KR101736790B1 - 바실러스, 히알루론산 효소, 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

보존 번호 CGMCC 5744를 갖는 바실러스를 제공한다. 상기 바실러스에 의해 생산된 히알루론산 효소의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타낸 바와 같다. 또한 상기 바실러스를 사용하거나 또는 상기 바실러스에 의해 생산된 히알루론산 효소를 사용하는 히알루론산 올리고머 및 그의 염의 제조 방법, 또는 저분자량 히알루론산 또는 그의 염의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조된 히알루론산 올리고머 염 또는 저분자량 히알루론산 염은 양호한 경피 흡수, 높은 순도, 무 세포독성, 및 강한 내산화성과 같은 이점들을 갖는다. 또한 화장품, 식품 및 의학 분야에서 보존번호 CGMCC 5744를 갖는 바실러스, 상기 바실러스에 의해 생산된 히알루론산 효소, 히알루론산 올리고머 또는 그의 염, 및 저분자량 히알루론산 및 그의 염의 용도를 제공한다.

Description

바실러스, 히알루론산 효소, 및 그의 용도{BACILLUS, HYALURONIC ACID ENZYME, AND USES THEREOF}
본 발명은 효소학 및 약품 화학의 분야에 관한 것이며, 바실러스 스페시즈, 히알루로니다제 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 올리고머성 히알루론산 또는 그의 염 또는 저분자량 히알루론산 또는 그의 염의 제조 방법, 및 상기 바실러스 스페시즈, 히알루로니다제, 올리고머성 히알루론산 또는 그의 염, 저분자량 히알루론산 또는 그의 염의 용도에 관한 것이다.
히알루론산(HA)은 N-아세틸글루코스아민 및 D-글루쿠론산 다이사카라이드 반복 단위로 이루어지는 분지되지 않은 고분자량 글리코스아미노글리칸인 산 뮤코폴리사카라이드이며, 동물 조직의 세포간 물질 중에 또는 일부 세균의 캡슐 중에 존재한다. 히알루론산은 약물, 화장품 및 식품에 광범위하게 사용되며, 대개는 105 내지 107 Da(달톤)의 분자량을 갖는다.
올리고머성 히알루론산은 10 k Da 미만의 분자량을 갖는 히알루론산을 지칭한다. 연구자들은 분자량이 히알루론산의 활성에 현저한 영향을 미치며 상이한 분자량을 갖는 히알루론산은 완벽히 역전된 활성을 가질 수도 있음을 보인다(문헌[GUO, Xueping, et al, Low-molecular-weight and Oligomeric hyaluronic acids, Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics, 2003, 24(3): 148-150]).
연구자들은 올리고머성 히알루론산이 생체내에서 혈관형성을 촉진하는 활성뿐만 아니라 시험관내에서 내피세포의 증식을 촉진하는 활성을 가지며, 상처 치유를 촉진할 수 있음을 보인다(문헌[West DC, Kumar S. The effect of hyaluronate and its oligosaccharides on endothelial cell proliferation and monolayer integrity. Exp Cell Res. 1989, 183(1): 179-96]). 올리고머성 히아루로네이트는 혈관형성을 촉진하고, 상처 치유를 촉진하는 생물 활성을 가지며, 의학 및 약학 분야에 양호한 적용 전망을 갖는다.
염증 과정 동안, 올리고머성 히알루론산은 수지상 세포 및 대식세포와 같은 면역적격 세포에 대해 효능 있는 활성화 효과를 갖는다(문헌[Termeer C, Benedix F, Sleeman J, et al. Oligosaccharides of Hyaluronan activate dendritic cells via toll-like receptor 4. J Exp Med. 2002, 195(1):99-111]).
시험관내에서, 올리고머성 히알루론산은 마우스 TA3/St 유방암 세포, 래트 CG 신경교종, 인간 HCT 클론 종양 세포 및 인간 LXI 폐암 세포의 생육을 억제할 수 있으며, 항-종양 작용을 갖는다(문헌[Ghatak S, Misra S, Toole BP. Hyaluronan constitutively regulates ErbB2 phosphorylation and signaling complex formation in carcinoma cells. J Biol Chem. 2005, 280(10): 8875-83]).
또한, 올리고머성 히알루로네이트 중의 하이드록실기, 카복실기 및 다른 극성기들은 물 분자와 수소 결합을 형성하여 다량의 물과 결합하며, 이에 의해 현저한 수분 보유 효과를 가질 수 있다. 따라서, 올리고머성 히아루로네이트를 일광 차단, 노화 방지 및 보습 화장품에 사용할 수 있다.
현재, 히알루론산의 분해 방법은 주로 3 개의 그룹, 즉 물리적 분해, 화학적 분해 및 생물학적 분해로 분류된다. 물리적 분해 방법은 히알루론산을 10 k Da 이하로 거의 분해할 수 없다. 화학적 분해 방법 및 효소적 방법이 올리고머성 히알루론산을 제조할 수 있지만, 화학적 분해 방법은 올리고머성 히알루론산의 제조에서 최대 분해도에 도달하기 위해서 매우 심한 반응 조건(예를 들어 높은 산염기 농도)을 필요로 한다. 바로 그때, 사카라이드 쇄의 글루코사이드 결합이 파괴되고, 모노사카라이드(글루쿠론산 및 아세틸글루코스아민) 잔기의 구조가 또한 파괴된다, 예를 들어 가수분해에 의한 아세틸기의 제거 및 모노사카라이드의 6-원 고리의 파괴(표시는 유럽 약전의 표준 스펙트럼과 적외선 스펙토그램의 불일치이다)는 상기 수득된 올리고머성 히알루론산의 생물 활성에 영향을 미친다(문헌[GUO Xueping, et al, Low-molecular-weight and Oligomeric Hyaluronic Acid, Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics, 2003, 24 (3): 148-150]). 화학적 분해 방법에 의해 제조된 올리고머성 히알루론산은 갈변하는 경향이 있으며(중국 특허 출원 제 201110008110.9 호), 그의 생산 방법은 환경을 오염시킬 수도 있다. 히알루론산을 효소적 방법에 의해 제조하는 경우, 오직 모노사카라이드들 간의 글루코사이드 결합만이 파괴되며, 다른 구조들은 파괴되지 않는다. 또한, 효소적 방법은 보통의 반응 조건들을 사용하며, 강산 및 강염기를 사용하지 않는다. 상기 수득된 올리고머성 히알루론산은 갈변하는 경향이 없고 환경오염을 피하며, 효소적 방법에 의해 제조된 올리고머성 히알루론산은 완전한 구조를 갖고 그의 적외선 스펙트럼은 유럽 약전의 표준 스펙트럼과 일치한다. 따라서, 효소적 방법이 올리고머성 히알루론산의 제조에 가장 적합하다.
히알루론산의 분해에 사용되는 효소는 주로 히알루로니다제(또한 "파이산매"라 칭한다)이며, 이는 그의 기전에 따라 3 개의 그룹으로 분류될 수 있다: (1) 엔도-β-N-아세틸글루코스아미니다제, 상기는 하이드롤라제이며, β-1,4-글루코사이드 결합상에서 작용하고, 주 생성물이 테트라사카라이드이며, 콘드로이틴 또는 콘드로이틴 설페이트상에서 작용할 수 있고, 트랜스글리코시다제 활성을 갖는다; (2) 히루도 또는 구충으로부터 유래된 히알루로니다제, 상기는 엔도-β-글루쿠로니다제이고, β-1,3-글루코사이드 결합상에서 작용하며, 또한 하이드롤라제이고, 주 분해 산물은 테트라사카라이드이며, 히알루론산을 특이적으로 분해할 수 있다; (3) 세균성 히알루로니다제, 상기는 또한 히알루로네이트 라이아제라 지칭되며, β-1,4-글루코사이드 결합상에서 작용하고, β-제거 기전을 통해서 4,5-불포화된 다이사카라이드를 생성시킨다(문헌[Kreil, G, Hyaluronidases -- a group of neglected enzymes, Protein Sci, 1995, 4(9): 1666-1669]).
현재, 올리고머성 히알루론산 또는 그의 염의 산업적인 생산 방법은 화학적 분해 방법이다. 히알루로니다제를 함유하는 동물 조직의 공급원은 제한되기 때문에, 일부 보고서는 미생물-공급된 히알루로니다제 발효 브로쓰가 단위당 보다 낮은 효소 활성을 가지며 발효 브로쓰의 최대 효소 활성은 1.3 x 102 IU/㎖임을 보이고(WO2010130810A1; 문헌[Eileen Ingham, K.T. Holland, G.Gowland and W.J. Cunliffe, Purification and Partial Characterization of Hyaluronate Lyase (EC4.2.2.1) from Propionibacterium acnes, Journal of General Microbiology(1979),115,411-418]), 다른 보고서들은 모두 100 IU/㎖ 미만의 효소 활성, 및 히알루로니다제가 대규모로 생산될 수 없으며 따라서 올리고머성 히알루론산 또는 그의 염을 효소적 방법에 의해 대규모로 생산할 수 없음을 보인다.
또한, 104 Da 내지 106 Da의 분자량을 갖는 히알루론산을 대개는 저분자량 히알루론산(LMW-HA)이라 칭한다. 20,000 내지 60,000의 분자량을 갖는 LMW-HA는 시험관내에서 배양된 뼈 세포의 증식을 자극하고, 배양 배지 중의 뼈 세포 콜로니의 수 및 단일 콜로니의 면적을 증가시킬 수 있다(US 5646129). 세균성 각막궤양의 치료에 토브라마이신 및 500,000의 분자량을 갖는 HA를 함유하는 점안제를 사용함으로써, 토브라마이신만을 함유하는 점안제에 비해 치유 시간이 현저하게 단축되었다(문헌[Gandolfi SA, Massari A, Orsoni JG. Low-molecular-weight sodium hyaluronate in the treatment of bacterial corneal ulcers s[J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 1992, 230(1): 20-23]). 대한민국 특허(KR20080087941)는 100,000 미만의 분자량을 갖는 HA의 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 인체에 흡수되기 쉽고, 그의 경구 투여는 피부 주름을 유효하게 제거하고 피부 탄력을 개선시킬 수 있다. 일본 특허(JP2000-103723)는 200,000 내지 400,000의 분자량을 갖는 HA를 함유하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 모발 성장을 촉진할 수 있다. 그러나, 올리고머성 히알루론산 또는 그의 염과 유사하게, 효소적 분해 방법에 의해 제조된 바와 같은 LMW-HA 또는 그의 염은 화학적 방법에 의해 제조된 경우보다 구조적으로 보다 완전하며, 화학적 방법에 의해 제조된 바와 같은 LMW-HA 또는 그의 염은 그의 구조 중에 개환 및 탈아세틸화를 가질 수도 있다.
LMW-HA는 보다 작은 상대 분자량을 가지며, 따라서 외용으로 피부에 의해 잘 흡수되고, 피부 영양 공급 및 노폐물 배출을 촉진하여, 피부 노화를 예방하고, 심부 보습을 성취하며 아름다움을 유지하고, 표피 세포의 증식 및 분화를 촉진하며, 자유 라디칼을 제거할 뿐만 아니라 일광 또는 자외선에 의해 유발된 피부 손상을 보수할 수 있다. 경구 LMW-HA는 흡수되기 쉽고, 피부 세포를 활성화시키며 피부 수분을 유지할 수 있고, 한편 면역-강화 기능 및 노화방지 기능을 충분히 제공한다. 따라서, 화장품 및 건강 식품에 사용되는 HA는 대개 LMW-HA이다. 또한, LMW-HA는 또한 혈관형성, 세포 면역 활성화 및 골형성을 촉진할 수 있고, 세균성 각막궤양의 치료에 양호한 치료 효과를 가지며, 따라서 의학 분야에 광범위하게 사용된다.
LMW-HA는 고분자량 HA를 분해시킴으로써 수득되며, 분해 방법은 주로 3 개의 그룹, 즉 물리적 분해, 화학적 분해 및 생물학적 분해이다. 물리적 분해 방법으로서 초음파 분해 방법은 화학작용제 및 효소가 없지만, 200k Ka 이하의 분자량에 도달하도록 고분자량 HA를 거의 분해시킬 수 없다(문헌[QIN Caifeng, WANG Miao, CHEN Xiaofeng, Studying of Degradation methods and Process Conditions of Hyaluronic Acid, [J]. 2007, 4: 32-36]). 기계적 분쇄 방법이 또한 HA의 상대 분자량을 감소시키기에 유효한 방법이다. 특허는 분쇄 시간이 실온에서 0.5 시간 내지 12 시간이고, 발진 주파수가 10 Hz 내지 30 Hz이나, 이는 대규모 생산에 적합하지 않음을 개시한다(CN101942037A). 화학적 분해 방법은 구조를 파괴할 수도 있으며, 이는 사카라이드 쇄의 글루코사이드 결합을 파괴할 수도 있을 뿐만 아니라 모노사카라이드(글루쿠론산 및 아세틸글루코스아민) 잔기, 예를 들어 아세틸기를 가수분해에 의해 제거하고 모노사카라이드의 6-원 고리를 파괴한다.
일부 보고서들은 효소적 분해 방법에 의한 저분자량 HA의 제조 방법을 보이며, 상기 방법에서 HA를 먼저 단리하고 발효 브로쓰로부터 정제시키며, 이어서 효소적 분해를 위해 히알루로니다제를 가한 다음 멤브레인 여과, 에탄올 침전, 탈수 및 건조를 수행하여 저분자량 HA를 수득하며(CN101020724A), 상기 방법에 사용된 히알루로니다제는 히알루로니다제의 완제품이고, 이는 매우 값비싸며 산업적인 생산에 거의 사용될 수 없다. 현재, 일부 보고서들은 미생물-공급된 히알루로니다제 발효 브로쓰가 단위당 보다 낮은 효소 활성을 가지며 발효 브로쓰의 최대 효소 활성은 1.3 x 102 IU/㎖임을 보이고(WO2010130810A1), 다른 보고서들은 모두 100 IU/㎖ 미만의 효소 활성을 보이며, 따라서 현재 저분자량 HA는 효소적 방법에 의해 대규모로 생산될 수 없다.
발명자들은 예의 연구 노력을 수행하였으며 이에 의해 바실러스뿐만 아니라 히알루로니다제를 수득하였다. 상기 히알루로니다제는 105 IU/㎖ 이하(발효 브로쓰) 및 정제 후 8 x 106 내지 1.5 x 107 IU/㎎의 높은 활성을 가지며, 상기 활성은 현재 문서들에 보고된 최고의 효소 활성보다 훨씬 더 크다. 상기 히알루로니다제는 123 kDa의 분자량, 가장 적합한 온도 42 ℃ 및 가장 적합한 pH 6.5를 가지며, 양호한 열 안정성 및 pH 안정성을 갖는다. 상기 효소는 히알루론산 및 콘드로이틴 설페이트를 촉매적으로 분해할 수 있지만, 나트륨 알기네이트, 헤파린 나트륨, 키토산, 키틴 및 카복시메틸 셀룰로스 나트륨을 분해할 수 없다. 고분자량 히알루론산의 분해에 상기 히알루로니다제를 사용할 때 상기 효소는 높은 반응 속도, 보통의 반응 조건, 적은 환경 오염을 가지며, 따라서 저분자량 히알루론산 및 올리고머성 히알루론산의 대규모 산업적인 생산에 적합하고, 이를 또한 저분자량 콘드로이틴 설페이트(본 발명에서 1,000 내지 10,000의 분자량을 갖는 콘드로이틴 설페이트를 지칭하며, 또한 LMW 콘드로이틴 설페이트라 칭한다)의 생산에 사용할 수 있다. 발효에 상기 바실러스를 사용함으로써 본 발명에서 수득한 히알루로니다제는 고분자량 히알루론산 또는 그의 염의 분해에 유용하며, 상기 효소는 보통의 조건으로, 높은 효소 활성을 나타내고, 작업이 간단하며 환경 오염이 없고; 또한, 상기 수득된 올리고머성 히알루론산 또는 그의 염 또는 저분자량 히알루론산 또는 그의 염은 완전한 구조를 가지며 갈변이 없다. 따라서, 하기의 발명을 제공한다.
본 발명의 하나의 태양은 CGMCC 5744번의 기탁물 수납 번호, 2012년 2월 8일의 기탁일자, 중국 일반 미생물 보존 센터(CGMCC)의 기탁 기관명을 갖는 바실러스 스페시즈에 관한 것이다.
종래 기술의 히알루론산 또는 그의 염의 생물학적 분해에서 낮은 효소 활성, 공급원 제한 및 고비용과 같은 결점들을 극복하기 위해서, 발명자들은 공기로부터 히알루로니다제를 생산하는 바실러스(바실러스 스페시즈) A50을 단리하였으며, 상기 균주를 2012년 2월 8일에, CGMCC 5744번의 기탁물 수납 번호로 중국 일반 미생물 보존 센터(CGMCC)에 기탁하였다.
본 발명의 또 다른 태양은 본 발명의 바실러스를 사용하는 단계를 포함하는, 히알루로니다제의 제조 방법에 관한 것이며; 구체적으로 하기의 단계들을 포함한다:
본 발명의 바실러스에 사면 배양, 종균 배양, 발효 배양, 원심분리, 암모늄 설페이트 분별 침전, 한외여과를 가하여 히알루로니다제를 수득한다.
본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 히알루로니다제의 제조 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
(1) 본 발명의 바실러스에 사면 배양을 가하여 사면 균주를 수득하고;
(2) 상기 사면 균주를 멸균된 종균 배양 배지에 접종하고, 10 내지 24 시간 동안 25 내지 40 ℃, 100 내지 200 rpm의 조건 하에서 배양하여 종균 용액을 수득하고;
(3) 상기 종균 용액을 멸균된 발효 배양 배지에 접종하고, 12 내지 24 시간 동안 25 내지 40 ℃, 100 내지 300 rpm의 조건 하에서 배양하여 히알루로니다제 발효 브로쓰를 수득하고;
(4) 상기 발효 브로쓰를 원심분리에 의해 분리시켜 상등액을 수득하고;
(5) 상기 상등액에 암모늄 설페이트 분별 침전, 여과(예를 들어 0.65 ㎛ 미세여과 멤브레인을 사용하는 여과)를 가하여 조 히알루로니다제를 수득하고;
(6) 상기 단계 (5)에서 침전된 바와 같은 조 히알루로니다제를 포스페이트 완충 용액에 용해시키고, 한외여과에 의해 소분자 불순물을 제거하여 정제된 히알루로니다제를 수득한다.
임의로, 상기 단계 (6)을 하기 (6-1) 내지 (6-3)의 단계에 의해 수행할 수 있다:
(6-1): 상기 단계 (5)의 조 히알루로니다제를 pH 4.5 내지 8.0의 완충 용액에 용해시켜 조 효소 용액을 수득하고; 상기 조 효소 용액을 3.0 x 103 내지 1.4 x 104 Da의 분자 컷오프를 갖는 투석 주머니에 로딩하고, pH 4.5 내지 8.0을 갖는 완충 용액에 넣고, 4 ℃에서 밤새 투석시키고;
(6-2): 상기 투석된 조 효소 용액에 이온 교환 크로마토그래피 분리를 가하고, 여기에서 DEAE 아가로스 젤 FF 매질 및 구배 용리를 위한 0 내지 0.5M NaCl 용액의 크로마토그래피 컬럼 충전이 사용되며, 용출 피크를 수집하고;
(6-3): 상기 단계 (6-2)에서 수득된 히알루로니다제 샘플에 진공 동결 건조를 가하여 히알루로니다제로서 백색 분말을 수득한다.
단계 (6-1) 내지 (6-3)은 히알루로니다제를 추가로 정제하기 위한 것이다.
상기 히알루로니다제의 분리 및 정제를 위한 공정에서, 단계 (6-2)에서 수득된 히알루로니다제는 SDS-PAGE 전기영동에 의해 측정된 97% 이상의 순도를 갖는다.
상기 단계 (1)에서, 사면 배양 배지 100 ㎖당 하기의 성분들을 함유한다: 펩톤 0.2 내지 2.0 g, 효모 분말 0.2 내지 2.0 g, K2HPO4·3H2O 0.05 내지 0.15 g, MgSO4·7H2O 0.05 내지 0.15 g, 글루코스 0.5 내지 1.5 g, 아가 분말 2.0 g; pH를 6.0 내지 8.0으로 조절하고, 사면 배양 온도는 25 ℃ 내지 40 ℃이다.
상기 단계 (2)에서, 종균 배양 배지 100 ㎖당 하기의 성분들을 함유한다: 펩톤 0.2 내지 2.0 g, 효모 분말 0.2 내지 2.0 g, K2HPO4·3H2O 0.05 내지 0.15 g, MgSO4·7H2O 0.05 내지 0.15 g, 글루코스 0.5 내지 1.5 g; pH를 6.0 내지 8.0으로 조절한다.
상기 단계 (3)에서, 발효 배양 배지 100 ㎖당 하기의 성분들을 함유한다: 펩톤 0.2 내지 2.0 g, 효모 분말 0.2 내지 2.0 g, K2HPO4·3H2O 0.05 내지 0.15 g, MgSO4·7H2O 0.05 내지 0.15 g, 글루코스 0.5 내지 1.5 g, 트윈 80 0.05 ㎖; pH를 6.0 내지 8.0으로 조절한다.
염산, 황산 및 인산 중 하나 이상을 사용하여 상기 사면 배양 배지, 종균 배양 배지 및 발효 배양 배지의 pH를 조절한다.
사면, 종균 배양 및 발효를 위한 접종량은 진보적인 작업 없이 종래 기술에서 획득될 수 있다. 종균 배양 배지를 위한 접종량은 발효 배양용 종균 용액의 접종량을 획득하기에 충분하며, 상기 발효 배양 배지에 대한 접종량은 대개 3% 내지 15%이다.
상기 단계 (4)에서, 발효 브로쓰의 원심분리의 회전 속도는 10000 내지 15000 rpm이며, 원심분리 시간은 10 내지 20 분이다.
상기 단계 (5)에서, 암모늄 설페이트 분별 침전은 하기의 단계들을 포함한다: 상등액에 암모늄 설페이트를 가하여 20% w/v 내지 25% w/v의 농도를 성취하고, 상기 생성된 침전물을 여과에 의해 제거하고, 이어서 35% 내지 40% w/v의 농도에 도달할 때까지 암모늄 설페이트를 연속적으로 가하여 히알루로니다제로서 침전물을 수득한다. 본 발명에서, "w/v 농도"는 상등액의 ㎖당 암모늄 설페이트의 질량(g)을 지칭한다.
상기 단계 (6)에서, 포스페이트 완충 용액은 바람직하게는 6.0의 pH, 바람직하게는 50 mmol/L의 농도를 가지며, 상기 농도는 실제로 상황에 따라 변할 수도 있다. 상기 한외여과는 한외여과 멤브레인을 사용한다. 상기 한외여과 멤브레인은 3 x 104 Da의 분자 컷오프를 갖는다.
본 발명의 추가의 또 다른 태양은 선행 항들 중 어느 한 항에 따른 히알루로니다제의 제조 방법에 의해 수득되는 히알루로니다제에 관한 것이다.
본 발명의 바실러스에 의해 생산되는 바와 같은 히알루로니다제는 발효 브로쓰에서 1 x 105 내지 3 x 105 IU/㎖ 이하의 효소 활성을 가지며, 이는 보고된 최고의 효소 활성(1.3 x 102 IU/㎖)보다 훨씬 더 크고, 상기 효소는 높은 열 안정성 및 pH 안정성을 갖는다. 상기 효소가 올리고머성 또는 저분자량 히알루론산을 생산하기 위해 고분자량 히알루론산의 분해에 사용되는 경우, 비용이 현저하게 감소되며 상기 효소를 대규모 생산에 사용할 수 있다. 따라서, 동물로부터 유래된 히알루로니다제의 고비용 문제가 해결된다. 상기는 올리고머성 또는 저분자량 히알루론산의 생물학적 연구 및 생산에 적용시 유망하다.
본 발명은 또한 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩타이드(또는 단백질)에 관한 것이다; 구체적으로 상기 폴리펩타이드(또는 단백질)는 히알루로니다제이다.
본 발명은 또한 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다; 구체적으로 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 서열 또는 서열번호 3의 상보성 서열이다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 또 다른 태양은 본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 히알루로니다제 또는 본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 히알루로니다제를 함유하는 발효 브로쓰를 사용함으로써 10 kDa 초과의 분자량을 갖는 히알루론산 또는 그의 염을 분해시키는 단계를 포함하는, 올리고머성 히알루론산 또는 올리고머성 히알루로네이트의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 올리고머성 히알루론산 또는 올리고머성 히알루로네이트의 제조 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
1) 히알루론산 또는 그의 염의 용액 제조: 10 kDa 초과의 분자량을 갖는 히알루론산 또는 그의 염을 정제수에 가하여 1% w/v 내지 30% w/v의 농도를 갖는 용액을 수득한다;
2) 효소 분해: 상기 단계 1) 용액의 온도를 20 ℃ 내지 48 ℃로 조절하고, pH를 4 내지 9로 조절하고, 이어서 바실러스 히알루로니다제를 상기 용액에 가하고, 상기 히알루론산 또는 그의 염을 목적하는 분자량으로 분해시켜 효소분해 용액을 수득한다;
3) 불활성화: 상기 효소분해 용액을 50 ℃ 내지 90 ℃에서 10 내지 60 분 동안 유지시켜 상기 바실러스 히알루로니다제를 불활성화시킨다;
4) 여과: 용해성 무기염을 상기 불활성화된 w/v에 가하고, 상기가 완전히 용해될 때까지 교반하고, 이어서 0.45 ㎛ 여과 멤브레인을 통해 여과하여 여액을 수득하며, 여기에서 효소적 가수분해산물 100 ㎖ 당 0.1 내지 10 g의 상기 용해성 무기염을 가한다;
5) 침전: 상기 단계 4)의 여액을 상기 여액의 3 내지 20 배 부피의 알콜 또는 케톤과 균일하게 혼합하여 올리고머성 히알루로네이트를 침전시킨다;
6) 탈수 및 건조: 상기 단계 5)의 올리고머성 히알루로네이트 침전물을 분리시키고, 유기 용매로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 올리고머성 히알루로네이트를 수득한다.
본 발명에 따른 올리고머성 히알루론산 또는 올리고머성 히알루로네이트의 제조 방법에서, 단계 1)에서 히알루론산 또는 그의 염 1 ㎏ 당 2 x 107 내지 5 x 107 IU의 바실러스 히알루로니다제를 가한다.
본 발명에 따른 올리고머성 히알루론산 또는 올리고머성 히알루로네이트의 제조 방법에서, 단계 2)에서 효소분해 온도는 35 ℃ 내지 45 ℃이고, 효소분해 pH는 5.5 내지 7.5이며, 히알루론산을 3000 Da 이상 104 Da 미만의 분자량을 갖도록 효소분해한다.
본 발명에 따른 올리고머성 히알루론산 또는 올리고머성 히알루로네이트의 제조 방법은 하기 A 내지 F 중 하나 이상을 충족시킨다:
A. 단계 1)에서, 히알루로네이트를 히알루론산의 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염 및 아연염으로 이루어진 그룹 중에서 선택한다;
B. 단계 2)에서, 산 또는 염기를 사용하여 pH를 4 내지 9로 조절하고, 상기 산을 염산, 빙초산, 황산 및 인산으로 이루어진 그룹 중에서 선택하며, 상기 염기는 수산화 나트륨 또는 수산화 칼륨이다;
C. 단계 3)에서, 효소분해 용액을 55 ℃ 내지 65 ℃에서 20 내지 30 분 동안 유지시켜 바실러스 히알루로니다제를 불활성화시킨다;
D. 단계 4)에서, 상기 용해성 무기염을 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 아연염 및 마그네슘염으로 이루어진 그룹 중에서 선택하고; 상기 염은 바람직하게는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 아연 또는 마그네슘의 클로라이드, 설페이트 또는 나이트레이트이다;
E. 단계 5)에서, 상기 알콜 또는 케톤은 에탄올, 아세톤, 메탄올, 프로판올 또는 아이소프로판올이다;
F. 단계 6)에서, 상기 탈수에 사용된 유기 용매는 케톤 또는 알콜이다.
상기 방법에서, 사용된 바실러스 히알루로니다제, 즉 바실러스(바실러스 스페시즈) A50 CGMCC 5744번의 발효에 의해 수득된 정제된 히알루로니다제의 비활성은 8 x 106 내지 1.5 x 107 IU/㎎이고, 히알루론산 또는 그의 염의 ㎏당 첨가되는 효소의 양은 2 x 107 내지 5 x 107 IU이다. 상기 히알루로니다제는 히알루론산에 대해 양호한 분해 활성을 가지며, 임의의 작은 분자량을 갖는 히알루론산은 적합한 양의 상기 히알루로니다제를 첨가함으로써 수득될 수 있고, 따라서 상기 효소분해 동안, 목적하는 분자량을 갖는 히알루론산을 시간의 길이를 조절함으로써 수득할 수 있다.
또한, 단계 4)는 히알루로니다제와 같은 불순물을 제거하고 생산 순도를 개선시키기 위해서 상기 효소 가수분해산물을 여과하기 위해 여과 멤브레인을 사용한다. 상기 여과 멤브레인은 본 발명의 기공 직경의 필요조건을 충족시키는 한 종래 기술의 통상적인 여과 멤브레인이다. 상기 여과 멤브레인의 기공 직경은 0.45 ㎛이고, 그의 재료는 셀룰로스 에스터, 폴리설폰, 또는 폴리아미드일 수 있다.
상기 단계 6)에서, 탈수에 사용되는 유기 용매는 물과 상호 용해성인 유기 용매이고; 바람직하게 상기 용매는 케톤 또는 알콜, 및 가장 바람직하게 에탄올 및/또는 아세톤이다. 임의의 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 유기 용매를 올리고머성 히알루로네이트 침전물에 가하여 상기 침전물 중의 대부분의 물을 제거한다.
본 발명의 올리고머성 히알루론산 또는 그의 염의 제조 방법은 보통의 조건으로, 생성물 구조의 파괴 없이, 작업이 간단하며, 환경 오염이 없고, 발효 유도된 히알루로니다제의 비용이 저렴하며, 대규모의 산업적인 생산에 적합하고, 상기 제조된 올리고머성 히알루로네이트는 완전한 구조, 양호한 경피 흡수, 높은 순도, 무 세포독성, 강한 산화방지 능력을 가지며, 화장품, 식품 및 약물에 광범위하게 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 또 다른 태양은 본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 올리고머성 히알루론산 또는 올리고머성 히알루로네이트의 제조 방법에 의해 수득되는 올리고머성 히알루론산 또는 올리고머성 히알루로네이트에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 또 다른 태양은, N-아세틸글루코스아민 및 D-글루쿠론산 다이사카라이드를 ≥65%, ≥70%, ≥75%, ≥80%, ≥85%, ≥90% 또는 ≥95% (w/w)의 양으로 갖는 올리고머성 히알루론산 또는 올리고머성 히알루로네이트에 관한 것이며; 구체적으로, N-아세틸글루코스아민 및 D-글루쿠론산 다이사카라이드의 양을 HPLC 방법에 의해 측정한다. 보다 구체적으로, HPLC의 조건은 하기와 같다: 고성능 액체 크로마토그래피 측정을 수행하기 위해서 사카라이드 분석 컬럼을 사용하고; 이동상이 0.4 mol/L의 NaH2PO4 용액이고; 유량이 0.6 ㎖/분이고; 컬럼 온도가 35 ℃이고; 검출 파장이 232 ㎚이고; 샘플 크기가 20 ㎕이다.
예를 들어, 하기의 단계들을 사용할 수 있다:
a. 표준 대조용 용액: 표준 대조군(히알루론산 다이사카라이드 ΔDiHA 나트륨 염, H9649, 시그마)의 양을 칭량하고, 포스페이트 완충 용액(pH 6.0, 5 mmol/L)으로 용해시켜 1 ㎎/㎖ 용액을 제형화하고, 따라서 표준 대조용 용액을 수득한다;
b. 샘플 전처리: 시험하고자 하는 샘플(비교 실시예 1-7, 실시예 13-26에 의해 제조됨)의 양을 칭량하고, 포스페이트 완충 용액(pH 6.0, 5 mmol/L)으로 용해시켜 1 ㎎/㎖ 용액을 제형화한다. 1 ㎖의 샘플 용액에 1000 IU의 히알루로니다제(실시예 10-12에 의해 제조될 수 있다)를 가하고, 여기에 42 ℃ 수욕을 2 시간 동안 가하고; 효소분해 후에, 상기 효소분해 용액을 2 분 동안 비등시켜 상기 효소를 불활성화시키고, 따라서 효소분해 용액 샘플을 수득한다.
상기 효소분해 용액 샘플을 20 ㎖ 메스플라스크로 옮기고, 이동상을 상기 눈금으로 가하고, 균일하게 혼합하고, 여과하여 시험하고자 하는 용액을 수득한다.
c. 표준 대조용 용액의 처리: 1 ㎖의 표준 대조용 용액을 이동상으로 20 배까지 희석하고, 대기 사용을 위해 여과한다.
d. 크로마토그래피 조건: 고성능 액체 크로마토그래피 측정을 수행하기 위해 사카라이드 분석 컬럼을 사용하고; 이동상은 0.4 mol/L NaH2PO4 용액이며; 유량은 0.6 ㎖/분이고; 컬럼 온도는 35 ℃이고; 검출 파장은 232 ㎚이고; 샘플 크기는 20 ㎕이다;
e. 결과 계산: 표준 대조용 및 시험하고자 하는 샘플의 크로마토그래피 분리를 수행하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하고, 히알루론산 다이사카라이드 피크 면적을 외부 표준 방법에 의해 계산한다; 구체적으로 하기의 식을 사용하여 올리고머성 히알루론산 또는 그의 염의 함량(N-아세틸글루코스아민 및 D-글루쿠론산 다이사카라이드의 양으로 나타냄)을 계산한다:
올리고머성 히알루론산 또는 그의 염의 함량: C(%) = (AX x CR x 100)/(AR x WX x (100-h)) x 100%
Ax: 시험하고자 하는 샘플의 히알루론산 다이사카라이드의 피크 면적;
AR: 표준 대조군의 히알루론산 다이사카라이드의 피크 면적;
Wx: 시험하고자 하는 샘플의 양, ㎎;
CR: 표준 대조용 용액의 농도, ㎎/㎖;
h(%)는 시험하고자 하는 샘플의 건조 손실이다.
특정한 방법을 또한 출원 번호 CN102323344A의 중국 특허 출원에서 찾을 수 있으며, 상기 출원의 모든 내용은 본 발명에 참고로 인용된다.
본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 올리고머성 히알루론산 또는 올리고머성 히알루로네이트에 관하여, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량 및 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 1% 미만의 차이를 갖는다.
본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 올리고머성 히알루론산 또는 올리고머성 히알루로네이트는 3000 Da 이상 104 Da 미만의 분자량을 갖는다. 구체적으로, 상기 올리고머성 히알루론산 또는 올리고머성 히알루로네이트를 효소분해 방법에 의해 제조하며(효소 절단 방법); 보다 구체적으로, 본 발명의 히알루로니다제를 사용함으로써 제조한다.
본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 올리고머성 히알루로네이트는 백색 분말 또는 과립이며, 그의 함량은 95% 초과이고, 그의 0.1% 수용액은 6 내지 8의 pH를 갖는다. 그의 적외선 스펙트럼은 유럽 약전의 표준 스펙트럼과 일치하며, 그의 성질은 양호하고, 그의 구조는 파괴되지 않는다.
본 발명의 더욱 또 다른 태양은 저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트의 제조 방법에 관한 것이며, 1000 kDa 초과의 분자량을 갖는 히알루론산 또는 그의 염을 본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 히알루로니다제 또는 본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 히알루로니다제를 함유하는 발효 브로쓰를 사용하여 분해시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트의 제조 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
1) 히알루론산 또는 그의 염의 용액의 제조: 1000 kDa 초과의 분자량을 갖는 히알루론산 또는 그의 염을 정제수에 가하여 0.1% w/v 내지 2% w/v의 농도를 갖는 용액을 수득한다;
2) 효소분해: 상기 단계 1)의 용액의 온도를 20 ℃ 내지 48 ℃로 조절하고, pH를 4 내지 9로 조절하고, 이어서 바실러스 히알루로니다제를 상기 용액에 가하고, 상기 히알루론산 또는 그의 염을 목적하는 분자량으로 분해시켜 효소분해 용액을 수득한다;
3) 불활성화: 상기 효소분해 용액을 50 ℃ 내지 90 ℃에서 10 내지 60 분 동안 유지시켜 상기 바실러스 히알루로니다제를 불활성화시킨다;
바람직하게는 하기의 단계들을 추가로 포함한다:
4) 여과: 용해성 무기염을 상기 불활성화된 효소분해 용액에 가하고, 상기 용액이 완전히 용해될 때까지 교반하고, 이어서 0.45 ㎛ 여과 멤브레인을 통해 여과하여 여액을 수득하며, 여기에서 ℃의 100 ㎖ 당 0.1 내지 10 g의 상기 용해성 무기염을 가한다;
5) 침전: 상기 단계 4)의 여액을 상기 여액의 1 내지 10 배 부피의 알콜 또는 케톤과 균일하게 혼합하여 저분자량 히알루로네이트를 침전시킨다;
6) 탈수 및 건조: 상기 단계 5)의 저분자량 히알루로네이트 침전물을 분리시키고, 유기 용매로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 저분자량 히알루로네이트를 수득한다.
본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트의 제조 방법에서, 단계 1)에서 히알루론산 또는 그의 염 1 ㎏ 당 106 내지 107 IU의 바실러스 히알루로니다제를 가한다.
본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트의 제조 방법에서, 단계 2)에서 효소분해 온도는 35 ℃ 내지 45 ℃이고, 효소분해 pH는 5.5 내지 7.5이며, 히알루론산을 10kDa 내지 1000kDa; 바람직하게는 10kDa 내지 770kDa 또는 10kDa 내지 700kDa 또는 10kDa 내지 600kDa 또는 10kDa 내지 500kDa; 보다 바람직하게는 10kDa 내지 400kDa; 보다 바람직하게는 10kDa 내지 300kDa, 10kDa 내지 200kDa, 10kDa 내지 150kDa, 10kDa 내지 100kDa, 10kDa 내지 50kDa 또는 10kDa 내지 30kDa의 분자량으로 효소분해한다.
본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트의 제조 방법은 하기 A 내지 F 중 하나 이상을 충족시킨다:
A. 단계 1)에서, 히알루로네이트를 히알루론산의 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염 및 아연염으로 이루어진 그룹 중에서 선택한다;
B. 단계 2)에서, 산 또는 염기를 사용하여 pH를 4 내지 9로 조절하고, 상기 산을 염산, 빙초산, 황산 및 인산으로 이루어진 그룹 중에서 선택하며, 상기 염기는 수산화 나트륨 또는 수산화 칼륨이다;
C. 단계 3)에서, 효소분해 용액을 55 ℃ 내지 65 ℃에서 20 내지 30 분 동안 유지시켜 바실러스 히알루로니다제를 불활성화시킨다;
D. 단계 4)에서, 상기 용해성 무기염을 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 아연염 및 마그네슘염으로 이루어진 그룹 중에서 선택하고; 상기 염은 바람직하게는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 아연 또는 마그네슘의 클로라이드, 설페이트 또는 나이트레이트이다;
E. 단계 5)에서, 상기 알콜 또는 케톤은 에탄올, 아세톤, 메탄올, 프로판올 또는 아이소프로판올이다;
F. 단계 6)에서, 상기 탈수에 사용된 유기 용매는 케톤 또는 알콜이다.
본 발명의 추가의 또 다른 태양은 본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트의 제조 방법에 의해 제조되는, 저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트에 관한 것이다.
본 발명의 더욱 또 다른 태양은 N-아세틸글루코스아민 및 D-글루쿠론산 다이사카라이드를 ≥90% 또는 ≥95% (w/w)의 양으로 갖는 저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트에 관한 것이며; 구체적으로, N-아세틸글루코스아민 및 D-글루쿠론산 다이사카라이드의 양을 HPLC 방법에 의해 측정한다. 보다 구체적으로, HPLC의 조건은 하기와 같다: 고성능 액체 크로마토그래피 측정을 수행하기 위해서 사카라이드 분석 컬럼을 사용하고; 이동상이 0.4 mol/L의 NaH2PO4 용액이고; 유량이 0.6 ㎖/분이고; 컬럼 온도가 35 ℃이고; 검출 파장이 232 ㎚이고; 샘플 크기가 20 ㎕이다. 구체적인 방법은 또한 상기 올리고머성 히알루론산 또는 그의 염의 함량(N-아세틸글루코스아민 및 D-글루쿠론산 다이사카라이드의 함량)을 측정하기 위한 상기 방법을 지칭할 수 있다.
본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트는 10kDa 내지 1000kDa; 바람직하게는 10kDa 내지 770kDa 또는 10kDa 내지 700kDa 또는 10kDa 내지 600kDa 또는 10kDa 내지 500kDa; 보다 바람직하게는 10kDa 내지 400kDa; 보다 바람직하게는 10kDa 내지 300kDa, 10kDa 내지 200kDa, 10kDa 내지 150kDa, 10kDa 내지 100kDa, 10kDa 내지 50kDa 또는 10kDa 내지 30kDa의 분자량을 갖는다. 구체적으로, 상기 저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트는 효소분해 방법(효소 절단 방법)에 의해서 제조되고; 보다 구체적으로 본 발명의 히알루로니다제를 사용함으로써 제조된다.
본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트에 관하여, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량 및 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 1% 미만의 차이를 갖는다.
임의의 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 동일한 양의 효소가 사용될 때, 상이한 분자량을 갖는 히알루론산이, 상이한 효소분해 시간을 조절함으로써 수득될 수 있다, 즉 적합한 효소분해 시간을 조절함으로써 저분자량 히알루론산 또는 올리고머성 히알루로네이트를 수득할 수 있다. 그러나, 실제로, 효소 활성은 긴 시간 후에 감소될 수도 있으며, 히알루로네이트의 용액이 세균으로 요염될 수 있고, 따라서 바람직하게는 상이한 분자량을 갖는 히알루론산을 상이한 양의 효소의 첨가를 조절함으로써 수득된다, 예를 들어 저분자량 히알루로네이트의 제조는 적은 양의 효소가 필요한 반면, 올리고머성 히알루로네이트의 제조는 보다 많은 양의 효소를 필요로 한다.
상기 생성물의 분자량을 구간 방식으로 샘플링함으로써 측정할 수 있다. 상기 올리고머성 히알루로네이트 및 저분자량 히알루로네이트의 분자량을 GPC-MALLS 방법 또는 로랑(Laurent) 방법에 의해 측정할 수 있으며(GPC-MALLS 방법이 더 편리하다); 당해 분야의 숙련가들은 당해 분야의 지식에 따라 검출에 적합한 시간 구간을 선택할 수 있다.
본 발명의 더욱 또 다른 태양은 본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 히알루로니다제, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 본 발명의 재조합 벡터, 본 발명의 재조합 숙주 세포, 또는 본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트를 포함하고; 임의로 약학적으로 허용 가능한 또는 식물학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 조성물에 관한 것이며; 구체적으로 상기 조성물은 화장품, 식품 또는 약물이고; 보다 구체적으로 상기 화장품은 일광 차단, 일광화상 후 보수, 노화방지, 또는 보습용 화장품이다.
본 발명의 추가의 태양은 히알루로니다제의 제조에서 본 발명의 바실러스, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 본 발명의 재조합 벡터, 또는 본 발명의 재조합 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
당해 분야에 공지된 기술적 수단을 사용하여, 본 발명에 따른 히알루로니다제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현 벡터에 클로닝하고, 적합한 숙주 세포에 형질도입시켜, 본 발명의 히알루로니다제를 발현시킬 수 있다.
본 발명은 또한 올리고머성 산 또는 올리고머성 히알루로니다제, 저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트, 또는 저분자량 콘드로이틴 설페이트의 제조에서 본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 히알루로니다제의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 혈관형성의 촉진 및/또는 상처 치유의 촉진, 또는 산화 방지, 또는 유리 라디칼 제거, 또는 일광 차단, 또는 일광화상 후 보수, 또는 HUVEC 세포의 증식 촉진, 또는 종양(예를 들어 유방 종양, 폐암, 또는 신경해면종) 방지, 또는 면역성 증대를 위한 약제의 제조, 또는 식품 또는 건강관리 제품 또는 화장품의 제조에서 본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 올리고머성 산 또는 올리고머성 히알루로네이트, 또는 본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트의 용도에 관한 것이며; 구체적으로 상기 화장품은 일광차단, 일광화상 후 보수, 노화 방지, 또는 보습용 화장품이다.
본 발명의 추가의 또 다른 태양은 환자에게 유효량의 본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 올리고머성 산 또는 올리고머성 히알루로네이트, 또는 본 발명의 항들 중 어느 한 항에 따른 저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트를 투여하거나 또는 사용하는 단계를 포함하는, 생체내 또는 시험관내에서 혈관형성의 촉진 및/또는 상처 치유의 촉진, 또는 산화 방지, 또는 유리 라디칼 제거, 또는 일광 차단, 또는 일광화상 후 보수, 또는 HUVEC 세포의 증식 촉진, 또는 종양(예를 들어 유방 종양, 폐암, 또는 신경해면종) 억제의 방법에 관한 것이며; 구체적으로 상기 환자는 포유동물, 보다 구체적으로 상기 환자는 인간이다.
본 발명에서, 달리 명시되지 않는 한, "올리고머성 히알루론산 또는 올리고머성 히알루로네이트"를 또한 "올리고머성 히알루론산 또는 그의 염"이라 간단히 칭할 수 있으며, 올리고머성 히알루론산 또는 올리고머성 히알루로네이트는 10 kDa 미만; 바람직하게는 3000 Da 이상 104 Da 미만의 분자량을 갖는다. 상기 올리고머성 히알루로네이트의 종류는 특별히 제한되지 않지만, 비제한적으로 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염, 아연염 등을 포함한다.
본 발명에서, 달리 명시되지 않는 한, "저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트"를 또한 간단히 "저분자량 히알루론산 또는 그의 염"이라 칭할 수 있으며, 저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트는 10kDa 내지 1000kDa; 바람직하게는 10kDa 내지 770kDa 또는 10kDa 내지 700kDa 또는 10kDa 내지 600kDa 또는 10kDa 내지 500kDa; 보다 바람직하게는 10kDa 내지 400kDa; 보다 바람직하게는 10kDa 내지 300kDa, 10kDa 내지 200kDa, 10kDa 내지 150kDa, 10kDa 내지 100kDa, 10kDa 내지 50kDa 또는 10kDa 내지 30kDa의 분자량을 갖는다. 상기 저분자량 히알루로네이트의 종류는 특별히 제한되지 않지만, 비제한적으로 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염, 아연염 등을 포함한다.
본 발명에서, 몇몇 성분의 함량의 백분율에 관하여, 달리 명시되지 않는 한, 상기는 중량 백분율(w/w)을 지칭한다.
본 발명의 일부 다른 용어들을 하기에 나타낸다.
발현 벡터
본 발명은 또한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열, 프로모터뿐만 아니라 전사 및 번역 종결 신호를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 상기 다양한 핵산 및 조절 서열들을 함께 결합시켜 재조합 발현 벡터를 제조할 수 있으며, 상기 벡터는 히알루로니다제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 삽입 또는 치환하기 위한 하나 이상의 편리한 제한 부위들을 포함할 수 있다. 또는, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 서열을 함유하는 뉴클레오타이드 구조물을 적합한 발현 벡터에 삽입함으로써 상기 뉴클레오타이드 서열을 발현시킬 수 있다. 상기 발현 벡터의 제조 시, 상기 암호화 서열을, 상기 서열이 적합한 발현 조절 서열에 작동적으로 결합되도록 상기 벡터에 위치시킬 수 있다.
상기 재조합 발현 벡터는, 재조합 DNA 작동을 수행하고 상기 뉴클레오타이드 서열을 발현시키기에 적합한 임의의 벡터(예를 들어 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 상기 벡터를 대개는 상기 벡터의 적합성 및 상기 벡터가 도입되는 숙주 세포에 따라 선택한다. 상기 벡터는 선형이거나 또는 폐쇄된 고리 플라스미드일 수 있다.
상기 벡터는 자기-복제 벡터(즉 염색체 부재 하에서 복제될 수 있는 염색체외 파괴되지 않은 구조), 예를 들어 플라스미드, 염색체외 요소, 소염색체, 또는 인공 염색체일 수 있다. 상기 벡터는 자기 복제를 위한 임의의 기구를 함유할 수 있다. 또는, 상기 벡터는, 숙주 세포에 도입되고, 게놈에 통합되고 상기 벡터가 통합되는 염색체와 함께 복제될 때, 상기와 같은 벡터이다. 또한, 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 2 개 이상의 벡터 또는 플라스미드는 일반적으로 상기 숙주 세포 게놈 내로 도입되는 전체 DNA를 함유하거나, 또는 트랜스포손이 또한 사용될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 벡터는 형질전환된 세포를 선택하기 위한 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 선택성 마커는 상기 생성물에 살생물제 또는 바이러스에 대한 내성, 중금속에 대한 내성을 제공하거나, 또는 영양요구성 양성자이전을 제공하는 유전자이다. 세균성 선택성 마커의 예는 바실러스 서브틸리스, 또는 바실러스 리케니포르미스의 dal 유전자, 또는 항생제, 예를 들어 암피실린, 가나마이신, 클로로마이세틴 또는 테트라사이클린에 대한 내성 마커일 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 벡터는, 숙주 세포 게놈 내로의 상기 벡터의 안정한 통합을 보장하거나, 또는 세포 게놈에 관계 없이 세포에서 상기 벡터의 자기-복제를 보장하는 요소들을 포함한다.
자기-복제에 관하여, 상기 벡터는 표적 숙주 세포에서 자기-복제를 보장하기 위해 복제 기원을 포함할 수 있다. 상기 복제 기원은 상기를 숙주 세포에서 온도-민감성 유형으로 변화시키는 돌연변이를 포함할 수 있다(예를 들어 문헌[fEhrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences 75: 1433]을 참조하시오).
본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 하나 이상의 사본을 유전자 산물의 수율을 증가시키기 위해서 숙주 세포에 삽입할 수 있다. 상기 뉴클레오타이드의 사본수의 증가는 상기 서열의 하나 이상의 추가적인 사본을 숙주 세포 게놈에 삽입하거나, 또는 상기 뉴클레오타이드 서열과 함께 증폭할 수 있는 선택성 마커를 삽입하고, 적합한 선택제의 존재 하에서 세포를 배양하고, 상기 뉴클레오타이드 서열의 추가적인 사본들을 함유하는 세포를 수득하기 위해서, 증폭된 사본을 함유하는 선택성 마커 유전자를 골라냄으로써 수행할 수 있다.
상기 요소들을 결합시켜 본 발명의 재조합 발현 벡터를 제작하는 작업들은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Sambrook, et al, Molecular Cloning Mannual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]을 참조하시오).
숙주 세포
본 발명은 또한 히알루로니다제의 생산을 위한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열(폴리뉴클레오타이드)의 재조합을 위한 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 벡터를, 상기 벡터가 염색체 구성요소 또는 자기-복제 염색체외 벡터의 형태로 유지되도록 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. "숙주 세포"란 용어는 복제 중 돌연변이로 인해 모 세포와 다른 모든 자손들을 포함한다. 상기 숙주 세포의 선택은 주로 히알루로니다제 및 그의 공급원을 암호화하는 유전자에 따른다.
상기 숙주 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포, 예를 들어 세균 또는 효모 세포일 수 있다. 상기 벡터를 당해 분야의 숙련가들에 의해 공지된 기술에 의해 상기 숙주 세포에 도입시킬 수 있다.
제조 방법
본 발명은 또한 (a) 히알루로니다제의 생산에 적합한 조건 하에서 뉴클레오타이드 구조물을 함유하는 숙주 세포를 배양하고(상기 뉴클레오타이드 구조물은 상기 히알루로니다제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다); (b) 상기 펩타이드를 회수함을 포함하는, 본 발명의 히알루로니다제의 재조합 생성 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제조 방법에서, 세포를 히알루로니다제의 생산에 적합한 배양 배지에서 배양한다. 예를 들어 히알루로니다제의 발현 및/또는 분리를 허용하는 조건 하에, 적합한 배양 배지에서, 세포를 소규모 또는 대규모 발효(연속, 배치, 배치 충전 또는 고상 발효를 포함한다)를 위한 진탕 플라스크, 실험용 또는 산업용 발효 탱크에서 배양한다. 탄소원 및 질소원뿐만 아니라 무기염을 함유하는 적합한 배양 배지에서, 당해 분야에 공지된 단계들이 배양에 사용된다. 적합한 배양 배지는 제작자에 의해 제공되거나 또는 공지된 조성(예를 들어 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션의 카탈로그에 있는 것들)에 따라 제조될 수 있다. 히알루로니다제가 배양 배지 내로 분비되는 경우, 이를 상기 배양 배지로부터 직접 회수할 수 있다. 히알루로니다제가 분비되지 않는 경우, 이를 세포 용해 산물로부터 회수할 수 있다.
상기 생성된 히알루로니다제를 당해 분야에 공지된 방법에 의해 회수할 수 있다. 예를 들어, 상기를 통상적인 작업(비제한적으로 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전 포함)에 의해 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
본 발명의 히알루로니다제를 당해 분야에 공지된 단계들에 의해 정제할 수 있으며, 이들 단계는 비제한적으로 크로마토그래피(예를 들어 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크로마토초점화, 및 크기 배제 크로마토그래피), HPLC, 전기영동(예를 들어 예비 등전 초점화), 차별 용해도(예를 들어 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출(예를 들어 문헌[Protein Purification, edited by J.C.Janson and Lars Ryden, VCH Publishers, New York, 1989]을 참조하시오)을 포함한다.
본 발명에서, 올리고머성 히알루론산 또는 그의 염 또는 저분자량 히알루론산 또는 그의 염의 생산에 바실러스를 사용하는 방법은 보통의 조건으로, 작업이 간단하고, 생성물의 구조에 손상이 없으며, 환경 오염이 없고, 발효 공급원으로부터 히알루로니다제의 비용이 저렴하며, 산업적인 대규모 생산에 적합하다. 본 발명의 올리고머성 히알루로네이트 또는 저분자량 히알루로네이트는 완전한 구조, 고 순도, 무 세포독성, 효능 있는 산화방지 능력, 색상 갈변의 부재와 같은 이점들을 가지며, 화장품, 식품 및 약물 분야에 사용될 수 있다.
도 1은 SDS-PAGE 전기이동도이며, 여기에서 마커는 염색되지 않은 단백질 분자량 마커이고; 레인 1, 2, 3은 각각 실시예 10, 11, 12에서 제조된 히알루로니다제이다.
도 2는 상이한 방법들에 의해 제조된 올리고머성 히알루로네이트의 적외선 스펙트럼이고, 여기에서:
도 2a는 유럽 약전에 따른 나트륨 히알루로네이트의 표준 적외선 스펙트럼이고,
도 2b는 비교 실시예 1에서 제조된 올리고머성 히알루로네이트의 적외선 스펙트럼이고,
도 2c는 실시예 13에서 제조된 올리고머성 히알루로네이트의 적외선 스펙트럼이고,
도 2d는 실시예 14에서 제조된 올리고머성 히알루로네이트의 적외선 스펙트럼이고,
도 2e는 실시예 15에서 제조된 올리고머성 히알루로네이트의 적외선 스펙트럼이고,
도 2f는 실시예 16에서 제조된 올리고머성 히알루로네이트의 적외선 스펙트럼이고,
도 2g는 실시예 17에서 제조된 올리고머성 히알루로네이트의 적외선 스펙트럼이고,
도 2h는 실시예 18에서 제조된 올리고머성 히알루로네이트의 적외선 스펙트럼이다.
도 3은 히알루로니다제 활성에 대한 온도의 영향 및 히알루로니다제의 열 안정성의 실험 결과이다. 도 3a는 효소 활성에 대한 온도의 영향이고; 도 3b는 히알루로니다제의 열 안정성의 실험 결과이다.
도 4는 히알루로니다제 활성에 대한 pH의 영향 및 히알루로니다제의 pH 안정성의 실험 결과이다. 도 4a는 효소 활성에 대한 pH의 영향이고; 도 4b는 히알루로니다제의 pH 안정성의 실험 결과이다.
도 5a는 올리고머성 히알루로네이트의 경피적 흡수율의 그래프이다.
도 5b는 올리고머성 히알루로네이트의 DPPH 유리 라디칼 제거 능력의 그래프이다.
도 5c는 저분자량 히알루로네이트의 DPPH 유리 라디칼 제거 능력의 그래프이다.
도 5d는 올리고머성 히알루로네이트의 환원 능력의 그래프이다.
도 5e는 저분자량 히알루로네이트의 환원 능력의 그래프이다.
도 6a는 UVA 조사 후 L929 세포에 대한 올리고머성 히알루로네이트의 보수 효과이다.
도 6b는 UVA 조사 후 L929 세포에 대한 저분자량 히알루로네이트의 보수 효과이다.
도 6c는 UVA 조사에 대한, L929 세포에 대한 올리고머성 히알루로네이트의 보호 효과이다.
도 6d는 UVA 조사 후 L929 세포에 대한 저분자량 히알루로네이트의 보호 효과이다.
본 발명과 관련된 기탁된 생물학적 물질들:
본 발명의 바실러스(바실러스 스페시즈) A50이 2012년 2월 8일자로, 중국 일반 미생물 보존 센터(CGMCC)에, CGMCC 5744번의 기탁물 수납 번호로 기탁되었으며, 상기 기탁 주소는 중국 베이징 100101 챠오양구 웨스트 베이첸 로드 Buld. 1, 3# 소재의 중국 과학원 미생물 연구소이다.
본 발명의 일부 실시태양을 하기의 실시예들과 함께 상세히 예시하지만, 당해 분야의 숙련가들은 하기의 실시예들이 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이지, 본 발명의 범위에 대한 제한으로 간주해서는 안 됨을 알 것이다. 실시예에서 나타내지 않은 특정한 기법 또는 조건들은 당해 분야의 서류들(예를 들어 문헌[J. Sambrook, et al., translated by HUANG Peitang, et al, “Molecular Cloning”, 3rd Edition, Science Press])에 개시된 기법 또는 조건에 따르거나 또는 제품의 명세서에 따라 수행되었다. 제조자가 제공하지 않은 시약들 또는 장비들은 모두 상업적으로 입수할 수 있는 통상적인 것들이었다.
하기의 실시예 또는 비교 실시예에서, 올리고머성 히알루로네이트 및 저분자량 히알루로네이트의 분자량을 GPC-MALLS 방법에 의해 측정하였으며; 함량은 HPLC 방법 또는 카바졸 방법에 의해 측정되었다. 상기 올리고머성 히알루론산 또는 저분자량 히알루론산 및 직접 발효에 의해 제조된 바와 같은 히알루론산(구조가 파괴되지 않았다)은 모두 N-아세틸글루코스아민 및 D-글루쿠론산 다이사카라이드 반복 단위들로 이루어졌으며, 따라서 그들의 함량은 그들의 다이사카라이드 함량과 동등하였고, 상기 올리고머성 히알루론산 또는 저분자량 히알루론산 또는 통상적인 히알루론산은 바실러스 히알루로니다제에 의해 다이사카라이드로 분해될 수 있었으며, 상기 올리고머성 히알루로네이트 또는 저분자량 히알루로네이트의 함량을 획득하기 위해서 상기 다이사카라이드 함량을 HPLC 방법에 의해 측정할 수 있었다. 상기 올리고머성 히알루로네이트 또는 저분자량 히알루로네이트의 함량을 또한 카바졸 방법에 의해 측정할 수 있다(문헌[LING Peixue, Hyaluronic Acid [M]. Beijing: China Light Industry Press, 2002]). 상기 히알루론산 또는 그의 염의 구조가 파괴된 경우, 히알루로니다제는 파괴된 부분의 글루코사이드 결합을 깨뜨리지 않을 것이며, 따라서 이는 다이사카라이드 함량을 감소시킬 것이다. 상기 카바졸 방법의 기전은 헥소유론산의 함량을 측정함을 포함하며, 이어서 올리고머성 히알루론산 또는 저분자량 히알루론산 또는 직접 발효에 의해 수득한 히알루론산의 함량을 이로부터 추론할 수 있었다. 따라서, 이들 2 가지 방법에 의해 측정된 바와 같은 함량의 차이를 사용하여, 히알루론산 또는 그의 염의 구조가 파괴되었는지의 여부뿐만 아니라 그의 파괴 정도를 간접적으로 관찰할 수 있었다.
본 발명에서 히알루론산 또는 그의 염의 분해에 사용된 히알루로니다제(즉, 이후부터 바실러스 히알루로니다제)를, 바실러스 A50 발효에 의해 수득한 히알루로니다제 발효 브로쓰를 제조하고, 원심분리, 암모늄 설페이트 분별 침전, 한외여과 등과 같은 단계들을 수행함으로써 수득하였다. 상기 제조 공정은 사면 균주(바실러스 스페시즈 A50 CGMCC 5744번)를 취하여 멸균된 종균 배양 배지에 접종하고, 25 ℃ 내지 40 ℃, 100 내지 200 rpm에서 10 내지 24 시간 동안 배양하고, 이어서 상기 종균 용액을 멸균된 발효 배양 배지에 접종하고(접종량은 3% 내지 15%이다), 25 ℃ 내지 40 ℃, 100 내지 300 rpm에서 12 내지 24 시간 동안 배양하고, 발효 과정 동안 산을 사용하여 pH를 6.0 내지 8.0에서 유지시켜, 발효 종료 후에 히알루로니다제 발효 브로쓰를 수득하고; 상기 발효 브로쓰를 10000 내지 15000 rpm에서 10 내지 20 분 동안 원심분리시켜 상등액을 수득하고, 상기 상등액에 암모늄 설페이트를 가하여 20% w/v 내지 25% w/v의 농도를 성취하고, 상기 생성된 침전물을 여과에 의해 제거하고, 이어서 상기 농도가 35% w/v 내지 40% w/v일 때까지 암모늄 설페이트를 연속적으로 가하고, 상기 수득된 침전물, 즉 히알루로니다제를 포스페이트 완충 용액에 용해시키고, 최종적으로 소분자 불순물을 3 x 104 Da 한외여과 멤브레인으로 제거하여 효소분해에 유용한 히알루로니다제를 수득함을 포함하였다.
사용된 배양 배지는 하기와 같았다:
사면 배양 배지(100 ㎖): 펩톤 0.2 - 2.0 g, 효모 분말 0.2 - 2.0 g, K2HPO4·3H2O 0.05 - 0.15 g, MgSO4·7H2O 0.05 - 0.15 g, 글루코스 0.5 - 1.5 g, 아가 분말 2.0 g; pH를 6.0 - 8.0으로 조절한다, 물, 사면 배양 온도는 25 ℃ - 40 ℃이다.
종균 배양 배지(100 ㎖): 펩톤 0.2 - 2.0 g, 효모 분말 0.2 - 2.0 g, K2HPO4·3H2O 0.05 - 0.15 g, MgSO4·7H2O 0.05 - 0.15 g, 글루코스 0.5 - 1.5 g; pH를 6.0 - 8.0으로 조절한다.
발효 배양 배지(100 ㎖): 펩톤 0.2 - 2.0 g, 효모 분말 0.2 - 2.0 g, K2HPO4·3H2O 0.05 - 0.15 g, MgSO4·7H2O 0.05 - 0.15 g, 글루코스 0.5 - 1.5 g, 트윈 80 0.05 ㎖; pH를 6.0 - 8.0으로 조절한다.
상기 방법에 의해 제조된 발효 브로쓰를 중국 약전의 방법(문헌[Chinese Pharmacopoeia, 2010 Edition, Appendix VII. C. Measurement of hyaluronidase]을 참조하시오)에 의해 측정하였으며 그의 히알루로니다제 활성은 1 x 105 - 3 x 105 IU/㎖이고, 정제된 히알루로니다제의 비활성은 8 x 106 - 1.5 x 107 IU/㎎이었다.
실시예 1: 바실러스(바실러스 스페시즈) A50의 획득 및 확인
1. 바실러스(바실러스 스페시즈) A50의 획득
증균 배양 배지를 함유하는 페트리 디쉬의 커버 디쉬를 열고, 상기 디쉬를 공기 중에 놓아 공기로부터 침전된 세균을 수집하고, 상기 커버 디쉬를 1 시간 후에 닫고, 이어서 상기 디쉬를 호기성 배양을 위해서 25 ℃ 내지 40 ℃ 배양기에 놓고, 24 시간의 배양 후에, 분리에 의해 수득된 단일 콜로니를 선별 배양 배지에 접종하고, 호기성 배양을 25 ℃ 내지 40 ℃, 150 rpm에서, 12 내지 16 시간 동안 수행하고, 그의 히알루로니다제 활성을 중국 약전의 방법에 의해 측정하고, 가장 높은 효소 활성을 갖는 균주를 본 발명의 균주로서 선택하였으며, 상기 균주의 효소 활성은 105 IU/㎖ 이하일 수 있었다.
상기에 사용된 배양 배지의 조성은 하기와 같았다:
증균 배양 배지(100 ㎖): 펩톤 0.2 - 2.0 g, 효모 분말 0.2 - 2.0 g, K2HPO4·3H2O 0.05 - 0.15 g, MgSO4·7H2O 0.05 - 0.15 g, 나트륨 히알루로네이트 0.01 - 1 g, 아가 분말 2.0 g.
선별 배양 배지(100 ㎖): 펩톤 0.2 - 2.0 g, 효모 분말 0.2 - 2.0 g, K2HPO4·3H2O 0.05 - 0.15 g, MgSO4·7H2O 0.05 - 0.15 g, 나트륨 히알루로네이트 0.01 - 1 g.
상기 수득된 바실러스(바실러스 스페시즈) A50은 2012년 2월 8일자로, 중국 일반 미생물 보존 센터(CGMCC)에, CGMCC 5744번의 기탁물 수납 번호로 기탁되었으며, 상기 기탁 주소는 중국 베이징 100101 챠오양구 웨스트 베이첸 로드 Buld. 1, 3# 소재의 중국 과학원 미생물 연구소이다.
2. 바실러스(바실러스 스페시즈) A50의 형태학적 특징
상기 바실러스는 막대형 모양으로, 단일 형태 또는 쇄 형태를 가졌다. 상기 세균 콜로니는 유백색이었으며, 주름을 가졌다.
3. 바실러스(바실러스 스페시즈) A50의 분자 생물학적 특징의 확인
세균성 16S rDNA 일반 프라이머를 웨이스버그(Weisburg) 방법에 따라 합성하였다:
프라이머 1: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'; (서열번호 4);
프라이머 2: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(서열번호 5).
균주 A50의 전체 DNA(베이징 티안츠 인코포레이티드(Beijing Tiandz, Inc.)의 컬럼 유형 세균성 DNAout 키트를 사용하여 추출됨)를 주형으로서 사용하였으며, 그의 16S rDNA 단편을 증폭시켰고, PCR 증폭 반응 시스템은 하기와 같았다:
10×PCR 완충제 용액 5.0 ㎕
dNTP (10 mM) 1.0 ㎕
프라이머 1 (10 μM) 1.0 ㎕
프라이머 2 (10 μM) 1.0 ㎕
Taq DNA 폴리머라제 (5 U/㎕) 0.5 ㎕
DNA 주형 (50 ng/㎕) 0.5 ㎕
탈이온수를 전체 부피 50 ㎕
로 가하였다.
상기 PCR 반응 조건은 하기와 같았다:
95 ℃ 5 분
[94 ℃ 30 s
56 ℃ 1 분
72 ℃ 6 분](30 주기)
72 ℃ 10 분
4 ℃ 반응의 종결.
상기 PCR 산물을 아가로스 젤 전기영동에 의해 검출하고 서열화하였다(문헌[Weisburg W G, Bams S M, Pelletier D A, et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study [J]. Journal of Bacteriology, 1991, 173(2): 697-703]). 상기 수득된 16S rDNA(서열번호 1, 1418 bp)의 서열은 하기와 같았다:
gcggctggct ccttacggtt accccaccga cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact agcgattccg gcttcatgca ggcgagttgc agcctgcaat ccgaactgag aatggtttta tgggattggc taaacctcgc ggtcttgcag ccctttgtac catccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc accttagagt gcccaactga atgctggcaa ctaagatcaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tcactctgtc ccccgaaggg gaacgtccta tctctaggag tgtcagagga tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc gttagctgca gcactaaagg gcggaaaccc tctaacactt agcactcatc gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcgcctc agcgtcagtt acagaccaga aagccgcctt cgccactggt gttcctccac atctctacgc atttcaccgc tacacgtgga attccgcttt cctcttctgt actcaagtcc cccagtttcc aatgaccctc cacggttgag ccgtgggctt tcacatcaga cttaaaggac cgcctgcgcg cgctttacgc ccaataattc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt tctggttagg taccgtcaag gtaccggcag ttactccggt acttgttctt ccctaacaac agagctttac gacccgaagg ccttcatcgc tcacgcggcg ttgctccgtc agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct acgcatcgtc gccttggtga gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggcccat ctgtaagtgt cagcgtaaac cgactttcag cttttcctca tgagaggaaa aggattatcc ggtattagct ccggtttccc gaagttatcc cagtcttaca ggcaggttgc ccacgtgtta ctcacccgtc cgccgctaac caagaggtgc aagcacctca agattcgctc gacttgca (서열번호 1).
실시예 2: 히알루로니다제의 클론 및 서열 분석
바실러스(바실러스) A50의 게놈 DNA를 세균 게놈 DNA 추출 키트에 의해 추출하였으며, 게놈 DNA 추출의 결과를 1% 아가로스 젤 전기영동으로 검출하였다. 상기 게놈을 서열화하여 상기 균주의 전체 게놈 샷건 서열을 획득하였다. 그 동안에, 상기 바실러스(바실러스) A50 발효 브로쓰로부터 단리되고 정제된 히알루로니다제에, 상기 히알루로니다제의 부분 아미노산 서열을 획득하기 위해서, 트립신 분해 후에 N-말단 서열화 및 내부 펩타이드 구획 서열화를 가하였다. 상기 전체 게놈 샷건 서열 및 부분 아미노산 서열을, 상기 아미노산 서열에 대해 100% 유사성을 갖는 유전자 구획을 찾아내고 따라서 상기 히알루로니다제를 암호화하는 유전자의 대략 위치를 찾기 위해서, NCBI의 BLAST 도구를 사용하여 블라스팅하였다. 후속으로, 히알루로니다제의 N-말단 서열, SDS-PAGE 전기영동 밴드의 크기, 및 진툴(GeneTool) 소프트웨어에 의한 개방 판독 프레임(ORF)의 분석을 근거로, 표적 유전자의 특정한 위치 및 완전한 뉴클레오타이드 서열을 측정하였으며, 상기 뉴클레오타이드 서열을 바이오에디트(BioEdit) 소프트웨어를 사용함으로써 아미노산 서열로 번역하였다.
히알루로니아제의 아미노산 서열(서열번호 2, 1106 aa)은 하기와 같았다:
EKDGVLEIAVCDPTMENKGSIEIEIDGKAFKVLEADESITVENTKPSIKLKVNVNEAKGKTFTAKLKMIPSQKGNSPNSIR (서열번호 2)
히알루로니다제를 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 3, 3324 bp, 1106 개 아미노산을 암호화한다)은 하기와 같았다:
GAGAAGGATGGAGTCCTTGAGATTGCTGTATGTGATCCGACGATGGAAAACAAGGGTTCTATCGAAATCGAAATTGATGGCAAGGCGTTCAAGGTTTTAGAAGCCGATGAAAGTATCACGGTAGAAAATACGAAGCCGTCAATCAAGTTGAAGGTCAATGTGAATGAGGCAAAAGGGAAAACGTTCACAGCGAAATTGAAAATGATTCCGAGCCAAAAGGGCAATAGCCCGAACTCAATCAGATAATAA (서열번호 3)
NCBI/BLAST 소프트웨어에 근거한 아미노산 서열 상동성의 분석은 하기를 나타내었다: 서열번호 2의 아미노산 서열과 최고의 유사성을 갖는 단백질은 바실러스(파에니바실러스 알지노리티쿠스(Paenibacillus alginolyticus))의 잔탄 라이아제 XalB 전구체였으며, 상기 유사성은 46% 이하였고, 31% 내지 46%의 유사성을 갖는 단백질들은 대개 히알루로네이트 라이아제뿐만 아니라, 잔탄 라이아제, 폴리사카라이드 라이아제-8 계열, 및 일부 다른 추정되거나 공지되지 않은 단백질이었고, 이들은 모두 뮤코폴리사카라이드(GAG) 라이아제 계열에 속하였다.
NCBI/BLAST 소프트웨어에 근거한 유전자 서열 상동성의 분석은 하기를 나타내었다: 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열에 대한 상동 서열은 없었으며, 이는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 히알루로니다제를 암호화하는 유전자는 신규의 유전자임을 가리킨다.
실시예 3: 히알루로니다제(1)의 제조
사면 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 0.2 g, 효모 분말 2.0 g, K2HPO4·3H2O 0.05 g, MgSO4·7H2O 0.05 g, 글루코스 0.5 g, 아가 분말 2.0 g; 염산을 사용하여 pH를 6.0으로 조절한다.
종균 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 0.2 g, 효모 분말 2.0 g, K2HPO4·3H2O 0.05 g, MgSO4·7H2O 0.05 g, 글루코스 0.5 g; 염산을 사용하여 pH를 6.0으로 조절한다.
발효 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 0.2 g, 효모 분말 2.0 g, K2HPO4·3H2O 0.05 g, MgSO4·7H2O 0.05 g, 글루코스 0.5 g, 트윈 80 0.05 ㎖.
사면 균주(바실러스 스페시즈 A50, CGMCC 5744번)를 취하여 멸균된 종균 배양 배지에 접종하고, 25 ℃, 150 rpm에서 24 시간 동안 배양하고, 이어서 상기 종균 용액을 멸균된 발효 배양 배지에 접종하고(접종량은 10%이다), 25 ℃, 200 rpm에서 24 시간 동안 배양하고, 발효 과정 동안 황산을 사용하여 pH를 6.0에서 유지시키고, 발효에 의해 히알루로니다제 발효 브로쓰를 수득하고, 상기 발효 브로쓰를 10000 rpm에서 20 분 동안 원심분리시켜 상등액을 수득하고, 상기 상등액에 암모늄 설페이트를 가하여 20%의 농도를 성취하고, 침전물을 여과에 의해 제거하고, 이어서 상기 농도가 35%에 도달할 때까지 암모늄 설페이트를 연속적으로 가하고, 상기 수득된 침전물을 히알루로니다제로서 취하고, 상기 수득된 히알루로니다제 침전물을 포스페이트 완충 용액(pH 6.0, 50 mmol/ℓ)에 용해시키고, 최종적으로 소분자 불순물을 3 x 104 Da 한외여과 멤브레인으로 제거하여 정제된 히알루로니다제를 수득하였다.
중국 약전의 방법을 사용함으로써 측정된, 상기 발효 브로쓰에서의 히알루로니다제 활성은 1 x 105 IU/㎖이고, 정제된 히알루로니다제의 비활성은 8 x 106 IU/㎎이었다.
실시예 4: 히알루로니다제(2)의 제조
사면 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 1.0 g, 효모 분말 1.0 g, K2HPO4·3H2O 0.1 g, MgSO4·7H2O 0.1 g, 글루코스 1.0 g, 아가 분말 2.0 g; 인산을 사용하여 pH를 7.0으로 조절한다.
종균 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 1.0 g, 효모 분말 1.0 g, K2HPO4·3H2O 0.1 g, MgSO4·7H2O 0.1 g, 글루코스 1.0 g; 인산을 사용하여 pH를 7.0으로 조절한다.
발효 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 1.0 g, 효모 분말 1.0 g, K2HPO4·3H2O 0.1 g, MgSO4·7H2O 0.1 g, 글루코스 1.0 g, 트윈 80 0.05 ㎖.
사면 균주(바실러스 스페시즈 A50, CGMCC 5744번)를 취하여 멸균된 종균 배양 배지에 접종하고, 30 ℃, 100 rpm에서 15 시간 동안 배양하고, 이어서 상기 종균 용액을 멸균된 발효 배양 배지에 접종하고(접종량은 10%이다), 35 ℃, 300 rpm에서 16 시간 동안 배양하고, 발효 과정 동안 황산을 사용하여 pH를 7.0에서 유지시키고, 발효에 의해 히알루로니다제 발효 브로쓰를 생성시켜 수득하고, 상기 발효 브로쓰를 15000 rpm에서 10 분 동안 원심분리시켜 상등액을 수득하고, 상기 상등액에 암모늄 설페이트를 가하여 22%의 농도를 성취하고, 침전물을 여과에 의해 제거하고, 상기 농도가 38% 이하일 때까지 암모늄 설페이트를 연속적으로 가하고, 상기 수득된 히알루로니다제 침전물을 포스페이트 완충 용액(pH 6.0, 50 mmol/ℓ)에 용해시키고, 최종적으로 소분자 불순물을 3 x 104 Da 한외여과 멤브레인으로 제거하여 정제된 히알루로니다제를 수득하였다.
중국 약전의 방법을 사용함으로써 측정된, 상기 발효 브로쓰에서의 히알루로니다제 활성은 3.0 x 105 IU/㎖이고, 정제된 히알루로니다제의 비활성은 9.5 x 106 IU/㎎이었다.
실시예 5: 히알루로니다제(3)의 제조
사면 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 1.5 g, 효모 분말 1.5 g, K2HPO4·3H2O 0.15 g, MgSO4·7H2O 0.15 g, 글루코스 1.5 g, 아가 분말 2.0 g; 황산을 사용하여 pH를 8.0으로 조절한다.
종균 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 1.5 g, 효모 분말 1.5 g, K2HPO4·3H2O 0.15 g, MgSO4·7H2O 0.15 g, 글루코스 1.5 g; 황산을 사용하여 pH를 8.0으로 조절한다.
발효 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 0.5 g, 효모 분말 1.5 g, K2HPO4·3H2O 0.1 g, MgSO4·7H2O 0.05 g, 글루코스 1.5 g, 트윈 80 0.05 ㎖.
사면 균주(바실러스(바실러스 스페시즈) A50, CGMCC 5744번)를 취하여 멸균된 종균 배양 배지에 접종하고, 35 ℃, 200 rpm에서 13 시간 동안 배양하고, 이어서 상기 종균 용액을 멸균된 발효 배양 배지에 접종하고(접종량은 10%이다), 40 ℃, 100 rpm에서 12 시간 동안 배양하고, 발효 과정 동안 염산을 사용하여 pH를 7.0에서 유지시키고, 발효에 의해 히알루로니다제 발효 브로쓰를 수득하고, 상기 발효 브로쓰를 12000 rpm에서 15 분 동안 원심분리시켜 상등액을 수득하고, 상기 상등액에 암모늄 설페이트를 가하여 25%의 농도를 성취하고, 생성된 침전물을 여과에 의해 제거하고, 이어서 상기 농도가 35%에 도달할 때까지 암모늄 설페이트를 연속적으로 가하고, 상기 수득된 히알루로니다제 침전물을 취하여 포스페이트 완충 용액(pH 6.0, 50 mmol/ℓ)에 용해시키고, 최종적으로 소분자 불순물을 3 x 104 Da 한외여과 멤브레인으로 제거하여 정제된 히알루로니다제를 수득하였다.
중국 약전의 방법을 사용함으로써 측정된, 상기 발효 브로쓰에서의 히알루로니다제 활성은 1.2 x 105 IU/㎖이고, 정제된 히알루로니다제의 비활성은 9.0 x 106 IU/㎎이었다.
실시예 6: 히알루로니다제(4)의 제조
사면 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 2.0 g, 효모 분말 0.5 g, K2HPO4·3H2O 0.05 g, MgSO4·7H2O 0.05 g, 글루코스 1.0 g, 아가 분말 2.0 g; 황산을 사용하여 pH를 6.5로 조절한다.
종균 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 2.0 g, 효모 분말 0.5 g, K2HPO4·3H2O 0.05 g, MgSO4·7H2O 0.05 g, 글루코스 1.0 g; 황산을 사용하여 pH를 6.5로 조절한다.
발효 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 1.5 g, 효모 분말 0.2 g, K2HPO4·3H2O 0.15 g, MgSO4·7H2O 0.15 g, 글루코스 1.5 g, 트윈 80 0.05 ㎖.
사면 균주(바실러스 스페시즈 A50, CGMCC 5744번)를 취하여 멸균된 종균 배양 배지에 접종하고, 40 ℃, 180 rpm에서 10 시간 동안 배양하고, 이어서 상기 종균 용액을 멸균된 발효 배양 배지에 접종하고(접종량은 10%이다), 36 ℃, 280 rpm에서 15 시간 동안 배양하고, 발효 과정 동안 인산을 사용하여 pH를 8.0에서 유지시키고, 발효에 의해 히알루로니다제 발효 브로쓰를 수득하고, 상기 발효 브로쓰를 10000 rpm에서 20 분 동안 원심분리시켜 상등액을 수득하고, 상기 상등액에 암모늄 설페이트를 가하여 20%의 농도를 성취하고, 생성된 침전물을 여과에 의해 제거하고, 상기 농도가 40%에 도달할 때까지 암모늄 설페이트를 연속적으로 가하고, 상기 수득된 히알루로니다제를 취하여 포스페이트 완충 용액(pH 6.0, 50 mmol/ℓ)에 용해시키고, 최종적으로 소분자 불순물을 3 x 104 Da 한외여과 멤브레인으로 제거하여 정제된 히알루로니다제를 수득하였다.
중국 약전의 방법을 사용함으로써 측정된, 상기 발효 브로쓰에서의 히알루로니다제 활성은 1.5 x 105 IU/㎖이고, 정제된 히알루로니다제의 비활성은 8.2 x 106 IU/㎎이었다.
실시예 7: 히알루로니다제(5)의 제조
사면 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 0.5 g, 효모 분말 1.5 g, K2HPO4·3H2O 0.15 g, MgSO4·7H2O 0.1 g, 글루코스 0.5 g, 아가 분말 2.0 g; 인산을 사용하여 pH를 7.5으로 조절한다.
종균 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 0.5 g, 효모 분말 1.5 g, K2HPO4·3H2O 0.15 g, MgSO4·7H2O 0.1 g, 글루코스 0.5 g; 인산을 사용하여 pH를 7.5로 조절한다.
발효 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 2.0 g, 효모 분말 0.2 g, K2HPO4·3H2O 0.05 g, MgSO4·7H2O 0.05 g, 글루코스 0.5 g, 트윈 80 0.05 ㎖.
사면 균주(바실러스 스페시즈 A50, CGMCC 5744번)를 취하여 멸균된 종균 배양 배지에 접종하고, 36 ℃, 120 rpm에서 14 시간 동안 배양하고, 이어서 상기 종균 용액을 멸균된 발효 배양 배지에 접종하고(접종량은 10%이다), 30 ℃, 180 rpm에서 20 시간 동안 배양하고, 발효 과정 동안 인산을 사용하여 pH를 7.5에서 유지시키고, 발효에 의해 히알루로니다제 발효 브로쓰를 수득하고, 상기 발효 브로쓰를 10000 rpm에서 20 분 동안 원심분리시켜 상등액을 수득하고, 상기 상등액에 암모늄 설페이트를 가하여 25%의 농도를 성취하고, 생성된 침전물을 여과에 의해 제거하고, 이어서 상기 농도가 40%에 도달할 때까지 암모늄 설페이트를 연속적으로 가하고, 상기 수득된 히알루로니다제 침전물을 취하여 포스페이트 완충 용액(pH 6.0, 50 mmol/ℓ)에 용해시키고, 최종적으로 소분자 불순물을 3 x 104 Da 한외여과 멤브레인으로 제거하여 정제된 히알루로니다제를 수득하였다.
중국 약전의 방법을 사용함으로써 측정된, 상기 발효 브로쓰에서의 히알루로니다제 활성은 2.0 x 105 IU/㎖이고, 정제된 히알루로니다제의 비활성은 9.3 x 106 IU/㎎이었다.
실시예 8: 히알루로니다제(6)의 제조
사면 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 1.0 g, 효모 분말 1.0 g, K2HPO4·3H2O 0.1 g, MgSO4·7H2O 0.15 g, 글루코스 1.5 g, 아가 분말 2.0 g; 염산을 사용하여 pH를 7.0으로 조절한다.
종균 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 1.0 g, 효모 분말 1.0 g, K2HPO4·3H2O 0.1 g, MgSO4·7H2O 0.15 g, 글루코스 1.5 g; 염산을 사용하여 pH를 7.0으로 조절한다.
발효 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 1.5 g, 효모 분말 0.5 g, K2HPO4·3H2O 0.05 g, MgSO4·7H2O 0.15 g, 글루코스 1.5 g, 트윈 80 0.05 ㎖.
사면 균주(바실러스 스페시즈 A50, CGMCC 5744번)를 취하여 멸균된 종균 배양 배지에 접종하고, 32 ℃, 150 rpm에서 18 시간 동안 배양하고, 이어서 상기 종균 용액을 멸균된 발효 배양 배지에 접종하고(접종량은 10%이다), 28 ℃, 200 rpm에서 22 시간 동안 배양하고, 발효 과정 동안 염산을 사용하여 pH를 8.0에서 유지시키고, 발효에 의해 히알루로니다제 발효 브로쓰를 수득하고, 상기 발효 브로쓰를 15000 rpm에서 10 분 동안 원심분리시켜 상등액을 수득하고, 상기 상등액에 암모늄 설페이트를 가하여 24%의 농도를 성취하고, 생성된 침전물을 여과에 의해 제거하고, 이어서 상기 농도가 36%에 도달할 때까지 암모늄 설페이트를 연속적으로 가하고, 상기 수득된 히알루로니다제 침전물을 취하여 포스페이트 완충 용액(pH 6.0, 50 mmol/ℓ)에 용해시키고, 최종적으로 소분자 불순물을 3 x 104 Da 한외여과 멤브레인으로 제거하여 정제된 히알루로니다제를 수득하였다.
중국 약전의 방법을 사용함으로써 측정된, 상기 발효 브로쓰에서의 히알루로니다제 활성은 1.8 x 105 IU/㎖이고, 정제된 히알루로니다제의 비활성은 8.4 x 106 IU/㎎이었다.
실시예 9: 히알루로니다제(7)의 제조
사면 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 2.0 g, 효모 분말 1.5 g, K2HPO4·3H2O 0.05 g, MgSO4·7H2O 0.15 g, 글루코스 0.5 g, 아가 분말 2.0 g; 인산을 사용하여 pH를 7.0으로 조절한다.
종균 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 2.0 g, 효모 분말 1.5 g, K2HPO4·3H2O 0.05 g, MgSO4·7H2O 0.15 g, 글루코스 0.5 g; 인산을 사용하여 pH를 7.0으로 조절한다.
발효 배양 배지 조성물(100 ㎖): 펩톤 0.5 g, 효모 분말 1.5 g, K2HPO4·3H2O 0.15 g, MgSO4·7H2O 0.1 g, 글루코스 1.0 g, 트윈 80 0.05 ㎖.
사면 균주(바실러스 스페시즈 A50, CGMCC 5744번)를 취하여 멸균된 종균 배양 배지에 접종하고, 30 ℃, 200 rpm에서 20 시간 동안 배양하고, 이어서 상기 종균 용액을 멸균된 발효 배양 배지에 접종하고(접종량은 10%이다), 34 ℃, 220 rpm에서 14 시간 동안 배양하고, 발효 과정 동안 인산을 사용하여 pH를 7.5에서 유지시키고, 발효에 의해 히알루로니다제 발효 브로쓰를 수득하고, 상기 발효 브로쓰를 12000 rpm에서 15 분 동안 원심분리시켜 상등액을 수득하고, 상기 상등액에 암모늄 설페이트를 가하여 25%의 농도를 성취하고, 생성된 침전물을 여과에 의해 제거하고, 이어서 상기 농도가 38%에 도달할 때까지 암모늄 설페이트를 연속적으로 가하고, 상기 수득된 히알루로니다제 침전물을 취하여 포스페이트 완충 용액(pH 6.0, 50 mmol/ℓ)에 용해시키고, 최종적으로 소분자 불순물을 3 x 104 Da 한외여과 멤브레인으로 제거하여 정제된 히알루로니다제를 수득하였다.
중국 약전의 방법을 사용함으로써 측정된, 상기 발효 브로쓰에서의 히알루로니다제 활성은 1.2 x 105 IU/㎖이고, 정제된 히알루로니다제의 비활성은 8.1 x 106 IU/㎎이었다.
실시예 10: 히알루로니다제(8)의 제조
바실러스 스페시즈 A50의 발효 브로쓰(예를 들어 실시예 3 내지 9 중 어느 하나의 발효 브로쓰)를 4 ℃에서 원심분리하여 세균을 제거하고, 상등액을 수거하였다. 상기 상등액에, 암모늄 설페이트 고체 분말을 그의 농도가 20% w/v로 될 때까지 서서히 가하고, 침전물을 여과에 의해 제거하고, 암모늄 설페이트 고체 분말을 그의 농도가 40% w/v로 될 때까지 상기 여액에 연속적으로 가하고, 침전물을 여과에 의해 수거하였다. 상기 침전물을 Na2HPO4-시트르산 완충 용액에 4.5의 pH로 용해시켜, 조 효소 용액을 수득하였다. 상기 조 효소 용액을 3.0 x 103 Da의 분자량 컷오프를 갖는 투석 주머니에 로딩하고, pH 4.5 Na2HPO4-시트르산 완충 용액에 넣고, 4 ℃에서 밤새 투석시켰다. 상기 투석 주머니 중의 용액에 이온 교환 크로마토그래피 분리를 가하였으며, 상기 크로마토그래피 컬럼 충전물은 DEAE 아가로스 젤 FF 매질이었고, 구배 용리를 0 내지 0.5M NaCl 용액으로 수행하고 용출 피크를 수집하였다. 상기 최종적으로 수거된 용출물에 SDS-PAGE 전기영동을 가하여 분리 및 정제 효과를 검출하였다. 상기 전기영동 결과를 도 1에서 레인 1로서 나타내었다: 히알루로니다제 순도는 97.6%이었다. 그 동안에, 상기 최종적으로 수거한 표적 프로테아제 용출물에 진공 동결 건조를 가하여 히알루로니다제로서 백색 분말을 수득하였다. 상기 수득된 히알루로니다제는 1.3 x 107 IU/㎎의 비활성을 갖는다.
실시예 11: 히알루로니다제(9)의 제조
바실러스 스페시즈 A50의 발효 브로쓰(예를 들어 실시예 3 내지 9 중 어느 하나의 발효 브로쓰)를 4 ℃에서 원심분리하여 세균을 제거하고, 상등액을 수거하였다. 상기 상등액에, 암모늄 설페이트 고체 분말을 그의 농도가 25% w/v로 되도록 서서히 가하고, 침전물을 여과에 의해 제거하고, 암모늄 설페이트 고체 분말을 그의 농도가 40% w/v로 될 때까지 상기 여액에 연속적으로 가하고, 침전물을 여과에 의해 수거하였다. 상기 침전물을 50 mM Na2HPO4-NaH2PO4 완충 용액에 6.5의 pH로 용해시켜, 조 효소 용액을 수득하였다. 상기 조 효소 용액을 1.0 x 104 Da의 분자량 컷오프를 갖는 투석 주머니에 로딩하고, 50 mM pH 6.5 Na2HPO4-NaH2PO4 완충 용액에 넣고, 4 ℃에서 밤새 투석시켰다. 상기 투석 주머니 중의 용액에 이온 교환 크로마토그래피 분리를 가하였으며, 상기 크로마토그래피 컬럼 충전물은 DEAE 아가로스 젤 FF 매질이었고, 구배 용리를 0 내지 0.5M NaCl 용액으로 수행하고 용출 피크를 수집하였다. 상기 최종적으로 수거된 용출물에 SDS-PAGE 전기영동을 가하여 분리 및 정제 효과를 검출하였다. 상기 전기영동 결과를 도 1에서 레인 2로서 나타내었다: 히알루로니다제 순도는 98.1%이었다. 그 동안에, 상기 최종적으로 수거한 표적 프로테아제 용출물에 진공 동결 건조를 가하여 히알루로니다제로서 백색 분말을 수득하였다. 상기 수득된 히알루로니다제는 1.4 x 107 IU/㎎의 비활성을 갖는다.
실시예 12: 히알루로니다제(10)의 제조
바실러스 스페시즈 A50의 발효 브로쓰(예를 들어 실시예 3 내지 9 중 어느 하나의 발효 브로쓰)를 4 ℃에서 원심분리하여 세균을 제거하고, 상등액을 수거하였다. 상기 상등액에, 암모늄 설페이트 고체 분말을 그의 농도가 20% w/v로 되도록 서서히 가하고, 침전물을 여과에 의해 제거하고, 암모늄 설페이트 고체 분말을 그의 농도가 40% w/v로 될 때까지 상기 여액에 연속적으로 가하고, 침전물을 여과에 의해 수거하였다. 상기 침전물을 50 mM pH 8.0 Na2HPO4-NaH2PO4 완충 용액에 용해시켜, 조 효소 용액을 수득하였다. 상기 조 효소 용액을 1.4 x 104 Da의 분자량 컷오프를 갖는 투석 주머니에 로딩하고, 50 mM pH 8.0 Na2HPO4-NaH2PO4 완충 용액에 넣고, 4 ℃에서 밤새 투석시켰다. 상기 투석 주머니 중의 용액에 이온 교환 크로마토그래피 분리를 가하였으며, 상기 크로마토그래피 컬럼 충전물은 DEAE 아가로스 젤 FF 매질이었고, 구배 용리를 0 내지 0.5M NaCl 용액으로 수행하고 용출 피크를 수집하였다. 상기 최종적으로 수거된 용출물에 SDS-PAGE 전기영동을 가하여 분리 및 정제 효과를 검출하였다. 상기 전기영동 결과를 도 1에서 레인 3으로서 나타내었다: 히알루로니다제 순도는 97.5%이었다. 그 동안에, 상기 최종적으로 수거한 표적 프로테아제 용출물에 진공 동결 건조를 가하여 히알루로니다제로서 백색 분말을 수득하였다. 상기 수득된 히알루로니다제는 1.5 x 107 IU/㎎의 비활성을 갖는다.
본 발명의 히알루로니다제는 높은 효소 활성, 양호한 열 안정성 및 pH 안정성을 가지며, 히알루론산의 대규모 산업적 분해에 대한 효소 투여 요건을 충족시킬 수 있고, 상기 효소의 제조 공정은 보통의 조건 및 저렴한 비용으로 간단하며, 화학적 분해의 환경 오염, 생물학적 분해의 효소 공급원 제한뿐만 아니라 낮은 활성 및 고비용과 같은 결점들을 극복한다.
하기의 실시예들은 본 발명의 8 x 106 - 1.5 x 107 IU/㎎의 효소 활성을 갖는 히알루로니다제를 사용하여 효소 절단 방법을 통해 올리고머성 히알루로네이트 또는 저분자량 히알루로네이트를 제조함을 예시하였다.
실시예 13: 올리고머성 나트륨 히알루로네이트의 제조
1 ㎥ 스테인레스 스틸 용해 탱크에, 1 ㎥의 정제수를 가하고, 2 x 104 Da의 분자량을 갖는 나트륨 히알루로네이트 300 ㎏을 상기 용해 탱크에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, pH를 빙초산으로 4.0으로 조절하고, 온도를 20 ℃로 상승시키고, 1.35 x 1010 IU의 바실러스 히알루로니다제(실시예 3에서 제조됨)를 가하고, 분자량이 104 Da 미만일 때까지 효소분해를 계속하고(이 기간 동안, GPC-MALLS 방법을 통한 연속적인 샘플링 및 검출), 온도를 50 ℃로 상승시키고, 60 분간 유지시키고, 1 ㎏의 NaCl을 가하고, 상기 효소분해 용액을 0.45 ㎛ 혼합된 셀룰로스 여과 멤브레인으로 여과하고, 이어서 20 ㎥의 에탄올을 침전에 사용하여 나트륨 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 에탄올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 올리고머성 나트륨 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 올리고머성 나트륨 히알루로네이트는 백색 과립이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 96.8%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 97.5%이었으며; 8.6 kDa, pH 6.8의 분자량을 가졌다. 그의 적외선 스펙트럼을 도 2c에 나타내었으며, 이는 유럽 약전의 표준 스펙트럼 도 2a(유럽 약전의 표준 스펙트럼의 샘플은 분해되지 않았다)와 일치하였다.
실시예 14: 올리고머성 칼륨 히알루로네이트의 제조
1 ㎥ 스테인레스 스틸 용해 탱크에, 1 ㎥의 정제수를 가하고, 3 x 106 Da의 분자량을 갖는 칼륨 히알루로네이트 10 ㎏을 상기 용해 탱크에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, pH를 수산화 나트륨으로 9.0으로 조절하고, 온도를 48 ℃로 상승시키고, 4 x 108 IU의 바실러스 히알루로니다제(실시예 4에서 제조됨)를 가하고, 분자량이 104 Da 미만일 때까지 효소분해를 계속하고, 온도를 90 ℃로 상승시키고, 10 분간 유지시키고, 100 ㎏의 KCl을 가하고, 상기 효소분해 용액을 0.45 ㎛ 폴리설폰 여과 멤브레인으로 여과하고, 이어서 5 ㎥의 케톤을 침전에 사용하여 칼륨 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 아세톤로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 올리고머성 칼륨 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 올리고머성 칼륨 히알루로네이트는 백색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 98.8%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 98.3%이었으며; 3.2 kDa, pH 6.5의 분자량을 가졌다. 그의 적외선 스펙트럼을 도 2d에 나타내었으며, 이는 유럽 약전의 표준 스펙트럼과 일치하였다.
실시예 15: 올리고머성 나트륨 히알루로네이트의 제조
1 ㎥ 스테인레스 스틸 용해 탱크에, 1 ㎥의 정제수를 가하고, 1.6 x 106 Da의 분자량을 갖는 나트륨 히알루로네이트 30 ㎏을 상기 용해 탱크에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, pH를 수산화 칼륨으로 8.0으로 조절하고, 온도를 40 ℃로 상승시키고, 1.2 x 109 IU의 바실러스 히알루로니다제(실시예 5에서 제조됨)를 가하고, 분자량이 104 Da 미만일 때까지 효소분해를 계속하고, 온도를 60 ℃로 상승시키고, 60 분간 유지시키고, 50 ㎏의 NaCl을 가하고, 상기 효소분해 용액을 0.45 ㎛ 나일론 여과 멤브레인으로 여과하고, 이어서 10 ㎥의 프로판올을 침전에 사용하여 나트륨 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 프로판올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 올리고머성 나트륨 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 올리고머성 나트륨 히알루로네이트는 백색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 97.6%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 97.8%이었으며; 그의 분자량은 6.2 kDa이었고, pH는 7.1이었다. 그의 적외선 스펙트럼을 도 2e에 나타내었으며, 이는 유럽 약전의 표준 스펙트럼과 일치하였다.
실시예 16: 올리고머성 칼슘 히알루로네이트의 제조
1 ㎥ 스테인레스 스틸 용해 탱크에, 1 ㎥의 정제수를 가하고, 8 x 105 Da의 분자량을 갖는 칼슘 히알루로네이트 60 ㎏을 상기 용해 탱크에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, pH를 빙초산으로 7.0으로 조절하고, 온도를 35 ℃로 상승시키고, 2.4 x 109 IU의 바실러스 히알루로니다제(실시예 6에서 제조됨)를 가하고, 분자량이 104 Da 미만일 때까지 효소분해를 계속하고, 온도를 70 ℃로 상승시키고, 30 분간 유지시키고, 35 ㎏의 CaCl2를 가하고, 상기 효소분해 용액을 0.45 ㎛ 폴리에테르 설폰 여과 멤브레인으로 여과하고, 이어서 3 ㎥의 아이소프로판올을 침전에 사용하여 칼슘 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 아이소프로판올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 올리고머성 칼슘 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 올리고머성 칼슘 히알루로네이트는 백색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 96.6%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 97.3%이었으며; 그의 분자량은 5.6 kDa이었고, pH는 6.5이었다. 그의 적외선 스펙트럼을 도 2f에 나타내었으며, 이는 유럽 약전의 표준 스펙트럼과 일치하였다.
실시예 17: 올리고머성 나트륨 히알루로네이트의 제조
1 ㎥ 스테인레스 스틸 용해 탱크에, 1 ㎥의 정제수를 가하고, 2 x 105 Da의 분자량을 갖는 나트륨 히알루로네이트 200 ㎏을 상기 용해 탱크에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, pH를 황산으로 6.0으로 조절하고, 온도를 25 ℃로 상승시키고, 8 x 109 IU의 바실러스 히알루로니다제(실시예 7에서 제조됨)를 가하고, 분자량이 104 Da 미만일 때까지 효소분해를 계속하고, 온도를 80 ℃로 상승시키고, 20 분간 유지시키고, 60 ㎏의 NaCl을 가하고, 상기 효소분해 용액을 0.45 ㎛ 폴리에테르 설폰 여과 멤브레인으로 여과하고, 이어서 6 ㎥의 메탄올을 침전에 사용하여 나트륨 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 메탄올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 올리고머성 나트륨 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 올리고머성 나트륨 히알루로네이트는 백색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 98.7%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 98.3%이었으며; 그의 분자량은 7.6 kDa이었고, pH는 7.3이었다. 그의 적외선 스펙트럼을 도 2g에 나타내었으며, 이는 유럽 약전의 표준 스펙트럼과 일치하였다.
실시예 18: 올리고머성 아연 히알루로네이트의 제조
1 ㎥ 스테인레스 스틸 용해 탱크에, 1 ㎥의 정제수를 가하고, 105 Da의 분자량을 갖는 나트륨 히알루로네이트 100 ㎏을 상기 용해 탱크에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, pH를 수산화 나트륨으로 5.0으로 조절하고, 온도를 20 ℃로 상승시키고, 4 x 109 IU의 바실러스 히알루로니다제(실시예 8에서 제조됨)를 가하고, 분자량이 104 Da 미만일 때까지 효소분해를 계속하고, 온도를 55 ℃로 상승시키고, 40 분간 유지시키고, 20 ㎏의 ZnCl2를 가하고, 상기 효소분해 용액을 0.45 ㎛ 나이트로셀룰로스 여과 멤브레인으로 여과하고, 이어서 4.5 ㎥의 에탄올을 침전에 사용하여 아연 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 에탄올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 올리고머성 아연 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 올리고머성 아연 히알루로네이트는 백색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 96.8%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 97.6%이었으며; 그의 분자량은 9.1 kDa이었고, pH는 6.8이었다. 그의 적외선 스펙트럼을 도 2h에 나타내었으며, 이는 유럽 약전의 표준 스펙트럼과 일치하였다.
실시예 19: 저분자량 나트륨 히알루로네이트(1)의 제조
1 ㎥ 스테인레스 스틸 용해 탱크에, 1 ㎥의 정제수를 가하고, 3 x 106 Da의 분자량을 갖는 나트륨 히알루로네이트 1 ㎏을 상기 용해 탱크에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, 온도를 48 ℃에서 조절하고, pH를 수산화 나트륨으로 9.0으로 조절하고, 107 IU의 바실러스 히알루로니다제(실시예 9에서 제조됨)를 효소분해를 위해 교반 하에서 가하였다. 목적하는 분자량이 성취될 때까지 효소분해를 계속하고; 온도를 50 ℃로 상승시키고, 60 분간 유지시켰다. 2 ㎏의 NaCl을 가하고, 완전히 용해된 후에 0.45 ㎛ 폴리프로필렌 여과 코어로 여과를 수행하고, 이어서 1 ㎥의 아세톤을 침전에 사용하여 저분자량 나트륨 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 아세톤으로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 저분자량 나트륨 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 저분자량 나트륨 히알루로네이트는 백색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 98.3%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 98.5%이었으며; 그의 분자량은 931 kDa이었다.
실시예 20: 저분자량 칼륨 히알루로네이트의 제조
1 ㎥ 스테인레스 스틸 용해 탱크에, 1 ㎥의 정제수를 가하고, 1 x 106 Da의 분자량을 갖는 칼륨 히알루로네이트 20 ㎏을 상기 용해 탱크에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, 온도를 20 ℃에서 조절하고, pH를 빙초산으로 4.0으로 조절하고, 108 IU의 바실러스 히알루로니다제(실시예 7에서 제조됨)를 효소분해를 위해 교반 하에서 가하였다. 목적하는 분자량이 성취될 때까지 효소분해를 계속하고; 온도를 90 ℃로 상승시키고, 10 분간 유지시켰다. 100 ㎏의 KCl을 가하고, 완전히 용해된 후에 0.45 ㎛ 나이트로셀룰로스 여과 코어로 여과를 수행하고, 이어서 10 ㎥의 에탄올을 침전에 사용하여 저분자량 칼륨 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 에탄올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 저분자량 칼륨 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 저분자량 칼륨 히알루로네이트는 백색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 96.8%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 97.5%이었으며; 그의 분자량은 15 kDa이었다.
실시예 21: 저분자량 아연 히알루로네이트의 제조
1 ㎥ 스테인레스 스틸 용해 탱크에, 1 ㎥의 정제수를 가하고, 1.61 x 106 Da의 분자량을 갖는 나트륨 히알루로네이트 12 ㎏을 상기 용해 탱크에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, 온도를 45 ℃에서 조절하고, pH를 빙초산으로 5.0으로 조절하고, 2 x 107 IU의 바실러스 히알루로니다제(실시예 8에서 제조됨)를 효소분해를 위해 교반 하에서 가하였다. 목적하는 분자량이 성취될 때까지 효소분해를 계속하고; 온도를 80 ℃로 상승시키고, 20 분간 유지시켰다. 40 ㎏의 ZnCl2를 가하고, 완전히 용해된 후에 0.45 ㎛ 폴리에테르 설폰 여과 코어로 여과를 수행하고, 이어서 3 ㎥의 메탄올을 침전에 사용하여 저분자량 아연 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 메탄올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 저분자량 아연 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 저분자량 아연 히알루로네이트는 백색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 98.5%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 98.2%이었으며; 그의 분자량은 754 kDa이었다.
실시예 22: 저분자량 칼륨 히알루로네이트의 제조
1 ㎥ 스테인레스 스틸 용해 탱크에, 1 ㎥의 정제수를 가하고, 1.77 x 106 Da의 분자량을 갖는 칼륨 히알루로네이트 10 ㎏을 상기 용해 탱크에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, 온도를 38 ℃에서 조절하고, pH를 인산으로 6.0으로 조절하고, 5 x 107 IU의 바실러스 히알루로니다제(실시예 9에서 제조됨)를 효소분해를 위해 교반 하에서 가하였다. 목적하는 분자량이 성취될 때까지 효소분해를 계속하고; 온도를 60 ℃로 상승시키고, 30 분간 유지시켰다. 30 ㎏의 K2SO4를 가하고, 완전히 용해된 후에 0.45 ㎛ 폴리에테르 설폰 여과 코어로 여과를 수행하고, 이어서 5 ㎥의 아이소프로판올을 침전에 사용하여 저분자량 칼륨 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 아이소프로판올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 저분자량 칼륨 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 저분자량 칼륨 히알루로네이트는 백색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 96.3%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 97.3%이었으며; 그의 분자량은 421 kDa이었다.
실시예 23: 저분자량 마그네슘 히알루로네이트의 제조
1 ㎥ 스테인레스 스틸 용해 탱크에, 1 ㎥의 정제수를 가하고, 2.55 x 106 Da의 분자량을 갖는 마그네슘 히알루로네이트 8 ㎏을 상기 용해 탱크에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, 온도를 42 ℃에서 조절하고, pH를 황산으로 5.5로 조절하고, 3 x 107 IU의 바실러스 히알루로니다제(실시예 6에서 제조됨)를 효소분해를 위해 교반 하에서 가하였다. 목적하는 분자량이 성취될 때까지 효소분해를 계속하고; 온도를 55 ℃로 상승시키고, 50 분간 유지시켰다. 60 ㎏의 MgCl2를 가하고, 완전히 용해된 후에 0.45 ㎛ 폴리프로필렌 여과 코어로 여과를 수행하고, 이어서 2.5 ㎥의 프로판올을 침전에 사용하여 저분자량 마그네슘 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 프로판올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 저분자량 마그네슘 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 저분자량 마그네슘 히알루로네이트는 백색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 97.2%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 98.1%이었으며; 그의 분자량은 538 kDa이었다.
실시예 24: 저분자량 칼슘 히알루로네이트의 제조
1 ㎥ 스테인레스 스틸 용해 탱크에, 1 ㎥의 정제수를 가하고, 2.46 x 106 Da의 분자량을 갖는 칼슘 히알루로네이트 5 ㎏을 상기 용해 탱크에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, 온도를 40 ℃에서 조절하고, pH를 빙초산으로 7.0으로 조절하고, 5 x 107 IU의 바실러스 히알루로니다제(실시예 5에서 제조됨)를 효소분해를 위해 교반 하에서 가하였다. 목적하는 분자량이 성취될 때까지 효소분해를 계속하고; 온도를 65 ℃로 상승시키고, 40 분간 유지시켰다. 50 ㎏의 CaCl2를 가하고, 완전히 용해된 후에 0.45 ㎛ 폴리프로필렌 여과 코어로 여과를 수행하고, 이어서 4.5 ㎥의 아세톤을 침전에 사용하여 저분자량 칼슘 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 아세톤으로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 저분자량 칼슘 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 저분자량 칼슘 히알루로네이트는 백색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 98.1%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 98.2%이었으며; 그의 분자량은 205 kDa이었다.
실시예 25: 저분자량 나트륨 히알루로네이트의 제조
1 ㎥ 스테인레스 스틸 용해 탱크에, 1 ㎥의 정제수를 가하고, 2.78 x 106 Da의 분자량을 갖는 나트륨 히알루로네이트 2 ㎏을 상기 용해 탱크에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, 온도를 35 ℃에서 조절하고, pH를 빙초산으로 6.5로 조절하고, 2 x 107 IU의 바실러스 히알루로니다제(실시예 4에서 제조됨)를 효소분해를 위해 교반 하에서 가하였다. 목적하는 분자량이 성취될 때까지 효소분해를 계속하고; 온도를 58 ℃로 상승시키고, 50 분간 유지시켰다. 70 ㎏의 Na2SO4를 가하고, 완전히 용해된 후에 0.45 ㎛ 나이트로셀룰로스 여과 코어로 여과를 수행하고, 이어서 4.8 ㎥의 에탄올을 침전에 사용하여 저분자량 나트륨 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 에탄올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 저분자량 나트륨 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 저분자량 나트륨 히알루로네이트는 백색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 98.6%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 98.3%이었으며; 그의 분자량은 332 kDa이었다.
실시예 26: 저분자량 나트륨 히알루로네이트의 제조
1 ㎥ 스테인레스 스틸 용해 탱크에, 1 ㎥의 정제수를 가하고, 1.41 x 106 Da의 분자량을 갖는 나트륨 히알루로네이트 15 ㎏을 상기 용해 탱크에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, 온도를 43 ℃에서 조절하고, pH를 수산화 나트륨으로 8.0으로 조절하고, 4 x 107 IU의 바실러스 히알루로니다제(실시예 3에서 제조됨)를 효소분해를 위해 교반 하에서 가하였다. 목적하는 분자량이 성취될 때까지 효소분해를 계속하고; 온도를 65 ℃로 상승시키고, 40 분간 유지시켰다. 80 ㎏의 NaCl을 가하고, 완전히 용해된 후에 0.45 ㎛ 폴리설폰 여과 코어로 여과를 수행하고, 이어서 8 ㎥의 에탄올을 침전에 사용하여 저분자량 나트륨 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 에탄올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 저분자량 나트륨 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 저분자량 나트륨 히알루로네이트는 백색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 98.2%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 99.1%이었으며; 그의 분자량은 38 kDa이었다.
실시예 27: 저분자량 콘드로이틴 설페이트의 제조에서 히알루로니다제의 용도
1 ㎥ 스테인레스 스틸 용해 탱크에, 1 ㎥의 pH 6.0 포스페이트 완충 용액을 제조하고, 5 x 104 Da의 분자량을 갖는 콘드로이틴 설페이트 50 ㎏을 상기 용해 탱크에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, 온도를 37 ℃에서 조절하고, 9 x 108 IU의 바실러스 히알루로니다제(예를 들어, 실시예 3 내지 9 중 어느 하나에서 제조된 바와 같은 히알루로니다제)를 가하고, 분자량이 5000 Da일 때까지 효소분해를 계속하고, 온도를 50 ℃로 상승시키고, 60 분간 유지시키고, 상기 효소분해 용액을 0.45 ㎛ 여과 코어로 여과하고, 이어서 20 ㎥의 에탄올을 침전에 사용하여 저분자량 콘드로이틴 설페이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 에탄올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 저분자량 콘드로이틴 설페이트를 수득하였다. 상기 저분자량 콘드로이틴 설페이트는 백색 분말이었으며, 그의 함량은 95.8%이었고; 그의 분자량은 5.1 kDa이었고, 그의 pH는 6.8이었다.
비교 실시예 1: 화학적 분해 방법(1)에 의한 올리고머성 나트륨 히알루로네이트의 제조
1 L 비이커에, 1 L의 정제수를 가하고, 8 x 105 Da의 분자량을 갖는 나트륨 히알루로네이트 50 g을 상기 비이커에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, 10 ㎖의 농축된 염산을 가하고, 분자량이 104 Da 미만일 때까지 분해가 진행되었으면, pH를 수산화 나트륨으로 6.2로 조절하고, 상기 분해 용액을 0.45 ㎛ 혼합된 셀룰로스 여과 멤브레인으로 여과하고, 이어서 10 L의 에탄올을 침전에 사용하여 나트륨 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 에탄올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 올리고머성 나트륨 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 올리고머성 나트륨 히알루로네이트는 밝은 황색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 63.8%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 98.9%이었으며; 그의 분자량은 8.1 kDa이었고, pH는 4.8이었다. 그의 적외선 스펙트럼을 도 2b에 나타내었으며, 이는 유럽 약전의 표준 스펙트럼과 일치하지 않았다.
비교 실시예 2: 화학적 분해 방법(2)에 의한 올리고머성 나트륨 히알루로네이트의 제조
1 L 비이커에, 1 L의 정제수를 가하고, 5 x 105 Da의 분자량을 갖는 나트륨 히알루로네이트 100 g을 상기 비이커에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, 10 ㎖의 농축된 염산을 가하고, 분자량이 104 Da 미만일 때까지 분해가 진행되었으면, pH를 수산화 나트륨으로 6.5로 조절하고, 상기 분해 용액을 0.45 ㎛ 폴리설폰 여과 멤브레인으로 여과하고, 이어서 10 L의 에탄올을 침전에 사용하여 나트륨 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 에탄올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 올리고머성 나트륨 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 올리고머성 나트륨 히알루로네이트는 밝은 황색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 60.2%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 99.2%이었으며; 그의 분자량은 7.6 kDa이었고, pH는 4.2이었다.
비교 실시예 3: 화학적 분해 방법(1)에 의한 저분자량 나트륨 히알루로네이트의 제조
1 L 비이커에, 1 L의 정제수를 가하고, 1 x 106 Da의 분자량을 갖는 나트륨 히알루로네이트 10 g을 상기 비이커에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, 5 g의 수산화 나트륨을 가하고, 온도를 65 ℃로 상승시키고, 목적하는 분자량이 성취될 때까지 분해가 진행되었으면, pH를 빙초산으로 6.5로 조절하고, 상기 분해 용액을 0.45 ㎛ 폴리설폰 여과 멤브레인으로 여과하고, 이어서 5 L의 에탄올을 침전에 사용하여 저분자량 나트륨 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 에탄올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 저분자량 나트륨 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 저분자량 나트륨 히알루로네이트는 밝은 황색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 68.2%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 97.5%이었으며; 그의 분자량은 15 kDa이었고, pH는 6.9이었다.
비교 실시예 4: 화학적 분해 방법(2)에 의한 저분자량 나트륨 히알루로네이트의 제조
1 L 비이커에, 1 L의 정제수를 가하고, 1.41 x 106 Da의 분자량을 갖는 나트륨 히알루로네이트 15 g을 상기 비이커에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, 6 g의 수산화 나트륨을 가하고, 온도를 65 ℃로 상승시키고, 목적하는 분자량이 성취될 때까지 분해가 진행되었으면, pH를 염산으로 6.2로 조절하고, 상기 분해 용액을 0.45 ㎛ 폴리설폰 여과 멤브레인으로 여과하고, 이어서 4 L의 에탄올을 침전에 사용하여 저분자량 나트륨 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 에탄올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 저분자량 나트륨 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 저분자량 나트륨 히알루로네이트는 밝은 황색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 70.5%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 96.8%이었으며; 그의 분자량은 39.2 kDa이었고, pH는 6.4이었다.
비교 실시예 5: 화학적 분해 방법(3)에 의한 저분자량 나트륨 히알루로네이트의 제조
1 L 비이커에, 1 L의 정제수를 가하고, 1.61 x 106 Da의 분자량을 갖는 나트륨 히알루로네이트 8 g을 상기 비이커에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, 6 g의 수산화 나트륨을 가하고, 온도를 60 ℃로 상승시키고, 목적하는 분자량이 성취될 때까지 분해가 진행되었으면, pH를 빙초산으로 6.8로 조절하고, 상기 분해 용액을 0.45 ㎛ 폴리설폰 여과 멤브레인으로 여과하고, 이어서 4 L의 에탄올을 침전에 사용하여 저분자량 나트륨 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 에탄올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 저분자량 나트륨 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 저분자량 나트륨 히알루로네이트는 밝은 황색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 73.2%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 98.5%이었으며; 그의 분자량은 330 kDa이었고, pH는 6.2이었다.
비교 실시예 6: 화학적 분해 방법(4)에 의한 저분자량 나트륨 히알루로네이트의 제조
1 L 비이커에, 1 L의 정제수를 가하고, 2.25 x 106 Da의 분자량을 갖는 나트륨 히알루로네이트 5 g을 상기 비이커에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, 5 g의 수산화 나트륨을 가하고, 온도를 60 ℃로 상승시키고, 목적하는 분자량이 성취될 때까지 분해가 진행되었으면, pH를 빙초산으로 6.6으로 조절하고, 상기 분해 용액을 0.45 ㎛ 폴리설폰 여과 멤브레인으로 여과하고, 이어서 2 L의 에탄올을 침전에 사용하여 저분자량 나트륨 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 에탄올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 저분자량 나트륨 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 저분자량 나트륨 히알루로네이트는 밝은 황색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 89.9%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 96.8%이었으며; 그의 분자량은 530 kDa이었고, pH는 7.5이었다.
비교 실시예 7: 화학적 분해 방법(5)에 의한 저분자량 나트륨 히알루로네이트의 제조
1 L 비이커에, 1 L의 정제수를 가하고, 2.46 x 106 Da의 분자량을 갖는 나트륨 히알루로네이트 4 g을 상기 비이커에 교반하면서 가하고, 완전히 용해시킨 후에, 4 g의 수산화 나트륨을 가하고, 온도를 60 ℃로 상승시키고, 목적하는 분자량이 성취될 때까지 분해가 진행되었으면, pH를 염산으로 6.2로 조절하고, 상기 분해 용액을 0.45 ㎛ 폴리설폰 여과 멤브레인으로 여과하고, 이어서 3 L의 에탄올을 침전에 사용하여 저분자량 나트륨 히알루로네이트 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 에탄올로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 저분자량 나트륨 히알루로네이트를 수득하였다. 상기 저분자량 나트륨 히알루로네이트는 밝은 황색 분말이었으며, HPLC 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 95.8%이었고; 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 함량은 98.5%이었으며; 그의 분자량은 770 kDa이었고, pH는 7.6이었다.
실험 실시예 1: 효소분해(효소 절단) 및 화학적 분해에 의해 제조된 바와 같은 올리고머성 히알루로네이트들의 구조의 비교
올리고머성 히알루론산 또는 저분자량 히알루론산뿐만 아니라 통상적인 히알루론산은 모두 N-아세틸글루코스아민 및 D-글루쿠론산 다이사카라이드 반복 단위들로 이루어지며, 따라서 그들의 함량은 그들의 다이사카라이드 함량과 동등하였고, 상기 올리고머성 히알루론산 또는 저분자량 히알루론산 또는 통상적인 히알루론산은 바실러스 히알루로니다제에 의해 다이사카라이드로 분해될 수 있었으며, 상기 올리고머성 히알루로네이트 또는 저분자량 히알루로네이트의 함량을 획득하기 위해서 상기 다이사카라이드 함량을 HPLC 방법에 의해 측정할 수 있었다. 그 동안에, 상기 올리고머성 히알루로네이트 또는 저분자량 히알루로네이트의 함량을 또한 카바졸 방법에 의해 측정하였다. 상기 히알루론산 또는 그의 염의 구조가 파괴된 경우, 히알루로니다제는 파괴된 부분의 글루코사이드 결합을 깨뜨리지 않을 것이며, 따라서 이는 다이사카라이드 함량을 감소시킬 것이다. 상기 HPLC 방법과 카바졸 방법 간에 측정된 값의 차이가 클수록, 올리고머성 히알루로네이트 또는 저분자량 히알루로네이트의 파괴된 부분이 크다.
구체적인 방법을 또한 출원 번호 CN 102323344A의 중국 특허 출원(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에서 찾을 수 있다.
예를 들어, 상기 HPLC를 하기의 단계들에 의해 수행할 수 있다:
a. 표준 대조용 용액: 표준 대조군(히알루론산 다이사카라이드 ΔDiHA 나트륨 염, H9649, 시그마)의 양을 칭량하고, 포스페이트 완충 용액(pH 6.0, 5 mmol/L)으로 용해시켜 1 ㎎/㎖ 용액을 제형화하고, 따라서 표준 대조용 용액을 수득하였다;
b. 샘플 전처리: 시험하고자 하는 샘플(비교 실시예 1 내지 7, 실시예 13 내지 26에 의해 제조된)의 양을 칭량하고, 포스페이트 완충 용액(pH 6.0, 5 mmol/L)으로 용해시켜 1 ㎎/㎖ 용액을 제형화하였다. 1 ㎖의 샘플 용액에 1000 IU의 히알루로니다제(실시예 10-12에 의해 제조될 수 있다)를 가하고, 여기에 42 ℃ 수욕을 2 시간 동안 가하고; 효소분해 후에, 상기 효소분해 용액을 2 분 동안 비등시켜 상기 효소를 불활성화시키고, 따라서 효소분해 용액 샘플을 수득하였다.
상기 효소분해 용액 샘플을 20 ㎖ 메스플라스크로 옮기고, 이동상을 상기 눈금으로 가하고, 균일하게 혼합하고, 여과하여 시험하고자 하는 용액을 수득하였다.
c. 표준 대조용 용액의 처리: 1 ㎖의 표준 대조용 용액을 이동상으로 20 배까지 희석하고, 대기 사용을 위해 여과한다.
d. 크로마토그래피 조건: 고성능 액체 크로마토그래피 측정을 수행하기 위해 사카라이드 분석 컬럼을 사용하고; 이동상은 0.4 mol/L NaH2PO4 용액이며; 유량은 0.6 ㎖/분이고; 컬럼 온도는 35 ℃이고; 검출 파장은 232 ㎚이고; 샘플 크기는 20 ㎕이었다;
e. 결과 계산: 표준 대조용 및 시험하고자 하는 샘플 각각의 크로마토그래피 분리를 수행하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하고, 히알루론산 다이사카라이드 피크 면적을 외부 표준 방법에 의해 계산하였다; 구체적으로 하기의 식을 사용하여 올리고머성 히알루론산 또는 그의 염의 함량을 계산하였다:
히알루로네이트의 함량: C(%) = (AX x CR x 100)/(AR x WX x (100-h)) x 100%
Ax: 시험하고자 하는 샘플의 히알루론산 다이사카라이드의 피크 면적;
AR: 표준 대조군의 히알루론산 다이사카라이드의 피크 면적;
Wx: 시험하고자 하는 샘플의 양, ㎎;
CR: 표준 대조용 용액의 농도, ㎎/㎖;
h(%)는 시험하고자 하는 샘플의 건조 손실이다.
비교 실시예 1 내지 2 및 실시예 13 내지 18에서 수득한 올리고머성 히알루로네이트의 함량의 비교를 표 1에 나타내었다.
올리고머성 히알루로네이트의 함량
비교 실시예 실시예
1 2 13 14 15 16 17 18
함량 (HPLC 방법, %) 63.8 60.2 96.8 98.8 97.6 96.6 98.7 96.8
함량 (카바졸 방법, %) 98.9 99.2 97.5 98.3 97.8 97.3 98.3 97.6
함량 차이 (%) 35.1 39 0.7 0.5 0.2 0.7 0.4 0.8
표 1에서, HPLC 방법과 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같이, 화학적 분해 방법을 통해 제조된 올리고머성 히알루로네이트의 함량의 비교적 큰 차이가 존재하는 반면, HPLC 방법과 카바졸 방법에 의해 측정된 바와 같이, 효소분해 방법을 통해 제조된 올리고머성 히알루로네이트들의 함량의 유의수준 차이는 없음, 즉 상기 차이들은 모두 1% 미만임을 알 수 있다. 이는 효소분해 방법에 의해 제조된 올리고머성 히알루로네이트가 완전한 구조를 갖는 반면 화학적 분해 방법에 의해 제조된 히알루로네이트의 구조는 비교적 큰 정도로 파괴되었음을 가리킨다.
그 동안에, 적외선 스펙트럼은 효소 절단 방법에 의해 제조된 올리고머성 히알루로네이트가 유럽 약전의 표준 스펙트럼과 일치하는 반면, 화학적 분해 방법에 의해 제조된 올리고머성 히알루로네이트는 대략 1610 ㎝-1의 파수에서 유럽 약전의 표준 스펙트럼과 현저하게 상이함을 보이며, 이는 상기 화학적 분해 방법에 의해 제조된 올리고머성 히알루로네이트의 구조가 파괴된 반면, 효소 절단 방법에 의해 제조된 올리고머성 히알루로네이트는 완전함을 가리킨다.
실험 실시예 2: 효소분해(효소 절단) 및 화학적 분해에 의해 제조된 바와 같은 저분자량 히알루로네이트들의 구조의 비교
비교 실시예 3 내지 7 및 실시예 19 내지 26에서 수득한 저분자량 히알루로네이트들의 함량의 비교를 표 2 내지 3에 나타내었다.
구체적인 단계들은 실험 실시예 1에서 언급되었다.
저분자량 히알루로네이트(비교 실시예 3 내지 7)의 함량
비교 실시예 3 4 5 6 7
분자량 (KDa) 15 39.2 330 530 770
함량 (HPLC 방법, %) 68.2 70.5 73.2 89.9 95.8
함량 (카바졸 방법, %) 97.5 96.8 98.5 96.8 98.5
차이 (%) 29.3 26.3 25.3 6.9 2.7
저분자량 히알루로네이트(실시예 19 내지 26)의 함량
실시예 20 26 24 25 22 23 21 19
분자량 (KDa) 15 38 205 332 421 538 754 931
함량(HPLC 방법, %) 96.8 98.2 98.1 98.6 96.3 97.2 98.5 98.3
함량 (카바졸 방법, %) 97.5 99.1 98.2 98.3 97.3 98.1 98.2 98.5
차이 (%) 0.7 0.9 0.1 0.3 1.0 0.9 0.3 0.2
표 2 및 3으로부터, 화학적 분해 방법에 의해 제조된 저분자량 히알루로네이트의 분자량이 770,000 미만일 때, 상기 2 가지 방법에 의해 측정된 바와 같은 함량의 차이는 분자량의 감소에 따라 증가하는 반면; 상기 2 가지 방법에 의해 측정된 바와 같은 함량의 차이는 항상, 효소분해 방법에 의해 제조된 저분자량 히알루로네이트의 분자량이 변할 때, 매우 작음, 즉 모두 1% 미만임을 알 수 있다. 이러한 현상은 효소분해 방법에 의해 제조된 저분자량 히알루론산의 구조가 완전한 반면, 화학적 분해 방법에 의해 제조된 저분자량 히알루론산의 분자량이 770,000 미만일 때, 상기 분자량이 작을수록 구조의 손상 정도가 크다는 것을 나타낸다.
동물 효소 분해에 의해 수득한 올리고머성 히알루로네이트는 생물 활성, 예를 들어 혈관형성 촉진, 상처 치유 촉진, 종양 대항 및 면역 조절을 갖는다. 미생물-공급된 히알루로니다제 분해에 의해 수득된 올리고머성 히알루로네이트의 생물 활성은 보고되지 않았다. 그러나, 하기의 실험 연구자들은 본 발명에서 수득된 올리고머성 히알루로네이트가 세포독성이 없으며, 화학적 분해 방법에 의해 수득된 올리고머성 히알루로네이트에 비해, 유리 라디칼 제거에 효능 있는 효과, 효능 있는 환원 능력, 일광 차단 및 일광화상 후 보수에 효능 있는 효과를 가지며, 따라서 화장품에 사용될 수 있고; 상기 올리고머성 히알루로네이트는 작은 분자량을 가지며 장 흡수에 용이하고, 따라서 식품에 사용될 수 있으며; 그 동안에, 상기 올리고머성 히알루로네이트는 혈관형성 촉진 및 상처 치유 촉진 작용을 갖고, 따라서 의학 분야에 사용될 수 있음을 보인다.
미생물-공급된 히알루로니다제 분해에 의해 수득된 저분자량 히알루로네이트의 생물 활성도 또한 보고되지 않았다. 그러나, 상기 실시예 19 내지 26은 효소 절단에 의해 제조된 저분자량 히알루로네이트가 완전한 구조를 가짐을 보이며, 하기의 실험 연구자들은 본 발명에서 수득된 저분자량 히알루로네이트가 유리 라디칼 제거에 효능 있는 효과, 효능 있는 환원 능력, 일광 차단 및 일광화상 후 보수에 효능 있는 효과를 가지며, 따라서 화장품 및 약물에 사용될 수 있고; 상기 저분자량 히알루로네이트를 또한 식품, 피부의 매끄러움 및 탄력의 유지에 사용할 수 있음을 보인다.
실험 실시예 3: 히알루로니다제 활성에 대한 온도의 영향 및 히알루로니다제의 열 안정성 시험
pH 6.0의 포스페이트 완충 용액을 사용하여 2 ㎎/㎖의 최종 농도를 갖는 HA 용액을 제조하고, 9.9 ㎖을 취하여 기질 용액으로서 사용하고, 100 ㎕의 적합하게 희석된(232 ㎚에서 흡수 값이 0.3 내지 0.7인 한) 히알루로니다제 용액(예를 들어 실시예 3 내지 12 중 어느 하나에서 제조된 히알루로니다제)을 가하고, 수욕 하에서 반응을 상이한 온도에서 30 분간 수행하고, 이어서 2 분간 비등시키고, 예비-불활성화시킨 희석된 효소 용액을 대조군으로서 사용하였으며, 상기 용액이 실온으로 냉각되었을 때, 232 ㎚에서의 흡수 값을 측정하고(상기 값은 히알루로니다제의 활성을 나타내었다), 결과를 도 3a에 나타내었으며, 여기에서 가장 적합한 반응 온도는 42 ℃였다.
상기 히알루로니다제 용액을 상이한 시간의 기간 동안 각각 40 ℃, 45 ℃, 50 ℃, 55 ℃, 60 ℃의 일정한 온도에서 유지시키고, 이어서 잔류 효소 활성을 측정하고, 결과를 도 3b에 나타내었다: 상기 효소 활성은 40 ℃ 및 45 ℃에서 비교적 안정하였고, 6 시간 이내에 거의 변하지 않았으며, 이는 상기 히알루로니다제 활성이 45 ℃ 이하에서 매우 안정하고 실온에서 산업적인 생산 요건을 충족시킬 수 있었음을 나타낸다.
실험 실시예 4: 히알루로니다제 활성에 대한 pH의 영향 및 히알루로니다제의 pH 안정성 시험
pH 1.0 내지 pH 12.0의 완충 용액들을 각각 제조하고, 이들 완충 용액을 사용하여 상응하는 pH를 갖는 2 ㎎/㎖의 히알루론산 용액들을 제조하고, 상이한 pH의 HA 용액 9.9 ㎖을 별도로 취하여 기질 용액으로서 사용하고, 100 ㎕의 적합하게 희석된(232 ㎚에서 흡수 값이 0.3 내지 0.7인 한) 히알루로니다제 용액(예를 들어 실시예 3 내지 12 중 어느 하나에서 제조된 히알루로니다제)을 가하고, 수욕 하에서 반응을 30 분간 수행하고, 이어서 2 분간 비등시키고, 예비-불활성화시킨 희석된 효소 용액을 대조군으로서 사용하였으며, 상기 용액이 실온으로 냉각되었을 때, 232 ㎚에서의 흡수 값을 측정하고, 결과를 도 4a에 나타내었다: 상기 효소의 가장 적합한 pH는 6.5였으며, pH≤4.0 또는 pH≥9.0일 때 상기 효소는 활성이 없었다.
상기 히알루로니다제(예를 들어 실시예 3 내지 12 중 어느 하나에서 제조된 히알루로니다제)를 상이한 pH를 갖는 완충 용액으로 적합하게 희석하고, 이어서 잔류 효소 활성을 측정하고, 결과를 도 4b에 나타내었다: 상기 효소 활성은 pH 5.0 내지 6.0에서 비교적 안정하였고, 이는 6 시간 이내에 거의 감소하지 않았다.
본 발명의 히알루로니다제가 높은 효소 활성, 양호한 열 안정성 및 pH 안정성을 가지며, 히알루론산의 대규모 산업적인 분해를 위한 효소량의 요건을 충족시킬 수 있고, 상기 효소의 제조 공정이 간단하며, 조건이 보통이고, 비용이 저렴하며, 화학적 분해의 환경 오염, 생물학적 분해 효소의 공급원의 제한, 낮은 활성 및 높은 가격과 같은 결점들을 극복함을 알 수 있다.
실험 실시예 5: 효소의 기질 특이성의 시험
10 ㎎/㎖의 최종 농도를 갖는 콘드로이틴 설페이트, 나트륨 알기네이트, 헤파린 나트륨, 키토산, 키틴 및 카복시메틸 셀룰로스 나트륨의 용액들을 pH 6.0 포스페이트 완충 용액으로 별도로 제조하고, 각각으로부터 9.9 ㎖을 기질 용액으로서 취하고, 100 ㎕의 적합하게 희석된(232 ㎚에서 흡수 값이 0.3 내지 0.7인 한) 히알루로니다제 용액(예를 들어 실시예 3 내지 12 중 어느 하나에서 제조된 히알루로니다제)을 가하고, 수욕 하에서 반응을 42 ℃에서 30 분간 수행하고, 이어서 2 분간 비등시키고, 예비-불활성화시킨 희석된 효소 용액을 대조군으로서 사용하였으며, 상기 용액이 실온으로 냉각되었을 때, 232 ㎚에서의 흡수 값을 측정하였다. 결과를 표 4에 나타내었다.
히알루로니다제의 기질 특이성
기질 A 232
콘드로이틴 설페이트 1.0813
나트륨 알기네이트 0
헤파린 나트륨 0
키토산 0
키틴 0
카복시메틸 셀룰로스 나트륨 0
상기 결과는 히알루로니다제가 히알루론산을 촉매적으로 분해시킬 뿐만 아니라 콘드로이틴 설페이트상에서도 작용하지만, 나트륨 알기네이트, 헤파린 나트륨, 키토산, 키틴 및 카복시메틸 셀룰로스 나트륨을 분해시킬 수 없음을 보였다.
실험 실시예 6: 화학적 분해 방법 및 효소 절단 방법에 의해 제조된 올리고머성 히알루로니다제들의 세포독성의 비교
상기 실험 사용된 L929 마우스 섬유아세포 세포(중국 과학원의 표준 배양 콜렉션 위원회의 세포 은행으로부터 구입하였다)를 관찰 세포로서 사용하였으며, 10% 소 태아 혈청이 첨가된 RPMI-1640 배양 배지를 완전 배지로서 사용하였고, 음성 대조군은 시험하고자 하는 어떠한 샘플도 없는 완전 배지이고, 양성 대조군은 5 g/L의 페놀 용액(상기 완전 배지에 용해된)이며, 블랭크 대조군은 무세포 완전 배지이고, 시험하고자 하는 샘플은 올리고머성 나트륨 히알루로네이트 샘플이 첨가된 완전 배지였다. 72 시간 동안 배양 후에, 상대 생육률(RGR)을 하기의 식에 의해 계산하였다.
RGR(%) = A/A0 x 100%
상기에서,
RGR은 상대 생육률, %이고;
A는 블랭크의 공제 없이, 시험하고자 하는 샘플 그룹(음성 그룹, 양성 그룹)의 흡광도이고;
A0는 블랭크의 공제 없이, 음성 대조군의 흡광도이다.
세포독성의 등급을 표 5의 RGR 등급 표준에 따라 측정하였다. 상기 양성 대조군이 3 등급 이상의 반응이고, 상기 샘플의 세포독성 반응도가 2 등급 이하일 때, 그의 세포독성은 허용 가능한 것으로 간주되었다.
세포독성 반응 등급(미국 약전에 따름)
등급 0 1 2 3 4
RGR(%) 100 80 - 99 50 - 79 30 - 49 0 - 29
올리고머성 나트륨 히알루로네이트의 세포독성의 실험 결과
샘플 샘플 농도(%,w/v) OD570 (X±SD) RGR (%) 세포독성 등급
비교 실시예1 0.25 0.762±0.062 84.36 1
0.5 0.681±0.092 74.43 2
1.0 0.629±0.057 68.14 2
2.0 0.452±0.052 46.61 3
3.0 0.357±0.023 35.14 3
4.0 0.193±0.024 15.21 4
실시예13 0.25 0.985±0.063 110.94 0
0.5 1.147±0.059 130.43 0
1.0 1.075±0.041 121.74 0
2.0 0.929±0.095 104.21 0
3.0 0.646±0.038 70.20 2
4.0 0.471±0.039 49.19 3
실시예 14 0.25 1.012±0.057 113.58 0
0.5 1.107±0.044 124.24 0
1.0 0.998±0.045 112.01 0
2.0 0.935±0.026 104.94 0
3.0 0.742±0.030 83.28 1
4.0 0.520±0.030 58.36 2
실시예 15 0.25 0.898±0.060 100.79 0
0.5 0.997±0.045 111.90 0
1.0 0.925±0.038 103.82 0
2.0 0.832±0.041 93.38 1
3.0 0.605±0.058 67.90 2
4.0 0.450±0.049 50.51 2
실시예 16 0.25 1.015±0.029 113.92 0
0.5 1.090±0.035 122.33 0
1.0 0.985±0.038 110.55 0
2.0 0.886±0.055 99.44 1
3.0 0.721±0.032 80.92 1
4.0 0.489±0.033 54.88 2
실시예 17 0.25 0.932±0.054 104.60 0
0.5 1.005±0.067 112.79 0
1.0 0.974±0.051 109.32 0
2.0 0.889±0.055 99.78 1
3.0 0.719±0.042 80.70 1
4.0 0.530±0.039 59.48 2
실시예 18 0.25 1.033±0.055 115.94 0
0.5 1.213±0.048 136.14 0
1.0 1.098±0.029 123.23 0
2.0 0.980±0.028 109.99 0
3.0 0.726±0.030 81.48 1
4.0 0.501±0.037 56.23 2
음성 대조군 0.891±0.030 100.00 0
양성 대조군 0.071±0.010 0.43 4
상기 결과는 화학적 분해 방법에 의해 제조된 올리고머성 나트륨 히알루로네이트가, 그의 농도가 1.0% 이하일 때 세포독성이 아닌 반면; 효소 절단 방법에 의해 제조된 올리고머성 나트륨 히알루로네이트는 그의 농도가 3.0% 이하일 때 세포독성이 아님을 나타낸다. 화학적 분해 방법의 올리고머성 나트륨 히알루로네이트에 비해, 효소 절단 방법에 의해 제조된, 동일한 농도를 갖는 올리고머성 나트륨 히알루로네이트는 세포 증식의 촉진에 대해 유의수준의 효과를 갖는다(p<0.05).
실험 실시예 7: 효소 절단 방법에 의해 제조된 히알루로네이트의 경피 흡수, 산화방지 활성 및 환원능에 대한 연구
1. 효소 절단 방법에 의해 제조된 올리고머성 히알루로네이트의 경피 흡수에 대한 연구
털이 없는 마우스의 피부 재료를 경피 흡수 장비의 확산 셀에 고정시키고, 0.5% 올리고머성 히알루로네이트(별도로 실시예 13 내지 18에서 제조됨) 용액을 상기 확산 셀의 공여 부분에 가하고, 샘플을 3 시간 마다 취하고, 수용된 용액 중의 올리고머성 히알루로네이트의 함량을 측정하였다. 결과를 도 5a에 나타내었다. 상기 다이어그램은 상기 올리고머성 히알루로네이트가 피부 내부에 들어가 흡수될 수 있음을 보였다.
2. 올리고머성 히알루로네이트 및 저분자량 히알루로네이트의 산화방지 활성에 대한 연구
효소 절단 방법 및 화학적 분해 방법에 의해 제조된 올리고머성 히알루로네이트 및 저분자량 히알루로네이트를 DPPH 유리 라디칼의 제거 능력 및 그의 환원 능력에 대해 별도로 예비 연구하였다.
사용된 시약 및 세포 균주는 하기와 같았다:
상이한 분자량을 갖는 히알루로네이트:
효소 절단 올리고머성 히알루로네이트: 실시예 13 내지 18에서 제조됨;
화학적 방법 올리고머성 히알루로네이트: 비교 실시예 1 내지 2에 따라 제조됨;
효소 절단 저분자량 히알루로네이트: 실시예 19 내지 26에서 제조됨;
화학적 방법 저분자량 히알루로네이트: 비교 실시예 3 내지 7에서 제조됨;
고분자량 나트륨 히알루로네이트(분자량: 1610,000, HA-1610k); 후악시 푸루이다 바이올로지컬 메디슨 캄파니 리미티드(Huaxi Furuida Biological Medicine Co., Ltd.)에 의해 제조됨.
1) 유리 라디칼 제거 능력에 대한 연구
DPPH 유리 라디칼의 제거 능력을 측정하기 위한 기전: 다이페닐-피크릴하이드라진(DPPH)은 질소 중심을 갖는 안정한 유리 라디칼이며, DPPH의 메탄올 용액 또는 에탄올 용액은 보라색이고, 510 내지 530 ㎚의 파장에서 최대 흡광도를 가지며, 그의 농도는 그의 흡광도와 1차 관계였다. 유리 라디칼 제거제가 존재할 때, 유리 라디칼 제거제는 1 개의 전자를 제공하여 DPPH의 고립 쌍 전자와 쌍을 이루고 따라서 색상이 퇴색되며, 상기 색상 퇴색 정도는 상기 수용된 전자와 정량적인 관계이다, 즉 상기 용액의 색상이 밝게 변하고, 흡광도가 감소하였다(문헌[Alisi, C. S., et al., Free radical scavenging and in-vitro antioxidant effects of ethanol extract of the medicinal herb Chromolaena odorata Linn. British Journal of Pharmaceutical Research, 2011,1 (4), 141-155]). 상기 유리 라디칼 제거제의 능력이 클수록, 흡광도가 작아진다. 0.1 mM DPPH(2-메틸-2,3-다이하이드로-5,6-다이페닐피라진) 에탄올 용액 5.0 ㎖ 및 상이한 농도를 갖는 올리고머성 히알루로네이트 또는 저분자량 히알루로네이트 5.0 ㎖을 별도로 정확하게 계량하고, 마개로 막은 시험관에 넣고, 균일하게 혼합하였다. 물 및 95% 에탄올의 균등 혼합된 용액을 블랭크 대조군으로서 사용하였다. 실온에서 30 분 동안 정치시킨 후에, 용액 흡광도 값을 523 ㎚에서 별도로 측정하였다.
제거율(%) = 1 - [(HA와 DPPH의 반응 후 흡광도)/(DPPH 단독의 흡광도)]
상기 올리고머성 히알루로네이트의 실험 결과를 도 5b에 나타내었으며, 화학적 분해 올리고머성 나트륨 히알루로네이트(비교 실시예 1 또는 비교 실시예 2에서 제조됨)와 비교하여, 동일한 농도의 효소 절단 올리고머성 나트륨 히알루로네이트(실시예 13 내지 18에서 제조됨)가 더 큰 DPPH 유리 라디칼 제거 능력을 가졌음(p<0.05)을 알 수 있다.
상기 저분자량 히알루로네이트의 실험 결과를 도 5c에 나타내었다.
상기 다이어그램은 유리 라디칼 제거 능력이 화학적 분해 저분자량 히알루로네이트나 또는 효소 절단 저분자량 히알루로네이트 모두에서 분자량의 감소에 따라 증가함을 나타내었다. 그러나, 유사한 분자량을 갖는 저분자량 히알루로네이트에 관하여, 효소 절단 저분자량 히알루로네이트는 화학 분해 저분자량 히알루로네이트와 비교하여 더 큰 유리 라디칼 제거 능력을 가졌다. 1000,000 초과의 분자량을 갖는 히알루로네이트는 유리 라디칼 제거 능력을 거의 갖지 못했다.
2) 환원 능력의 측정
환원 능력의 측정 기전: pH 6.6의 약한 산성 환경에서 칼륨 페리시아나이드는 환원 물질에 의해 환원되어 칼륨 헥사시아노페레이트 K4Fe(CN)6을 생성시킬 수 있었으며, 상기는 FeCl3에 의해 제공된 제2철 이온과 추가로 반응하여, 700 ㎚에서 특정한 흡광도를 갖는 프러시안 블루(Fe4[K4Fe(CN)6]3)를 생성시켰고, 프러시안 블루의 생산량을 지표로서 사용함으로써, 상기 흡광도가 클수록, 상기 환원 능력이 강해진다. 따라서, 히알루로네이트 수용액을 원료 물질로서 사용한 경우, 그의 환원 능력을 상기 시스템에서 생성된 프러시안 블루의 양을 측정함으로써 판단할 수 있었다(문헌[Oyaizu, M. Antioxidant activity of browing products of glucosamine fractionated by organic solvent and thin-layer chromatography. Japanese Journal of Nutrition, 1986, 44, 307-315]).
올리고머성 히알루로네이트(실시예 13 내지 18에서 제조됨) 및 저분자량 히알루로네이트(실시예 19 내지 26에서 제조됨) 각각의 용액 2.5 ㎖ 뿐만 아니라 2.5 ㎖의 포스페이트 용액을 정확하게 계량하고 각각 마개로 막은 시험관에 넣고, 2.5 ㎖의 1.0% 칼륨 페리시아나이드 용액을 가하고, 균일하게 혼합하고, 50 ℃ 수욕으로 20 분간 처리하였다. 수욕 처리 후에, 상기를 신속히 냉각시키고, 2.5 ㎖의 10% 트라이클로로아세트산 용액을 가하고, 3000 rpm에서 10 분간 원심분리시켰다. 8 ㎖의 상등액을 취하고 5 ㎖의 물 및 1 ㎖의 0.1% 삼염화 제2철 용액을 가하고, 균등한 물을 블랭크 대조군으로서 사용하여 삼염화 제2철 용액을 대체하였다. 실온에서 10분간 정치시킨 후에, 용액 흡광도 값을 700 ㎚에서 측정하였다.
올리고머성 히알루로네이트의 환원 능력의 결과를 도 5d에 나타내었으며, 상기 다이어그램은 화학적 분해 올리고머성 히알루로네이트(비교 실시예 1 또는 비교 실시예 2에서 제조됨)와 비교할 때 동일한 농도의 상기 효소 절단 올리고머성 히알루로네이트가 더 큰 환원 능력을 가짐(p<0.05)을 보였다.
저분자량 히알루로네이트의 환원 능력의 결과를 도 5e에 나타내었으며, 상기 다이어그램은 분자량의 감소에 따라, 상기 환원 능력이 화학적 분해 저분자량 히알루로네이트나 또는 효소 절단 저분자량 히알루로네이트 모두에서 증가함을 나타내었다. 그러나, 유사한 분자량을 갖는 저분자량 히알루로네이트에 관하여, 효소 절단 저분자량 히알루로네이트는 화학적 분해 저분자량 히알루로네이트와 비교하여 더 큰 환원 능력을 가졌다. 1000,000 초과의 분자량을 갖는 히알루로네이트는 환원 능력을 거의 갖지 못했다.
상기 실험 결과들은 효소 절단 올리고머성 히알루로네이트(예를 들어 올리고머성 나트륨 히알루로네이트) 및 저분자량 히알루로네이트(예를 들어 저분자량 나트륨 히알루로네이트)가 화학적 분해 올리고머성 히알루로네이트(예를 들어 올리고머성 나트륨 히알루로네이트) 및 저분자량 히알루로네이트(예를 들어 저분자량 나트륨 히알루로네이트)와 비교하여 더 큰 DPPH 유리 라디칼 제거 능력 및 더 큰 환원 능력을 가지며, 따라서 인체에서 유리 라디칼을 유효하게 제거할 수 있고, 멜라닌의 형성을 감소시킬 수 있으며, 화장품에 사용되어 일광 차단, 일광화상 후 보수, 화이트닝 및 브라이트닝과 같은 작용들을 제공할 수 있고; 또한 건강관리 식품 및 통상적인 식품에 사용되어 체내 유리 라디칼의 제거 및 노화방지의 작용들을 제공할 수 있으며; 또한 체내 유리 라디칼에 의해 유발된 손상에 대항하기 위해 약물에 사용될 수 있음을 보였다.
실험 실시예 8: 건강관리 식품에서 효소 절단 히알루로네이트의 작용에 대한 연구
1. 건강관리 식품에서 효소 절단 올리고머성 히알루로네이트의 작용에 대한 연구
예를 들어, 주요 작용 성분으로서 올리고머성 히알루로네이트를 갖는 건강관리 경구 용액에서, 상기 첨가된 올리고머성 히알루로네이트의 양은 0.05% 내지 2%이었다. 상기 경구 용액의 제법은 0.5% 올리고머성 히알루로네이트(실시예 13 내지 18 중 어느 하나에서 제조됨)를 가하고, 이어서 25% 식용 설탕 또는 벌꿀을 가하고, 정제수로 용해시킴으로 이루어졌다. 완전한 용해 후에, 한외여과 장치를 사용하여 멸균을 수행하고, 이어서 10 ㎖의 경구 용액 병(고온 또는 자외선 오존으로 멸균됨)에 붓고, 뚜껑을 닫고 밀봉하였으며, 상기 작업들은 모두 청정한 작업장에서 수행되었다. 이어서 올리고머성 히알루로네이트 경구 용액을 수득하기 위해서 생성물에 대해 품질 시험을 수행하였다. 피실험자는 30 내지 65 세였으며, 각 그룹당 30 명으로 6 개의 그룹으로 나뉘었고, 각각의 피실험자에게 하루에 10 내지 20 ㎖의 올리고머성 히알루로네이트 경구 용액을 연속되는 달 동안 투여하였으며, 그 효과를 표 7에 나타내었다. 추가로 30 명을 대조군으로서 사용하였으며, 이들에게 하루에 식용 설탕 또는 꿀 용액을 투여하였다.
올리고머성 히알루로네이트 경구 용액의 투여 효과
샘플 평가 항목 상당한 변화 약간의 변화 변화 없음
실시예13 1. 피부가 매끄럽고, 촉촉하며, 탄력적이다 24 5 1
2. 발그레한 볼, 주름 감소, 젊어보임 17 8 5
3. 증대된 저항력, 쉽게 병에 걸리지 않음 23 4 3
4. 신체 이완 및 건강함, 쉽게 피로하지 않음 12 13 5
실시예 14 1. 피부가 매끄럽고, 촉촉하며, 탄력적이다 25 4 1
2. 발그레한 볼, 주름 감소, 젊어보임 21 6 3
3. 증대된 저항력, 쉽게 병에 걸리지 않음 22 5 3
4. 신체 이완 및 건강함, 쉽게 피로하지 않음 14 11 5
실시예 15 1. 피부가 매끄럽고, 촉촉하며, 탄력적이다 22 5 3
2. 발그레한 볼, 주름 감소, 젊어보임 19 7 4
3. 증대된 저항력, 쉽게 병에 걸리지 않음 21 5 4
4. 신체 이완 및 건강함, 쉽게 피로하지 않음 13 12 5
실시예 16 1. 피부가 매끄럽고, 촉촉하며, 탄력적이다 23 5 2
2. 발그레한 볼, 주름 감소, 젊어보임 17 9 4
3. 증대된 저항력, 쉽게 병에 걸리지 않음 22 5 3
4. 신체 이완 및 건강함, 쉽게 피로하지 않음 14 11 5
실시예 17 1. 피부가 매끄럽고, 촉촉하며, 탄력적이다 24 4 2
2. 발그레한 볼, 주름 감소, 젊어보임 18 8 4
3. 증대된 저항력, 쉽게 병에 걸리지 않음 23 5 2
4. 신체 이완 및 건강함, 쉽게 피로하지 않음 13 13 4
실시예 18 1. 피부가 매끄럽고, 촉촉하며, 탄력적이다 21 7 2
2. 발그레한 볼, 주름 감소, 젊어보임 19 6 5
3. 증대된 저항력, 쉽게 병에 걸리지 않음 20 7 3
4. 신체 이완 및 건강함, 쉽게 피로하지 않음 12 12 6
대조군 1. 피부가 매끄럽고, 촉촉하며, 탄력적이다 1 7 22
2. 발그레한 볼, 주름 감소, 젊어보임 0 7 23
3. 증대된 저항력, 쉽게 병에 걸리지 않음 0 3 27
4. 신체 이완 및 건강함, 쉽게 피로하지 않음 1 6 23
표 7로부터, 상기 올리고머성 나트륨 히알루로네이트를 건강관리 식품으로서 직접 먹을 수 있고, 상기는 흡수가 매우 용이하며, 면역력 증대, 노화 지연, 피부 광택 및 탄력의 복원과 같은 다수의 작용들을 가짐을 알 수 있었다. 본 발명의 올리고머성 히알루로네이트는 작은 분자량을 가지며, 인간의 장에 의해 흡수되어, 체조직 중 히알루론산의 함량을 증가시킬 수 있고, 노화로 인해 감소될 수도 있는 피부 히알루론산을 공급할 수 있다. 또한, 경구 투여에 의해 흡수된 소 분자량 히알루론산은, 피부가 부드러워지고 매끄러워지며, 관절이 유연해지고, 주름의 형성이 예방되도록 체내 고분자량 히알루론산을 생성시킬 수 있고, 따라서 식품 분야에 사용될 수 있다.
2. 건강관리 식품에서 저분자량 히알루로네이트의 작용에 대한 연구
예를 들어, 주요 작용 성분으로서 저분자량 히알루로네이트를 갖는 건강관리 경구 용액에서, 상기 첨가된 저분자량 히알루로네이트의 양은 0.05% 내지 2%이었다. 상기 경구 용액의 제법은 1.0% 저분자량 히알루로네이트(실시예 19 내지 26 중 어느 하나에서 제조됨)를 가하고, 이어서 25% 식용 설탕 또는 벌꿀을 가하는 것으로 이루어졌다. 제형화 방법: 제형화를 청정실에서 수행하고, 실온에서 정제수를 취하여 교반하고, 상기 저분자량 히알루로네이트를 나누어 가하고, 이어서 완전히 용해될 때까지 식용 설탕 또는 벌꿀을 가하고, 물을 100%까지 가한다. 완전한 용해 후에, 수분-가열 살균에 의해 멸균을 수행하고, 이어서 10 ㎖의 경구 용액 병(고온 또는 자외선 오존으로 멸균됨)에 붓고, 뚜껑을 닫고 밀봉하였으며, 상기 작업들은 모두 청정한 작업장에서 수행되었다. 이어서 저분자량 히알루로네이트 경구 용액을 수득하기 위해서 생성물에 대해 품질 시험을 수행하였다. 피실험자는 22 내지 55 세였으며, 각 그룹당 32 명으로 8 개의 그룹으로 나뉘었고, 각각의 피실험자에게 하루에 20 ㎖의 저분자량 히알루로네이트 경구 용액을 연속되는 달 동안 투여하였다. 추가로 30 명을 대조군으로서 사용하였으며, 이들에게 하루에 식용 설탕 또는 꿀 용액을 투여하였다.
피실험자의 피부 수분 함량 및 수분 손실량이 투여전후에 지정된 사람들에 의해 피부 수분 미터로 측정되었으며, 여기에서 측정 부위 및 실온 및 습도를 측정전후에 일관되게 유지하였다. 인간 피부 수분 함량 측정 결과를 표 8에 나타내었다.
피부 수분 함량의 측정 결과
샘플 수분함량 (%) 수분 손실량 (%)
실시예 19 투여전 28.86±1.55 9.23±0.85
투여후 39.77±1.94 6.51±0.64
실시예 20 투여전 27.54±1.51 9.15±0.80
투여후 36.72±1.75 6.92±0.55
실시예 21 투여전 25.69±1.68 9.86±0.81
투여후 33.78±1.54 6.67±0.51
실시예 22 투여전 28.27±1.55 10.06±0.78
투여후 37.82±1.75 7.39±0.58
실시예 23 투여전 25.26±1.55 9.93±0.75
투여후 35.30±1.94 7.58±0.52
실시예 24 투여전 22.47±1.58 10.43±0.87
투여후 32.56±1.83 7.01±0.66
실시예 25 투여전 24.78±1.48 10.03±0.82
투여후 35.43±1.94 7.35±0.44
실시예 26 투여전 22.16±1.44 9.83±0.79
투여후 33.72±1.85 6.71±0.67
대조군 투여전 29.11±1.78 9.45±0.75
투여후 28.65±1.66 8.89±0.81
표 8로부터, 상기 피실험자 그룹들은 저분자량 히알루로네이트의 1 개월 투여 후, 투여 전의 경우에 비해 현저한 수분 함량 증가 및 현저한 수분 손실 개선을 보임을 알 수 있었다. 피실험자 그룹의 사람들은 대조군에 비해 피부의 보다 양호한 광택, 조밀성 및 탄력을 보이는 것으로 관찰되었다. 따라서, 저분자량 히알루론산의 경구 투여는 흡수가 용이하고, 수분 보유 및 보습 효과가 양호하며, 피부 세포를 활성화시킬 수 있고, 따라서 노화 방지 작용을 갖는다.
따라서, 올리고머성 히알루로네이트 또는 저분자량 히알루로네이트의 경구 투여 후에 피실험자의 피부 광택, 탄력이 개선될 수 있었으며, 이를 건강관리 식품뿐만 아니라 통상적인 식품에도 사용할 수 있었다.
실험 실시예 9: 혈관형성 촉진에서 효소 절단 올리고머성 히알루로네이트의 효과에 대한 연구
인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC, 샨동 지방 의료과학원(Shandong Province Academy of Medical Science)에 의해 제공됨) 배양 시험 및 치킨 장요막(CAM) 모델 시험(종란을 샨동 지방 농업과학원의 가금류 연구소(the Poultry Institute of Shandong Province Academy of Agricultural Sciences)로부터 구입하였다)을 사용하여 상기 효소 절단 올리고머성 히알루로네이트(실시예 13 내지 18 중 어느 하나에서 제조됨)가 혈관형성을 촉진할 수 있는지의 여부를 연구하였다. HUVEC 증식 효과 및 CAM 혈관형성 효과를 표 9에 나타내었다. 실험 단계들은 예를 들어 문헌[WANG Yanhou, WANG Fengshan, GUO Xueping, Preparation of relatively low molecular weight hyaluronic acid and effects thereof on promoting angiogenesis, Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics, 2007,28(2):107-109]을 참조할 수 있었다.
혈관형성 촉진에 대한 올리고머성 나트륨 히알루로네이트의 효과
그룹 분자량
(kDa) 		농도
(㎍/ mL ) 		치킨 태아
(난)의 수 		CAM 혈관
(혈관)의 수 		HUVEC 증식 (OD 570nm )
블랭크 대조군/통상적인 염수 -- -- 10 10.33±3.67 0.402±0.012
실시예 13 8.6 10 10 13.75±4.83 0.412±0.011
40 10 22.79±4.52 0.435±0.006
실시예 14 3.2 10 10 18.71±4.67 0.410±0.010
40 10 28.31±4.56 0.455±0.007
실시예 15 6.2 10 10 17.32±5.64 0.408±0.013
40 10 25.89±3.51 0.447±0.009
실시예 16 5.6k 10 10 17.23±3.42 0.413±0.014
40 10 26.58±4.68 0.450±0.004
실시예 17 7.6k 10 10 15.99±5.04 0.402±0.011
40 10 23.24±3.65 0.438±0.005
실시예 18 9.1k 10 10 12.89±4.61 0.409±0.010
40 10 22.48±4.74 0.442±0.007
양성 대조군 (bFGF*) -- 40IU/ml 10 25.74±3.67 0.475±0.014
상기 실험 결과는 상기 올리고머성 나트륨 히알루로네이트가 혈관형성을 촉진하는 상당한 활성을 가지며, 생체내에서 CAM의 혈관형성을 촉진할 수 있고, 시험관내에서 HUVEC 세포의 증식을 촉진할 수 있으며, 상처 치유와 같은 의학 분야에 사용될 수 있음을 보였다.
실험 실시예 10: 일광화상 후 보수 및 일광 차단에서 히알루로네이트의 효과에 대한 연구
태양광 중 자외선(주로 UVA 및 UVB 포함)은 피부의 일광 화상 및 일광 노화뿐만 아니라 피부암을 유발하는데 중요한 인자이다. 3 가지 종류의 피부 체세포, 즉 각질세포, 섬유아세포 및 멜라닌세포는 모두 자외선에 민감하다. UVA 손상은 주로 피부 섬유아세포의 DNA의 산화적 손상을 유발하고, 이는 DNA 돌연변이 및 피부암을 발생시킬 수도 있다. 본 실험에서, 마우스 섬유아세포 L929(중국 과학원의 표준 배양 콜렉션 위원회의 세포 은행으로부터 구입하였다)를 일정 용량의 UVA에 노출시키고, 이어서 상기 세포를 히알루로네이트로 처리하여, UVA 조사에 노출된 L929 세포에 대한, 상이한 분해 방법들에 의해 제조된 히알루로네이트 및 상이한 분자량을 갖는 히알루로네이트의 영향을 연구하였으며; 마우스 섬유아세포 L929를 히알루로네이트로 처리하고, 이어서 상기 세포를 일정 용량의 UVA 조사에 노출시켜, L929 세포에 대한 UVA 조사 차단에 대한, 상이한 분해 방법들에 의해 제조된 히알루로네이트 및 상이한 분자량을 갖는 히알루로네이트의 영향을 연구하였다.
사용된 시약 및 세포 균주는 하기와 같았다:
섬유아세포 세포 균주 L929: 중국 과학원의 표준 배양 콜렉션 위원회의 세포 은행으로부터 구입함;
상이한 분자량을 갖는 히알루로네이트:
효소 절단 올리고머성 히알루로네이트: 실시예 13 내지 18에서 제조됨;
화학적 방법 올리고머성 히알루로네이트: 비교 실시예 1 내지 2에 따라 제조됨;
효소 절단 저분자량 히알루로네이트: 실시예 19 내지 26에서 제조됨;
화학적 방법 저분자량 히알루로네이트: 비교 실시예 3 내지 7에서 제조됨;
고분자량 나트륨 히알루로네이트(분자량: 1610,000, HA-1610k); 후악시 푸루이다 바이올로지컬 캄파니 리미티드에 의해 제조됨.
1. 자외선에 대한 히알루로네이트의 보수 효과에 대한 연구
UVA 조사 후 L929 마우스 섬유아세포에 대한, 상이한 제조 방법에 의해 제조된 히알루로네이트 및 상이한 분자량을 갖는 히알루로네이트의 보수 효과.
L929 세포를 대수 증식기 동안 취하고, 췌장 효소로 절단하고, 2 x 104/㎖의 세포 밀도를 갖도록 조절하고, 96-웰 세포 배양 플레이트상에 웰당 100 ㎕의 세포 현탁액으로 접종하고, 이산화 탄소 배양기에 넣고 37 ℃, 5% CO2에서 밤새 통상적으로 배양하였다. 배양 배지를 96-웰 플레이트로부터 제거하고, 이어서 웰당 100 ㎕의 PBS를 가하였다. 음성 대조군은 조사에 노출시키지 않은 반면, 다른 시험 그룹들의 L929 세포는 7.2 J/㎠ UVA 조사에 노출시켰다. PBS를 조사 후 제거하고, 상기 세포를 하기의 작업들에 의해 처리하였다:
비-조사 그룹(음성 대조군): 100 ㎕의 완전 배양 배지를 가하였다;
조사 그룹(양성 대조군): 100 ㎕의 완전 배양 배지를 가하였다;
조사 + 히알루로네이트: 0.0625% 히알루로네이트를 함유하는 완전 배양 배지 100 ㎕를 가하였다;
24 시간의 연속 배양 후에, 웰당 20 ㎕의 MTT를 가하고, 이어서 세포 배양 배양기에서 배양을 4 시간 동안 계속하였다. 배양 용액을 버리고, 웰당 150 ㎕의 DMSO를 가하고, 10 분간 암실에서 진탕하고, 흡광도 값을 효소 표지화 장비를 사용하여 570 ㎚의 파장에서 측정하였다. 세포의 상대 생육률(RGR)을 하기 식으로부터 계산하였다:
RGR(%) = Ac/Ac,0 x 100%
상기에서,
Ac는 시험 그룹의 흡광도 값을 나타내고, Ac,0는 음성 대조군의 흡광도 값을 나타낸다.
상기 결과를 도 6a 및 도 6b에 나타내었으며, 상이한 제조 방법에 의해 제조된 올리고머성 히알루로네이트 및 상이한 분자량을 갖는 히알루로네이트는 모두 UVA 조사 후에 손상된 세포의 보수 효과를 가졌고, 여기에서 상기 효소 절단 올리고머성 히알루로네이트가 최고의 일광화상 후 보수 효과를 가진 반면, 화학적 분해 올리고머성 히알루로네이트의 효과는 다음으로 높았다. 또한, 히알루로네이트의 분자량 감소에 따라 상기 보수 효과는 더 양호해졌다. 상기 효소 절단 올리고머성 히알루로네이트 및 저분자량 히알루로네이트는 고분자량 히알루로네이트의 경우보다 더 양호한 일광화상 후 보수 효과를 가졌다.
2. 히알루로네이트의 자외선 차단 효과에 대한 연구
상이한 방법에 의해 제조된 올리고머성 히알루로네이트 및 상이한 분자량을 갖는 히알루로네이트의 L929 마우스 섬유아세포 상의 UVA 조사에 대한 차단 효과를 연구하였다.
본 실험에서, 상이한 분자량을 갖는 히알루로네이트들을 마우스 섬유아세포 균주 L929에 적용하고, 이어서 상기 세포를 일정 용량의 UVA 조사에 노출시키고, 상이한 분자량을 갖는 히알루로네이트 및 상이한 방법에 의해 제조된 올리고머성 히알루로네이트의, L929 마우스 섬유아세포 상의 UVA 조사에 대한 차단 효과를 연구하였다.
세포를 대수 증식기 동안 취하고, 췌장 효소로 절단하고, 2 x 104/㎖의 세포 밀도를 갖도록 조절하고, 96-웰 세포 배양 플레이트상에 웰당 100 ㎕의 세포 현탁액으로 접종하고, 이산화 탄소 배양기에 넣고 37 ℃, 5% CO2에서 밤새 통상적으로 배양하였다. 배양 배지를 밤새 배양 후 제거하고, 세포를 하기와 같은 그룹으로 처리하고, 세포 배양 배양기에서 12 시간 동안 배양하였다.
비-조사 그룹(음성 대조군): 100 ㎕의 완전 배양 배지를 가하였다;
조사 그룹(양성 대조군): 100 ㎕의 완전 배양 배지를 가하였다;
조사 + 히알루로네이트: 0.0625% 히알루로네이트를 함유하는 완전 배양 배지 100 ㎕를 가하였다;
96-웰 플레이트 중의 배양 용액을 버리고, 이어서 웰당 100 ㎕의 PBS를 가하였다. 비-조사 그룹을 제외하고, 모든 시험 그룹의 L929 세포를 7.2 J/㎠ UVA 조사에 노출시켰다. 조사 후에 PBS를 버리고, 웰당 20 ㎕의 MTT를 가하고, 세포 배양 배양기에서 배양을 4 시간 동안 계속하였다. 배양 용액을 버리고, 웰당 150 ㎕의 DMSO를 가하고, 10 분간 암실에서 진탕하고, 흡광도 값을 효소 표지화 장비를 사용하여 570 ㎚의 파장에서 측정하였다. 세포의 상대 생육률(RGR)을 하기 식으로 계산하였다:
RGR(%) = Ac/Ac,0 x 100%
상기에서,
Ac는 시험 그룹의 흡광도 값을 나타내고, Ac,0는 음성 대조군의 흡광도 값을 나타낸다.
상기 결과를 도 6c 및 도 6d에 나타내었으며, 상이한 방법에 의해 제조된 올리고머성 히알루로네이트 및 상이한 분자량을 갖는 히알루로네이트는 모두 UVA 조사에 대한 차단 효과를 가졌다. 상기 효소 절단 올리고머성 히알루로네이트가 UVA 조사에 대해 최고의 차단 효과를 가진 반면, 효소 절단 저분자량 히알루로네이트의 효과는 다음으로 높았다. 상기 화학적 방법 올리고머성 히알루로네이트 및 고분자량 히알루로네이트는 최악의 차단 효과를 가졌다.
요약하면, 상기 효소 절단 올리고머성 히알루로네이트 및 저분자량 히알루로네이트는 모두 자외선에 대한 보수 효과 및 자외선에 대한 차단 효과를 가졌으며, 여기에서 상기 효소 절단 올리고머성 히알루로네이트가 최고의 자외선에 대한 보수 효과 및 자외선에 대한 차단 효과를 가졌고; 상기 저분자량 히알루로네이트는 자외선에 대한 양호한 차단 효과를 가졌으며, 그들의 자외선에 대한 보수 효과는 화학적 방법 올리고머성 히알루로네이트의 경우보다 열등하였지만, 상기 고분자량 히알루로네이트의 경우보다는 우수하였다. 따라서, 상기 효소 절단 올리고머성 히알루로네이트 및 저분자량 히알루로네이트를 일광 차단 및 일광화상 후 보수를 위한 화장품에 사용할 수 있었다.
상기 언급한 내용으로부터, 본 발명의 제조 방법에 의해 수득된 올리고머성 히알루로네이트 및 저분자량 히알루로네이트는 외용으로 피부의 표피층에 침투되어 피부에 영양 및 수분을 제공하고, 피부 노화를 예방하고, 자외선의 피해를 예방하고, 일광 화상 피부 세포를 보수하고, 따라서 화장품에 사용될 수 있으며; 경구 투여에 의해 쉽게 흡수될 수 있고, 자유 라디칼을 제거하고 피부 세포를 활성화시키며 피부 수분을 유지할 뿐만 아니라 면역 기능 및 노화방지 작용을 증대시키는 양호한 효과를 갖고, 따라서 식품 및 건강관리 제품에 사용될 수 있음을 알 수 있다. 또한, 상기는 혈관형성, 세포 면역 활성화 및 골형성을 촉진할 뿐만 아니라, 세균성 각막염에 양호한 치료 효과를 가지며, 따라서 의학 분야에 사용될 수 있다.
본 발명의 특정한 모델들을 상세히 예시하지만, 당해 분야의 숙련가들은 이들 상세한 내용이 당해 분야의 교시에 따라 변형되거나 변화될 수 있고 이러한 모든 변화가 본 발명의 보호 범위 내에 있음을 알 수 있다. 본 발명의 전체 범위는 첨부되는 특허청구범위 및 그의 임의의 등가물에 의해 제공된다.
중국 일반 미생물 보존 센터 CGMCC5744 20120208
SEQUENCE LISTING <110> Bloomage Freda Biopharm Co. Ltd. <120> Bacillus, hyaluronidase, and uses thereof <130> IEC120067PCT <160> 5 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1418 <212> DNA <213> bacillus sp. <400> 1 gcggctggct ccttacggtt accccaccga cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga 60 cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact 120 agcgattccg gcttcatgca ggcgagttgc agcctgcaat ccgaactgag aatggtttta 180 tgggattggc taaacctcgc ggtcttgcag ccctttgtac catccattgt agcacgtgtg 240 tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc 300 accggcagtc accttagagt gcccaactga atgctggcaa ctaagatcaa gggttgcgct 360 cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg 420 tcactctgtc ccccgaaggg gaacgtccta tctctaggag tgtcagagga tgtcaagacc 480 tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540 ccgtcaattc ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc 600 gttagctgca gcactaaagg gcggaaaccc tctaacactt agcactcatc gtttacggcg 660 tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcgcctc agcgtcagtt 720 acagaccaga aagccgcctt cgccactggt gttcctccac atctctacgc atttcaccgc 780 tacacgtgga attccgcttt cctcttctgt actcaagtcc cccagtttcc aatgaccctc 840 cacggttgag ccgtgggctt tcacatcaga cttaaaggac cgcctgcgcg cgctttacgc 900 ccaataattc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta 960 gccgtggctt tctggttagg taccgtcaag gtaccggcag ttactccggt acttgttctt 1020 ccctaacaac agagctttac gacccgaagg ccttcatcgc tcacgcggcg ttgctccgtc 1080 agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg 1140 tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct acgcatcgtc gccttggtga 1200 gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggcccat ctgtaagtgt cagcgtaaac 1260 cgactttcag cttttcctca tgagaggaaa aggattatcc ggtattagct ccggtttccc 1320 gaagttatcc cagtcttaca ggcaggttgc ccacgtgtta ctcacccgtc cgccgctaac 1380 caagaggtgc aagcacctca agattcgctc gacttgca 1418 <210> 2 <211> 1106 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 2 Asn Glu Ser Thr Leu Leu Leu Asn Thr Ser Phe Glu Glu Thr Glu Ala 1 5 10 15 Pro Lys Ser Gly Trp Asp Gln Leu Gly Ala Pro Lys Trp Gly Val Trp 20 25 30 Arg Pro Thr Gly Ser Pro Ile Val Thr Ile Thr Lys Glu Ala Ser Arg 35 40 45 Thr Gly Glu Tyr Gly Leu Lys Ile Ala Ala Ala Gln Ser Ala Arg Ala 50 55 60 Ala Val Ser Gln Asp Val Pro Val Gln Gly Gly Gln Thr Tyr Gln Leu 65 70 75 80 Gly Thr Trp Leu Lys Thr Asp Asn Ile Val Ser Gly Gln Gly Ala Arg 85 90 95 Leu Arg Val Val Leu Tyr Glu Gly Thr Gln Gln Leu Gly Leu Leu Tyr 100 105 110 Ser Ser Arg Leu Thr Gly Thr His Asp Trp Ser Gln Ile Lys Met Glu 115 120 125 Val Lys Thr Pro Ala Asn Ala Asp Ser Ile Arg Val Gln Leu Phe Phe 130 135 140 Glu Thr Gly Thr Gly Thr Ala Leu Phe Asp Asp Val Ser Leu Gln Leu 145 150 155 160 Ile Gln Pro Ala Thr Ser Ile Ala Ile Glu Glu Ser Glu Ile Thr Ile 165 170 175 Lys Glu Gln Glu Thr Gly Leu Leu His Ala Gln Met Val Pro Ala Asp 180 185 190 Ala Ser Ser Lys Val Ser Trp Val Ser Ala Asp Pro Ser Ile Ala Thr 195 200 205 Val Asp Asn Gly Lys Val Thr Gly Val Asn Pro Gly Gly Thr Thr Ile 210 215 220 Met Ala Phe Thr Asp Asn Gly Leu Ala Ala Thr Ser Thr Val Lys Val 225 230 235 240 Ile Lys Asn Asp Gly Ile Glu Arg Pro Glu Val Thr Gln Leu Asp Leu 245 250 255 Gln Pro Lys Glu Leu Glu Leu Gly Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Gln 260 265 270 Ala Ile Ile Ala Pro Ala Thr Ala Asp Ala Glu Lys Leu Val Trp Ser 275 280 285 Ser Ser Asn Glu Ala Val Ala Ser Ile Gln Lys Gly Leu Ile Glu Ala 290 295 300 Lys Ala Ser Gly Thr Ala Val Ile Thr Val Glu Thr Glu Asp Gly Ser 305 310 315 320 Leu Lys Ser Glu Ser Gln Ile Thr Val Thr Asp Ala Val Val Asp Glu 325 330 335 Tyr Asp Gln Leu Arg Lys Lys Trp Lys Ser Leu Met Thr Gly Leu Asp 340 345 350 Ser Tyr Asp Pro Thr Asn Val Arg Met Asn Glu Met Ile Gln Asn Gln 355 360 365 Thr Lys Ser Ala Glu Thr Leu Trp Lys Thr Met Phe Lys Asn Asn Asp 370 375 380 Arg Ser Phe Leu Trp Ile Asn Phe Ala Ser Thr Asp Asn Ser Ala Asp 385 390 395 400 Ile Arg Asp Ser Tyr Arg Asn Leu Thr Thr Met Ala Lys Ala Phe Ala 405 410 415 Asn Glu His Ser Ser Leu Tyr Arg Asn Pro Gln Leu Leu Lys Asp Ile 420 425 430 Thr Glu Ala Leu Glu Trp Leu Tyr Gln Asn Arg Tyr Asn Glu Ser Ile 435 440 445 Ala Gln Tyr Ser Asn Trp Trp His Trp Glu Ile Gly Val Pro Asn Glu 450 455 460 Leu Asn Ser Leu Met Val Leu Leu Tyr Asp Tyr Leu Asp Gln Asp Ser 465 470 475 480 Ile His Arg Tyr Leu Lys Val Val Asp His Phe Gln Pro Asp Pro Thr 485 490 495 Lys Ser Gly Ala Thr Thr Pro Glu Lys Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Ala 500 505 510 Asn Arg Ile Asp Val Ser Lys Val Val Gly Val Arg Gly Val Ile Val 515 520 525 Lys Asp Ala Thr Lys Ile Ala Ala Ala Arg Asp Ala Leu Ser Gln Thr 530 535 540 Phe Glu Asn Val Thr Glu Gly Asp Gly Phe Tyr Glu Asp Gly Ser Phe 545 550 555 560 Val Gln His Glu Asn Ile Ala Tyr Asn Gly Ser Tyr Gly Ile Val Leu 565 570 575 Ile Glu Gly Leu Thr Asp Met Leu Glu Leu Leu Ser Asn Ser Thr Trp 580 585 590 Gln Val Thr Asp Pro Lys Val Thr Asn Val Tyr Asp Trp Ile Glu Thr 595 600 605 Ala Tyr Glu Pro Phe Met Tyr Lys Gly Ala Leu Met Asp Met Val Arg 610 615 620 Gly Arg Ala Ile Ser Arg Asn Phe Leu Gln Asp His Gln Ala Gly His 625 630 635 640 Thr Ile Ile Lys Ser Val Ile Arg Met Ala Gln Phe Ala Pro Glu Pro 645 650 655 Tyr Ala Glu Lys Tyr Asn Ser Met Ala Lys Tyr Trp Leu Gln Glu Asp 660 665 670 Thr Tyr Leu Asp Tyr Phe Lys Asn Ala Gly Asn Phe Arg Asp Ile Thr 675 680 685 Leu Ala Lys Gln Leu Leu Glu Lys Gln Glu Val Thr Pro Arg Gly Asp 690 695 700 Leu Asp Phe His Lys Thr Phe Ala Ser Met Asp Arg Val Val His Arg 705 710 715 720 Lys Ser Gly Tyr Ala Phe Gly Ile Ser Met Tyr Ser Asn Arg Ile Gln 725 730 735 Asn Tyr Glu Asp Met Asn Asp Glu Asn Arg Lys Gly Trp Tyr Thr Gly 740 745 750 Glu Gly Met Thr Tyr Leu Tyr Asn Gly Asp Leu Ala Gln Tyr Ser Asp 755 760 765 Asp Phe Trp Pro Thr Val Asp Pro Tyr Arg Met Pro Gly Thr Thr Val 770 775 780 Asp Thr Met Arg Arg Ala Asp Gly Ser Gly Glu His Arg Ser Ser Glu 785 790 795 800 Ser Trp Thr Gly Gly Ser Thr Leu Lys Asn Phe Gly Ser Ala Gly Met 805 810 815 Ser Tyr Asp Ala Trp Asn Ser Ser Leu Ile Ala Lys Lys Ser Trp Phe 820 825 830 Met Phe Asp Asn Glu Ile Val Ala Leu Gly Ala Gly Ile Thr Ser Ser 835 840 845 Glu Asp Arg Asn Val Glu Ser Ile Val Glu Asn Arg Lys Ile Arg Asn 850 855 860 Asp Gly Ser Asn Gln Leu Val Ile Asn Gly Glu Thr Leu Asn Leu Ser 865 870 875 880 Asn Gly Gly Gln Asn Gln Thr Met Ala Ala Lys Trp Ala Phe Leu Glu 885 890 895 Gly Asn Val Pro Gly Ala Asp Ile Gly Tyr Tyr Phe Pro Glu Gly Lys 900 905 910 Met Leu Thr Ile Lys Lys Glu Glu Arg Thr Gly Ala Trp Lys Asp Ile 915 920 925 Asn Tyr Gly Gly Pro Ala Glu Ala Ile Lys Arg Ser Tyr Thr Thr Met 930 935 940 Trp Phe Asp His Gly Val Arg Pro Glu Gln Asp Thr Tyr Ser Tyr Val 945 950 955 960 Leu Leu Pro Gly Leu Asn Lys Glu Gln Thr His Gln Tyr Ser Gln Asn 965 970 975 Pro Asp Ile Thr Ile Leu Arg Asn Asp Ser Ala Val Gln Ala Val Gln 980 985 990 Asp Val Lys Glu Asn Ile Ile Gly Ala Asn Phe Trp Lys Asp Glu Lys 995 1000 1005 Gln Ser Ala Gly Pro Leu Thr Val Tyr Gln Lys Ala Ser Val Thr 1010 1015 1020 Met Gln Glu Lys Asp Gly Val Leu Glu Ile Ala Val Cys Asp Pro 1025 1030 1035 Thr Met Glu Asn Lys Gly Ser Ile Glu Ile Glu Ile Asp Gly Lys 1040 1045 1050 Ala Phe Lys Val Leu Glu Ala Asp Glu Ser Ile Thr Val Glu Asn 1055 1060 1065 Thr Lys Pro Ser Ile Lys Leu Lys Val Asn Val Asn Glu Ala Lys 1070 1075 1080 Gly Lys Thr Phe Thr Ala Lys Leu Lys Met Ile Pro Ser Gln Lys 1085 1090 1095 Gly Asn Ser Pro Asn Ser Ile Arg 1100 1105 <210> 3 <211> 3324 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 3 aatgaatcta ctttactatt gaatactagt tttgaagaga cggaggcgcc aaaatcaggc 60 tgggatcaat taggtgcacc aaaatggggt gtctggagac ctaccggaag ccccattgta 120 accattacaa aggaagcaag ccgtacgggt gagtatggtt taaaaattgc cgcggcgcaa 180 tctgctagag ctgccgtgtc acaggatgta cctgttcagg gcgggcagac ctatcagtta 240 ggcacctggc tgaagacaga taatatcgtc agcggtcaag gggcgcggct gagggttgtt 300 ttatatgaag gaacccagca gctgggctta ctttactctt caagattaac tgggacccac 360 gattggtcgc aaataaaaat ggaggtaaag actcctgcca atgccgatag catccgtgtc 420 cagcttttct ttgaaacagg aacgggtaca gccctatttg atgatgtttc actgcagctc 480 atccagccag ctacgtcgat tgctatcgaa gaaagtgaaa tcaccatcaa agagcaggaa 540 acaggtttat tgcatgcaca gatggttcct gctgatgcca gctccaaagt atcttgggtg 600 tcggcggatc catcgattgc caccgttgat aacggtaagg ttacgggtgt aaatcccggg 660 gggacaacga ttatggcttt taccgataac gggcttgctg ccactagtac cgtaaaagtg 720 atcaaaaatg atggtattga acggccggag gtaacacagt tggatctaca accaaaggaa 780 ctcgagcttg gatcaggtca agtgcgattg cttcaggcaa ttatcgcacc agccactgcc 840 gatgcagaaa agttggtatg gagctcttcc aatgaagcag tcgcttctat tcaaaaagga 900 cttattgaag cgaaagcctc aggaactgct gtgattaccg tagaaacgga agatggcagc 960 ttaaagagtg aaagccagat taccgttacc gatgcagtcg tagatgaata tgatcaactt 1020 cggaaaaagt ggaaaagcct gatgactggt cttgattcgt acgacccgac gaatgtgcgg 1080 atgaacgaaa tgattcagaa ccagacaaaa tcagcggaaa ccctttggaa aacaatgttt 1140 aaaaataacg atcgttcgtt cttatggatt aactttgcaa gcactgacaa ttcggctgat 1200 attcgcgaca gctaccggaa tctaacgacc atggctaaag cgtttgccaa tgaacactcc 1260 agcctttatc gaaatccgca attgctaaag gatatcacgg aggcgctaga gtggctgtac 1320 caaaatcgct ataacgaaag tattgctcaa tatagcaatt ggtggcattg ggaaatcggt 1380 gtcccgaatg aattaaacag tttaatggtt cttctatatg attatttgga tcaagatagt 1440 attcatcgct acttgaaagt agtcgaccac tttcaaccag atccaacgaa atccggagcc 1500 accactcccg agaaataccg ggaagctctt ggcgccaatc ggattgatgt cagcaaggta 1560 gtcggtgtgc gaggggtaat tgtgaaggac gccacgaaaa ttgcggctgc acgagatgcc 1620 ctaagccaaa cttttgaaaa cgtaactgaa ggagacggtt tttatgaaga tggctccttc 1680 gttcagcatg agaatatcgc ctataacggg tcatacggca ttgtcttaat tgaaggcttg 1740 actgacatgc tcgaactctt aagtaattct acttggcaag tgactgaccc taaggttacc 1800 aatgtttatg actggattga aactgcctat gaaccattta tgtataaagg tgctttgatg 1860 gatatggtga gaggaagagc gatttcacgt aatttccttc aggatcatca ggctggacac 1920 accattatca aaagtgtgat tcgaatggca caatttgctc cagagccata tgcagagaag 1980 tataattcca tggcaaaata ctggcttcaa gaagatactt acctggatta ttttaaaaac 2040 gcgggtaact tccgcgatat cactcttgca aagcagcttt tggaaaaaca agaggtcacc 2100 cctcgcggag atcttgattt tcataagact ttcgcctcca tggaccgggt tgtccacaga 2160 aaatcgggct atgcgtttgg tatcagtatg tattcaaaca ggattcaaaa ttatgaagac 2220 atgaatgatg aaaaccgcaa aggctggtat accggagaag ggatgaccta cttatataat 2280 ggtgacctcg ctcaatatag tgatgatttc tggccgacag tggacccgta ccggatgcca 2340 gggacaacgg ttgatacgat gagacgagcg gatggaagtg gtgagcacag gtcgtcagag 2400 tcatggactg gcggttcaac cctaaagaat tttggttctg caggaatgtc ttatgatgct 2460 tggaatagtt cattgattgc caaaaagtca tggtttatgt tcgataacga aatcgttgcc 2520 cttggtgcag ggattactag cagtgaagac cggaatgttg agagtattgt cgaaaaccga 2580 aagattcgaa atgacggttc caatcaattg gtcatcaatg gtgaaacgct gaatttaagc 2640 aatggtggtc aaaaccaaac gatggccgct aaatgggctt ttcttgaagg gaatgtccca 2700 ggagcagata ttggttacta tttcccagaa ggtaaaatgc tgacgattaa aaaagaagaa 2760 cgtaccggtg catggaaaga tattaattat ggcggtccag ctgaagcgat caagcgatcc 2820 tacacaacga tgtggtttga ccatggtgtc cgtcctgagc aggatacgta ctcctatgtt 2880 ctattgccag gtttaaataa ggaacaaaca caccaatatt ctcaaaatcc tgatattacg 2940 attttacgaa atgattctgc tgtccaagcg gtacaagacg taaaggagaa tatcataggg 3000 gctaatttct ggaaggatga aaagcaaagt gctggtccgt taactgttta tcaaaaagcc 3060 tccgtgacca tgcaggagaa ggatggagtc cttgagattg ctgtatgtga tccgacgatg 3120 gaaaacaagg gttctatcga aatcgaaatt gatggcaagg cgttcaaggt tttagaagcc 3180 gatgaaagta tcacggtaga aaatacgaag ccgtcaatca agttgaaggt caatgtgaat 3240 gaggcaaaag ggaaaacgtt cacagcgaaa ttgaaaatga ttccgagcca aaagggcaat 3300 agcccgaact caatcagata ataa 3324 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 4 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 5 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (37)

  1. CGMCC 5744번의 기탁물 수납 번호, 2012년 2월 8일의 기탁일자, 및 중국 일반 미생물 보존 센터(CGMCC)의 기탁 기관명을 갖는 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 CGMCC 5744.
  2. 제 1 항의 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 CGMCC 5744를 사용하는 단계를 포함하는 히알루로니다제의 제조 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    하기의 단계들을 포함하는 방법:
    (1) 제 1 항의 바실러스에 사면 배양을 가하여 사면 균주를 수득하고;
    (2) 상기 사면 균주를 멸균된 종균 배양 배지에 접종하고, 10 내지 24 시간 동안 25 내지 40 ℃, 100 내지 200 rpm의 조건 하에서 배양하여 종균 용액을 수득하고;
    (3) 상기 종균 용액을 멸균된 발효 배양 배지에 접종하고, 12 내지 24 시간 동안 25 내지 40 ℃, 100 내지 300 rpm의 조건 하에서 배양하여 히알루로니다제 발효 브로쓰를 수득하고;
    (4) 상기 발효 브로쓰를 원심분리에 의해 분리시켜 상등액을 수득하고;
    (5) 상기 상등액에 암모늄 설페이트 분별 침전, 여과를 가하여 조 히알루로니다제를 수득하고;
    (6) 상기 단계 (5)에서 수득된 조 히알루로니다제를 포스페이트 완충 용액에 용해시키고, 한외여과에 의해 소분자 불순물을 제거하여 정제된 히알루로니다제를 수득한다.
  4. 제 2 항의 방법에 의해 제조되는 히알루로니다제.
  5. 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖고; 히알루로니다제인 단리된 폴리펩타이드.
  6. 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제 6 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
  8. 제 7 항의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  9. 제 4 항의 히알루로니다제 또는 제 5 항의 폴리펩타이드를 사용함으로써 10 kDa 초과의 분자량을 갖는 히알루론산 또는 그의 염을 분해시키는 단계를 포함하는, 올리고머성 히알루론산 또는 올리고머성 히알루로네이트의 제조 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    1) 히알루론산 또는 그의 염의 용액 제조: 10 kDa 초과의 분자량을 갖는 히알루론산 또는 그의 염을 정제수에 가하여 1% w/v 내지 30% w/v의 농도를 갖는 용액을 수득하고;
    2) 효소 분해: 상기 단계 1) 용액의 온도를 20 ℃ 내지 48 ℃로 조절하고, pH를 4 내지 9로 조절하고, 이어서 히알루로니다제 또는 폴리펩타이드를 상기 용액에 가하고, 상기 히알루론산 또는 그의 염을 목적하는 분자량으로 분해시켜 효소분해 용액을 수득하고;
    3) 불활성화: 상기 효소분해 용액을 50 ℃ 내지 90 ℃에서 10 내지 60 분 동안 유지시켜 상기 히알루로니다제 또는 폴리펩타이드를 불활성화시키는
    단계들을 포함하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    단계 1)에서, 히알루론산 또는 그의 염 1 ㎏ 당 2 x 107 내지 5 x 107 IU의 히알루로니다제 또는 폴리펩타이드를 가하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    단계 2)에서, 효소분해 온도가 35 ℃ 내지 45 ℃이고, 효소분해 pH가 5.5 내지 7.5이며, 히알루론산을 3000 Da 이상 104 Da 미만의 분자량으로 효소분해시키 방법.
  13. 제 10 항에 있어서,
    4) 여과: 용해성 무기염을 상기 불활성화된 효소분해 용액에 가하고, 상기 용액이 완전히 용해될 때까지 교반하고, 이어서 0.45 ㎛ 여과 멤브레인을 통해 여과하여 여액을 수득하며, 여기에서 효소분해 용액 100 ㎖ 당 0.1 내지 10 g의 상기 용해성 무기염을 가하고;
    5) 침전: 상기 단계 4)의 여액을 상기 여액의 3 내지 20 배 부피의 알콜 또는 케톤과 균일하게 혼합하여 올리고머성 히알루로네이트를 침전시키고;
    6) 탈수 및 건조: 상기 단계 5)의 올리고머성 히알루로네이트 침전물을 분리시키고, 유기 용매로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 올리고머성 히알루로네이트를 수득하는
    단계들을 더 포함하는 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트의 제조 방법으로, 1000 kDa 초과의 분자량을 갖는 히알루론산 또는 그의 염을 제 4 항의 히알루로니다제 또는 제 5 항의 폴리펩타이드를 사용하여 분해시키는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    1) 히알루론산 또는 그의 염의 용액의 제조: 1000 kDa 초과의 분자량을 갖는 히알루론산 또는 그의 염을 정제수에 가하여 0.1% w/v 내지 2% w/v의 농도를 갖는 용액을 제조하고;
    2) 효소분해: 상기 단계 1)의 용액의 온도를 20 ℃ 내지 48 ℃로 조절하고, pH를 4 내지 9로 조절하고, 이어서 히알루로니다제 또는 폴리펩타이드를 상기 용액에 가하고, 상기 히알루론산 또는 그의 염을 목적하는 분자량으로 분해시켜 효소분해 용액을 수득하고;
    3) 불활성화: 상기 효소분해 용액을 50 ℃ 내지 90 ℃에서 10 내지 60 분 동안 유지시켜 상기 히알루로니다제 또는 폴리펩타이드를 불활성화시키는
    단계들을 포함하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    단계 1)에서, 히알루론산 또는 그의 염 1 ㎏ 당 106 내지 107 IU의 히알루로니다제 또는 폴리펩타이드를 가하는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서,
    단계 2)에서 효소분해 온도가 35 ℃ 내지 45 ℃이고, 효소분해 pH가 5.5 내지 7.5이며, 히알루론산을 10kDa 내지 1000kDa의 분자량으로 효소분해하는 방법.
  21. 제 18 항에 있어서,
    4) 여과: 용해성 무기염을 상기 불활성화된 효소분해 용액에 가하고, 상기 용액이 완전히 용해될 때까지 교반하고, 이어서 0.45 ㎛ 여과 멤브레인을 통해 여과하여 여액을 수득하며, 여기에서 효소분해 용액 100 ㎖ 당 0.1 내지 10 g의 상기 용해성 무기염을 가하고;
    5) 침전: 상기 단계 4)의 여액을 상기 여액의 3 내지 20 배 부피의 알콜 또는 케톤과 균일하게 혼합하여 올리고머성 히알루로네이트를 침전시키고;
    6) 탈수 및 건조: 상기 단계 5)의 올리고머성 히알루로네이트 침전물을 분리시키고, 유기 용매로 탈수시키고, 이어서 진공 건조시켜 올리고머성 히알루로네이트를 수득하는
    단계들을 더 포함하는 방법.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 제 4 항의 히알루로니다제, 제 5 항의 폴리펩타이드, 제 6 항의 폴리뉴클레오타이드, 제 7 항의 재조합 벡터 또는 제 8 항의 재조합 숙주 세포를 포함하는 조성물.
  26. 제 1 항에 있어서,
    히알루로니다제 제조용 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 CGMCC 5744.
  27. 제 4 항에 있어서,
    올리고머성 히알루론산 또는 올리고머성 히알루로네이트, 저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트, 또는 저분자량 콘드로이틴 설페이트 제조용 히알루로니다제.
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 제 2 항에 있어서,
    제 1 항의 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 CGMCC 5744에 사면 배양, 종균 배양, 발효 배양, 원심분리, 암모늄 설페이트 분별 침전 및 한외여과를 가하여 히알루로니다제를 수득하는 단계들을 포함하는 방법.
  31. 제 3 항에 있어서,
    상기 단계 (6)을 하기 (6-1) 내지 (6-3)의 단계에 의해 수행하는 방법.
    (6-1): 상기 단계 (5)의 조 히알루로니다제를 pH 4.5 내지 8.0의 완충 용액에 용해시켜 조 효소 용액을 수득하고; 상기 조 효소 용액을 3.0 x 103 내지 1.4 x 104 Da의 분자 컷오프를 갖는 투석 주머니에 로딩하고, pH 4.5 내지 8.0을 갖는 완충 용액에 넣고, 4 ℃에서 밤새 투석시키고;
    (6-2): 상기 투석된 조 효소 용액에 이온 교환 크로마토그래피 분리를 가하고, 여기에서 DEAE 아가로스 젤 FF 매질 및 구배 용리를 위한 0 내지 0.5M NaCl 용액의 크로마토그래피 컬럼 충전이 사용되며, 용출 피크를 수집하고;
    (6-3): 상기 단계 (6-2)에서 수득된 히알루로니다제 샘플에 진공 동결 건조를 가하여 히알루로니다제로서 백색 분말을 수득한다.
  32. 제 6 항에 있어서,
    서열번호 3에 나타낸 바와 같은 서열 또는 서열번호 3의 상보성 서열인 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  33. 제 13 항에 있어서,
    하기 A 내지 F 중 하나 이상을 특징으로 하는 방법:
    A. 단계 1)에서, 히알루로네이트를 히알루론산의 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염 및 아연염으로 이루어진 그룹 중에서 선택한다;
    B. 단계 2)에서, 산 또는 염기를 사용하여 pH를 4 내지 9로 조절하고, 상기 산을 염산, 빙초산, 황산 및 인산으로 이루어진 그룹 중에서 선택하며, 상기 염기는 수산화 나트륨 또는 수산화 칼륨이다;
    C. 단계 3)에서, 효소분해 용액을 55 ℃ 내지 65 ℃에서 20 내지 30 분 동안 유지시켜 바실러스 히알루로니다제를 불활성화시킨다;
    D. 단계 4)에서, 상기 용해성 무기염을 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 아연염 및 마그네슘염으로 이루어진 그룹 중에서 선택한다;
    E. 단계 5)에서, 상기 알콜 또는 케톤은 에탄올, 아세톤, 메탄올, 프로판올 또는 아이소프로판올이다;
    F. 단계 6)에서, 상기 탈수에 사용된 유기 용매는 케톤 또는 알콜이다.
  34. 제 33 항에 있어서,
    단계 4에서 상기 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 아연염 또는 마그네슘염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 아연 또는 마그네슘의 클로라이드, 설페이트 또는 나이트레이트인 방법.
  35. 제 21 항에 있어서,
    하기 A 내지 F 중 하나 이상을 특징으로 하는 방법:
    A. 단계 1)에서, 히알루로네이트를 히알루론산의 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염 및 아연염으로 이루어진 그룹 중에서 선택한다;
    B. 단계 2)에서, 산 또는 염기를 사용하여 pH를 4 내지 9로 조절하고, 상기 산을 염산, 빙초산, 황산 및 인산으로 이루어진 그룹 중에서 선택하며, 상기 염기는 수산화 나트륨 또는 수산화 칼륨이다;
    C. 단계 3)에서, 효소 가수분해산물을 55 ℃ 내지 65 ℃에서 20 내지 30 분 동안 유지시켜 바실러스 히알루로니다제를 불활성화시킨다;
    D. 단계 4)에서, 상기 용해성 무기염을 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 아연염 및 마그네슘염으로 이루어진 그룹 중에서 선택한다;
    E. 단계 5)에서, 상기 알콜 또는 케톤은 에탄올, 아세톤, 메탄올, 프로판올 또는 아이소프로판올이다;
    F. 단계 6)에서, 상기 탈수에 사용된 유기 용매는 케톤 또는 알콜이다.
  36. 제 20 항에 있어서,
    저분자량 히알루론산 또는 저분자량 히알루로네이트를 효소 절단 방법에 의해 수득하는 방법.
  37. 제 35 항에 있어서,
    단계 4에서 상기 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 아연염 또는 마그네슘염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 아연 또는 마그네슘의 클로라이드, 설페이트 또는 나이트레이트인 방법.
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