyjádřeny jako procento změny oproti pozitivní kontrole s vehikulem podle následujícího vzorce:

pg/ml (slouč. neg. k.) - pg/ml (neg. k. s vehik.) % změny =__ x 10 0 pg/ml (neg. k7 s vehik.)

Pro každou sloučeninu byly vypočteny hodnoty IC₅₀ analýzou nelineární regresí s použitím software vyrobeného na objednávku používajícího statistický soubor programů JUMP.

Ve studiích životaschopnosti buněk byla určována životaschopnost (nevychytávání Pl) sloučeného obsahu ze dvojice jamek a výsledky byly vyjádřeny jako % změny oproti pozitivní kontrole s vehikulem. Hodnoty životaschopnosti vypočtené pro skupiny ošetřené sloučeninami byly srovnány s hodnotou životaschopnosti vypočtenou pro pozitivní kontrolu s vehikulem, aby se určilo procento změny oproti kontrolní skupině, jak uvedeno níže. Hodnota procento změny oproti kontrolní skupině je indikátor toxicity léčiva.

% živých buněk (sloučenina) % změny = ~ __t_ -1 x 10 0 % živých buněk (poz. kÁ s vehik.)

Seznam použité literatury:

Bjornberg, F., Lantz, M., Olsson, I. and Gullberg, U.,

Mechanisms involved in the processing of the p55 and the p75 tumor necrosis factor (TNF) receptors to soluble receptor forms, Lymphokine Cytokine Res., 13, 203-211, 1994.

Gatanaga, T., Hwang, C., Gatanaga, M. , Cappuccini, F., Yamamoto, R. and Granger, G. , The regulation of TNF mRNA synthesis, membrane expression, and release PMA- and LPSstimulated human monocytic THP-1 cells in vitro, Cellular Immun., 138, 1-10, 1991.

Tsuchiya, S., Yamabe, M. , Yamagughi, Y., Kobayashi, Y. , Konno, T. and Tada, K., Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1)., Int. J. Cancer. 26, 1711-176, 1980.

Výsledky in vitro inhibice metaloproteináz mezibuněčné hmoty uvedené výše, inhibice TÁCE a postupy standardních farmakologických testů THP jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

o.

CK₃

NHOH

Příklad č. R MMP-l^a MMP-9^a MMP-13^a TACE^a THP^b

Mě -10 000 607 478 ΪΪ 3T“

H - - 44

a) IC₅₀ (nM)

b) % inhibice @ 3 M

Na základě standardních farmakologických testů popsaných výše jsou sloučeniny podle tohoto vynálezu použitelné pro léčení chorobných stavů, jako je například artritida, nádorové metastázy, tkáňové ulcerace, abnormální hojení ran, nemoci periodontu, rejekce štěpu, rezistence na inzulín, choroby kostí a infekce HIV.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou také použitelné pro léčbu nebo inhibici patologických změn zprostředkovaných metaloproteinázami mezibuněčné hmoty, jako je například ateroskleróza, tvorba aterosklerotického plátu, zúžení koronární trombózy rupturou aterosklerotického plátu, restenóza, osteopenie zprostředkované MMP, zánětlivá onemocnění centrálního nervového systému, stárnutí kůže, angiogeneze, nádorové metastázy, růst nádorů, osteoartritida, revmatoidní artritida, septická artritida, uleerace rohovky, proteinurie, aneurysma aorty, degenerativní poškození chrupavky po traumatickém poranění kloubu, demyelínizačni onemocnění nervového systému, cirhóza jater, onemocnění ledvinných glomerulů, předčasná ruptura fetálních membrán, zánětlivá onemocnění střev, makulární degenerace se vztahem k věku, diabetická retinopatie, proliferativní vitreoretinopatie, retinopatie nedonošených, oční záněty, keratokonus, Sjogrenův syndrom, myopie, nádory oka, oční angiogeneze/neovaskularizace a rejekce štěpu rohovky.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být podávány čisté nebo s farmaceutickým nosičem pacientovi, který to potřebuje. Farmaceutický nosič může být pevný nebo tekutý.

Vhodné pevné nosiče mohou zahrnovat jednu nebo více látek, které mohou také působit jako aromatizační činidla, lubrikanty, solubilizační činidla, suspendující činidla, plnidla, kluzné látky, pomocné komprimační látky, pojivá nebo rozvolňovadla tablet nebo obalovací látky.

V prášcích je nosič jemně mletá pevná látka, která je ve směsi s jemně mletou účinnou složkou. V tabletách je účinná složka smíchána ve vhodném poměru s nosičem majícím nezbytné kompresní vlastnosti a slisována na požadovaný tvar a velikost. Prášky a tablety výhodně obsahují až 99 % účinné složky. Vhodné pevné nosiče zahrnují například fosfát vápenatý, stearát horečnatý, dextrin, škrob, želatinu, karboxymethylcelulózu sodnou, talek, sacharidy, laktózu, celulózu, methylcelulózu, polyvinylpyrolidin, vosky s nízkým bodem tání a iontoměničové pryskyřice, • · ··· · · «···

Tekuté nosiče mohou být použity při přípravě roztoků, suspenzí, emulzí, sirupů a elixírů. Účinná složka podle tohoto vynálezu může být rozpuštěna nebo suspendována ve farmaceuticky přijatelném tekutém nosiči, jako je například voda, organické rozpouštědlo, směs obou nebo farmaceuticky přijatelné oleje nebo tuky. Tekutý nosič může obsahovat další vhodná farmaceutická aditiva, jako například solubilizační činidla, emulgátory, pufry, konzervační činidla, sladidla, aromatizační -činidla, suspendující činidla, zahušfovadla, barviva, regulátory viskozity, stabilizátory nebo regulátory osmózy. Vhodné příklady tekutých nosičů pro perorální a parenterální podávání zahrnují vodu (obsahující zejména aditiva, jak jsou uvedená výše, např., deriváty celulózy, výhodně roztok karboxymethylcelulózy sodné), alkoholy (včetně jednosytných alkoholů a vícesytných alkoholů, např. glykolů) a jejich deriváty a oleje (např. frakcionovaný kokosový olej a arašídový olej). Pro parenterální podávání může nosič také být olejnatý ester, -- jako - je například ethyloleát a isopropylmyristát. Sterilní tekuté nosiče byly použity ve sterilních tekutých přípravcích pro parenterální podávání.

Tekuté farmaceutické přípravky, které jsou sterilní roztoky nebo suspenze, mohou být použity například pro intramuskuíárni, intraperitoneální nebo subkutánní injekce. Sterilní roztoky mohou také být podávány intravenózně. Při perorálním podávání mohou přípravky být buď v tekuté nebo pevné formě.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být podávány rektálně ve formě běžných čípků. Pro podávání intranazálním způsobem nebo intrabronchiální inhalací či insuflací, mohou být sloučeniny podle tohoto vynálezu formulovány do vodyného nebo částečně vodného roztoku, který pak může být použit ve formě aerosolu. Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou také být podávány transdermálně při použití transdermální náplasti obsahující účinnou sloučeninu a nosič, který je vůči aktivní sloučenině inertní, pro kůži není toxický a umožňuje aplikaci agens pro systémovou absorpci do krevního oběhu prostřednictvím kůže. Nosič může také mít celou řadu forem, jako jsou například krémy a masti, pasty, gely a okluzni systémy. Krémy a masti mohou být viskózní tekuté nebo polotuhé emulze typu bud' olej ve vodě nebo voda v oleji. Pasty složené z absorpčních prášků dispergovaných v petrolatum nebo hydrofilním petrolatum obsahující účinnou složku mohou být také vhodné. Celá řada okluzních systémů může být použita pro uvolnění účinné složky do krevního oběhu, jako je například semipermeabilní membrána pokrývající rezervoár obsahující účinnou složku s nosičem nebo bez něj nebo matrici obsahující účinnou složku. Další okluzni systémy jsou známy v literatuře.

Dávkování použité v léčení specifického pacienta trpícího chorobným stavem závislým na

MMP nebo TÁCE musí být subjektivně určeno ošetřujícím lékařem. Uznávané proměnné zahrnují závažnost dysfunkce a- hmotnost, věk a charakter reakce pacienta. Léčení obecně začíná dávkami menšími, než je optimální dávka sloučeniny. Potom je dávka zvyšována, dokud není dosaženo optimálního účinku za daných podmínek. Přesné dávky pro perorální, parenterální, nazální nebo intrabronchiální podávání budou určeny ošetřujícím lékařem na základě zkušenosti s jednotlivými léčenými pacienty a se standardními lékařskými principy.

Výhodně je farmaceutický přípravek v jednotkové lékové formě, např. jako tablety nebo tobolky, přípravek dále rozdělen na jednotkové příslušná množství účinné složky, jednotková léková forma může být v baleních, jako například zabalené prášky, lahvičky, ampule, předem naplněné injekční stříkačky nebo sáčky obsahující tekutiny. Jednotková léková forma je například

V této formě je dávky obsahující

• « ·· · · · · · samotná tobolka nebo tableta nebo v každém balení je odpovídající počet lékových forem.

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY

1. Hydroxamové kyseliny vzorce:

kde skupina C(=O)NHOH a skupina -NR₅- jsou navázány k sousedním uhlíkům skupiny A, kde

A je heteroarylová skupina s 5 až 6 členy mající 1 až 3 heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, S a 0,

X je skupina S0₂ nebo skupina -P(O)R₁₀,

Y je arylová skupina nebo mono- nebo bicyklická heteroarylová skupina s 5 až 10 členy mající 1 až tři heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, S a 0, za podmínky, že X a Z se nevážou k sousedním atomům z Y,

Z je 0, skupina NH, skupina CH₂ nebo S,

R₅ je vodík nebo alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku,

R_s a R₇ jsou každý, nezávisle, vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, skupina -CN, skupina -CCH,

R₈ je vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, alkenylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, alkinylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, cykloalkylové skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, arylová skupina, heteroarylová skupina s 5 až 10 členy mající 1 až 3 heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, S a 0 nebo heterocykloalkylová skupina s 5 až 9 členy mající 1 nebo 2 heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, S a 0, • ♦ ··· ·

Rg je vodík, arylová skupina, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo cykloalkylové skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, a R₁₀ je alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, cykloalkylové skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, arylová skupina nebo heteroarylová skupina, nebo jejich farmaceuticky přijatelná sůl.
2. Sloučenina struktury B podle nároku 1, kde atom kruhu z A sousedící se skupinou -NR₅- je uhlík a má jiný substituent než vodík.
3. Sloučenina podle nároku 1 nebo 2, kde Y je fenylový kruh substituovaný v poloze 1 a 4 substituenty X a Z, v daném pořadí.
4. Sloučenina podle kteréhokoliv nároku 1 až 3, kde X je skupina S0₂.
5. Sloučenina podle kteréhokoliv nároku 1 až 4, kde Z je kyslík.
6. Sloučenina podle kteréhokoliv nároku 1 až 5, kde R₆ a R₇jsou vodík.
7. Sloučenina podle kteréhokoliv nároku 1 až 6, kde R₈ je skupina -CH₂OH nebo methylová skupina.
8. Sloučenina podle nároku 1, která je (3-[methyl(4-but-2-ynyloxybenzensulfonylamino]-N-hydroxy-2,6-dimethoxyisonikotinamid.
9. Sloučenina podle nároku 1, která je 3-(4-but-2-ynyloxybenzensulfonylamino)-N-hydroxy-2,6-dimethoxyisonikotinamid.
10. Způsob výroby sloučeniny vzorce I, vyznačuj ící se t £ m, že zahrnuje jeden z následujících kroků:

a) reakci sloučeniny vzorce V:

Rs °>=<v &^x

7 P⁶

ZŽ-Ry

R_s (V) kde R₅, R₆, R₇, R₈, A, X, Y a Z jsou tak, jak je definováno výše, a Q je skupina COOH nebo její reaktivní derivát, s hydroxylaminem za vzniku odpovídající sloučeniny vzorce B, nebo

b) odstranění chránící skupiny sloučeniny vzorce VI:

kde R₅, R₆, R₇, R₈, A, X, Y a Z jsou, jak je definováno výše, a R₃₀ je chránící skupina, za vzniku sloučeniny vzorce B,

c) rozštěpení směsi (např. racemátů) opticky aktivních izomerů sloučeniny vzorce B, aby se izoloval jeden enantiomer nebo diastereomer v podstatě bez dalšího enantiomerů nebo diastereomerů, nebo

d) acidifikace bazické sloučeniny vzorce B farmaceuticky přijatelnou kyselinou za vzniku farmaceuticky přijatelné soli.
11. Sloučenina vzorce:

kde R₆ a R₇ jsou každý, nezávisle, vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, skupina -CN, skupina -CCH, a R₈ je alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, alkenylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, alkinylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, cykloalkylová skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, fenylová skupina, naftylová skupina, heteroarylová skupina s 5 až 10 členy mající 1 až 3 heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, 0 nebo S, nebo heterocykloalkylová skupina s 5 až 9 členy mající 1 nebo 2 heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, O nebo S.
12. Sloučenina vzorce kde R₆ a R₇ jsou každý, nezávisle, vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, skupina -CN, skupina -CCH,

R₈ je alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, alkenylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, alkinylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, cykloalkylová skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, fenylová skupina, naftylová skupina, heteroarylová skupina s 5 až 10 členy mající 1 až 3 heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, O nebo S, nebo heterocykloalkylová skupina s 5 až 9 členy mající 1 nebo 2 heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, O nebo S, a J je fluor, brom, chlor, 1,2,4-triazolylová skupina, benzotriazolylová skupina nebo imidazolylová skupina.
13 . Způsob inhibice patologických změn zprostředkovaných enzymem konvertujícím TNF- (TÁCE) u savce, který to potřebuje, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání uvedenému savci terapeuticky účinného množství sloučeniny mající vzorec:

kde skupina C(=O)NHOH a skupina -NR₅- jsou navázány k sousedním uhlíkům skupiny A, kde

A je heteroarylová skupina s 5 až 6 členy mající 1 až 3 heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, S a 0,

X je skupina S0₂ nebo skupina -P(O)Ri₀,

Y je arylová skupina nebo mono- nebo bicyklická heteroarylová skupina s 5 až 10 členy mající 1 až tři heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, S a 0, za podmínky, že X a Z se nevážou k sousedním atomům z Y,

Z je 0, skupina NH, skupina CH₂ nebo S,

R₅ je vodík nebo alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku,

R₆ a R₇ jsou každý, nezávisle, vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, skupina -CN, skupina -CCH,

R₈ je vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, alkenylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, alkinylová • · *· ·« · · · · 4 • · · · · · · · · · · · • · · · ··· ·· · • ······ · · · · « « ·· ·· ·· ··· ·· ···· skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, cykloalkylové skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, arylová skupina, heteroarylová skupina s 5 až 10 členy mající 1 až 3 heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, S a O nebo heterocykloalkylová skupina s 5 až 9 členy mající 1 nebo 2 heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, S a O,

R₉ je vodík, arylová skupina, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo cykloalkylové skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, a Rio je alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, cykloalkylové skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, arylová skupina nebo heteroarylová skupina, nebo její farmaceuticky přijatelné soli.
14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že léčený chorobný stav je revmatoidní artritida, rejekce štěpu, kachexie, zánět, horečka, rezistence na inzulín, septický šok, městnavé srdeční selhání, zánětlivé onemocnění centrálního nervového systému, zánětlivá onemocnění střev nebo infekce HIV.
15. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu mající vzorec:

kde skupina C(=O)NHOH a skupina -NR₅- jsou navázány k sousedním uhlíkům skupiny A, kde ·· ·· · * · · · · * ···· · · » · ····

A je heteroarylová skupina s 5 až 6 členy mající 1 až 3 heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, S a O,

X je skupina SO₂ nebo skupina -P(O)Ri₀,

Y je arylová skupina nebo mono- nebo bicyklická heteroarylová skupina s 5 až 10 členy mající 1 až tři heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, S a O, za podmínky, že X a Z se nevážou k sousedním atomům z Y,

Z je 0, skupina NH, skupina CH₂ nebo S,

R₅ je vodík nebo alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku,

R_s a R₇ jsou každý, nezávisle, vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, skupina -CN, skupina -CCH,

Rg je vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, alkenylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, alkinylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, cykloalkylová skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, arylová skupina, heteroarylová skupina s 5 až 10 členy mající 1 až 3 heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, S a O nebo heterocykloalkylová skupina s 5 až 9 členy mající 1 nebo 2 heteroatomy vybrané z N, skupiny NR₉, S a O,

R₉ je vodík, arylová skupina, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo cykloalkylová skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, a Rio je alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, cykloalkylová skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, arylová skupina nebo heteroarylová skupina, nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl, a farmaceuticky přijatelný nosič.