CZ20003576A3 - Nukleová kyselina kódující pro hyaluronan syntázu a způsoby jejího použití - Google Patents

Description

Tato přihláška souvisí s US předběžnou patentovou přihláškou 60/080,414, která má název Unikátní hyaluronan syntáza z Pasturella multocida, podanou 2. dubna 1998, která se zde tímto v celém rozsahu začleňuje do popisu. Tato přihláška je také částečně pokračovací k US patentové přihlášce 09/178,851 nazvané Gen hyaluronan syntézy a jeho použití, podané 26. října 1998, která se zde tímto v celém rozsahu také začleňuje do popisu.

Vynález se týká DNA sekvence kódující hyaluronan syntázu z Pasturella multocida. Ještě konkrétněji se přihláška týká DNA sekvence kódující hyaluronan syntázu, získané z Pasturella multocida, která je schopna být umístěna do rekombinační konstrukce tak, že dokáže exprimovat hyaluronan syntázu v cizím hostiteli. Tento vynález se také týká způsobů použití a DNA sekvence kódující hyaluronan syntázu z Pasturella multocida pro: (1) výrobu hyaluronových polymerů různé distribuce velikostí; (2) výrobu hyaluronových polymerů inkorporujících sacharidy substitučních nebo adičních bází; (3) vývoj nových a inovovaných zvířecích vakcin; a (4) vývoj nových a inovovaných diagnostických testů k detekci a identifikaci zvířecích patogenů.

Dosavadní stav techniky

Polysacharid nazývaný hyaluronová kyselina (HA) nebo hyaluronan, je důležitou složkou vyšších organismů zvířat,

positivní skupina A Pasturella multocida kde hraje strukturní a rozpoznávací roli. U savců a ptáků je

HA přítomna ve velkých množstvích v kůži, v kloubním mazu a v oční sklivci. Určité patogenní bakterie, zejména grama C streptokok a gram-negativní

Carteróva typu A, produkují extrácelulární tobolky obsahující HA se stejnou chemickou strukturou jako HA molekula, nacházející se v obratlovci, jenž je jejich hostitelem. Tyto folie, představující molekulární mimikry se snaží zdolat silnou odpověď protilátek na polysacharid v tobolkách (kapsulích). V kontrastu s tím, polysacharidy v tobolkách s různou strukturou produkované jinými bakteriemi, mají často zcela povahu antigenů. Tobolky HA také očividně pomáhají patogenům obejít obranu hostitele včetně fagocytózy.

Historicky lze říci, že výzkumy na tomto poli nebyly úspěšné při klonování nebo identifikaci hyaluronan syntázy (HAS) z organismů druhu Pasturella. Byly identifikovány a klonovány bakteriální HAS enzymy ze skupiny A & C streptokoků. První HAS, která byla definitivně identifikována, byla HasA ze Streptococcus pyogenes. Tento integrální membránový protein využívá intraceiulární UDP-GlcA a UDP-GlcNAc jako substráty. Vznikající HA řetězec je protlačován přes membránu a tvoří extrácelulární kapsuli. Jako HAS byl již rozpoznán protein Xenopus, DG42. Bylo také již identifikováno několik lidských a murínových homologů DG42, pojmenovaných HASÍ, HAS2 a HAS3. mezi těmito molekulárně klonovanými savčími enzymy na aminokyselinové úrovni je zřetelná podobnost, ale jsou umístěny na různých chromozomech. Unikátní HAS z P. multocida má primární strukturu, která se dříve enzymům, klonovaným ze Streptokoka, PBCV-1 viru nebo z vyšších živočichů, vůbec nepodobá.

··· 4 4 4 4 ·

A virová HAS, s ORF zvanými A98R, byla identifikována jako z 28-30% identická se streptokokovými a obratlovčími enzymy. PBCV-1 (Paramecium bursaria Chlorella virus) produkuje autentický HA polysacharid krátce po infekci hostitele, kterým je zelená řasa, podobná jako Chlorela. A98R je první virový enkódovaný enzym, identifikovaný jako produkující uhlovodíkový polymer.

Carterův typ A P. multocida, příčina krůtí cholery, je odpovědný za velké ekonomické ztráty v oblasti chovu krůt ve Spojených státech. Akapsulární mutanti P. multocida po intravenózní injekci v krevním oběhu krůt tak dobře neprospívají, zatímco enkapsulované rodičovské kmeny se tam množí rychle a způsobují smrt v průběhu 1 až 2 dní. Spontánně vznikající mutantní kmen, který je akapsulární, byl také 10⁵krát méně virulentní než kmen divokého typu, ale povaha genetických defektů nebyla před objevením uvedeného mutanta v žádném případě známá (jak je zde popsáno).

Bakteriální patogeny Pasturella působí rozsáhlé ztráty v zemědělském hospodářství Spojených států. Bylo předpokládáno, že extracelulární polysacharidové kapsule P. multocida je hlavním virulentním faktorem. Kapsuli typu A tvoří polysacharid, zejména HA, který je identický s normálním polysacharidem v těle hostitele a tudíž je pro imunitní systém neviditelný. Toto molekulární mimikry také se také skrývá obraně hostitele, jako je fagocytóza a komplementem-zprostředkovaná lýze. Dále, HA není příliš silně imunogenní neboť polymer je normálním komponentem těla hostitele. Nicméně. kapsule jiných bakterií, které se skládají z různých polysacharidů, jsou obyčejně hlavními cíly imunitní odpovědi. Za likvidaci mikroorganismu a dlouhodobou • 4 ······ «· • · «4 · · · ··· • · ····· · · • · · · · · · ·· · ··· ·· · ·· · · ·· * imunitu jsou často odpovědné protilátky, generované proti kapsulárním polymerům.

Poznání faktorů odpovědných za virulenci patogenu poskytuje klíče k vyřešení problému, jak inteligentně a účinně bojovat proti nemoci. U typu A P. multocida, je jedním z virulentních faktorů ochranný štít neimunogenní HA, který tvoří spolehlivou bariéru proti obranným mechanizmům hostitele. Několik kmenů nemá k ochraně HA kapsule, ale používá k ochraně před obranným mechanizmem hostitele jiné neznámé faktory. Alternativně mohou tyto kmeny nést mnohem menší kapsule, které nejsou detekovány klasickými testy.

Pro kuřata a zejména krůťata, je krůtí cholera zhoubná. Několik až 1000 buněk některého z enkapsulovaných kmenů může zabít krůtu za 24-48 hodin. Krůtí cholera je ekonomicky závažnou chorobou v Severní Americe. Studie z pozdních osmdesátých let ukazuje některé dopady krůtí cholery na zemědělský chov krůt: (i) krůtí cholera způsobila 14,7 až 18% všech onemocnění, (ii) v pouhém jednom státě byly roční ztráty 600000,- $ (iii) náklady na léčení nemocného hejna antibiotiky byly 0,40 $ na jednoho ptáka, a (iv) při preventivním ošetření proti infekci krůtí cholerou byly náklady 0,12 $ na jednoho ptáka pro.

Určité kmeny P. multocida typu A způsobují plicní léze a vysoké horečky u hospodářských zvířat, která jsou vystavena stresu. Následný pokles hmotnostního přírůstku a ztráty na krmivěch představují hlavní podíl ztrát. Kmeny napadající skot jsou poněkud odlišné od kmenů krůtí cholery, ale molekulární příčiny těchto rozdílů v rozsahu přednostně napadaných hostitelů dosud nejsou objasněny. Typ A také způsobuje polovinu případů onemocnění pneumonií u prasat. Typ

D P. multocida je nejlépe poznaným typem, neboť způsobuje atrofickou rýmu, která je velmi rozšířenou chorobou u prasat.

Kapsulární polymer typu D má neznámou strukturu, která se projevuje jako některý typ glykosaminoglykanu; Je to stejná rodina polymerů, do které patří i HA. Tato choroba je také urychlena přítomností Bordetella bronchiseptica, ale podmínky jsou horší, pokud jsou přítomny oba tyto bakteriální kmeny. Odhaduje se, že typ F způsobuje asi 10% případu krůtí cholery. V tomto případě kapsulárním polymerem není HA, ale příbuzný polymer, zvaný chondroitin.

V současné době je prevence krůtích chorob u chovů zabezpečována dvěma prvky: vakcínami a antibiotiky, a zároveň přísnou hygienou. Užitečnost první možnosti je omezená, neboť, je v této oblasti mnoho serotypů a vakcíny jsou účinné pouze proti limitovanému podsouboru z celého spektra patogenů. Vakcína na bázi zabitých buněk je podávána ručně intenzivními injekcemi, a získaná obranyschopnost není příliš vysoká. Z těchto důvodů je tato cesta obvykle vyhrazena pouze pro chovná zvířata.Efektivnější vakciny na bázi živých buněk se dají podávat v pitné vodě, ale je obtížné je dávkovat hejnům až tisíců jedinců. Kromě toho, živé avirulentní vakciny můžou někdy způsobit chorobu, pokud jsou ptáci jinak oslabeni nebo nemocní. Nejběžnější příčinou tohoto nepředvídatelného chování je, že tyto avirulentní kmeny vznikly ze spontánních mutací v neznámých, nebo necharakterizovaných genech. Postupy, které používají opakovanou alternující expozici živých a mrtvých vakcín, mohou chránit ptáky pouze proti napadení stejným serotypem.

Druhou možností ochrany proti chorobě je podávání antibiotik. Ta jsou užívána buď v subterapeutických dávkách pro prevenci infekce nebo ve vysokých dávkách k vyléčení infikovaných ptáků z krůtí cholery. Procenta ptáků, kteří mají chorobu mohou při takovéto aplikaci účinných látek vzrůst, ale jsou nutné časté a rozsáhlé léčebné zákroky. Pozdější nebo předčasné dávky představují problém, který je nevýhodou antibiotik, a který často vede k chronické krůtí choleře a k nemocně vyhlížejícím ptákům s abscesy nebo lézemi, které vedou k zabavení produkce a k tržním ztrátám. Dále, jelikož rezistentní kmeny P. multocida kontinuálně vznikají a účinné látky jsou stále dražší, toto řešení není v dlouhodobém výhledu atraktivní. Dále, typ F P. multocida pravděpodobně způsobuje 5-10% případů onemocnění krůt krůtí cholerou v Severní Americe. Vakcína přímo proti kmenům typu A nemůže plně chránit proti tomuto ani proti jiným kmenům, které se objeví jako hlavní patogen v budoucnu. Při chovu Skotu a prasat se ukázalo, že žádná vakcína nebyla plně uspokojivá. Profylaktické antibiotické léčení se používá tehdy, když jde o to, zabránit ztrátám na hmotnosti zvířat, ale tato možnost je drahá a dochází při ní ke vzniku mikrobiální rezistence.

V tomto vynálezu se při vytváření ochranné bakteriální HA kapsule uplatňují enzymy, které byly identifikovány na úrovni gen/DNA. Identifikace těchto enzymů vede k zásahu do onemocnění blokováním syntézy kapsule patogenu se specifickými inhibitory, které biosyntézu HA u hostitele zmenšují. Tak například, látka napodobující substráty používané k výrobě HA nebo regulátoru P. multocida HA syntázy zastavuje produkci bakteriálního HA polysacharidu, a tím blokuje tvorbu kapsulí. Toto je přímá analogie mechanizmu mnoha současných antibiotik, která mají nepodobné účinky na mikrobiální a hostitelské systémy. Tento přístup je výhodný, protože HA syntéza v P. multocida a HA syntéza obratlovců • ·· ···· ·· ·· · · · · · · • · · · · · · · ··· ··· ·· ··· ·· ··· jsou na úrovni proteinů velmi odlišné. Z těchto důvodů je slibné, že enzymy se také liší v reakčním mechanismu nebo vazných místech substrátu.

P. multocida, která byla jednou zbavena ochranné kapsule, která představuje ochranný štít, je výrazně více zranitelná a představuje dobrý cíl pro obranu hostitele. Fagocyty snadno pohlcují a ničí akapsulární mikroby. Hostitelský komplementární komplex snadno dosáhne na vnější citlivou membránu bakterie a narušuje ji. Pak jsou mnohem více generovány protilátky proti nově se objevivším imunogenům, jako jsou například lipopolysacharidy nebo povrchové proteiny, které definují somatický serotyp P. multocida,. Tyto protilátky jsou lépe schopné navázat se na akapsulární buňky, což je součástí úspěšní imunitní reakce. Tudíž imunitní odezvy na vakcinaci jsou účinnější a efektivní z hlediska nákladů. Kapsule-inhibující účinné látky jsou tudíž velmi důležitými přísadami při léčení krůtí cholery.

Tento vynález a použití biosyntézy kapsule typu A P. multocida přispívá k pochopení jiných kapsulárních serotypů. DNA sondy byly použity pro kapsulární geny u typu A pro potvrzení, že typy D a F vykazují podobnou homologii.

HA s vysokou molekulovou hmotností (vysokomolekulární) také má širokou řadu použitelných aplikací - zasahující od oblasti kosmetiky do oční chirurgie. Vzhledem k její potenciálně vysoké viskozitě a vysoké biologické snášitelnosti (biokompatibilitě), nalézá HA konkrétní aplikace v oční chirurgii jako náhrada sklivce. HA se také používá k léčení závodních koní při zranění, artritidy pomocí intraartikulárních injekcí HA, v holících krémech, jako mazivo a v řadě kosmetických produktů vzhledem k jejím φ

fyziochemickým vlastnostem po stránce vysoké viskozity a vzhledem k její schopnosti udržet po dlouhou dobu vlhkost. Ve skutečnosti v srpnu 1997 schválila U.S. Food and Drug Agency používání vysokomolekulární HA při léčení závažných případů artritidy pomocí injekcí této vysokomolekulární HA přímo do postižených kloubů. Obecně vzato, HA s vyšší molekulovou hmotností se lépe používá. Je to tím, že viskozita roztoku HA roste se střední molekulovou hmotnosti jednotlivých HA polymerních molekul v roztoku. Bohužel, příliš vysoké molekulové hmotnosti HA, jako jsou ty, které se pohybují do 10⁷, byly dosud obtížně získatelné současnou známou izolační metodou.

Pokud chceme odstraňovat tyto nebo jiné potíže, je nutno najít nové způsoby a konstrukce, které se dají použít k produkci HA, která má jednu nebo několik vlastností zlepšených. Tak například může být řešena vyšší čistota preparátu. V konkrétním případě je třeba vyvinout metodiku pro produkci větších množství relativně vysokomolekulární a relativně čisté HA, ve srovnání s tou, která je v současnosti komerčně dostupná. Pro schopnost vyvinout metodiku pro takovou produkci HA, která bude mít modifikovanou velikost distribuce velikostí molekul (HA_Asize) a HA s modifikovanou strukturou (HA_Amod) .

Tento vynález, z uvedených důvodů, funkčně charakterizuje geny P. multocida typu A, které souvisejí s biosyntézou kapsulí, rozpoznává roli kapsule jako faktoru virulence u krůtí cholery a vyřešil získání homologních genů odpovědných za biosyntézu kapsulí u typu D a F. S použitím této informace byly vyvinuty vakciny používající kmen P. multocida s knokautovaným genem, který neprodukuje HAS.

4 444444 44

44 444 4*4

4 44444 44

4 44 4 4 44

444 444 44 444 44 444

Tyto akapsulární avirulentní kmeny mají schopnost působit jako vakcíny proti krůtí choleře nebo zhoubné horečce.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká nových HAS, které produkují HA. S pomocí různých technik molekulární biologie byl nalezen gen nové HAS v patogenu krůtí cholery, Pasturella multocida typu A. Tato nová HAS z Pasturella multocida, (PmHAS), byla klonována a ukázalo se, že je funkční i v jiných druzích bakterií.

Byl tedy identifikován nový zdroj HA. DNA sekvence PmHAS může být také použitelné pro generování potenciálně vhodných vakcinačních kmenů bakterie P. multocida po knokautování normálního mikrobiálního genu homologní rekombinací s přerušenou verzí. Kromě toho, DNA sekvence PmHAS umožňuje generovat diagnostické sondy pro rozlišení typu bakterie, pokud jsou příbuzné typům P. multocida, které jsou zemědělskými patogeny krůt, skotu, ovcí a prasat.

Stručný popis obrázků na přiložených výkresech

Obr. 1 je parciální složení sekvence PmHAS P. multocida a jiných glykosyltransferáz z jiné bakterie. PmHAS sekvence na obrázku 1 je SEQ ID NO: 10; Epsl sekvence na obrázku 1 je SEQ ID NO: 11; Cpsl4E sekvence na obrázku 1 je SEQ ID NO:12; LgtD sekvence na obrázku 1 je SEQ ID NO: 13; SpHasA sekvence na obrázku 1 je SEQ ID NO: 14; a ''shoda sekvencí na obrázku 1 je SEQ ID NO:15.

• · · · · · • · » * ···

Obrázek 2 je pořadí sekvence zbytků 342-383 PmHAS (SEQ ID NO: 16) jak se jeví při srovnání se zbytky 362-404 savčí UDP-GalNAc:polypeptid GalNAc-transferázy (SEQ ID N0:17). Shoda sekvencí na obrázku 2 je SEQ ID NO: 18.

Obr. 3 je autoradiogram představující test značení s využitím fotoafinity s analogy UDP-sacharidu PmHAS.

Obr. 4 je autoradiogram vyznačující snížení nebo absenci značení na základě fotoafinity s PmHAS v různých Tn mutantech PmHAS.

Obr. 5 znázorňuje fotomikrografy demonstrující HA produkci v rekombinační E. coli.

Obr. 6 graficky znázorňuje konstrukci pPmHAS a její subklonování do expresního vektoru.

Obr. 7 znázorňuje závislost PrnHAS aktivity na pH.

Obr. 8 znázorňuje závislost HAS aktivity na kovu.

Obr. 9 znázorňuje závislost HAS aktivity na koncentraci UDP-GlcNAc.

Obr. 10 znázorňuje závislost HAS aktivity na koncentraci UDP-GlcA.

Obr. 11 je Hanes-Woolfův diagram, podle kterého se odhaduje Vmax a K_M.

Obr. 12 je Southern blot mapa Tn mutantů.

• · · · · · · · • φ φ φφφ • · ·φφ φ · φ φ φφφφ φ φφ ··· <· φφφ

Obr. 13 znázorňuje chimérické DNA šablony pro sekvenční analýzu míst přerušení Tn.

Obr. 14 je grafické znázornění části místa HA biosyntézy P. multocida typu A.

Obr. 15 je Southern blot analýza různých kapsulárních typů P. multocida se sondou na bázi genu kapsule typu A.

Obr. 16 je elektroforetogram PCR typu A DNA a heterologní DNA s různými typy A primérů.

Obr. 17 je porovnání parciální sekvence typu A (SEQ ID NO:5) a F (SEQ ID NO:4) KfaA homologů a E. coli (SEQ ID NO:6) KfaA.

Obr. 18 je schematické porovnání genu HAS divokého typu s knokautovaným mutantním genem.

Obr. 19 je molekulárně biologické potvrzení akapsulárního knokautovaného mutanta pomocí Southern blot a pomocí PCR analýzy.

Obr. 20 je porovnání sekvence typů A a F P. multocida. PmHAS sekvence na obrázku 20 je SEQ ID NO:7; PmCS sekvence na obrázku 20 je SEQ ID NO:8; a shoda sekvencí na obrázku 20 je SEQ ID NO:9.

Obr. 21 je Western blot analýza nativního a rekombinačního PmHAS proteinu.

• φ φφφφφφ φφ φφ φφ φφφ φφφ φ φ φφφφφ φφ φ φφφφ φφφφ φφφ φφφ φφ φφφ φφ

Podrobný popis vynálezu uvedených výkresech,

Před vysvětlením alespoň jednoho provedení vynálezu detailně je třeba rozumět, že vynález není omezen na tato provedení do všech detailů konstrukce a uspořádání složek, v následujícím popisu nebo zobrazených na Tento vynález umožňuje i jiná provedení nebo pro praktické provádění nebo uskutečnění různými cestami. Také je třeba rozumět, že výrazy a termíny, které se zde používají pro účely popisu jsou konkrétně voleny a vynález by neměl být takto na jednotlivé konkrétní termíny omezován.

Termín „segment nukleové kyseliny, jak je zde používán a „DNA segment se používají jako vzájemně zaměnitelné a znamenají DNA molekulu, která byla izolována bez celkové genomové DNA z určitého druhu. Proto „čištěná DNA nebo segment nukleové kyseliny, jak je zde tento výraz používán, znamená DNA segment, který obsahuje nějakou syntézu Hyaluronát syntáza („HAS) kódující sekvenci, která byla izolována a ve směsi se nenachází nebo ze směsi byla uměle odstraněna nepříbuzná genomová DNA, např. celková Pasturella multocida nebo např. genomová DNA savčího hostitele. V rámci termínu „DNA segment jsou zahrnuty DNA segmenty a menší fragmenty těchto segmentů, také rekombinační vektory včetně např. plasmidů, kosmidů, fágů, virů a pod.

Podobně termín DNA segment obsahující izolovaný nebo čištěný PmHAS gen znamená DNA segment včetně HAS kódujících sekvencí, ze kterého byly v podstatě odstraněny jiné v přírodě se vyskytující geny nebo sekvence kódující protein. V souladu s tím termín „gen se používá pro jednoduchost k označení jednotky kódující funkční protein, polypeptid nebo peptid. Jak bude jasné odborníkovi v oboru, tyto funkční

4* 4444 • ·

	13	• 4 44 4 4 4 • 4 4 4444	4 4·· • 44 4 · 4 • 4 4 44 44 4
4 4*44 4 4 44 444 44Φ 44	4 4 • 444
termíny zahrnují genomové	sekvence,	sekvence cDNA	nebo	jejich
kombinace. „Izolované	v podstatě	vyčištěné	od	j iných

kódujících sekvencí znamená, že gen, o který jde, v tomto případě PmHAS, tvoří výraznou část kódujícího regionu DNA segmentu a že DNA segment neobsahuje z velké části v přírodě se vyskytujících kódujících DNA, jako jsou velké chromozómové fragmenty nebo jiné funkční geny nebo DNA kódující regiony. Pochopitelně to znamená DNA segmenty jak byly originálně izolovány a nevylučují se geny nebo kódující oblasti, které jsou později dodané nebo záměrně ponechané člověkem segmenty.

Vzhledem k určitým výhodám spojeným s použitím prokaryotických zdrojů bude snadno realizovatelná většina výhod s izolací genu HAS z prokaryota P. multocida. Jednou z takových výhod je, že obvykle eukaryotické enzymy vyžadují signifikantní post-translační modifikace, které mohou být dosaženy pouze u eukaryotického hostitele. Z toho vyplývá tendence k omezení použitelnosti jakýchkoliv genů eukariotické HA syntézy, které se získají. Kromě toho odborník v oboru snadno uskuteční další výhody, které se týkají doby a snadnosti genetické manipulace v případě, že se zamýšlí použít gen prokaryotického enzymu. Tyto další výhody jsou (a) snadnost izolace prokaryotického genu, neboť jde o relativně malou velikost genomu a z toho důvodu o menší velikost prohledávané odpovídající knihovny genomů a (b) snadnost manipulace, protože celková velikost kódujícího regionu prokaryotického genu je výrazně menší vzhledem k absenci intronů. Dále, jestliže produkt PmHAS genu (tj. enzymu) vyžaduje posttranslační modifikace, lépe se dá dosáhnout i v podobném prokaryotickém buněčném prostředí (hostitelské), ze kterého je gen odvozen.

Výhodně mohou DNA sekvence podle vynálezu dále obsahovat genetické kontrolní oblasti, které umožňují expresi sekvence ve zvoleném rekombinačním hostiteli. Pochopitelně povaha kontrolních oblastí, které se použijí, obecně vždy závisí na konkrétním použití (např. klonovaný hostitel).

V konkrétních provedeních se vynález týká izolovaných DNA segmentů a rekombinačních vektorů inkorporujících DNA sekvence, které enkódují PmHAS gen, zahrnující uvnitř aminokyselinové sekvence aminokyselinovou sekvenci podle přiložené SEQ ID NO:1. Kromě toho v dalších konkrétních provedeních se vynález týká izolovaných DNA segmentů a rekombinačních vektorů inkorporujících DNA sekvence, které enkódují gen, zahrnující uvnitř aminokyselinové sekvence aminokyselinovou sekvenci genu HAS nebo DNA HAS a v konkrétním případě gen HAS nebo cDNA, odpovídající Pasturella multocida HAS. Tak např., pokud DNA segment nebo vektor enkóduje plnou délkou HAS proteinu nebo je zamýšlen pro použití při expresi HAS proteinu, výhodné sekvence jsou ty, které jsou v podstatě takové, jak je uvedeno v SEQ ID NO:1.

Do definice výhodných sekvencí spadají také zkrácené PmHAS, jak jsou uvedeny v SEQ ID NO:1. Tak např. na C zakončení může být odstraněno přibližně 270-272 aminokyselin ze sekvence SEQ ID NO:1 a ještě bude mít funkci HAS. Běžným odborníků v oboru bude jasné, že jednoduché odstranění aminokyseliny z jakéhokoliv konce PmHAS sekvence se v každém případě dělat dá. Zkrácené nebo omezené verze sekvence se musí jednoduše zkontrolovat, zda ještě vykazují HAS aktivitu, čímž se stanoví, jestliže takovéto omezené nebo zkrácené sekvence jsou ještě schopny produkce HAS.

• ·

4 4 4

4

Segmenty nukleové kyseliny, které mají aktivitu HA syntézy, se dají izolovat metodami, které jsou zde popsány. Výraz „sekvence v podstatě taková, jak je uvedena v SEQ ID NO:1 znamená, že sekvence v podstatě koresponduje s částí SEQ ID NO:1 a má relativně málo aminokyselin, které nejsou identické s touto napsanou sekvencí nebo biologicky funkčně ekvivalentní s touto sekvencí SEQ ID NO:1. Termín „biologicky funkční ekvivalent je v oboru dostatečně známý a je dále definován podrobně v tomto popisu, jako gen, který má sekvencí v podstatě takovou, jak je uvedeno v SEQ ID NO:1, a který je spojen se schopností prokaryotů produkovat HA nebo povlak hyaluronové kyseliny.

Dosavadní stav techniky je přeplněn příklady schopností praktiků v oboru provést strukturální změnu na segmentu nukleové kyseliny (tj. kódující konzervované nebo polokonzervativní substituce aminokyselin) a ještě zachovávající enzymatickou nebo funkční aktivitu. Viz např. (1) Risler et al. „Amino Acid Substitutions in Structuraly Related Proteins. A Pattern Recognition Approach. J.Mol.Biol. 204:1019-1029 (1988) [podle pozorované zaměnitelnosti aminokyselinových postraních řetězců mohly být odpojeny pouze čtyři skupiny: (i) Ile and Val; (ii) Leu a Met, (iii) Lys, Arg, and Gin, and (IV) Tyr and Phe.^,r]; (2) Niefind et al. „Amino Acid Similarity Coefficients for Protein Modeling and Sequence Alignment Derived from MainChain Folding Anoles. J. Mol. Biol. 219:481-497 (1991) [parametry podobnosti umožňují navrhnout náhrady aminokyselin]; a (3) Overington et al. Envíronment-Specific Amino Acid Substitutions Tables: Tertiary Templates and Prediction of Protein Folds, Protein Science 1:216-226 (1992) [Analýza vzorce pozorovaných substitucí jako funkce

	• « • · • · • ·	• · · · • • « · •	• ·
• « •	• · • •
• ·	• ·	• · ·		• · ·

lokálního prostředí ukazuje, že existují oddělitelné vzorce, které ukazují možnost kompatibility záměn]

Tyto odkazy a další, které by se daly vypočítat, ukazují, že běžný odborník v oboru je schopen na dané sekvenci nukleové kyseliny provést substituce a změny tak, aby vznikla sekvence nukleových kyselin bez změny funkčnosti původní nukleové kyseliny. Také může být segment nukleové kyseliny vysoce identický a zachovává si enzymatickou aktivitu ve vztahu k jeho původním formám, ale stále ještě není schopen hybridizace s nimi.

Vynález ukazuje a popisuje segmenty nukleové kyseliny enkódující enzymaticky aktivní hyaluronát syntézu z P. multocída - PmHAS. Pro odborníka v tomto oboru je zjevné, že se mohou dělat substituce v PmHAS nukleovém segmentu uvedeném v SEQ ID NO:2, aniž by došlo k odchylce od rozsahu vynálezu a nároků. Standardizované a přijaté funkční ekvivalenty aminokyselinových substitucí jsou uvedeny v tabulce A.

TABULKA A

Aminokyselinová skupina	Konzervativní a semi-konzervativní substituce
Nepolární	Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin,
R skupiny	Prolin, Methionin, Fenylalanin, Tryptofan
Polární, ale nenabité	Glycin, Serin, Threonin, Cystein,
R skupiny	Asparagin, Glutamin
Negativně nabité R skupiny	Aspartová kyselina, glutamová kyselina
Pozitivně nabité R skupiny	Lysin, Arginin, Histidin

Dalším výhodným provedením podle vynálezu je čištěný segment nukleové kyseliny, který enkóduje protein podle SEQ ID NO:1, dále definovaný jako rekombinační vektor. Jak je zde používán termín „rekombinační vektor znamená vektor, který již byl modifikován tak, aby obsahoval segment nukleové kyseliny, který enkóduje HAS protein nebo jeho fragment. Tento rekombinační vektor může být dále definován jako expresní vektor obsahující promotor operativně napojený na uvedený HAS enkódující segment nukleové kyseliny.

Dalším výhodným provedením vynálezu je buňka hostitele, vyrobená rekombinačně pomocí rekombinačního vektoru obsahujícího gen HAS. Výhodnou rekombinační hostitelskou buňkou může být prokaryotická buňka. V dalším provedení je rekombinační hostitelskou buňkou eukaryotická buňka. Termín „upravená genetickým inženýrstvím nebo „rekombinační buňka je míněn tak, že znamená buňka, do které byl zaveden rekombinační gen, např. jako je gen enkódující HAS. Z těchto důvodů buňky upravené genetickým inženýrstvím jsou odlišitelné od buněk vyskytujících se v přírodě, které neobsahují rekombinačně zavedený gen. Buňky upravené genetickým inženýrstvím jsou tudíž buňky, které mají gen nebo geny zavedené činností člověka. Rekombinačně zavedené geny buď mají formu cDNA genu, kopii genomového genu nebo obsahují geny, umístěné vedle promotoru nepřírodně spojeného s určitým zavedeným genem.

Ve výhodných provedeních zahrnují segmenty DNA enkódující HA syntázu, dále DNA sekvence, známé v oboru funkčně jako původci replikace nebo „replikonů, které umožňují replikaci bezprostředně následující k sekvenci konkrétního hostitele. Takové zdroje replikací umožňují

připravit extrachromozomálně lokalizované a chiméricky replikující segmenty nebo plasmidy, do kterých se navazují DNA sekvence HA syntázy. V ještě výhodnějších případech se používá zdrojů, které jsou schopné replikace v bakteriálním hostiteli, což je vhodné pro biotechnologické aplikace. Nicméně pro větší proměnlivost segmentů klonované DNA může být žádoucí alternativně nebo dokonce přídavně použít zdrojů rozpoznaných jiným hostitelským systémem, jehož použití se předpokládá, tak jako v případě kyvadlového (shuttle) vektoru) .

Izolace a použití jiných replikačních zdrojů tak jako je např. SV40, polyom nebo zdroje z hovězího papilomu, které se dají použít pro klonování nebo expresi v řadě vyšších organismů, jsou dobře známé odborníkům v oboru. V některých provedeních lze tudíž vynález definovat v termínech rekombinačního transformačního vektoru, který obsahuje sekvenci kódující gen HA syntázy spolu s vhodným replikačním zdrojem a pod kontrolou zvoleného kontrolního regionu.

Z těchto důvodů je jasné odborníkům z oboru, že se dají k získání genu HAS nebo cDNA použít jiné prostředky, což je zřejmé ve světle tohoto popisu. Tak např. lze získat DNA fragmenty, které jsou produktem reakce polymerázového řetězce nebo RT-PCR, které obsahují plné komplementy genů nebo cDNA z řady zdrojů, včetně jiných kmenů Pasturellas nebo z eukaryotických zdrojů, jako jsou cDNA knihovny. Teoreticky lze použít jakýkoliv molekulárně klonovací přístup pro generování DNA fragmentů pro získání produktů podle vynálezu. Tudíž jediným obecným omezením rozsahu konkrétních použitelných metod pro izolaci DNA podle vynálezu je to, že izolované nukleové kyseliny by měly enkódovat biologicky funkční ekvivalent HA syntázy.

Poté co se DNA izoluje, naváže se pomocí zvoleného vektoru. Teoreticky lze použít jakéhokoliv klonovacího vektoru a dosáhne se výhod podle vynálezu. Obvykle se používají vektory, které zahrnují plasmidy a fágy vhodné pro použití v prokaryotických organismech a dokonce virové vektory pro použití v eukaryotických organismech. Mezi příklady patří pKK223-3, pSA3, rekombinant lambda, SV40, polyom, adenovirus, virus hovězího papilomu a retrovirus. Nicméně máme na to, že konkrétních výhod bude zcela určitě dosaženo realizací takového provedení, kdy se jedná o vektory schopné replikace jak ve kmenech Lactococcus nebo Bacillus, tak E. coli.

Vektory jako jsou tyto, jejichž příkladem je pSA3 vektor od Dao and Ferretti nebo pAT19 vektor Trieu-Cuot, et al., které umožňují provést výběr klonované kolonie v hostiteli, se kterým se snadno manipuluje, jako je např. E. coli, přičemž poté následuje transfer zpět do organismu Lactococcus potravinářské kvality nebo Bacillus, přičemž tyto kmeny se používají pro produkci HA. Jedná se totiž o benigní a dobře prostudované organismy, které se používají při produkci určitých potravinářských a biotechnologických produktů. Pokud se použijí kmeny Lactococcus nebo Bacillus, je možné počítat s určitými výhodami spočívajícími v jejich schopnosti syntetizovat HA v průběhu dávkování genu (tj. poskytnutím vnější kopie genu HA syntézy zesílením) a/nebo včetně přídavných genů, které zvyšují přístupnost HA prekursorů. Inherentní schopnost bakterie syntetizovat HA může také být využita pomocí vytvoření vnějších kopií, nebo zesílením, plasmidu, který nese gen HA syntázy. Toto zesílení může být až 10ti násobné ohledně počtu plastidových kopií a tudíž počtu kopii genu HA syntázy.

I

Jiným postupem, který může dále rozšířit počet kopií genu HA syntázy je vložení většího množství kopií genu do plasmidů. Jiná technika je např. integrace genu HAS do chromozomové DNA. Toto vnější zesílení by mohlo být zejména vhodné, pokud velikost genu bakteriální HA syntázy je malá. V některých scénářích se používá chromozomálně DNA-vázaný vektor k transfekci hostitele, který se volí tak, aby byl vhodný pro účel klonálního screeníngu jako např. E. coli, prostřednictvím použití vektoru, který je schopen exprese vložené DNA ve zvoleném hostiteli.

V některých provedeních se vynález týká izolovaných DNA segmentů a rekombinačních vektorů, které obsahují sekvenci nukleové kyseliny, sekvenci v podstatě jak je uvedena pro SEQ ID NO:2. Termín „v podstatě jako je uvedena pro SEQ ID NO:2 se používá v tom samém významu, jak je shora popsáno pro sekvence nukleové kyseliny v podstatě korespondující s částí SEQ ID NO:2 a má relativně málo kodonů, které nejsou identické nebo funkčních ekvivalentů kodonů SEQ ID NO: 2. Termín „funkčně ekvivalentní Godon se zde používá ve významu kodonů, které enkódují stejnou aminokyselinu, jako např. šest kodonů pro arginin nebo serin, jak je uvedeno v tabulce A a také znamená kodony, které enkódují biologicky ekvivalentní aminokyseliny.

Je také třeba si uvědomit, že sekvence aminokyselin a nukleových kyselin mohou obsahovat přídavné zbytky, jako je přídavný N- nebo C- terminální zbytek aminokyselin nebo 5'nebo 3' nukleokyselinových sekvencí a přitom stále jsou v podstatě jak je uvedeno pro jednu zde popsaných sekvencí, a to vždy tehdy, pokud sekvence splňují kritéria uvedená shora včetně udržení aktivity biologického proteinu pokud je • Φ φφφφ φφ • · · φφφ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φφ φφφ protein exprimován a což se týká také enzymové aktivity. Přidání terminálních sekvencí se zejména aplikuje na sekvence nukleových kyselin, které mohou např. zahrnovat různé nekódující sekvence lemující buď 5'nebo 3'části kódujícího regionu nebo mohou zahrnovat různé vnitřní sekvence, o nichž je známo, že se vyskytují uvnitř genu. Dále z N nebo C koncových aminokyselin se mohou odstranit zbytky a přitom stále v podstatě bude sekvence jak je popsaná zde, pokud sekvence splňuje kritérium uvedené shora, podobně jako v předešlém případě.

Možnost degenerace genetického kódu stejně jako konzervativní a semi-konzervativní substituce sekvence, které mají mezi 40% a asi 80% nebo víc výhodně asi mezi 80% a asi 90% nebo dokonce ještě výhodněji mezi 90% a asi 99%, nukleotidů, které jsou identické nukleotidům SEQ ID NO: 2 budou sekvencemi, které jsou „v podstatě jako je uvedeno v sekvenci SEQ ID NO:2. Sekvence, které jsou v podstatě stejné jako ty, uvedené v SEQ ID NO:2 mohou také být funkčně definovány jako sekvence, které jsou schopné hybridizace na segment nukleové kyseliny, obsahující komplement SEQ ID NO: 2 za standardních nebo méně příznivých hybridizačních podmínek. Vhodné standardní hybridizační podmínky jsou známy odborníkům v oboru a jsou zde jasně uvedeny.

Termín „standardní hybridizační podmínky jak je zde používán, znamená takové podmínky, za kterých v podstatě komplementární segmenty nukleové kyseliny budou tvořit standardní Watson-Crick párování bází. Je známa řada faktorů, které determinují specifičnost vazby nebo hybridizace, jako je pH, teplota, koncentrace soli, přítomnost činidel, jako je formamid a dimethylsufoxid, délka segmentů, které se hybridizují a pod. Pokud jde o kratší segmenty nukLeových ·♦ 9999 99

9 9 » · 9 • 9 999 9 9

9 9 9

999 99 9 kyselin, používá se pro hybridizaci např. fragmentů mezi asi 14 a asi 100 nukleotidy, bude co do koncentrací soli a co do teploty výhodné prostředí pro hybridizaci 1,2 - 1,8 x HPB při 40 - 50°C.

V podstatě tento vynález zahrnuje DNA segmenty, které jsou komplementární nebo v podstatě komplementární těm, které jsou uvedeny pro SEQ ID NO:2. Sekvence nukleových kyselin, které jsou „komplementární jsou ty, které jsou schopné párování bází podle standardního pravidla Watson-Crickova pro komplementaritu. Jak je zde uvedeno, termín „komplementární sekvence znamená sekvence nukleových kyselin, které jsou v podstatě komplementární, jak může být seznáno srovnáním stejných nukleotidů, uvedených shora nebo jak je definováno jako schopnost hybridizace na segment nukleové kyseliny sekvence SEQ ID NO:2.

Segmenty nukleové kyseliny podle vynálezu bez ohledu na délku kódující sekvence jako takové, mohou být kombinovány s jinými DNA sekvencemi, jako jsou promotory, polyadenylačními signály, přídavnými restrikčními enzymovými místy, větším počtem klonovacích míst, epitopovými značkami, polyhistidinovými regiony, jinými kódujícími segmenty a pod., takže jejich celková délka může být velmi proměnlivá. To se předpokládá proto, že fragment nukleové kyseliny u jakékoliv délky je použitelný, přičemž celková délka je výhodně omezena snadností přípravy a použití pro zamýšlený rekombinační DNA protokol.

Je třeba rozumět, že tento vynález není omezen na určité aminokyselinové a nukleokyselinové sekvence, konkrétně jmenované v SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:2. Rekombinační vektory a izolované DNA segmenty mohou proto různě obsahovat HAS » ···· * »

999 kódující regiony, kódující regiony nesoucí zvolené alterace nebo modifikace v základním kódujícím regionu nebo mohou enkódovat delší polypeptidy, které nicméně zahrnují HAS kódující regiony nebo mohou enkódovat biologicky funkčně ekvivalentní proteiny nebo peptidy, které mají různé sekvence aminokyselin.

DNA segmenty podle tohoto vynálezu obsahují samozřejmě biologicky funkční ekvivalentní HAS proteiny a peptidy. Takovéto sekvence mohou vznikat jako konsekvence kodonové redundance a o funkční ekvivalence, o nichž je známo, že se objevují v přírodě uvnitř sekvencí nukleových kyselin a proteinů jimi enkódovaných. Alternativně funkčně ekvivalentní proteiny nebo peptidy mohou být vytvořeny cestou aplikace, rekombinanční DNA technologie, přičemž změny v proteinové struktuře se dají změnit genetickým inženýrstvím, založeným na zjištění vlastností aminokyselin, které se mají vyměnit. Změny navržené nebo provedené člověkem se mohou zavést pomocí místně-řízených mutagenních technik, např. zavést vylepšení enzymové aktivity nebo antigenicity HAS proteinů nebo testovat HAS mutanty za účelem zjištění aktivity HA syntázy na molekulární úrovni.

Také specifické změny v HAS kódující sekvenci mohou vést k produkci HA, která má změněnou distribuci velikosti nebo strukturální konfiguraci. Odborník v oboru zjevně pozná, že HAS kódující sekvence se dají manipulovat takovým způsobem, aby se produkovala alterovaná hyaluron syntáza, která je na druhé straně schopna produkce hyaluronové kyseliny, která má odlišné polymerní velikosti a/nebo funkční schopnosti. Tak např. HAS kódující sekvence může být alterována takovým způsobem, že hyaluronová syntáza má změněnou specifičnost na sacharidový substrát tak, že hyaluronová syntáza tvoří nové • Φ φφφφ ·· • · · φφφ • · ··· · φ

polymery podobné hyaluronové .kyselině, které mají vloženou jinou strukturu jako předtím neinkorporované cukry nebo deriváty cukrů. Tento nově inkorporovaný cukr by mohl vést k modifikované hyaluronové kyselině, která má funkční vlastnosti, hyaluronové kyselině, která má menší nebo větší polymerní velikost/molekulovou hmotnost nebo obojí. Odborník v oboru daných HAS kódujících sekvencí snadno sezná z tohoto popisu, že lze provést změny a/nebo substituce v HAS kódujících sekvencích tak, že požadované vlastnosti a/nebo modifikace velikosti budou zachovány.

Termín „modifikovaná struktura, jak je zde používán, znamená polyhyaluronové kyseliny, obsahující cukr nebo derivát, který se normálně nenachází v přírodně se vyskytujícím HA polysacharidů. Termín „modifikovaná distribuce velikostí znamená syntézu hyaluronové kyseliny distribuce velikostí, která se normálně nenachází na přírodním enzymu; uměle upravená velikost by mohla být menší nebo větší než normální.

Různé produkty hyaluronové kyseliny různých velikostí mají použití v oblasti podávání účinných léčiv a získávání enzymů alterované struktury, což může být kombinováno s hyaluronovou kyselinou různých velikostí. Aplikace v angiogenesi a léčení otevřených poranění jsou potenciálně rozsáhlé, pokud polymery hyaluronové kyseliny o asi 20 monosacharidech se dají připravovat v dobrých množstvích.

Jiná konkrétní aplikace pro malé oligosacharidy kyseliny hyaluronové spočívá ve stabilizaci rekombinačních lidských proteinů, používaných pro lékařské účely. Hlavním problémem s takovýmito proteiny je jejich rychlé odstraňování z krve a krátká poloviční doba biologického života. Jedním z předkládaných řešeních tohoto problému je napojit kryt

4« 4444 44 4 • · · 4 4 44

4 444 4 4 4 ·· 4 4 4 4 ·· ·44 44 444 tvořený malou molekulou, který zabraňuje odstraňování proteinu z krve v krevním oběhu příliš velkou rychlostí. Hyaluronová kyselina o velmi malé molekulové hmotnosti je velmi vhodná pro tuto roli a je neimunogenní a biokompatibilní. Hyaluronová kyselina o velké molekulové hmotnosti připojená k účinné látce nebo proteinu se může použít k zacílení rétikuloendoteliálního buněčného systému, který má endocytové receptory pro hyaluronovou kyselinu.

Pro odborníka v oboru, kterému bude poskytnut tento popis, bude zřejmé, že je mnoho cest, kterými se distribuce velikostí polymeru hyaluronové kyseliny dá pomocí hyaluronát syntézy regulovat, s cílem dosáhnout různých velikostí. Za prvé kontrola kinetiky produktu a velikostí částice se dá měnit snížením teploty, zkrácením času působení enzymu a snížením koncentrace jednoho nebo obou substrátu na bázi cukrového nukleotidu. Snížení jakékoliv z těchto proměnných poskytne nižší množství a menší velikosti produktu hyaluronové kyseliny. Nevýhody těchto přístupů jsou, že výtěžek produktu bude také klesat a může být obtížné dosáhnout reprodukovatelnosti každý den a pro každou várku.

Za druhé, alterace vnitřní schopnosti enzymu syntetizovat produkt na bázi kyseliny hyaluronové ve velkém množství. Změny proteinů se dají dosáhnout rekombinační DNA technologií, včetně substituce, delece a adice specifických aminokyselin (nebo dokonce zavedení ochranných skupin při metabolíckém zpracování). Takovéto změny, které vedou k vnitřně pomalejšímu enzymu, mohou pak umožnit reprodukovatelnější kontrolu velikostí hyaluronové kyseliny kinetickými prostředky. Finální distribuce velikostí hyaluronové kyseliny je determinována určitými charakteristikami a vlastnostmi enzymu, které nezávisí na

	• • · •	• · · • · ···	·· · • · · · • · ·
• ·	···	• · ·· ·	9* 4 4

konkrétních aminokyselinách v sekvenci. Mezi 20% zbytku absolutně konzervovaných mezi streptokokovými enzymy a eukaryotickými hyaluronát syntázami, existuje soubor aminokyselin v unikátních pozicích, který kontroluje nebo má velký vliv na velikost polymeru hyaluronové kyseliny, která může enzym vyrobit. Specifické změny v jakémkoliv z těchto zbytků mohou mít za následek modifikovanou HAS, která produkuje HA produkt s modifikovanou distribucí velikostí. Umělé biotechnologicky inženýrské změny v seHAS, spHAS, pmHAS nebo cvHAS, které snižují vnitřní velikost hyaluronové kyseliny, kterou enzym může vyrobit před tím, že se hyaluronová kyselina uvolní, poskytuje silné prostředky k výrobě hyaluronové kyseliny menší nebo potenciálně větší velikosti ve srovnání s nativním enzymem.

Na závěr je třeba říci, že větší molekulová hmotnost hyaluronové kyseliny se dá snížit degradací specifickými hyaluronidázami, které pomohou vyrobit hyaluronovou kyselinu s menší molekulovou hmotností. Tato praxe, nicméně, je velmi obtížná a po stránce reprodukovatelnosti a experimentátor musí produkt přečišťovat a odstraňovat hyaluronidázu a nežádoucí produkty digesce.

Strukturně modifikovaná hyaluronová kyselina není principiálně odlišná od hyaluronové kyseliny s pozměněnou distribucí velikostí, provedenou změnou určitých aminokyselin ve vhodných HAS nebo spHAS. Deriváty UDP-GlcNAc, ve kterých N-acetyl skupina chybí (UDP-GlcN) nebo je nahrazena jinou chemicky použitelnou skupinou, jsou potenciálně v konkrétních případech použitelné, Silná specifika substrátu musí odpovídat konkrétnímu podsouboru aminokyselin mezí 20%, které jsou konzervované. Specifické změny, týkající se jednoho nebo více těchto zbytků tvoří funkční syntézy, které interagují ·· *·*· φ · » ··· *· · « φφφ φ · β ♦ · · φ · » · ΦΦΦ· ··» ··· φφ φφφ φφ ·« méně specificky s jedním nebo více substráty, ve srovnání s nativním enzymem. Tyto pozměněné enzymy mohou pak využívat pozměněné přírodní nebo speciální cukrové nukleotidy, které se inkorporují do cukrových derivátů, vytvořených tak, aby umožnily různé chemické použití pro následující účely: (i) kovalentní napojení specifických účinných látek, proteinů nebo toxinů na strukturně modifikovanou hyaluronovou kyselinu obecně s cílem podávání účinné látky, radiologické procedury atd. (ii) kovalentně zesíťovaně napojená hyaluronová kyselina jako taková nebo na jiném podkladu, což vytvoří gel nebo jiné trojrozměrné biomateriály s přesnějšími fyzikálními vlastnostmi a (iii) kovalentně vázaná hyaluronová kyselina k povrchu, za účelem vytvoření biokompatibílního filmu nebo monomolekulární vrstvy.

Tento vynález se také týká nových HAS, které produkují HA. S použitím různých technik molekulární biologie, byl nalezen v patogenu typu A Pasturella multocida cholery drůbeže byl nalezen gen pro novou HAS. Tato nová HAS z organismu Pasturella multocida nebo PmHAS byla klonována a ukázalo se, že je funkční v jiných druzích bakteriích. PmHAS protein polymeroval autentický HA polysacharid.

Tento sacharid produkovaný rekombinační E. coli transformovaný pomocí PmHAS je rozpoznatelný kartilážním

HA-navázaným proteinem a je citlivý na digesci HA lyázou. Obě tato činidla jsou osobám sběhlým v oboru známá jako specifická pro HA polysacharid. Také UDP-GlcA a UDP-GlcNAc byla požadována pro HA syntézy in vitro. Azido-UDP-GlcA a azido-UDP-GlcNAc, ale ne azido-UDP-Glc, specificky fotoinkorporované do PmHAS. Jako v tomto případě streptokokové HasA a Xenopus DG42, ukazuje se, že jeden polypeptidový druh, PmHAS, přenáší dvě rozlišitelné skupiny cukrů do nascentního HA řetězce.

Mnoho enkapsulavaných Gram-negativních bakterií, včetně E. coli, Neisseria meningitidis, and Hemophilus influenzae, vykazuje klastry genů odpovědné za tobolkovou biosyntézu organizovanou v operonech. Tyto operony často obsahují geny enkódující (i) enzymy požadované pro syntézu prekursorů cukrových nukleotidů, (ii) glykosyltransferázy pro polymerací exopolysacharidu, (iii) s proteiny implikované při polysacharidovém exportu. Typ A P. multocída HA capsulovaný operon obsahuje (i) KfaA analog, (ii) HA syntázu, a (iii) tečkovou UDP-Glc dehydrogenázu. Elementy Tn916 v P. multocida a kapsulární mutanty H a L nebyly integrovány přímo v HAS genu, ale spíše byly umístěny v KfaA v genovém homologu.

Tak jako existuje PmHAS v místě, kde jsou alespoň některé geny důležité pro přípravu polysacharidu, lese nebo defekt v jakémkoli z těchto kapsulových genů by mohl ovlivnit HA produkci a tvorby kapsule v Pasturella. Tudíž rušením přilehlého genu by se také mohla vyrobit vakcína. Tak např. pokud UDP-Glc dehydrogenáza je odstraněna nebo zrušena, žádný prekursorový cukr pro HA syntázu není přístupný a HA se nemůže vyrobit. Také pokud Kfa nebo jiný transportně spojený gen je zabit, pak mikrobem není vyrobena žádná provrchová HA. Tudíž produkt HA syntázy v přírodním mikrobu Pasturella, tj . HA kapsule, by bylo možné zastavit (a) přerušením tvorby prekursoru nebo za (b) přerušením polymeračního mechanismu nebo za (c) přerušením transportního mechanismu.

Na úrovni aminokyselin lze říci, že PmHAS není tak podobná jiným klonovaným HAS, jak by mohl odborník v oboru očekávat. Potenciální krátké úseky, DGS(S/T) (SEQ ID NO:19) » · · · · • » • · · · ve zbytcích 477-480 a DSD ve zbytcích 527-529 v PmHAS jsou přítomny v HasA. Jiné podobné úseky obsahující DGS lze nalézt opakovaně ve zbytcích 196-198 PmHAS. DG prvního úseku a DSD jsou konzervovány ve všech HASech. Nicméně několik absolutně konzervovaných úseků ((S/G)GPLXXY (SEQ ID NO:20), GDDRXLTN (SEQ ID NO:21), a LXQQXRWXKS(Y/F/W) (F/C)RE (SEQ ID NO:22)) nalézajících se ve všech dříve uvedených klonovaných HASech nejsou přítomny v PmHAS. Místo toho řada bakteriálních glykosyltransferáz je uložena daleko blíže k sekvencím v centrální části HAS proteinů P. multocida. Tyto enzymy, u kterých bylo již buď zjištěno nebo přepovězeno, že přenášejí GlcNAc, galaktózu nebo GalNac skupiny, představují zhruba jednu třetinu velikosti PmHAS a jejich aminokyselinové koncové sekvence leží spolu se střední částí PmHAS peptidu ve zbytcích 430-540.

Sekce prvních 420 zbytků PmHAS vykazují určitou podobnost částem savčí UDP-GalNAc:polypeptid GalNActransferázy. Tato pozorování mohou být odrazem možné doménové struktury uvnitř PmHAS. Posledních přibližně 340 zbytků v PmHAS nejsou signifikatně podobné jiným částem v databázích sekvencí. Tudíž P. multocida HAS je unikátní a je nejspíše prototypem celé nové třídy HAS.

PmHAS je zhruba dvakrát větší než streptokoková, virová nebo obratlovcům příslušející HAS - 972 versus 417-588 zbytků. Dále hydropatie lidské ploty PmHAS a jiných známých HAS jsou nepodobné. Použitím TMPRED-programu, který je dobře známý a přístupný pracovníkům v oboru na World Wide Web,

PmHAS předpovídá, že máme co činit pouze dva kandidáty transmembránových šroubovic (centrované na zbytcích 170 a

510) a oba konce proteinu mohou být umístěny v cytoplazmě.

Topologicky, tyto předpoklady vedou k představě, že jedna • · · · · I ·· ··· třetina polypeptidu P. multocida (zhruba 340 zbytků) je umístěna mimo cytoplazmu. Na druhé straně dá se předpokládat různá topologie pro jiné třídy HAS.

Analýza pomocí fuze hlásících enzymů streptokokové HAS potvrzuje, že v tomto enzymu sestávajícím za (i) dvou transmembránových šroubovic poblíž aminokyselinového zakončení, za (ii) předpokládané cytoplazmové domény, následované (iii) třemi regiony spojenými s membránou v karboxylové polovině proteinu, existují různá topologická uspořádání. Spojovací smyčky mezi regiony spojenými s membrány jsou dosti krátké (4 - 10 zbytků); z těchto důvodů hlavní část polypeptidového řetězce pravděpodobně není extra celulárně vystavena.

Následující detailní experimentální stupně a diskuse o výsledcích, potvrzují, že tento vynález opravdu vyřešil nové a unikátní PmHAS.

1. Molekulární klonování PmHAS

Nejprve byl proveden test mutageneze vkládáním Tn916 a test množení. Tn916 bylo použito k přerušení a k označení P. multocida HA biosyntetického místa. Tn element na nereplikujícím plasmidů, pAM150, byl zaveden do divokého typu encapsulovaného kmene P. multocida (ATCC číslo 15742) elektropora. Pozměněná morfologie kolonie byla nejprve sledována pouhým okem pomocí běžného osvětlení. Kmen divokého typu vytvořil velký mukoid („vlhký vzhled) kolonií, který se jevil jako iridescentní (červené a zelené zbarvení). Menší „suché kolonie postrádaly iridescenci a ty byly vybrány a očkovány. Pro druhotné hledání pro posouzení stavu enkapsulace bylo použito vybarvení čínskou tuší a mikroskopie za normálního světla. Pozice Tn elementů v mutantním chromozomu byla mapována Southernovou analýzou.

DNA sekvence v Tn-přerušených místech z několika nezávisle zvolených mutantů, byla získána přímou analýzou dideoxy sekvence značené chromozomovou DNA. Stručně řečeno chimérický DNA fragmen, sestávající z 12-kb částí Tn916 elementu a krátkého regionu P. multocida DNA generovaný Hhal digescí mutantní chromozomální DNA byl přečištěn elektroforézou na agarozovém genu (všechny divoké typy Hhal genomických fragmentů jsou méně než ekvivalentní 7 kb). Chimérický fragment sloužil jako šablona v cyklu sekvenčních reakcí využívajících 33P terminátory a Tn916 pravotočivému zakončení priméru (5^Z-GACCTTGATAAAGTGTGATAAGTCC-3^Z(SEQ ID NO:23)). Data o sekvenci byla použita k sestavení PCR primérů. Gelové čištění PCR produktů bylo značeno pomocí digoxigeninu používající vysoce výkonný a čistý High Prime systém firmy vyrobený firmou Boehringer Mannheim a dobře známý pracovníkům, kteří jsou dobře obeznámeni s tímto oborem.

Dalším stupněm byla izolace funkčního HAS lokusu. λ knihovna Sau3A částečně digestovaná divokým typem DNA byla vyrobená pomocí BamHI-štěpené ÁZap systému expresního vektoru produkovaného Stratagenem. Plakové změny byly vyhledávány hybridizací digoxigeninem značeného PCR produktu. Escherichia coli XLl-Blue MRF' byla koinfikována spolu s individuálně vyčištěným λ pozitivním klonem a pomocí fagem ExAssist, čímž se získaly fagemidy. Získané fagemidy byly trasfektovány do E. coli XLOLR buněk, čímž se získaly plasmidy.

'4

9

Získané plasmidy byly transformovány do hostitele, který je vhodnější pro produkci HA polysacharidů, kterýmžto hostitelem byl kmen BÍ8337-41 E. coli K5. Tento kmen produkoval UDP-GlcA, což je požadovaný substrát pro HA biosyntézu, který se nenachází v signifikantním množství ve většině laboratorních kmenů. Kromě toho, K5 nese mnoho jiných genů podstatných pro kapsulární transport polysacharidů v E. coli. Jiným hostitelem, který byl využit pro studium exprese, byl E. coli EV5, což je akapsulární odvozenina kmene Kl, která produkuje kapsule tvořené polysialickou kyselinou a která také nese všechny stejné obecné mechanismy transportu kapsulálního polysacharidů jako K5, přičemž nemá vysoké hladiny UDP-Glc dehydrogenázy.

Kultury transformantů E. coli s testovanými plasmidy rostoucí na plně definované živné půdě, byly testovány na produkci HA polysacharidů, jak bylo popsáno shora, s tou výjimkou, že buněčné pelety byly extrahovány 8 M močovinou, 0,01% SDS při 95°C po dobu 2 minut. Tyto HA testy a soupravy pro ně vyráběné firmou Pharmacia Biotech lne., které jsou velmi známé odborníkům v tomto oboru, využívají specifický protein vázající HA k detekci HA, koncentrací větší než nebo rovných 0,1 gg/ml. Větší množství stanovení HA úrovni bylo zprůměrováno. Koncentrace HA v bakteriálních kulturách byla normalizována s použitím diferencí v počtu buněk, měřením hodnoty A600 a prezentována byla data jako přepočtená na gg HA/ml/A600 bakterií. Jeden z plasmidů, pPm7A, s 5,8 kb inzertem odpovídal E. coli K5 se schopností produkovat ΉΑ; buňkami se samotným vektorem plasmidů neprodukovaly žádnou HA. Zkrácený derivát pPm7A obsahoval asi přibližně 3,3 kb inzert, zvaný pPmA6e, který mohl přímo biosyntetizovat ΉΑ, pokud byl transformován do E. coli K5. Z tohoto důvodu byly determinovány sekvence obou kmenů pPm7A plasmidu odpovídající pPmA6e DNA. Byl nalezen samostatný komplet ze zbytku 972 ORF, který nazýváme PmHAS a který je znázorněn v SEQ ID NO:1.

Odpovídající nukleotidové sekvence je znázorněna v SEQ ID

NO: 2.

Poté bylo provedeno fotoafinitní značení nativní HAS P.multocida. Radioaktivně značené analogy UDP cukrů, [32P]azido-UDP-GlcA (3 mCi/μΜοΙ) a [32P]azido-UDP-GlcNAc (2,5 mCi/μΜοΙ), byly připraveny a čištěny jak je popsán o v literatuře a jak je známo odborníkovi v oboru. Preparáty membrán z P. multocita divokého typu v 50 mM Tris, 20 mM MgCl₂, pH 7, byly inkubovány buď spolu se sondou (finální koncentrace 20 μΜ) po dobu 30 sekund na ledu před ozářením ultrafialovým světlem (254 nm, 90 sekund). Proteiny pak byly vysráženy 5% kyselinou trichloroctovou před analýzou elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Pokud byl vynechán stupeň ozařování, nebylo vpraveno žádné radioaktivní značení. Pro kontrolu specifičnosti byl spolu se sondou a membránami inkubován 10 molární přebytek normálního UDP cukru. Jako další kontrola byl také použit [32P]azido-UDP-Glc 3 mCi/μΜοΙ).

Přibližně 8 χ 10⁴ transformantů obsahující Tn připravených v několika várkách mutageneze, bylo testováno na rozdíly v morfologii kolony. Podle světelné spektroskopie s použitím indické tuše nevykazovaly buňky z malých neiridescentních kolonií (n = 4) žádné zjistitelné tobolky (akapsulární), zatímco buňky z středně iridescentních kolonií (n=8) vykazovaly tobolky velikosti 10 - 25% průměru s porovnáním s divokým typem (mikrokapsulární). Dva z akapsulárních mutantů, které byly pojmenovány H a L, které měly Tn elementy mapující stejnou HindlII nebo BstXI • 9 99 9 genomické fragmenty, revertovaly na divoký typ na morfologii kolony divokého typu v poměru asi na 10-3. Tn element v každém revertantu byl odstřižen z původní pozice a znovu vsazen na jiné nové umístění, jak bylo posouzeno pomocí Southernovy analýzy; na druhé straně všechny akapsulární subkolonie si podržely Tn element na původním místě. U membránových preparátů z mutantů buněk HA nebyla zjištěna žádná signifikatní aktivita HAS, zatímco z buněk divokého typu (méně než nebo rovno 0,7 versus 120 pmol transfer GlcA/ml protein/h) byla zjištěna výrazná HAS aktivita. Tato zjištění naznačují, že Tn elementy v mutantech H a L byly v každém případě odpovědné za přerušení biosyntézy HA.

Za účelem přemostění mezery mezí inzertními místy Tn dvou akapsulárních mutantů bylo provedeno PCR s pomocí mutanta L chromozomální DNA matrice s primérem odvozeným od sekvence na přerušovacím místě mutanta H, PmHF (5'CTCCAGCTGTAAATTAGAGATAAAG-3 ' (SEQ ID NO: 26) a priméru odpovídajícímu levému zakončení Tn916 TnL2 (5'GCACATAGAATAAGGCTTTACGAGC-3' (SEQ ID NO:27)). Specificky bylo získáno přibližně 1 kb PCR produktu; alternativně žádný produkt nebyl vytvořen, pokud PmHR (inversní komplement PmHF) nebo Tn916 pravotočivý primér byl substituován. PCR produkt byl použit jako hybridizační sonda k získání funkční kopie P. multocída HAS.

Šest pozitivně hybridizovaných plaků bylo nalezeno po screeningu přibližně 10⁴ plaků a tyto fágy byly konvertovány na plasmidy. Jeden plasmid pPm7A byl nalezen, který mohl přímo v E. coli K5 produkovat HA in vivo (20 pg HA/ml/Aeoo bakterií). E. coli K5 s kontrolními plasmidy neprodukovala HA (méně nebo rovno 0,05 gg HA/ml/A_6Oo) · E. coli XLOLR or E.coli • 4 · · 4 · • · · • 4 9 tt • 4 • 44 • 44

EV5 buněk (ve kterých chyběla UDP-Glc dehydrogenázová aktivita) neprodukovala HA dokonce když obsahovala pPm7A plasmid (méně nebo rovno 0,05 gg HA/ml/A₆₀₀) . Tyto genetické důkazy naznačují, že inzerce pPm7A neenkóduje funkční UDP-Glc dehydrogenázu jako enzym.

Zkrácený derivát pPm7A plasmidu s nejmenší inzerční schopností přímé biosyntézy HA (85 gg HA/ml/A_6Oo K5 bakterie) pPmA6e, obsahující jeden komplet ORF enkódující zbytek 972 proteinu, jak je ukázáno v SEQ ID NO. 1. V SEQ ID NO. 1 není přítomen žádný běžný promotor, ale je tam předpověděný ribosom vážící se k místu značenému v tučných písmenech („vystředěné na nukleotidech -10 až -7 a dvěma předpokládaným t ran smemb ráno vým regionům předpověděným pomocí TMPRED jsou podtrženy (zbytky 162 - 182, a 503 - 522). PmHAS SEQ ID NO. 1 je dvakrát tak velká jako streptokoková HasA. Tento protein představuje HA syntézu z P. multocida, PmHAS. Předpověděný Mr je 111,923 a

Tato PmHAS byla použita jako dotaz při rešerších BLASTP na proteinové sekvence v databázi. Centrální část PmHAS (zbytky 436-536) je nejvíce homologní bakteriálním glykosyltransferázám z široké řady druhů, včetně streptokoků, Vibrio, Neisseria a Stafylokokus, které tvoří exopolysacharidy nebo sacharidové části lipopolysacharídů (nejmenší jsou pravděpodobnosti 10'²² - 1O~¹⁰ jak je ukázáno na obr. 1. Obrázek 1 graficky znázorňuje rozložení sekvenci P. multocida HAS a jiných glykosyltransferáz. Rozložení MULTALIN ilustruje, že centrální region PmHAS (zbytky 436-536) je nejvíce podobný amino-terminálním částem různých enzymů, které produkují jiné exopolysacharidy (Streptococus thermophilus Epsl; Type 14 S. pneumoniae Cpsl4J) nebo ·· ·· · φ φφ » · · · φ « φ φ φ · · φ φ • Φ ··· φφ ··· sacharidové skupiny lipopolysacharidů (Η. Influenzae LgtD homology). Pouze několik z možných příkladů je znázorněno na obr. 1. S. pyogenes HasA (zbytky 61-168) má určitou omezenou podobnost tomuto znázorněnému regionu PmHAS.

Nejpozoruhodnější podobnosti jsou DGSTD (SEQ ID NO:28) a DXDD (SEQ ID NO:29) skupiny. Neočekávaně bylo zjištěno, že není žádná výrazná celková podobnost PmHAS se streptokokovou, virovou nebo obratlovcovou HAS s HASA, která má nejmenší pravděpodobnost 0,33. Jenom jeden krátký region streptokokové HasA souhlasil s PmHAS určitým způsobem a je znázorněn na obr. 1.

Několik segmentů první poloviny PmHAS je také podobných částem savčí UDP-GalNAc:polypeptide GalNAc-transferázy a enzymu, který iniciuje Q-glykosylaci proteinů mucinového typu s nejmenší pravděpodobností, která je přibližně IO³, viz obr. 2. Jak je znázorněno na obr.2, pořadí v sekvenci ve zbytcích 342-383 PmHAS je nejvíce podobné zbytkům 362-404 savčí UDPGalNac:polypeptidu GalNAc transferázy. Jak na obr. 1, tak na obr. 2 jsou identické zbytky označeny tučně a podtrženy a shoda symbolů je označena vykřičníkem, buď I nebo V; #, přičemž jde o jakýkoliv N, D, E nebo Q; %, nebo F nebo Y, Klastry kyselých zbytků jsou velmi konzervovány ve všech sekvencích.

Parciální ORF (27 zbytků) pořadí v PmHAS je velmi podobné amino zakončení několika UDP-Glc dehydrogenáz s bakterií včetně E. coli, Salmonella typhímurium, a Streptococcus pneumoniae (67-74% identita). Výrazné omezení v původním pPm7A klonu by podle čekávání mělo mít za důsledek kompletní ztrátu dehydrogenázové aktivity. Jiné • 4 • 4 4

4 4 44 « * <4 4 4 · 4 4

9 4 4 4 ·* 4·4 44 4 přadí ORF (623 zbytků) v PmHAS je velmi homologní E. coli K5 KfaA proteinu s nejmenší pravděpodobností 10~⁵², přičemž tento protein potenciálně způsobuje transport kapsulárního polysacharidu ven z buňky.

Předpověděná velikost 972 zbytků (112kDa) pro PmHAS byla potvrzena fotoafinitním značením preparátu membrány z divokého typu P. multocida. Obě sondy [32P]azido-UDP-GlcA a [32P]azido-UDP-GlcNAc byly fotoinkorporovány do přibližně 110 kDa proteinu způsobem, který je závislý na UV záření. Obr. 3 je fotoafinitní značení PmHAS s UDP-cukernými analogy. [32P]azido-UDP-GlcA a [32P]azido-UDP-GlcNAc byly inkubovány s preparáty membrány (45 gg proteinu) izolovanými z divokého typu P. multocida a ozářeny UV světlem. Autoradiogramy (5 denní expozice) 10% SDS-PAGE gelů jsou znázorněny na obr. 3.

Obě sondy fotoznačení a přibližně 110 kDa protein při UVzávislé metodě („-„). Za účelem posouzení specifity fotoinkorporace byl zpracován stejným způslobem paralelní vzorek, s tím rozdílem, že reakční směs obsahovala desetinásobný přebytek neznačeného kompetitoru (UDP-GlcNAc nebo UDP-GlcA, resp. označení „+). Pásy intenzit se ve srovnání s označením snížily. Standardy jsou značeny v kDa.

Konkurence s odpovídajícími neznačenými prekursory přírodních UDP-cukrů se snížila rozsah fotoinkorporace sondy.

V paralelních experimentech bylo zjištěno, že [32P]azido-UDPGlc, což je analog normálních HA prekursorů, tento 110 kDa protein neznačil. Dále je třeba uvést, že membrány, odvozené od Tn mutantů, neměly buď žádné nebo měly velmi nízká množství azido-UDP-GlcA fotoinkorporace v tomto proteinu. Jak ukazuje obr. 4, membránové preparáty (60 gg proteinu) ·· · ·· φφφφ • φ φ • φ · · · • φ · • · φ

Μ ··· • Φ

Φ Φ • Φ

Φ Φ

Φ Φ

Φ Φ z divokých typů (W) nebo různých akapsulárních Tn mutantů (A, G, nebo H) byly fotograficky značeny pomocí [32P]azido-UDPGlcA. Region autoradiogramu v oblasti přibližně 110 kDa proteinu je znázorněn na obr.4. Není vidět žádná fotoinkorporace ve vzorcích A a G. Malý rozsah fotovybarvení v H vzorku je důsledkem nízkého reverzního poměru, který byl pozorován u tohoto konkrétního mutanta. Velikost fotoafinity značeného proteinu ve vzorku W odpovídá dobře předpověděnému M_r klonovaného PmHAS ORF.

Membrány odvozené od E. coli SUR.E buněk obsahující pPmHAS plasmid, ale ne vzorky z buněk s vektorem pKK223-3 samotné, syntetizovaly HA in vitro, pokud byly dodány spolu s oběma UDP GlcA i UDP-GlcNAc (25 versus méně nebo rovno 1,5 pMol GlcA transferu/mg protein/hodinu). Žádná inkorporace [¹⁴C]G1cA nebyla pozorována, jestliže byl vynechán UDP-GlcNAc nebo jestliže byly ionty dvojmocného kovu chelatovány pomocí EDTA. HAS aktivita, odvozená od rekombinační HAS, byla podobná aktivitě enzymu, získaného z membrán P. multocida divokého typu, protože Mn²⁺ stimuloval ale nejméně desetkrát větší aktivitou než Mg²⁺.

Kultury nebo rekombinační E. coli byly také testovány na přítomnost HA polysacharidu s použitím radiometrického testu využívajícího značený HA vázající protein. E. coli K5 s pPmHAS, produkované 460 pg HA/ml/A₆oo· K5 buňky s pKK223-3 vektory samotným neprodukovaly HA (méně nebo rovno 0,05 pg HA/ml/A600. Pro srovnání, divoký typ P. mutocida množený ve stejném prostředí, produkoval 1100 pg HA/ml/ΑβΟΟ. E. coli K5 s pPmHAS produkovalo takové hladiny HA, že buňky přecházely na enkapsulované. Jak je znázorněno na obr. 5, panel A, fotomikrografy rekombinační E. coli vybarvené indickou tuší • 44

4 4

444 (1000 násobné zvětšení) potvrdily, že E. coli K5 buňky s pPmHAS produkují výrazné kapsule, které se jeví bílé okolí kolem buněk.

Průměr kapsule rekombinačního kmene byl přibližně 0,2 0,5 gm (předpokládá se, že velikost bakteriální buňky je 0,5 μιη) . Tato kapsule nemohla být odstraněna ani působením ovčí testikulární hyaluronidázy ani lyázy streptomyces HA, Jak je znázorněno na obr. 5 panel B, kapsulární materiál byl odstraněn z E. coli K5 (pPmHAS) buněk krátkým ošetřením lyázou streptomyces HA. Tudíž PmHAS řídí polymeraci HA polysacharidů.

Jak bylo zjištěno při spektroskopii při obyčejném světle ani nativní K5 hostitelský kmen, ani transformanty obsahující pKK223-3 vektor, nevykazují snadno pozorovatelné kapsule. K5 buňky s pPmHAS byly také považovány za enkapsulované podle hustoty po odstředění bujónu. Rekombinační buňky, plovoucí na povrchu 58% percollova polštáře, zatímco vektorem kontrolované buňky nebo hyaluronidázou ošetřené rekombinační buňky se v percollově polštáři srážely.

Plasmid p/PmHAS v E. coli K5 je první generační systém pro výrobu rekombinační HA s PmHAS; jiné optimalizované vektory a/nebo jiní hostitelé mohou poskytovat větší výtěžky a tyto další optimalizované vektory a/nebo hostitelé se zde předpokládají a patří do rozsahu tohoto vynálezu. Odborník v oboru, který má k dispozici tento popis, je schopen takové vektory a/nebo hostitelé optimalizovat.

2. Enzymologická charakterizace PmHAS • · ·♦ 4444 44 4 ·· ·· 4 4 4 4 4 44 • 4 44444 44 4 • 4444 4444 4

4 44 4444

444 444 44 444 44 444

Protein byl stanoven testem s navázaným Coomassie barvivém, s použitím standardního albuminu z hovězího séra.

Divoký typ P. multocida (American Type Culture Collection 15742), což je kmen vysoce virulentní vůči krůtám, který tvoří velmi mukoidní kolonie, byl udržován na inřuzním prostředí mozek/srdce za aerobních podmínek při 37°C. Zde popsanou mutagenezní metodou s Tn916 inzercí byl vytvoen akapsulární mutant tohoto kmene, který tvořil menší „sušší kolonie a byl pojmenován TnA.

Z P. multocida byly připraveny upravenou metodou pro přípravu HA syntázy z E. coli celé membrány s rekombinačními plasmidy obsahujícími hasA. Buňky byly množeny při živém promíchávání v fázi mid-log (0,4-0,8 A600) a poté byla pro odstranění kapsulí přidána ovčí testikulární hyaluronidáza (Sigma Type V, 20 units/mL finál). Po 40 minutách byly buňky ochlazeny na ledu a sklizeny pomocí odstředění (2000Xg po dobu 15 minut). Buňky byly dvakrát promyty PBS opakovaným rozmícháním a odstředěním a buněčná sraženina mohla být uskladněna při -80°C. Veškeré následující kroky byly prováděny na ledu, pokud není uvedeno jinak

Buňky byly opět rozmíchány odpipetováním v množství 1/400 v poměru k původnímu objemu kultury bylo přidáno 20% sacharóza a 30 mMol Tris, pH bylo 8,0, obsahové inhibitory proteázy pepstatin a leupeptin. Buněčný rozklad byl prováděn s použitím lysozomové digesce (přidání 4 mg/ml enzymu v 0,1 M EDTA, v objemu 1/10 počítáno na rozmíchaný objem a výsledná směs byla inkubována 40 minut, poté následovalo ultrazvukové narušení (nastavení intenziny 3, 3 cykly po 30 sekundách, zahřívací systém W-380 s mikrosondou). Před ultrazvukovým stupněm byl ke směsi přidán thioglykolát sodný, (finální koncentrace 0,1 mMolu na litr) a následně byl přidán

•	• ♦··	9999	99
• ·	9 ·	9	9	9	9 9
•	•	9	9	9 99	9 9
•	9	9 9	9	9	9 9 9
•	9	9	9	9	• ·
• · ·	999		9 9	999	99	9

fenylmethalsulfonylfluorid. Ve všech zbývajících manipulacích PBS také obsahovalo čerstvě přidaný glykolát ve stejné koncentraci.

Lysat pak byl ošetřen Dnázou Rnázou (1 gg/ml v každém případě 10 minut při 4°C) a buněčný debriv byl odstraněn nízkorychlostním odstředěním (100000 x g po dobu 1 hodiny). Supernatantová frakce rozpuštěna 6x s PBS a membránová frakce byla rozdrcena ultracentrifugací (lOOOOOxg po dobu 1 hodiny). Sraženina byla dvakrát promyta s opakovaným rozmícháním v PBS s obsahem 10 mM na litr MgCl2, s následující ultracentrifugací. Pro získání membránových preparátů používaných při testech na specifitu vůči kovům nebylo, používáno MgClž a bylo nahrazeno 0,2 mM na litr EDTA v průběhu promývacích stupňů. Membránové preparáty byly rozmíchány v 50 mM Tris, pH 7, a 0,1 mM thioglykolátu, při koncentraci 1-3 mg/ml proteinu a ukladněny při -80°C.

Aktivita HA syntázy byla rutinním způsobem detekována vložením zavedením radioaktivního značení, odvozeného od prekursoru cukrového nukleotidu (UDP-[14C]GlcA (0,27 Ci/mmol, ICN), na produkty s vyšší molekulovou hmotností. Různé testovací pufry, popsané na legendách k obrázkům také obsahovaly 0,3 mM/Ι DTT. Testy (100 μΐ finálního objemu, byly zahájeny přidáním membrán do reakční směsi a inkubací při 37°C. Po jedné hodině byla reakce ukončena přidáním SDS (finálně 2%) a promícháním. Pro kinetické studie byly produkt a prekursory odděleny stupňovitou papírovou chromatografii (Whatman 3M s 65:35 ethanol/1 M ammonium acetate, pH 5,5). HA polysacharid byl na tomto druhu chromatografického papíru eluován pomocí vody a hodnocen kapalnou scintilací. Testy byly obvykle prováděny za • · ······ ·· ·< ·· 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 999 9 9 « · ·♦ ···· 999 999 99 999 99 999 podmínek, ve kterých nebylo konzumováno více než 5% prekursorů omezenými množstvími enzymu.

kontrolní experimenty, které byly prováděny za účelem inkorporace do autentických HA zahrnovaly vynechání požadovaného prekursoru druhého cukrového nukleotidu nebo digesci pomocí specifické hyaluronidázy ze streptomyces hyalurolyticus. Gelová filtrační chormatografie pomocí preparátu Sephacryl S-200 (Pharmacia) v PBS byla použita z toho důvodu, aby bylo možné posoudit molekulovou hmotnost radioaktivně značeného polymeru, vytvářeného in vitro za optimalizovaných testovacích podmínek. Tyto vzorky byly ošetřeny stejně jako se to provádí pro papírovou chromatografii, s tou výjimkou, že po ukončení byly zahřátý na 95°C na dobu 2 minut a přečištěny odstředěním (15000Xg po dobu 7 minut) před aplikací na kolonu.

K chelatací přítomných kovových iontů byla použita EDTA (0,2 mM), což bylo prováděno proto, aby se v testovací směsi ověřila závislost HAS aktivity na přítomnost kovů. Byly testovány různé dvojmocné kovy, včetně Mg, Mn, Cu, Co a Ni, a jejich chloridy. Hodnoty K_m substrátu byly odhadnuty titrací jedné koncentrace cukrového nukleotidu, přičemž ostatní radioaktivně značené prekursory byly drženy na zhruba podobné konstantní koncentraci a podobném sycení. Pro tyto testy byly použity UDP-[3H]GlcNAc (30 Ci/mmol, NEN) , UDP-[14CjGlcA prekursor.

P. multocida produkují znadno viditelné extracelulární

HA kapsule, a jelikož streptokoková HasA je trans fmembránový protein, byly testovány membránové preparáty patogenu krůtí cholery. Při prvních testech vykazovaly membránové frakce • · • · · * · odvozené ze samotného ultrazvukování velmi nízké hladiny, pokud UDP-GlcNAc-závislá UDP-[14C]GlcA inkoroporovala do HA [přibližně 0,2 pmol GlcA transfer (pg proteinů)-lh-1] pokud bylo testováno za podmínek podobných těm, které jsou vhodné pro měření streptokokové HAS aktivity. Enzym z E. coli s rekombinačním hasA plasmidem byl také určen k izolaci jako první. Tyto výsledky byly v kontrastu se snadně detekovatelnými množstvími získanými ze streptokoků s jednoduchými metodami.

Alternativní protokol přípravy s použitím ledem chlazeného lysozymu za přítomnosti inhibitorů proteázy ve spojení s ultrazvukovým ošetřením umožnil získání výrazné HAS aktivity z obou druhů gramnegativní bakterie. Specifické aktivity 5-10 pmol GlcA transféru (μς proteinů)-lh-1 byly rutinně získány pro surové membrány divokého typu P. multocida pomocí nové metody. V nepřítomnosti UDP-GlcNAc, teoreticky bez radioaktivity (méně než 1% identický test s oběma prekursory cukrů) z UDP-[14C]GlcA byl inkorporován do materiálu s vyšší molekulovou hmotností. Membrány, připravené z akapsulárního mutantu, TnA, nevykazovaly žádnou detekovatelnou HAS aktivitu, pokud byly doplněny oběma prekursory nukleotidových cukrů. Analýza gelovou filtrací s použitím kolony Sephacryl S-200 ukazuje, že molekulová hmota většiny 14C-značených produktů syntetizovaných in vitro je větší nebo rovno 8 x 104 Da, jelikož tento materiál eluuje v prázdném objemu; takováto hodnota odpovídá HA molekule sestavené z alespoň 400 monomerů. Tento produkt je také senzitivní vůči degesci hyaluronidázou streptomyces, ale rezistentní vůči zpracování pronázou.

• ·* «·« ·· 9 9 4

9 9 4 44 <9 ·

9 4 4 • 4 4 4 94 44 ·4 4

Parametry při provádění HAS testů byly měněny, aby se maximalizovala inkorporace UDP cukrů do polysacharidů pomocí membrán P. multocida. Streptokoková HasA vyžaduje Mg²⁺ a proto tento iont kovu byl zahrnut hned v prvních testech membrán P. multocida. P. multocida HAS byla relativně aktivní od pH 6,5 do pH 8,6 v pufrech typech Tris s optimem při pH 7, obr. 7. Obr. 7 ukazuje závislost aktivity P. multocida HAS na pH. Inkorporace [14C]GlcA do HA polysacharidů katalyzovaná membránami (38 gg proteinu) byla měřena v reakci pufrovanou při různých pH hodnotách (50 mM Tris/2-(N-(morfolino)ethansulfonová kyselina, bis-Tris/HCl, nebo Tris/HCl; žádný výrazný iontově specifický efekt v pufru nebyl zaznamenán). Inkubační směs také obsahovala 20mM MgCl₂, 120 μΜ UDP-GlcA (4,5 x 104 dpm/test), and 300μΜ UDP-GlcNAc. Inkorporační test s použitím optimálního pufru, pH 7 Tris, byl nastaven na 100% aktivitu. Bylo zaznamenáno široké optimum pH, pohybující se kolem neutrality.

Závislost HAS aktivity na inkubační době byla při neutrálním pH nejméně po dobu 1 hodiny lineární. Enzym P. multocida byl zjevně méně aktivní při vyšších iontových sílách, neboť přidání 100 mM NaCl do reakčního roztoku,obsahujícího 50 mM Tris, pH 7, a 20 mM MgCl₂ snižovalo inkorporaci cukru o zhruba 50%.

Specifická reakce P. multocida HAS na kovy při pH 7 je uvedena n obrázku 8. Obr. 8 znázorňuje závislost HAS aktivity na kovech. Produkce HA byla měřena za přítomnosti různých koncentrací iontů Mg (kolečka) nebo Mn (čtverečky). Membrány (46 gg proteinu), promyté předem 0,2 mM EDTA, byly inkubovány ve směsi kovových iontů v 50 mM pufru Tris, pH 7, 120 μΜ UDPGlcA (4,5 x 104 dpm/test) a 300 μΜ UDP-GlcNAc po dobu 1 • · · ·< ···· ·· • · · · · · • 4 4 44 4 4 • · · · 4 · • · 4 4 4 hodiny. Z každého bodu bylo odečteno pozadí, což je hodnota bez přítomnosti kovu (22 dpm). Mn se ukázal být účinnější než Mg.

V podmínkách bez přítomnosti kovů a za přítomnosti EDTA nebyla detekovatelná žádná inkorporace radioaktivně značeného prekursoru do polysacharidů (<0,5% maximálního signálu).

Ionty Mn²⁺ poskytovaly vyšší stupně inkorporace při nižších koncentracích testovaných kovů (porovnávány byly Mg, Mn, Co, Cu and Ni). Mg²⁺ poskytoval asi 50 % stimulaci Mn²⁺ ale při 10-krát vyšších koncentracích. Co²⁺ nebo Ni²⁺ při 10 mM podporovalo nižší úrovně aktivit (20 % nebo 9 % 1 mM Mn²⁺ v testovaných vzorcích), ale membrány testované v přítomnosti 10 mM Cu²⁺ byly inaktivní. Přesto, přimíchání lOmM Cu²⁺ a 20 mM Mg²⁺ k membránovému preparátu mělo za následek, že většinou nedošlo k vůbec žádné inkorporaci značené substance do polysacharidů (pouze hodnoty < 0,8 % Mg).

Počáteční charakterizace P. multocida HAS byla provedena v přítomnosti Mg²⁺. Vazebná afinita enzymu k vlastním prekursorům sacharidového nukleotidu byla posouzena měřením hodnoty K_M. Inkorporace [14C]GlcA nebo [3H] GlcNAc do polysacharidů byla monitorována při různých koncentracích UDP-GlcNAc nebo UDP-GlcA, Obr. 9 and 10, respectively.

Obr. 9 znázorňuje závislost HAS aktivity na koncentraci UDP-GlcNAc. Membrány (20 pg proteinu) byly inkubovány při zvyšovaných koncentracích UDP-GlcNAc v pufru s obsahem 50 mM Tris, pH 7, 20 mM MgCl₂, and 800 μΜ UDP-GlcA (1,4 x 10⁵ dpm ¹⁴C) 1 hod. V každém bodě byla odečtena radioaktivita pozadí (identický test, ale bez přídavku UDP-GlcNAc). Nejvyšší specifická inkorporace do HA (v průměru přibližně 780 • · ·♦ ···· ·· · ·· ·· · · « · · ·· • · ·«··· « · · • · · · * · · · · · • * · · ···· ·*· ··· ·· «·· ·· tu dpm/hodinu) při titraci byla definována Vmax při normalizaci na hodnoty do 100 %.

Obr. 10 znázorňuj závislost HAS aktivity na koncentraci UDP-GlcA. V experimentech, které byly paralelně prováděny, Obr. 9, byla inkubace s 1 irM UDP-GlcNAc (2,7 χ 10⁵ dpm ³H) za provedeny za stejných všeobecných podmínek a v přítomnosti stejných pufrů při zvyšovaných množstvích UDP-GlcA. V každém bodě byla odečtena radioaktivita pozadí (test bez přídavku UDP-GlcNAc). Výsledky jsou znázorněny na Obr. 9. Specifická inkorporace při Vmax byla v průměru přibližně 730 dpm/hod.

V pufrech obsahujících Mg2+ byly zjištěné hodnoty K_M ~20 μΜ pro UDP-GlcA a ~75 μΜ pro UDP-GlcNAc, přičemž tyto hodnoty byly získány pomocí Hanes-Woolfových grafů (Vynese se [S]/v.proti [S]), získaných z výsledků titrace, uvedených na Obr. 11. Obr. 11 znázorňuje odhad Vmax a K_M podle HanesWoolf ova diagramu. Naměřené hodnoty specifických inkorporací, která byla použita pro vytvoření Obr. 9 (čtverečky) a Obr. 10 (kroužky) byly vyneseny do grafu jako funkce závislosti [S]/v na [S]. Paralelní rozptylové plochy, které odpovídají 1/Vmax, indikují, že maximální rychlosti pro prekursory sacharidových nukleotidů byly ekvivalentní. Osa x ukazuje, které hodnoty -K_M poskytly K_M hodnoty 7 5 a 20 μΜ pro UDP-GlcNAc a UDP-GlcA.

Hodnoty Vmax pro oba cukry byly stejné, protože plochy byly ekvivalentní. Ve srovnání s výsledky z testů s Mg2+, je hodnota K_M pro UDP-GlcNAc vyšší o asi 25-50 % do koncentrace ~10⁵ μΜ a Vmax je vyšší asi 2-3 krát v přítomnosti Mn2+. Zmíněné hodnoty jsou uvedeny v tabulce I.

TABULKA I ·· ··«** • · ♦ ··· • · · • · · • · ··* ·· ·

promytí membrány	testovaný iont	ΚΜ(μΜ)	Vmax(pmol/h)
Mg	Mg	75±5	114+36
EDTA	Mg	55±25	98±1
EDTA	Mn	105±5	380±70

Jak bylo dříve uvedeno, HA capsule patogenů P. multocida a S. pyogenes jsou virulenci ovlivňujícími faktory, které poskytují patogennímu organizmu možnost potlačit obranu hostitele. Enzym HA syntáza z různých bakteriálních zdrojů využívá UDP-sacharidů, ale nemá co do hodnot pH a závislosti na iontech kovů K_M, odlišné kinetické optimum. Oba enzymy jsou nejaktivnější při pH = 7; nicméně, funkce PmHAS funguje lépe na alkalické straně tohoto pH optima, nejméně do pH = 8,6. Na druhé straně, spHAS podle některých zpráv vykazuje vyšší aktivitu při mírně kyselém pH a je relativně inaktivní nad pH 7,4. Enzymy P. multocida, v podmínkách in vitro testu, využívají prostředí Mn2+ účinněji než Mg2+.

PmHAS váží UDP-sacharidy pevněji než streptokoková HasA. Naměřené hodnoty K_M pro PmHAS v surových membránách jsou pro každý substrát asi 2-3 krát nižší, než hodnoty, získané pro HAS, nacházející se v streptokokových membránách.

3. Použití PmHAS k vakcinaci

DNA sekvence PmHAS může být také použita ke generování potencionálních zúžených vakcin kmenů bakterií P. multocida po vyřazení normálních mikrobiálních genů homologní p kombinací s přerušenou verzí. Dále, PmHAS DNA sekvence umožňuje vytvořit diagnostický bakteriální typovací sondy pro

* · «·	β·9·	• 9
	··	4 «	•	» ·	9
	•	e ·	9·*	• 9
	•	• · ·	• 9	• 9
	•	• 9	9	• 9
• 4	« ··	··	··*	99	9'

příbuzné typy P. multocída, které jsou zemědělskými patogeny, krůt, dobytka, ovcí a prasat.

Existuje alespoň 5 různých typů bakteriálního patogenu P. multocída s různými kapsulárními antigeny. Krůtí cholera nebo ptačí pasteurolosa, která je většinou způsobena kmeny typu A, je široce rozšířená, ekonomicky způsobuje v komerčních chovech drůbeže veliké škody. Akutní rozvoj krůtí cholery se obyčejně detekuje pouze tehdy, pokud ptáci již kolabují a symptomy se často objevují několik hodin před smrtí. Jelikož není mnoho známo o molekulárních základech, na kterých je založena virulence P. multocída, zjevně jeden z virulentních patogenních kmenů vykazuje polysacharidové kapsule a jejich kolonie se projevují mukoidní nebo „vlhkou morfologií na agarových destičkách. Bílé krvinky mají potíže s inaktivací bakterií a komplementární komplex nemůže kontaktovat bakteriální membránu, aby provedl rozklad. Hlavní komponent kapsule Carterova typu A P. multocída, který je odpovědný za zhruba 90-95% onemocnění krůtí cholerou, je polysacharid HA a HA nevykazuje imunitní odezvu v případě všech membrán živočišné říše. Dokonce pokud se jakási imunitní odezva objevila, byl zde problém pro ptáky, způsobený reperkusí autoimunitních reakcí. Kmeny typu A P. multocída jsou také hlavním viníkem plicní pasteurolozy prasat, hovězího dobytka a horečky skotu.

Dva další kapsulární typy P. multocída, typ D a typ F jsou méně dobře prostudovány, ale jde o významné patogeny v Severní Americe. Typ F je izolován z 5-10% případů krůtí cholery. Typ D je také způsoben pneumonií u dobytka, ovcí a prasat. Izoláty z pneumotických lesií těchto domácích zvířat byly analyzovány z kapsulí jednotlivých typů a asi 25-40% byl typ D a zbytek byl typ A. Dále, kmen typu D je zejména *· ···· ··· ··· ^e< přítomen při atrofické rýmě prasat. Kapsule těchto typů D a F mikrobů jsou sestaveny z různých polysacharidů s neznámou strukturou, ale jsou zjevně podobné chondroitanu, časté molekule v těle obratlovce. Obecná struktura kostního chondroitanu opakuje (βΐ,4)Θ1οΑ(β1,3)GalNAc jednotky a je velmi podobná HA. Není překvapením, že proto polysacharidy typu D a F jsou málo imunogenní.

Obvykle protilátky proti povrchovým složkám bakterie, odvozených od předchozích infekcí (nebo vakcinace) jsou významným prostředkem pro bílé krvinky, aby jim umožnily připojit se k bakterii v průběhu fagocitózy. Tento prostředek obvykle způsobuje imunitní odpověď extrémně účinnou při boji proti chorobě. Tudíž přítomnost kapsuli, sestasvených z neimunogenních polymerů, jako HA nebo s cukry podobné chondroitanu, snižují účinnost ve všech fázích obrany hostitele. Streptococcus pyogenes, lidský patogen, také využívá HA kapsuli jako molekulární „mimikry, aby sám sebe chránil před obranou hostitele. Akapsulární S. pyogenes mutanti nemohou přežívat v krvi a jsou 100 méně virulentní, než divoký typ u myši. Mnoho virulentních kmenů E. coli využívá kapsule obsahující jiné polysacharidy, které předstírají molekuly hostitele a chrání buňku před rozpuštěním imunitním systémem. Kapsule všech těchto patogenních bakterií jsou chytrými evolučními adaptacemi, které musejí být překonány, aby bylo možné proti nemoci bojovat.

Předchozí výzkumy se zaměřily na kapsule P. multocida a jejich vlivu na virulenci. Stejně jako kmeny typu A, bakterie divokého typu enkapsulované a akapsulární formy byly testovány na schopnost přežít izolovanou hostitelskou obranu

(bílé krvinky a doplňky) nebo způsobit infekci a smrt živé krůty. Akapsulární bakterie byly obvykle: (a) spontánně vznikající mutanti; (b) chemicky indukovaní mutanti; nebo (c) bakterie divokého typu, na které se působí hyaluronidázou [HAase], což je specifický enzym, degradující HA. Obecně řečeno, bakterie typu A, které nemají kapsuli, byly mnohem snadněji zabíjeny izolovanou obranou hostitele in vitro.

Krůtí sérum zabilo oba mutanty a buňky ošetřené HAasou, zatímco buňky divokého typu se množily. Komplementní systém byl zahrnut do testu také, neboť schopnost zabíjení byla ztracena ohřátím nebo ošetřením chelatačním prostředkem na kalcium séra před inkubací s bakterií. Skutečnost, že enkapsulované buňky divokého typu konzumují nebo snižují hladinu komplementu v séru bez aktivace, indikuje, že komplexní vazby existují, ale nejsou schopny rozložit buňky. Makrofágy krůty a heterofilní fagocytóza, obě akapsulární varianty a Haasou ošetřené buňky ovlivňují silněji než buňky divokého typu.

Při testování na živých zvířatech byli spontánní mutanti 103 - 105 krát méně virulentní, než odpovídající divoké typy rodičovských kmenů, což bylo zjištěno měřením LD50 (tj. letální dávka pro 50% testovaných zvířat. Tyto enormní rozdíly ukazují, že význam kapsuli pro patogenézy kmenů typu A je velký. Osud bakterií v živých krůtách také závisí na enkapsulaci; pouze buňky divokého typu přežívají v játrech.

- 24 hodin po injekci byly v krvi nalezeny buňky divokého typu v koncentraci 105 krát vyšší než v případě neenkapsulovaných mutantů. Jinou rolí HA kapsuli je adheze a kolonizace. Některé buňky v těle obratlovců nesou na svém povrchu specifické proteiny, které váží HA; potencionálně by

2. ········ bakterie měla přilnout k hostiteli přes tuto interakci protein/HA.

Podobně kapsule typu D a F P. multocida jsou implikovány jako virulentní faktory, které odpovídají mikrobům s rezistencí vůči fagocytóze. Pokud buňky typu D nebo F jsou testovány s chondroitinézou, ztrácejí mikroby jejich kapsule a jsou mnohem snadněji fagocytozovány in vitro. Dále, tyto polymery nejsou silně imunigenní.

Z testování in vivo, bylo zjištěno, že kmeny enkapsulovaného typu D způsobují mnohem nebezpečnější nosní lese u prasat a měly mnohem nižší LD₅₀ u myší, než neenkapsulované varianty (102 versus 107-8 buněk).

V případě typu A a D mutantů studovaných shora nicméně, genetická povaha jejich defektu nebyla známá, a nebyla zaznamenána žádná metoda pro mapování těchto mutací.

Konkrétně chemickou mutagenézí je také možno použít k mutaci a je to provedeno v jednom uvedeném „mutantu. Dále nebylo ukázáno, že produkce HA byla kompletně odstraněna v „akapsulárních mutantech; tenké kapsule, které nebyly detekovatelné podle morfologie kolonie, světelnou mikroskopií ani chemickým testem by stále mohly přesto existovat. Pro detekci menších a menších kapsulí jsou nutné citlivější radiometrické metody a testy založené na měření hustoty bujónu. Použitím těchto nových metod bylo zjištěno, že jeden kmen použitý v testech nebezpečnosti virulence a hlášený jako akapsulární, ve skutečnosti vykazoval velmi tenké HA kapsule. Proto je důležité stanovit účinky, které mají opravdu akapsulární kmen.

Historicky je třeba uvést, že geny odpovědné za produkci kapsulí v P. multocida nebyly známé. Několik genů sídlících • 4 ♦ 4 4 4 4 4 v kapsulovém lokusu jiných bakterií v odpovídajícím genu, Haemophilus influenzae, bylo mapováno a sekvencováno, ale molekulární podrobnosti biosyntetického aparátu nejsou dostupné. Dokonce i v E. coli, což je velmi dobře prostudovaný Gram-negativní organismus, není exaktní role všech potenciálních genových produktů dobře pochopena, stále dobře vysvětlena, přestože místo pro tvorbu kapsulí bylo pečlivě zmapováno a DNA sekvence byly získány pro několik kapsulárních typů.

Klonování a sekvencování HA biosyntetického lokusu Streptococcus pyogenes je již popsáno. Tento mikrob, stejně jako P. multocida, využívá HA kapsulí k potlačování lidské obrany. HA operon obsahuje 3 geny uspořádané v tandemu na zhruba 4 kb DNA. První gen, hasA, enkóduje HA syntázu 45,1 kDa, která polymeruje dva prekursory cukrových nukleotidů, UDP-GlcA a UDP-GlcNAc, čímž se tvoří HA polysacharid. Druhý gen, hasB, enkóduje UDP-glukózovou hydrogenázu 45,5 kDa, která konvertuje UDP glukózu (UDP-Glc) na UDP-GlcA pro biosyntézu HA. Třetí gen, hasC, enkóduje UDP-glukozovou pyrofosforylázu 34 kDa, která tvoří UDP-Glc z UTP a glukóza1-fosfát. Existuje pomocný enzym, určený k tvorbě UDP-cukrů pro biosyntézu kapsulí; jiný „domácí gen sídlící na různých místech chromozomu, supluje UDP-Glc pro normální metabolickou cestu bakterie. UDP-GlcNAc je přítomen ve všech eubakteriích, neboť má funkci při syntéze buněčné stěny. Z těchto důvodů HA syntéza a dehydrogenáza jsou jediné dva exogenní proteiny, nutné k přímé syntéze HA polysacharidů v heterologní bakterii. S. pyogenes HA syntéza, která je předpovídána jako membránový protein s transmembránovými šroubovicemi, možná polymeruje HA a transportuje rostoucí polysacharidový řetězec ven z buňky.

* ·

Jak bylo diskutováno shora, gen byl jak izolován, tak sekvencován, gen odpovědný za produkty kapsule HA v P. multocida. (Viz např. SEQ. ID Nos. 1 a 2.) Tento gen je zde popsán a chráněn jako součást vynálezu. Jak také bylo diskutováno v předešlém textu, polymery P. multocida kapsulí způsobují problém pro obranu hostitele. S použitím informace o sekvenci genu PmHAS, rekombinantě produkovaného kmeny P. multocida, které mají HA syntézní gen „vyřazen, bude přerušená syntéza bakteriální kapsule tohoto organismu.

S použitím „knokautovaného kmene jako vakcíny bude pak možné hostitelský kmen bránit změnám způsobeným patogenem v tomto poli.

Jak bylo diskutováno shora, Tn916, všestranný a významný mutagen, inzertuje do chromozomu P. multocida různě zjevných nebo náhodných místech. Tento Tn byl zaveden do buněk na „vhodném plasmidů - tj. takovém, který nelze opakovat v P. multocida - cestou elektroporace. Tento Tn mobilizoval nebo vyskočil z plasmidů a vpravil se do genomu s frakvencí asi 4000 případů/mikrogram DNA. Výsledné progeny nesly gen odolnosti proti tetracyklinu z Tn916 a byly snadno pomocí účinné látky dělitelné.

Dále je shora diskutován fakt, že panel byl generován nezávisle transponovaných mutantů defektních při biosyntéze kapsulí z virulentního rodičovského kmene. Po použití kombinace vizuálního a biochemického screeníngu přibližně 105 transfektovaných kolonií, byly nalezeny dvě třídy kapsulárních defektů, které vedly k mikrokapsulárním nebo akapsulárním mutantům. První třída (sedm nezávislých kmenů) vykazovala velmi malé kapsule HA, proto pojmenované jako mikrokapsulární. Enkapsulovaný divoký kmen produkuje na destičkách s živnou půdou velký mukoid, iridescentní kolonie » · φ · • · φ φ a tvoří jednotlivé buňky a kapsule s tloušťkou přibližně rovnou průměru těla buňky, jak bylo zjištěno měřením pod světelným mikroskopem. Ve srovnání s tím mikrokapsulární kmeny tvoří menší, iridescentní kolonie, které se jeví na destičkách s živným roztokem poněkud sušší. Tloušťka kapsulí jednotlivých buněk je pravidelně jedna čtvrtina (nebo méně) v porovnání s divokým typem.

Čtyři mutanti (čtyři nezávislé kmeny) se jeví jako skutečně akapsulární, a na destičkách s živnou půdou tvoří malé, suché kolonie. Světelnou mikroskopií nebyly detekovány žádné kapsule. Měřením hustoty bujónu akapsulárních kmenů, na které závisí míra enkapsulace, bylo ekvivalentní buňkám divokého typu, který byl zbaven kapsulí, působením hyaluronidázy. Tyto kmeny také nevykazovaly aktivitu HA syntézy; k těmto preparátům, odvozeným od těchto mutantů, byly pak přidány exogenní radioaktivně značené prekursory UDP cukrů, ale netvořil se žádný polysacharid.

Dva z akapsulárních mutantů, TnH a TnL, vykazovali zajímavé vlastnosti, které při frekvenci asi 10-3, popřípadě revertující s fenotypem divokého kapsulárního typu byly objevovány na destičkách. Revertované buňky měly kapsule divokého typu, jak bylo potvrzeno světelným mikroskopem a radiometrickými testy pro HA polysacharid. Molekulární vysvětlení je v tom, že občas Tn částečně ustřižené z kapsulárního genu, (žádná přidaná nebo zrušená báze) a integruje se někde v chromozomu. Výsledné enkapsulované progeny byly snadno pozorovatelné na destičkách s ivnou půdou. Tento reversní fenomén je klasickou genetickou zkouškou, která potvrzuje, že Tn byl v těchto kmenech odpovědný za mutování významného místa nutného syntézu kapsulí. Nicméně, vzhledem k této relativní nestabilitě, není ·· ····

Tn odvozený mutant vhodný pro použití kmene k vakcíně;

s určitou frekvencí by se mohly tvořit virulentní formy.

K mapování těchto míst byl použit „Southern blotting Tn v obou originální akapsulárních mutantech a enkapsulovaných revertantech. TnH a TnL mají Tn element na stejném místě, jak bylo zjištěno po vzorci HindlII nebo BstXI digesce, jak je ukázáno na obr. 12. Obr. 12 je mapa Southern blot Tn mutantů. Chromozomální DNA z dělení kapsulárních mutantů, enkapsulované revertanty a kontroly byly digestovány pomocí HindlII. DNA byla oddělena gelovou elektroforézou a podrobena analýze „Southern blot. Tn sonda rozpozná dva pruhy, pro každý transpozont ve vztahu k vnitřnímu restrikčnímu místu (tvoří velký 10 kb a malý 5 kb díl). Tn sonda nehybridizuje s DNA z rodičovského kmene bez Tn (lané 0). Více preparátů DNA odvozených od separovaných kolonií akapsulárních mutantů TnH (H) a TnL (L) nebo individuální enkapsulovaní revertanti (poznamenáno s podtrženými písmeny) bylo poté testováno. Všichni mutanti měli jednu inzerci Tn elementu s výjimkou TnL, který obvykle měl 2 kopie Tn (jeden ze subkulturních kmenů měl 3 kopie). TnW (W) je mukoidní Τη-obsahující kontrolní kmen. Jsou značeny pozice lambda HinsdIII markérů (λ) pro 23,1; 9,4 a 6,6 kb (shora dolů).

Tn element v akapsulárních mutantech H a L (které nemají žádnou aktivitu HA syntázy) a reprezentativní mikrokapsulární mutant, TnD (D) mapují na stejné pozici. Pokud jde o reversi na mukoidní fenotyp, ve všech případech se přesunul relativní Tn element na novou pozici. Přerušená DNA z mutantů byla izolována a tento lokus a sondy byly generovány pro kapsulární geny.

* · ··· ·

Následná analýza sekvencí ukázala, že TnH a TnL inzerce byly přibližně 1 kg vzdáleny. Ve všech případech revertanti těchto mutantů ztratili Tn v původní pozici a získali nové Tn na různých místech (tj. obr. 12 pruhy s podtrženými písmeny). Alternativně dosud nebyla nikdy pozorována reverse mikrokapsulárních mutantů na enkapsulovanou formu. Tn odpovědný za všechny mikrokapsulární mutanty (typizované podle TnD) mapovaly stejný 17 kilobase Hindlll fragment jako TnH a TnL mutanti. Tato lokalizace byla potvrzena mapováním s BstXI.

U jiných akapsulárních mutantů TnA a TnG byly Tn elementy lokalizovány v jiných irelevantních genech a HA kapsulové místo bylo znefunkčněno spontánními mutacemi. Případné spontánní mutace se v tomto případě dají očekávat; fakticky, při podobných studiích míst streptokokových kapsulí, bylo 12 ze 13 kmenů výsledně spontánně mutováno.

K identifikaci a klonování DNA, která se uplatňuje při biosyntéze HA kapsulí P. multocida bylo použito inzertní mutageneze Tn916. Při provádění této úlohy bylo použito tří kroků: (i) sekventování DNA hostitele při Tn inzertním miste používajícím primér odpovídající DNA na zakončení Tn916, (ii) označení PCR priméru pro kapsulární gen založené na nových sekvencích, k zesílení DNA segmentu mezi Tn elementy, a (iii) screening genomických knihoven divokých typů v lambda viru na funkční klon používající PCR produkt specifický pro lokus pro kapsule jako hybridizační sondu.

Klíčový stupeň při získávání DNA P. multocida napojené k Tn byl připraven s použitím současného přímého sekvencování, což je technika, která byla plně popsána v publikaci DeAngelis, P.L. (1998) „Transposon Tn916 ·

• 0 insertional mutagenesis of Pasturella multocida and direct sequencing of the disruption site, Microbial Pathogenesis, která je tímto odkazem plně zahrnuta do popisu. Genom P. multocida ze všech kapsulárních typů obsahuje mnoho míst pro restrikční enzym Hhal; tudíž téměř každý DNA fragment v digestu je menší než 7 kilobazí (kb) a je znázorněn na obr. 13 pruh „0.

Obr. 13 znázorňuje chimérické DNA šablony pro analýzu sekvence Tn přerušovacích míst. Při této metodě se dá rychle a přímo získat DNA sekvence jakéhokoliv genu přerušeného Tn916 elementem. Tento způsob získává na rozdílné senzitivitě Tn elementů a typu A P. multocida, vůči restrikčnímu enzymu Hhal. 16 kb TN element má pouze jedno Hhal místo vedoucí k 12 a 4 kb fragmentů při dgesci. Z tohoto důvodu jakýkoliv gen přerušený Tn elementem bude mít přídavných 12 kb DNA. Růst velikosti Hhal fragmentu umožňuje nezaznamenat přeměnění Tnznačeného genu ze zbytku chromozomální DNA běžnou elektroforézou na agaroze. Tento 0,7% gel ukazuje, že Hhal digestční vzorec chromozomální DNA z rodičovského kmene bez Tn (pruh 0) a několik mutantů obsahující Tn (Tn mutantní pruhy). Lambda/HindlII markéry (pruh S) jsou uvedeny v kb. Chimérické fragmenty Tn/genomová DNA, které migrují na místě přibližně 13-17 kb (označené šipkou) se nacházejí pouze v Tn mutantech. Je třeba poznamenat, že pruh L má tří chimérické pásy; tento konkrétní mutant má tři Tn elementy (viz obr. 12).

Chimérická DNA se může izolovat a použít přímo jako matrice sekvencováním; přitom není nutné žádné klonování nebo

PCR. Výsledná velká molekula chimérické DNA, která je snadno oddělitelná od zbytku malých genomových fragmentů elektroforézou na agarózovém gelu, slouží jako matrice • · v cyklu sekvencovacích reakcí. Sekvencovací primér odpovídající právotočivému zakončení Tn916 řídí prodlužování směrem ven k přerušené DNA. Tudíž sekvenční data v místě přerušení DNA mutanta se dají rutinně získat bez PCR zesílení nebo klonování matricové DNA.

Nové informace o sekvencích byly použity k návrhu PRC priméru pro zesílení regionu DNA mezi TnL a TnH mutanty. Specifický 1 kb produkt byl použit jako hybridizační sonda k získání 5,8 kb části operonu biosyntézy kapsulí typu A P. multocida, jak je vyneseno na obr. 14, který znázorňuje schematicky umístění HA biosyntézy typu A P. multocida. Jak ukazuje obr. 14, inzert typu A klonu genomové DNA, který by mohl řídit biosyntézu Ha v Έ. coli byl sekvencován. Bylo zjištěno, že otevřené čtecí rámy enkódují: dva proteiny podobné E. coli molekul implikovaných v transportu polysačharidu, Kps a KfaA, HA syntázu, která polymeruje HA polyasacharid; a enzym formující prekursor, UDP-glukozovou gehydrogenázu. Deleční analýza originálního plasmidu ukazuje, že intaktní HA syntáza byla v podstatě pro HA produkci využívána v heterologní bakterii. Umístění originálních původních Tn inzercí, odpovídajících TnH a TnL, jsou označeny hvězdičkami. Tn inzertní případy, zjevně způsobily polární mutanty, které zastavily expresi postupné HA syntázy a dehydrogenázových genů. Tudíž použitím sekvenční analýzy, byly nalezeny intaktní otevřené čtecí rámy nové PmHAS a potencionální polysacharidový trnasportní homolog. Tato data také ukazují, že UDP-Glc dehydrogenázový homolog, který vyrábí UDP-GlcA prekursor a jiný transportní protein, E. coli kps genový homolog, jsou přítomny v blízkosti HA syntázy.

Jediný 110 kDa protein z P. multocida, PmHAs, řídí produkci HA kapsule v E. coli. Tato kapsule rekombinačnich • * ···· • · • ·♦·

buněk, produkovaná PmHAS na plasmidů, byla tlustá jako kmen virulentního divokého typu. Kapsulární materiál byl stanoven jako autentická HA s měřením jeho schopnosti specifické HA lya digesce specifickou HA lyazou a jeho reaktivity se selektivní Ha vázajícím proteinem. Bylo velmi zajímavé, že PmHAS není příliš podobná jiným HASům na aminokyselinové úrovni.

Za účelem stabilizace izogenních mutantů P. multocida byla použita modifikace mutagenézní metody využívající P. haemolytica. Pro cílenou inaktivaci dvojitým krosingouvrem HA syntázy byla připravena knokautovací kazeta. Bezpromotorový gen chloramfeniklové rezistence (cat) byl inzertován do středu celkového PmHAS otevřeného čtecího rámu (v místě Xhol) a klonován do plasmidů (pKR223-3), který nereplikuje stabilně v P. multocida. Tento plasmid byl transformován do enkapsulovaného kmene divokého typu a buňky byly naneseny na živnou půdu s chloramfenikolem. Když byly integrovány do cíleného genu, intaktní PmHAS protein se již dále netvořil. Gen cat se transkribuje endogenním promotorem kapsulového genu; pokračovací gen, dehydrogenáza UDP=glukozy by neměl být účinný. Z tohoto důvodu se vytvořily skutečné izogenní mutanty.

Byli izolováni tři izogenní akapsulární mutanti. Žádný z těchto mutantů nebyl detekován jako kapsulový, což bylo zjišťováno pomocí světelné mikroskopie a vybarvením čínskou tuší. HA syntáza byla přerušená na dvou úrovních, DNA a biochemické úrovni. Viz např. tab. II. Analýzou „Western blot používající protilátky namířené proti části PmHAS enzymu, bylo zjištěno, že akapsulární knokautovaný mutant postrádal přibližně 110 kDa pás, PmHAS enzym, který se nachází v divokém rodičovském typu. V kombinaci s daty ♦ · ····

• · v tabulce II (chybění produkce polysacharidu) nebyl zjištěn v knokautovaném kmenu žádný funkční PmHAS.

Určité regiony jsou obecně nebo velmi podobně mezi geny různých kapsulárních typů. Tento se ukazuje na Southern blot analýze být typu D nebo F DNA, který je znázorněn na obr. 15. Jak je zobrazeno na obr. 15, chromozomová DNA z typu A, F nebo D kmenů byla digestována buď Hindlll nebo EooRI (pravý nebo levý pás pro každou sondu) a podroben Southern blotting. Pro detekci homologních sekvencí v bakteriích jiných kapsulárních typů (pásy značené hvězdičkami) byly použity digoxinem značené PCR produktové sondy, odpovídající regionům buď kfaA homologu (K) nebo HA syntázy (H) genu z typu A. KfaA homology jsou zjevně náleží oběma typům F a D. Velmi podobný syntázový homolog byl nalezen v typu F, ale ne v typu D.

Sondy jsou vhodné pro screening knihoven. Standardy lambda/HindlII jsou značeny v kilobázíeh.

Typ F má regiony, které jsou podobné oběma sondám, zatímco typ D byl pouze podobný transportérové proteinové sondě. PCR bylo použito s několika soubory primérů odpovídající typu A sekvencí k zesílení typu D nebo F genomieké DNA, jak je znázorněno na obr.16. PCR heterologní DNA s priméry typu A je znázorněno na obr. 16. Různé primérové páry odpovídající kfaA homolognímu genu (panel A) nebo HA syntázovému genu (panel B) kmene typu A byly použity k zesílení genomieké DNA izolované z několika jiných kmenů P. multocitá s různými kapsulárnímí typy. Bylo provedeno 4Θ cyklů (94'⁶C, 30 sekund; 42°C, 30 sekund; 72^ŮC, 60 sekund) reakcí polymerázového řetězce s enzymem Tag.

Reakční směsí byly děleny na 1% agarozovém gelu a vybarvovány etídíem (pruhy: A, typ A; D, typ D; F, typ F, O, ·< «···

4

444 • 4 • · žádná kontrola matrice. Standardy (S) jsou 100 bp 1 a 0,5 kb pásy a jsou označeny šipkami. P-I primérový pár ukazuje produkty pro všechny tři kapsulární typy, ale produkt typu D je menší než ostatní produkty. Páry P-II a P-III zesilují typ A a F DNA a žádný jiný. V kontrastu s tím , P-IV a P-V páry zesilují pouze typ A. Ukazuje to, že kapsulární lokus typu A a F jsou podobnější navzájem s typem D. PCR produkty z P-I primárního páru budou sloužit jako dobré hybridizační sondy pro kapsulární lokus z jiných typů.

Ne všechny kombinace primérů poskytují PCR produkty z heterologní matricí DNA. Části 0,2-1 kb typu F genu enkódují HA syntázu nebo kapsulární polysacharidový transportní analog a byly proto zesíleny. Také byl zesílen 1 kb region typu D genomu enkódující tranportní protein. Sekvenční analýza několika PCR produktů potvrdila homologní, ale ještě oddělitelné sekvence. Celkově lze říci, že tato data naznačují, že kmeny typu A a F jsou více navzájem příbuzné a nejsou tak příliš podobné typu D. Sekvenční srovnání typu A a F KfaA homologů a E. coli KfaA je znázorněno na obr. 17. PCR produkt, který byl generován zesílením typu DNA typu F se soustavou P-I priméru (viz obr. 16) byl gelově čištěn a sekvencován s jedním z originálních primérů. Bylo zjištěno, že sekvence typu A a F byly velmi podobné na aminokyselinové úrovni; konkrétní rozložení proteinových sekvencí ukazuje, že v této oblasti sekvencí jsou více identické s některými protivníky (rozdíly jsou podtrženy na obr. 17). Celkově sekvence P. multocida jsou zcela homologní KfaA proteinu E. coli, který je implikován v polysacharidovém transportu (identické zbytky jsou označeny tučnými písmeny na obr. 17). Tyto PCR produkty budou také použitelné jako hybridizační sondy k nalezení funkčního lokusu kapsulí z typu D nebo F genomických knihoven.

• ·

Klonovaná DNA také umožňuje konstruovat genové knokaut plasmidy: přičemž výsledné mutantní kmeny jsou použitelné na testy virulence nebo jako vakciny.

Produkce bakteriálních kapsuli P. multocida zahrnuje minimálně následující stupně: (i) syntéza prekursorů cukrových nukleotidů; (ii) polymerace prekursorů na účelem vytvoření kapsulárního polysacharidů; a (iii) export nebo transport polysacharidů do extracelulárního prostoru, kde se kapsule mohou projevit. Pochopitelně, potenciálně existují regulační geny nebo faktory, které kontrolují hladiny enzymů nebo enzymatickou aktivitu, ale pozornost je zaměřena na hlavní strukturální enzymy syntézní cesty. V E.coli jsou kandidáti typu genů typu 2, které enkódují enzymy pro tento proces, umístěny společně na jednom místě bakteriálního chromozomu. Kmeny E. coli, které mohou vyrábět kapsule s různými strukturami mají proměnlivé enzymy pro stupeň (i) a stupeň (ii), uvedený shora, ale všechny jeví společný mechanismus pro transport/export pro stupeň (iii).

Bylo objeveno, že jeden enzym integrální membrány v S. pyogenes, polymeruje prekursorové cukry a také transportuje HA polysacharid přes membránu. Typ A P. multocida má čtyři různé geny, které se uplatňují v každém ze tří biosyntetických stupňů při produkci bakteriální kapsule. (Víz obr. 14). Podobnost polysacharidového transportéru P. multocida homologu E. coli na úrovni proteinu napovídá, že obecné funkce některých jiných kapsulárních genů mohou být také podobné u těchto dvou druhů.

Byla hodnocena role kapsuli jako virulentního faktoru u cholery drůbeže. Za účelem odstranění utrpení a námitek proti testům bakteriálních kapsuli a virulence, byly srovnávány *9 <··· • · • · ·· · · definovaní mutanti s divokým typem mikrobů. Na schopnost potlačit předem existující nebo předem imunizovanou obranu hostitele in vitro byly testovány izogenní mutanti typu A, kteří měli narušené kapsulární geny. Tyto experimenty byly prováděny na živých krůtách, které byly infikovány in vivo. Stabilní izogenní mutanti byli získáni podle způsobu popsaných zde v předešlém textu. S pomocí přerušené verze PmHAS genu na plasmidu (viz obr. 18) a homologní rekombinace, byl vytvořen rekombinační kmen P. mutocida, který postrádal schopnost tvořit hyaluronové kapsule. Kmen byl dále analyzován jak na DNA, tak na biochemické úrovni. Zjistili jsme, že funkční gen HA syntázy byl nahrazen defektním genem, obsahujícím cat kazetové přerušení, a to jak Southern blot, tak i PCR analýzou. (Viz obr. 19).

Potvrzení narušení genu je znázorněno na obr.19. Panel A je Southern blot analýza. Chromozomální DNA z různých kmenů byla digestována pomocí HindlII, separována na 0,7% agarozovém gelu a přenesena na nitrocelulózu. Blot byl hybridizován s P. multocida HAS genovou sondou. Vzhledem k vnitřnímu HindlII restrikčnímu místu PmHAS genu byly detekovány dva pásy. Pruh M je mukoídní transformand; pruh KO je akapsulární knokautovaný mutant; pruh P je rodičovský kmen. Přidáním 670 bp kazety způsobilo posun ve velikosti horního pásu v KO pásu (značeno šipkami).

Panel B na obr. 19 představuje PCR analýzu. DNA v buňkách lyzátů z různých kmenů byla zesílelna 35 cykly PCR s použitím párových nebo oligonukleotidových primérů, které lemují Xhol místo PmHAS. Délka amplikonů z normálního genu divokého typu je 650 bázových párů. PCR reakční směs byla separována na 1% agarozovém genu a vizualizována pomocí etidium bromidu. Pás M je mukoídní transformant; pás KO je » » akapsulární knokautovaný mutant; pás P je rodičovský kmen; pás C je kontrola, kterou představuje klonovaný PmHAS plasmid; a pás S představuje velikostní standardy. PCR produkty připravené podle matrice knokautovaného mutantu má zhruba 1300 bp (značeno šipkou); tento pás sestává z 670 bp cat kazety a 650 bp odvozených z PmHAS. Podle reakce knokautovaného kmene nebyl detekován žádný amplikon divokého typu a proto je zjevné, že se projevila homologní rekombinace zprostředkovaná dvojitým krosingoverem.

Dále použitím citlivého radiochemického testu na HA polysacharid bylo zjištěno, že mutantní kmen neprodukuje HA a v tabulce II, která uvádí přehled HA produkce u různých kmenů, je toto znázorněno.

Tabulka II

Kmen	HA polysacharid (nanogramy/ml na OD600)
P = Divoký rodičovský typ	1 200
M = Mukoidní transformant	1 200
KO - Akapsulární knockout. mutant	0,05

Kmeny, uvedené v tabulce II, byly kultivovány přes noc a jsou to různé kmeny, které byly testovány na přítomnost HA polysacharidu pomocí specifického radiometrického testu, který je zde shora uveden. Kultury byly normalizovány spektrofotometr!! a data byla prezentována jako koncentrace HA v kultuře s absorbancí 1,0 při 600 nm. Divoký typ rodičovský nebo mukoidní, enkapsuloval transformant syntetizovaný pod velkými množstvími HA. V kontrastu s tím akapsulárním knokautovaným mutantem (KO) nebyla žádná detekovatelná HA. Z tohoto důvodu mohla být splolehlivě

4444 •

4 4 • 4» • 44 posouzena role kapsuli při virulenci. Metodika použita v tomto experimentu by také mohla být použita k sestavení jiných mutantu P. multocida a odborníkovi v oboru, který bude mít k dispozici tento popis, by nebylo zatěžko splnit takovouto úlohu.

• 4 • · ·

♦ » 4 «

·« · ·

4 •4 4 »

4* 4

Výsledky testů na zvířatech umožnily srovnat patogenicitu in vivo jednotlivých mutantů ve srovnání s komplementárními mutatními kontrolami a s typem A P. mutocida divokého typu. Knokautovaný kmen typu A Pasturella multocida ATCC 15742, (který způsobuje krůtí choleru), byl uložen u USDA Research Station in Ames, Iowa pro testování virulence. Pomocí cílené homologní rekombinace byla kapsulární biosyntéza knokautovaného kmene přerušena a bylo předpovězeno, že knokautovaný kmen bude mít 1000 krát menší virulenci.

Testování virulence bylo prováděno proto, aby se zkontrolovala spolehlivost takovéhoto KO kmene pro použití jako vakcinačního kmene. V čistém prostředí byla ponechána líhnout krůtí vajíčka a pro testování byla použita krůťata o věku 2 týdnů. Těmto krůťatům byly vstříknuty různé koncentrace bakterií (buď divokého rodičovského typu nebo knokautovaný kmen). Množství bakterií bylo spočítáno pod mikroskopem a spočítáním kolonií po nanesení na destičky. Zvířatům byla stříknuta intramuskulárně tato uvedená množství a zvířata byla umístěna do biologických chovných hostelů. Inokulovaná krůťata (skupiny po 6 nebo 7 pro jednu dávku mikrobů, která byla v rozmezí 80 až 107 bakterií v 10 krocích) byla pozorována. Po dobu 6 dnů byl hodnocen vzhled, úroveň aktivity a úmrtnost pokusných zvířat. Smrt nebo úmírající ptáci byly autopsiováni a byla provedena kontrola přítomnosti lésií, abscesů a selhání orgánů.

4

Výsledky experimentu in vivo jsou sumarizovány v tabulce

III.

Tabulka III

Kmen	Počet buněk v injekci	Mortalita
Divoký-typ divoký typ	8 x 103	43%
Divoký-typ divoký typ	860	17%
Mutant w/HAS knockout		0%

Důvodem tohoto typu testování bylo posoudit obecné trendy infekce v závislosti na enkapsulaci patogenu. Pro každé stanovení byly inokulovány bílé krůty s titrovaným množstvím bakterií IM. Symptomy a smrt krůt byly měřeny a zpracovány do tabulek za účelem porovnání relativní virulence mutantů. Testy ochrany byly prováděny za účelem stanovení, zda imunizované krůty mohou přežít napadení organismy divokého virulentního typu.

Byly také připraveny knokautované kmeny typu A, které infikují dobytek a králíky. Testování bylo prováděno in vivo, aby se stanovila jak patogenicita těchto knokautovaných kmenů, tak i ochrana za účelem stanovení, zda imunizovaná zvířata mohou přežít napadení organismy divokého virulentního typu.

• · · · • · · • ·

Byly prováděny dva hlavní typy experimentů, které sloužily k posouzení obranyschopnosti.Nejprve byla provedena pasivní imunizace. Jedno kuře se infikuje potenciálním vakcinačním KO kmenem a vzorek jeho séra (s ochrannými protilátkami) se odebere asi 1-2 týdny po inokulaci. Toto sérum nebo odvozená čištěná protilátka, se injekčně vstříkne živému kuřeti. Kuře se nakazí kmenem divokého typu. Pták, pokud obdrží ochrannou protilátku, přežije napadení jinak letálním divokým typem bakterie.

Byla provedena druhá, aktivní imunizace. V tomto případě se stejné kuře postupně infikuje potenciálním vakcinačním KO kmenem, a o několik týdnů později se pták nakazí normální letální dávkou bakterie divokého typu. V tomto případě byla testována imunita buněk a imunita prostředkovaná protilátkami.

Pomocí tohoto vynálezu lze předpokládat, že existuje podobnost v umístění kapsulárního lokusu různých enkapsulačních typů P. multocida, neboť polysacharidy jsou blízce strukturálně podobné. Tento vynález se také týká homologního typu genu P. multocida typu F („PmCS). PmCS sekvenční informace je poskytnuta v SEQ. ID NO.3. Gen typu F je přibližně z 85% identický s genem typu A a srovnání sekvence je znázorněno na obr. 20. Tato homologie byla zjištěna na úrovni DNA mezi kapsulárními geny klonovaného typu A a určitými regionu typu D a F genomu pomocí Southern blotting a PCR, jak je znázorněno na obr. 15, 16 a 17. Knihovny typu F genomické DNA v lambda fágu byly prohledány, za účelem izolování homologního kapsulárního lokusu. Knihovny typu D genomické DNA v lambda fágu se dají prohledat, a izolovat homologní kapsulární lokus a pro odborníka v oboru je zřejmé a dostatečně srozumitelné, že lokus kapsulí typu D se dá stanovit přesně stejným způsobem, jako to bylo provedeno s typem A a F. Sekvence PmHAS typu A a F jsou z 89% podobné.

Gen polysacharidové syntázy typu F byl získán použitím hybridizační sondy PCR produktu, obr. 16, připojením HAS homologu a Kfa homologu. Byl produkován 3 kb amplikon pomocí genomické DNA z kmene typu F a vhodné primery z Kfa a syntázních regionů. Tento materiál byl značen digoxigeninem a použit k získání klonu a následného plasmidu z typu F genomické DNA knihovny v lambda ZAP expresní knihovně (jak je popsáno pro klonování typu A). Pozitivně hybridizovaný klon byl sekvencován. Jako v případě genu syntázy HA typu A, byla funkčnost PmHAS kontrolována exprimací v pKK223-3 (Pharmacia) vektoru v E. coli. Bylo zjištěno, že tento enzym ínkorporoval in vitro UDP-GalNAc a UDP-GlcA do vysoko molekulárního polymeru, jak bylo očekáváno pro chondroitinovou molekulu.

Syntázy kapsulárního polysacharidu byly monitorovány s protilátkami a analýzou Western blot. Byly vyrobeny protilátky proti syntetickým peptidům, které korespondovaly rozdělenému, homolognímu regionu (rezidua s 12-20 aminokyselinami) syntázních enzymů. Western blots potvrdil, že oba typy jak typ A tak i typ F P. multocida měly imunoreaktivitu 110 kDA proteinu podle SDS-PAGE.

Obrázek 21 v analýze Western blot nativních a rekombinačních PmHAS proteinů. Nativní PmHAS a různé rekombinační zkrácené PmHAS proteiny odvozené z PmHAS vyrobené z E. coli byly srovnány na SDS-PAGE gelech. Pro rekombinační vzorky byly podrobeny Western blottingu s antiPmHAS protilátkou totální lysát (T), membrány (M) a cytoplasma (C). Originální protein, který se nalézá v nativní • 4 · 4 • ·

Pasturella multocida (Pm, pás W; označen šipkou) migruje na asi 110 kDa; knokautovaný vakcínační kmen (pruh KO) v tomto pásu chybí. Nativní PmHAS rekombinační verze chybějící části karboxylového zakončení (PmACC) měl aktivitu HA syntázy. Jiné omezené nebo o zkrácené konstrukce byly inaktivní.

4. Použití PmHAS při diagnostických aplikacích

Tento vynález se také týká vytvoření použitelných sond, které umožňují identifikaci typu A, D a F P. multocida nebo P. haemolytica v této oblasti. Diagnóza, který konkrétní kmen je přítomen u zvířat, je v současné době prováděna sérologicky, aglutinací nebo DNA fingerprintingem po restrikční analýze. Předchozí dvě metody mohou být problematické, často poskytují nesprávné výsledky a jsou proměnlivé v závislosti na zdroji typizace antiséra.

Kapsulární sérologie karterových typů A, D a F dokonce nevyužívá protilátky, protože tyto polymery jsou velmi málo imonugenní. Místo toho se provádí laboratorní testy enzymatickou digescí nebo flokulací buněk s akriflavinem. DNA fingerprinting je přesný, ale mění se v závislosti na extenzivní znalosti řady typů kmenů, kterou je nutno zaznamenat ve sbírce. Podle tohoto vynálezu mohou být použity uvedené kapsulárně specifické priméry, které lze snadno použít k provedení těchto epidemiologických testů, specificky použitím rychlé, PCR analýzy, za účelem identifikace patogenních izolátů za půl dne s minimálními nároky na manipulaci a kultivaci. Když byl patogen identifikován, lze provést mnohem informovanější rozhodnutí ve směru volby antibiotika nebo vakcíny.

Užitečnost použití informace kapsulární DNA k rychlému rozlišení typu P. multocida je ve světle problému s dosavadními posuzovacími metodami velmi jednoduché. Buď hybridizace nebo rozlišení založené na PCR se ukazuje jako praktické, citlivé a rychlé. V jednom konkrétním provedení by se např. dalo vnést vhodně značené nebo značkované DNA syntázní proby (nebo prodloužením genu kapsulárního lokusu, který se liší mezi kapsulárnimi typy), který pomocí své jedinečnosti může být odlišen za vhodných hybridizačních podmínek (např. komplementární gen a proby hybridizují, což poskytuje signál, který, zatímco neidentické geny z jiného kapsulárního typu nehybridizuji, čímž se žádný signál nezíská). Jiná specifická provedení lze navrhnout pomoci PCR primerů, kterými lze rozlišit kapsulární typy. Amplikon přesné velikosti by mohl rozlišovat také konkrétní kapsulární typy; v tomto případě nepřítomnost aplikonů je signifikantní pro jinak hodnocený kapsulární typ.

Podle současného stavu techniky se může vizualizovat rozlišná velikost pásů, kterou poskytují některé PCR primární páry. Takovýto multiplex metod by mohl umožnit řadu reakcí, které se také mohou provést simultánně. Znalost DNA sekvence různých lokusů kapsulární biosyntézy, při konkrétních syntézách, umožňuje tyto testy rapidně zpřesnit a zaměřit na různé patogenní kmeny.

Z těchto důvodů je zřejmé, že podle vynálezu byla poskytnuta izolovaná a sekvencovaná PmHAS a způsoby výroby a použití PmHAS a knokautované kmeny P. multocida, které plně uspokojují požadavky a mají výhody uvedené shora. Přestože byl vynález popsán ve spojení s určitými specifickými provedeními, je evidentní, že odborník z oboru může zřejmě provést mnoho alternativ, modifikací a obměn. Takovéto * · · · · · alternativy, modifikace a obměny spadají do myšlenky vynálezu a do jeho rozsahu, jak je definován připojenými nároky.

·· ··♦· ·· • · 0 · · ·

0 0 0 0 0 ·

0 0 0 0 0 ·

0 0 0 0

SEQ ID NO:1 + 1—>

¹ M

LALKLFE ⁴¹ KCQEKLS 64 KVNVCDS 87 VLSDSEK 110 N A Ε V R A V

133 P D Η V N D F

156 Q Η V G L S I

179 CLVNQKT 202 L S Ρ I I R q

225 F Q A S A A R

248 C D Μ A Ρ N P

271 Τ I I G P R κ

294 S L L E S L P

317 S L· D W R L E

340 F F A A G N V

363 F N H W G G E

386 Τ I D G I M A

409 G Κ N I T L D

432 E D S Η I N R

455 I Q R C V D S

478 G S T D N T L

501 S Κ Ρ N G G I

524 G Q L - D S D D

547 D Κ T L A C V

570 G Y N W Ρ E F

593 F Τ 1 R A W H

616 M F L K L S E

639 H G D N T S I

662 S L N R Q G I

685 Y I F N Κ T A

708 N K D A Κ I A

731 N N I 1 Ε Y N

754 P D I Κ Κ Ε I

777 I S Y Y T S N

800 Q L N L N C E

823 Y A Y Μ Κ Κ Y

846 I N A Η Ρ p F

869 N V K G A S Q

892 Κ Ε V I T S C

915 Q F A L L I L

938 Μ P W E R K L

961 Ρ V N K F I I

NTLSQAIKA

KSAEIYGRK ahpsvnsah

PLDIATQLL ntlknkwkl alvpkdfpk

TWYKKRKKR

IVTTFNRPA hypfevivt

YENKLDIRY nmglrlaky lwvhsyvae yidtqhidp evktnnsva

Qfektenlr afakkwlnk dvefgyrlf

YHQEPPGKE

IMREKVPYI

VPLVSIYIP alnqtvvdl evinklygn ASASNAAVS YLEPDAVEL YTTNRNVNP SREKLTTAM ltdgfneki VGKFKHLNK KKLGIQKKN tyynydefd eyqeeidil VSIFYPNTL KNIFVIVLH LAFYHKHQV Rlikteahl YIIFDNHDS dvgmnfsal KKLIKTYFŇ gmfmtyala qsi dsvpey ekktghvfn QWTNEQIE N S I T L *

972

T N S N D Y Q

V E F Q I τ ^{L s} V N Κ Ε E L S N V Κ K L ^L Τ Ε Κ K S E D L V L A P L ^L G I Κ p Ε H ^{1 L} S I T L A ^{D D} G S Q e D ^v R Q K D N G O Ε I G L l D L L E D D D L ^K D F L N N A A K G E G Τ V L S D S P F r ^s G F F D Ε E ^R Y G S F F K N Ε T D R E A

Y R K L L Ρ X A Y N C A N Y ^{E v} c I c N D ^N p R V R I M F A K G Y γ_ i ^c L Κ E F L K ^D θ S L I A N ¹ A Η H F R M Ε N A V D Y D I C Y N R V L. H F V V V N Q ^D L D E S R K K D I Κ I IQ ^N G L V Κ K L

V D Κ N H L T N I L L N N D S N I N K L S L F V Κ N D S T 8 D W I Ε K O N D L K S M Η E L L Τ I I N Τ E D I W F Κ T S T L Τ Y A K R G Ε N I

1.

Ίι

Cs

4444 44 4

4 4 4 4 44 • · 444 4 4 4

4 4 444· · • 4 4 ·44

444 44 444

SEQ ID NO: 2 +i—>

-18 ATTTTTTAAGGACAGAAAATGAATACATTATCACAAGCAATAAAAGCATATAACAGCAATGACTATCAA

TTAGCACTCAAATTATTTGAAAAGTCGGCGGAAATCTATGGACGGAAAATTGTTGAATTTCAAATTACC

121 AAATGCCAAGAAAAACTCTCAGCACATCCTTCTGTTAATTCAGCACATCTTTCTGTAAATAAAGAAGAA

190 AAAGTCAATGTTTGCGATAGTCCGTTAGATATTGCAACACAACTGTTACTTTCCAACGTAAAAAAATTA

259 GT ACTTTCTG ACTCGGAAAAAAACACGTTAAAAAAT AAATGGAAATTGCTCACTG AGAAGAAATCTGAA

328 AATGCGGAGGTAAGAGCGGTCGCCCTTGTACCAAAAGATTTTCCCAAAGATCTGGTTTTAGCGCCTTTA

397 CCTGATC ATGTTAATGATTTTACATGGTACAAAAAGCGAAAGAAAAG ACTTGGCATAAAACCTGAAC AT

66 CAACATGTTGGTCTTTCTATTATCGTTACAACATTCAATCGACCAGCAATTTTATCGATTACATTAGCC

535 TGTTTAGTAAACCAAAAAACACATTACCCGTTTGAAGTTATCGTGACAGATGATGGTAGTCAGGAAGAT

604 CTATCACCGATCATTCGCCAATATGAAAATAAATTGGATATTCGCTACGTCAGACAAAAAGATAACGGT

673 TTTCAAGCCAGTGCCGCTCGGAATATGGGATTACGCTTAGCAAAATATGACTTTATTGGCTTACTCGAC

742 TGTGATATGGCGCCAAATCCATTATGGGTTCATTCTTATGTTGCAGAGCTATTAGAAGATGATGATTTA

811 ACAATCATTGGTCCAAGAAAATACATCGATACACAACATATTGACCCAAAAGACTTCTTAAATAACGCG

880 AGTTTGCTTGAATCATTACCAGAAGTGAAAACCAATAATAGTGTTGCCGCAAAAGGGGAAGGAACAGTT

9 TCTCTGGATTGGCGCTTAGAACAATTCGAAAAAACAGAAAATCTCCGCTTATCCGATTCGCCTTTCCGT 1018 TTTTTTGCGGCGGGTAATGTTGCTTTCGCTAAAAAATGGCTAAAŤÁAATCCGGTTTCTTTGATGAGGAA 1087 TTTAATCACTGGGGTGGAGAAGATGTGGAATTTGGATATCGCTTATTCCGTTACGGTAGTTTCTTTAAA

1156 ACTATTGATGGCATTATGGCCTACCATCAAGAGCCACCAGGTAAAGAAAATGAAACCGATCGTGAAGCG

1225 GGAAAAAATATTACGCTCGATATTATGAGAGAAAAGGTCCCTTATATCTATAGAAAACTTTTACCAATA 1294 GAAGATTCGCATATCAATAGAGTACCTTTAGTTTCAATTTATATCCCAGCTTATAACTGTGCAAACTAT 1363 ATTCAACGTTGCGTAGATAGTGCACTGAATCAGACTGTTGTTGATCTCGAGGTTTGTATTTGTAACGAT 1432 GGTTCAACAGATAATACCTTAGAAGTGATCAATAAGCTTTATGGTAATAATCCTAGGGTACGCATCATG

1501 TCTAAACCAAATGGCGGAATAGCCTCAGCATCAAATGCAGCCGTTTCTTTTGCTAAAGGTTATTACATT

1570 GGGCAGTTAGATTCAGATGATTATCTTGAGCCTGATGCAGTTGAACTGTGTTTAAAAGAATTTTTAAAA

1639 GATAAAACGCTAGCTTGTGTTTATACCACTAATAGAAACGTCAATCCGGATGGTAGCTTAATCGCTAAT

1708 GGTTACAATTGGCCAGAATTTTCACGAGAAAAACTC ACAACGGCTATGATTGCTCACCACTTTAGAATG

1777 TTCACGATTAGAGCTTGGCATTTAACTGATGGATTCAATGAAAAAATTGAAAATGCCGTAGACTATGAC

• · · · ·

184 6 ATGTTCCTCAAACTCAGTGAAGTTGGAAAATTTAAACATCTTAAT AAAATCTGCTATAACCGTGTATTA

1915 CATGGTGATAACACATCAATTAAGAAACTTGGCATTCAAAAGAAAAACCATTTTGTTGTAGTCAATCAG

1984 TCATTAAATAGACAAGGCATAACTTATTATAATTATGACGAATTTGATGATTTAGATGAAAGTAGAAAG 2053 TATATTTTCAATAAAACCGCTGAATATCAAGAAGAGATTGATATCTTAAAAGATATTAAAATCATCCAG

2122 AATAAAGATGCCAAAATCGCAGTCAGTATTTTTTATCCCAATACATTAAACGGCTTAGTGAAAAAACTA

2191 AACAATATTATTGAATATAATAAAAATATATTCGTTATTGTTCTACATGTTGATAAGAATCATCTTACA

2260 CCAGATATCAAAAAAGAAATACTAGCCTTCTATCATAAACATCAAGTGAATATTTTACTAAATAATGAT

2329 ATCTCATATTACACGAGTAATAGATTAATAAAAACTGAGGCGCATTTAAGTAATATTAATAAATTAAGT

2398 CAGTTAAATCTAAATTGTGAATACATCATTTTTGATAATCATGACAGCCTATTCGTTAAAAATGACAGC

67 TATGCTTATATGAAAAAATATGATGTCGGCATGAATTTCTCAGCATTAACACATGATTGGATCGAGAAA

2536 ATCAATGCGCATCCACCATTTAAAAAGCTCATTAAAACTTATTTTAATGACAATGACTTAAAAAGTATG

2605 AATGTGAAAGGGGCATCACAAGGTATGTTTATGACGTATGCGCTAGCGCATGAGCTTCTGACGATTATT

2674 AAAGAAGTCATCACATCTTGCCAGTCAATTGATAGTGTGCCAGAATATAACACTG AGGATATTTGGTTC

2743 CAATTTGCACTTTTAATCTTAGAAAAGAAAACCGGCCATGTATTTAATAAAACATCGACCCTGACTTAT

2812 ATGCCTTGGGAACGAAAATTACAATGGACAAATGAACAAATTGAAAGTGCAAAAAGAGGAGAAAATATA

2881 CCTGTTAACAAGTTCATT ATTAATAGTATAACTCT ATAA stop

3' ·· ·« ··«« « ♦ t ···

·· <

• · • « · • ·

« ·· • · · • *«· ·· '··

ID NO:3 - Typ F PmCS pro PM chondroitin syntázu

MNTLSQAIKAYNCNDYELALKLFEKSAETYGRKIVEFQIIKCKEKLSTNSYVSEDNSYVS EDKKNSVCDSSLDIATQLLISNVKKLTLSESEKNSLKNKWKSITCKKSENAEIRKVELVP KDFPKDLVLAPLPDHVNDFTWYKNRKKRLGIKPVNKNIGLSIIIPTFNRSRILDITLACL vnqktnypfevwaddgskenlltivqkyeqkldikyvrqkdygyqlcavrnlglrtaky DFVSILDCDMAPQQLWVHSYLTELLEDIDIVLIGPRKYVDTHNITAEQFLNDPYLIESLP ETATNNNPSITSKGNISLDWRLEHFKKTDNLRLCDSPFRYFVAGNVAFSKEWLNKVGWFD EEFNHWGGEDVEFGYRLFPKGCFFRVIDGGMAYHQEPPGKENETEREAGKSITLKIVKEK VPYIYRKLLPIEDSHIRRIPLVSIY1PAYNCANYIQRCVDSALRQTWDLEVCICKDGST DNTIEVINKLYGNNPRVRIMSKPNGGIASASNAAVSFAKGYYIGQLDSDDYVEPDAVELC LKEFLKDKTLACVYTTNRNVUPDGSLIANGYNWPEFSREKLTTAMIAHHFRMFTIRAWHL ' TDGFNENIENAVDYDMFLKLSEVGKFKHLNKICYNRVLHGDNTSIKKLGIQKKNHFVWN QSLNRQGINYYNYDKFDDLDESRKYIFNKTAEYQEEIDMLKDLKLIQUKDAKIAVSIFYP NTLNGLVKKLNNIIEYNKNIFVIILHLDKNHLTPDIKKEILAFYHKHQVNILLNNDISYY TSNRLIKTEAHLSNINKLSQLNLNCEYIIFDNHDSLFVKNDSYAYMKKYDVGMKFSALTH DWIEKINAHPPFKKLIKTYFNDNDLRSMHVKGASQGMFMKYALRHALLTIIKEVITSCQS IDSVPEYNTEDIWFQFALLILEKKTGHVFNKTSTLTYMPWERKLQWTNEQIQSAKKGENI PVNKFIINSITL

Claims (85)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Segment čištěné nukleové kyseliny obsahující kódující region, enkodující enzymaticky aktivní hyaluronát syntézu z Pasturella multocida.
2. 2. Segment čištěné nukleové kyseliny podle nároku 1, přičemž tento segment čištěné nukleové kyseliny enkoduje Pasturella multocida hyaluronát syntézu SEQ ID NO: 1.
3. 3. Segment čištěné nukleové kyseliny podle nároku 1, přičemž tento segment čištěné nukleové kyseliny obsahuje nukleotidovou sekvencí v souladu s SEQ ID NO:2.
4. 4. Segment čištěné nukleové kyseliny, který má kódující region, enkodující enzymaticky aktivní hyaluronát syntézu, přičemž tento segment čištěné nukleové kyseliny je schopen hybridizovat na nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:2.
5. 5. Segment čištěné nukleové kyseliny, který má kódující region, enkodující enzymaticky aktivní hyaluronát syntézu, přičemž tento segment čištěné nukleové kyseliny má ve srovnání s nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO:2 semikonzervativní nebo konzervativní změny aminokyselinového kodonu.
6. 6. Rekombinační vektor vybraný ze souboru, do kterého patří plasmid, kosmid, fág nebo virus vektor a přičemž rekombinační vektor dále obsahuje segment čištěné nukleové kyseliny, který má kódující region, enkodující enzymaticky aktivní hyaluronan syntézu z Pasturella multocida.

   • · ·« ···· ·« • * · · · • ··· 9 · * 9 9 9 »
7. 7. rekombinační vektor podle nároku 6, přičemž tento segment čištěné nukleové kyseliny enkoduje

   Pasturella multocída hyalurcnan syntézu SEQ ID NO:1.
8. 8. rekombinační vektor podle nároku 6, přičemž tento segment čištěné nukleové kyseliny obsahuje nukleotidovou sekvenci v souladu s SEQ ID NO:2.
9. 9. rekombinační vektor podle nároku 6, přičemž plasmid dále obsahuje expresní vektor.
10. 10. rekombinační vektor podle nároku 9, přičemž expresní vektor obsahuje promotor operativně navázaný na region, kódující enzymaticky aktivní Pasturella multocída hyaluronan syntázu.
11. 11. Rekombinační buňka hostitele, přičemž tato rekombinační buňka hostitele je prokaryotická buňka transformovaná rekombinačním vektorem, obsahujícím m segment čištěné nukleové kyseliny, který má kódující region, enkódující enzymaticky aktivní hyaluronan syntázu z Pasturella multocída.
12. 12. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 11, přičemž tento segment čištěné nukleové kyseliny enkoduje Pasturella multocída hyaluronan syntázu SEQ ID NO:1.
13. 13. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 11, přičemž tento segment čištěné nukleové kyseliny obsahuje nukleotidovou sekvenci v souladu s SEQ ID NO:2.
14. 14. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 13, přičemž buňku hostitele produkuje hyaluronovou kyselinu.
15. 15. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 11, jejíž enzymaticky aktivní hyaluronan syntáza je schopna produkovat polymer hyaluronové kyseliny, který má módifíkůváhou strukturu.
16. 16. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 11, jejíž enzymaticky aktivní hýáluronan sýrítáža jě schopen produkovat polymer hyaluronové kyseliny, který má modifikovanou distribuci velikostí.
17. 17. Rekombinační buňka hostitele, přičemž tato rekombinační buňka hostitele je eukaryotická buňka transfektovaná rekombinačním vektorem, obsahujícím segment čištěné nukleové kyseliny, který má kódující region, enkodující enzymaticky aktivní hyalurůnaň syntézu z Pasturella multocida.
18. 18. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 17, přičemž tento segment čištěné nukleové kyseliny enkóduje Pasturella multocida hyaluronan syntázu SEQ ID NQ:1.
19. 19. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 17, přičemž tento segment čištěné nukleové kyseliny obsahuje nukleotidovou sekvenci v souladu s SEQ ID NQ:2.
20. 20. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 19, přičemž tato buňka hostitele produkuje hyaluronovou kyselinu.
21. 21. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 17, přičemž enzymaticky aktivní hyaluronan syntáza je schopna produkovat polymer hyaluronové kyseliny, který má modifikovanou strukturu.

    ·* · 4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4· • 4444 444 4 • · · 4 4 4 4

    4·· 444 44 444 44 4
22. 22. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 17, přičemž enzymaticky aktivní hyaluronan syntáza je schopen produkovat polymer hyaluronové kyseliny, který má modifikovanou distribuci velikostí.
23. 23. Rekombinační buňka hostitele, přičemž tato rekombinační buňka hostitele se podrobí elektroporéze za účelem zavedení rekombinačního vektoru do rekombinační buňky hostitele, přičemž rekombinační vektor obsahuje segment čištěné nukleové kyseliny, který má kódující region, enkódující enzymaticky aktivní hyaluronan syntázu z Pasturella multocida.
24. 24. Rekombinační buňka hostitele podlé nároku 23, přičemž tento segment čištěné nukleové kyseliny enkoduje Pasturella multocida hyaluronan syntázu SEQ ID NO;2.
25. 25. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 23, přičemž tento segment čištěné nukleové kyseliny obsahuje nukleotidovou sekvenci v souladu s SEQ ID NO:2.
26. 26. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 25, přičemž buňku hostitele produkuje hyaluronovou kyselinu.
27. 27. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 23, přičemž enzymaticky aktivní hyaluronan syntáza je schopen produkovat polymer hyaluronové kyseliny, který má modifikovanou strukturu.
28. 28. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 23, přičemž enzymaticky aktivní hyaluronan syntáza je schopen • φ

    Ί6 φφ φφφφ • φ φ φ φφφφ • φ φ • φ φ φφ φφφ produkovat polymer hyaluronové kyseliny, který má modifikovanou distribuci velikostí.
29. 29. Rekombínačni buňka hostitele, přičemž tato rekombinační buňka hostitele se transdukujé rekombiňáčňírn vektorem, obsahujícím segment čištěné nukleové kyseliny, který má kódující region, enkódující enzymaticky aktivní hýálúřóňáň syntázu ž Pastuřěllá múltóčidá.
30. 30. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 29, přičemž tento segment čištěné nukleové kyseliny enkoduje Páštúřěllá múltóčidá hýálúřóňáň syntázu SEQ ID NOi 1.
31. 31. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 29, přičemž segment čištěné nukleové kyseliny obsahuje hukléotídOvOu Sěkvéhčí V sóúládú š SEQ ID NO:2.
32. 32. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 31, přičemž tato buňka hostitele produkuje hyáluróňovou kyselinu.
33. 33. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 29, přičemž enzymaticky aktivní hyaluronan syntáza je schopna produkovat polymer hyaluronové kyseliny, který má modifikovanou strukturu.
34. 34. Rekombinační buňka hostitele podle nároku 29, přičemž enzymaticky aktivní hyaluronan syntáza je schopna produkovat polymer hyaluronové kyseliny, který má modifikovanou distribuci velikosti.
35. 35. Čištěná kompozice, přičemž tato čištěná kompozice obsahuje enzymaticky aktivní hyaluronan syntázu polypeptidu z Pasturella multocida.

    4 4 • 4 • 4 • 444 • 4 • 444 • · • · • 4 4
36. 36. Čištěná kompozice, přičemž čištěná kompozice Obsahuje a polypeptide, která má aminokyselinovou sekvenci v souladu s SEQ ID NO:1.
37. 37. Způsob detekce druhu DNA, při kterém se provádějí následující kroky :

    získání vzorku DNA;

    uvedení vzorku DNA do kontaktu se segmentem čištěné nukleové kyseliny, jenž je v souladu s SEQ ID NO:2;

    hybridizaci DNA vzorku a segmentu čištěné nukleové kyseliny, kterou se vytvoří hybridizovaný komplex;

    a detekci komplexu.
38. 38. Způsob detekce buňky bakterie která exprimuje mRNA enkódující Pasturella multocida hyaluronan syntázu, při kterém se provádějí následující kroky:

    získání vzorku buněk bakterie ;

    uvedení alespoň jedné nukleové kyseliny z buňky vzorku bakterie se segmentem čištěné nukleové kyseliny v souladu s SEQ ID NO:2;

    hybridizaci alespoň jedné nukleové kyseliny a segmentu čištěné nukleové kyseliny, kterou se vytvoří hybridizovaný komplex; a

    • · • · • · • · · · • ··· ♦ · • · • · • · • · • · » · • **· • · ·· • ·

    detekci hybridizovaného komplexu, přičemž přítomnost hybridizovaného komplexu je indikativní pro bakteriální kmen, který exprimuje mRNA, enkodující Pasturella multocida hyaluronan syntázu.
39. 39. Způsob výroby hyaluronové kyseliny, při kterém se provádějí následující kroky zavádění segmentu čištěné nukleové kyseliny z

    Pasturella multocida, který má kódující region, enkodující enzymaticky aktivní hyaluronan syntázu do hostitelského organismu, přičemž hostitelský organismus obsahuje segmenty nukleové kyseliny, enkodující enzymy které produkují UDP-GlcNAc a UDP-GlcA;

    pěstování hostitelského organismu v živném prostředí za účelem vylučování hyaluronové kyseliny; a získávání vylučované hyaluronovou kyselinu.
40. 40. Způsob podle nároku 39, přičemž krok získávání hyaluronové kyseliny zahrnuje extrakci vyloučené hyaluronové kyseliny z media.
41. 41. Způsob podle nároku 40, dále obsahující krok čištění extrahované hyaluronové kyseliny.
42. 42. Způsob podle nároku 39, přičemž v kroku pěstování hostitelského organismu tento hostitelský organismus vylučuje strukturně modifikovanou hyaluronovou kyselinu.

    • · 4 · • 4 • 4

    4 4

    444 444 •• 4 4 4 4 • 4 444 4 4 • · · 4 4 4 • 4 4 4 4 ·· 444 44 4
43. 43. Způsob podle nároku 39, ve kterém v kroku pěstování hostitelského organismu tento hostitelský organismus vylučuje hyaluronovou kyseliňu, která má modifikovanou distribuci velikosti.
44. 44. Farmaceutická kompozice obsahující předem zvolenou fármáčeutičkóu účinnou látku á účinné množství hyáluróňóvé kyseliny, Vyprodukované hyaluronan syntézou z

    Pasturella multocida.
45. 45. Farmaceutická kompozice podle nároku 44, přičemž hyaluronová kyselina je vyprodukovaná Pasturella multocida hyaluronan syntézou se SEQ ID NO:1.
46. 46. Farmaceutická kompozice podlé nároku 44, přičemž molekulová hmotnost hyaluronové kyseliny se modifikuje za účelem produkovat farmaceutickou kompozici s modifikovanou molekulovou hmotností, schopnou vyvolat imunitní odpověď.
47. 47. Farmaceutická kompozice podle nároku 44, přičemž molekulová hmotnost hyaluronové kyseliny je modifikována za účelem produkovat farmaceutickou kompozici s modifikovanou mólěkulóvóú hmotností Schopnou zaciléňí ňá Specifickou bkáft nebo buňku typu, který je v pacientovi, která má afinitu k farmaceutické kompozici s modifikovanou molekulovou hmotností.
48. 48. Čištěná a izolovaná sekvence nukleové kyseliny,, enkodující enzymaticky aktivní hyaluronan syntézu, přičemž tato sekvence nukleové kyseliny je vybrána ze souboru, do kterého patří:

    (á) sekvence nukleové kyseliny v souladu s SEQ ID NO:2;

    (b) k sekvence nukleové kyseliny, která je komplementární k sekvenci nukleové kyseliny, jenž je v souladu s SEQ ID NO:2;

    (c) sekvence nukleové kyseliny, která hybridizuje na nukleovou kyselinu v souladu s SEQ ID NO:2; a (d) sekvence nukleové kyseliny, která hybridizuje na sekvenci nukleové kyseliny, komplementární k SEQ ID NO: 2.
49. 49. Čištěný a izolovaný segment nukleové kyseliny sestávající v podstatě a segment nukleové kyseliny enkódující enzymaticky aktivní hyaluronan syntázu z Pasturella multocida.
50. 50. Prokaryotická nebo eukaryotická buňka hostitele transformovaná nebo transfektovaná segmentem izolované nukleové kyseliny podle nároku 1, 2 nebo 3 takovým způsobem, který umožňuje buňce hostitele exprimovat hyaluronovou kyselinu.
51. 51. Izolovaný segment nukleové kyseliny, sestávající se v podstatě z segmentu nukleové kyseliny enkódujícího hyaluronan syntázu Pasturella multocida, která má segment nukleové kyseliny dostatečně podobný segmentu kyseliny, který je v souladu SEQ ID NO:2, aby umožnil zajištění biologických vlastností enkódování hyaluronan syntézy Pasturella multocida.
52. 52. cDNA sekvence podle nároku 51.

    • · · • · • ·
53. 53. Prokaryotická nebo eukaryotická buňku hostitele transformovaná nebo transfektovaná s a segment nukleové kyseliny podle nároku 51 způsobem, který umožňuje buňce hostitele exprimovat hyaluronovóu kyselinu.
54. 54. Segment čištěné nukleové kyseliny, který má kódující region, enkodující enzymaticky aktivní hyaluronan syntázu z Pasturella multocida přičemž tento segment čištěné nukleové kyseliny je schopen hybridizovat na nukleotidovou sekvencí v souladu s SEQ ID NO:2.
55. 55. Segment čištěné nukleové kyseliny, který má kódující region, enkodující enzymaticky aktivní hyaluronát syntázu Pasturella multocida, přičemž tento segment čištěné nukleové kyseliny je vybraný ze souboru, do kterého patří:

    (A) segment nukleové kyseliny podle SEQ ID NO: 1;

    (B) nukleotidovou sekvenci v souladu s SEQ ID NO: 2;

    (C) segmenty nukleové kyseliny, které hybridizují na segmenty nukleové kyseliny definované v (A) nebo (B) nebo její fragmenty; a (D) segmenty nukleové kyseliny, které pouze pro degeneraci genetického kódu nebo enkodování funkčně ekvivalentních aminokyselin, hybridizují na segmenty nukleové kyseliny, definované v (A), (B) a (C) .
56. 56. Způsob vytváření vakcíny pro Pasturella multocida, při kterém se provádějí následující kroky :

    »0 «000 00 • · · 0 0 0

    0 0 000 0 0 • 00 «000 • · 0 0 0 ·« 000 00 0 vytvoření a přerušení kapsulové genové kazety na nereplikujícím plasmidu;

    zavádění přerušené genové kazety do kmene Pasturella, který má chromosomální gen;

    rekombinace ohromozomového genu kmene Pasturella přerušenou genovou kazetou, čímž se tvoří mutantní kmeny Pasturella;

    screening mutantních kmenů Pasturella; a výběr vhodného mutantního kmene pro použití jako vakciny.
57. 57. Živá oslabená vakcína pro Pasturella multocida, vybraná ze souboru, sestávajícího z:

    - kmene Pasturella s alespoň jedním přerušeným kapsulárním genem;

    - kmen Pasturella s přerušeným kapsulárním místem;

    - kmen Pasturella s přerušeným genem biosyntézy polysacharidu;

    - kmen Pasturella s přerušeným genem polysacharid syntázy; a

    - kmen Pasturella s přerušeným genem HA syntázy.
58. 58. Způsob detekce Pasturella multocida infekce u hospodářských zvířat, při kterém se provádějí následující kroky :

    ·· ···« to· to • · · to to toto • to tototo to to to ♦ toto to··· to • · · · · · *· ··· ·· ··· vytvoří se kapsulární genová sonda nebo směs sond, schopná hybridizovat s DNA extraktem bakteriálního vzorku, odebraným z živočicha;

    inkubuje se sonda kapsulárního genu bakteriálního vzorku v hybridizační reakční komoře; a působí se hybridizačním detekčním systémem, schopným rozpoznat komplementaritu u bakteriálních vzorků.
59. 59. Diagnostická testovací souprava k detekcí Pasturella multocida u hospodářských zvířat, obsahující:

    primérní pár kapsulárního genu PCR nebo směs primárních párů, schopný(ou) zesílení DNA extraktu bakteriálního vzorku ze vzorku odvozeného od zvířete prostředky k provádění termální cyklizače PCR s primérem kapsulárního PCR genu bakteriálních vzorků, a tím poskytnout amplikony; a prostředky k detekci amplikonů; a prostředky pro rozdělení amplikonů do kapsulárně specifických skupin.

    • 4 • · • 4 • 4 •44 444 • 4 44»· « · • 444 ·« 4
60. 60. Segment čištěné nukleové kyseliny podle nároku 1, přičemž tento segment čištěné nukleové kyseliny enkoduje Pasturella multocida chorídroitin syntézu se sekvencí

    SEQ ID NO:3.
61. 61. Segment nukleové kyseliny obsahující kódující region, enkodující hyaluronát syntázu.
62. 62. Segment nukleové kyseliny, který má kódující region, enkodující enzymaticky aktivní hyaluronát syntázu.
63. 63. Segment čištěné riukleóvé kyseliny, který má kódující region, enkodující enzymaticky aktivní hyaluronát syntézu.
64. 64. Rekombinační vektor přičemž rekombinační vektor dále obsahuje a segment nukleové kyseliny, který má kódující region enkodující hyaluronan syntázu.
65. 65. Rekombinační buňka hostitele, přičemž rekombinační host buňka je transformovaná rekombinačním vektorem obsahující a segment nukleové kyseliny, který má kódující region, enkodující hyaluronan syntázu.
66. 66. Rekombinační buňka hostitele, přičemž rekombinační host buňka je transfektovaná rekombinačním vektorem obsahující a segment nukleové kyseliny, který má kódující region, enkodující hyaluronan syntázu
67. 67. Rekombinační buňka hostitele, přičemž tato rekombinační host buňka má elektroporeticky zavedený rekombinační vektor, který obsahuje segment nukleové kyseliny, který má kódující region, enkodující hyaluronan syntázu.

    ΦΦΦΦ φ · φ φφφφ φφφ φ φ
68. 68. Rekombinační buňka hostitele, přičemž rekombinační host buňka se transdukuje tekombinačním vektorem obsahující segment nukleové kyseliny, který má kódující region, enkodující hyaluronan syntázu.
69. 69. Kompozice, přičemž tato kompozice obsahuje polypeptide hyaluronan syntázy.
70. 70. Kompozice, přičemž tato kompozice obsahuje a polypeptide, která má aminokyselinovou sekvenci v souladu s SEQ ID NO:1.
71. 71. Způsob detekce druhu DNA, při kterém se provádějí následující kroky:

    uvádění vzorku do kontaktu se segmentem nukleové kyseliny; a hybridizace DNA vzorku a segmentu nukleové kyseliny, čímž se vytvoří hybridizovaný komplex.
72. 72. Způsob detekce buňky bakterie, která exprimuje mRNA enkodující hyaluronan syntázu, při kterém se provádějí následující kroky:

    uvádí se do kontaktu alespoň jedna nukleová kyselina z bakteriální buňky vzorku se segmentem nukleové kyseliny; a hybridizuje se alespoň jeden segment nukleové kyseliny, čímž se vytvoří hybridizovaný komplex.
73. 73. Způsob výroby nyaiuronové kyseliny, při kterém se provádějí následující kroky:

    zavádí se segment nukleové kyseliny, který má kódující region, enkodující hyaluronan syntázu do organismu hostitele; a pěstuje se hostitelský organizmus v živném prostředí, aby se vylučovala kyseliny hyaluronová
74. 74. Farmaceutická kompozice, obsahující farmaceuticky účinnou látku a účinné množství hyaluronové kyseliny, produkované hyaluronan syntázou.
75. 75. Sekvence nukleové kyseliny, enkodující hyaluronan syntázu, vybraná ze souboru, do kterého patří:

    (a) sekvence nukleové kyseliny v souladu s SEQ ID N0:2;

    (b) sekvence nukleové kyseliny komplementární k sekvenci nukleové kyseliny, která je podle SEQ ID NO:2;

    (c) sekvence nukleové kyseliny, která hybridizuje na nukleovou kyselinou v souladu s SEQ ID NO:2; a (d) sekvence nukleové kyseliny, která hybridizuje na sekvenci nukleové kyseliny, komplementární k SEQ ID NO:2.
76. 76. Segment nukleové kyseliny, obsahující segment nukleové kyseliny enkodující hyaluronan syntézu.
77. 77. Buňka hostitele, transformovaná nebo transfektovaná segmentem nukleové kyseliny podle nároku 1, 2 nebo 3 způsobem, umožňujícím buňce hostitele exprimovat hyaluronovou kyselinu.
78. 78. Segment nukleové kyseliny, obsahující segment nukleové kyseliny enkodující hyaluronan syntézu, která má segmeriL nukleové kyseliny dosLalečně duplikativní na segment, nukleové kyseliny, jenž je v souladu s SEQ ID NO:2, aby umožnil udržení biologické vlastnosti enkodování hyaluronan syntézy.
79. 79. Buňka hostitele, transformovaná nebo transfektovaná se segmentem nukleové kyseliny podle nároku 78, způsobem, umožňujícím hostitelské buňce exprimovat hyaluronovou kyselinu.
80. 80. Segment nukleové kyseliny, který má kódující region, enkodující hyaluronan syntézu, přičemž tento segment nukleové kyseliny je schopen hybridizovat na nukleotidovou sekvenci v souladu s SEQ ID NO:2.
81. 81. Segment nukleové kyseliny, který má kódující region, enkodující hyaluronát syntézu, přičemž tento segment nukleové kyseliny je vybraný ze souboru, do kterého patří:

    (A) segment nukleové kyseliny v souladu s SEQ ID NO: 1;

    (B) nukleotidovou sekvenci v souladu s SEQ ID NO: 2;

    • · ······ ·· ·· · · ··· · · · • · ····· · · ··· · · · ·· · · · ·· · (C) segmenty nukleové kyseliny, které hybridizují na segmenty nukleové kyseliny definované v (A) nebo (B) nebo jejich fragmenty; a (D) segmenty nukleové kyseliny, který buď z důvodů degenerace genetického kódu nebo z důvodů enkodování funkčního ekvivalentu aminokyselin, může hybridizovat na segment nukleové kyseliny, definovaný v (A), (B) a (C).
82. 82. Způsob výroby vakciny, při kterém se provádějí následující kroky:

    vytvoření kazety s přerušeným kapsulárním genem na nereplikujícím plasmidu;

    zavedení kazety s přerušeným genem do bakteriálního kmene, který má chromozomový gen;

    rekombinace chromozomového genu bakteriálního kmene s kazetou s přerušeným genem, kterou se vytvoří mutantní bakteriální kmeny;

    screening mutantních bakteriálních kmenů; a

    Výběr vhodného mutantního kmene pro použití jako vakciny.
83. 83. Vakcína, vybraná ze souboru, do kterého patří:

    • · ······ ·«

    44 44 444 444

    4 4 44444 44

    4 4 4 · · 4444

    4 4 4 4 4 4 4

    444 444 44 444 44 4 bakteriální kmen s alespoň.jedním přerušeným kapsulárním genem;

    bakteriální kmen s přerušeným kapsulárním místem;

    bakteriální kmen s přerušeným genem biosyntézy polysacharidů;

    bakteriální kmen s přerušeným genem polysacharid syntázy;

    bakteriální kmen s přerušeným genem HA syntázy.
84. 84. Způsob detekce bakteriální infekce, při kterém se provádějí následující kroky:

    získá se kapsulární genová sonda nebo směs. sond, schopná hybridizovat s DNA extraktem bakteriálního vzorku odebraným z živočicha;

    - inkubuje se sonda kapsulárního genu bakteriálního vzorku v hybridizační reakční komoře; a

    - působí se hybridizačním detekčním systémem, schopným rozlišit komplementaritu bakteriálních vzorků.
85. 85. Diagnostický testovací souprava pro detekci bakterií, obsahující:

    - primérní pár kapsulárního genu PCR nebo směs primárních párů, schopný(ou) zesílit DNA extrakt bakteriálního vzorku ze vzorku, odvozeného od živočicha;

    • · · · • ·« · · · · ·

    - prostředky k provádění termální cyklické PCR s primérem kapsulárního genu PCR a bakteriálními vzorky, a tím získat amplikony;

    - prostředky k detekci amplikonů; a

    - prostředky k rozdělení amplikonů do kapsulárně specifických skupin.