CZ139496A3 - Endothelin-converting enzyme - Google Patents
Endothelin-converting enzyme Download PDFInfo
- Publication number
- CZ139496A3 CZ139496A3 CZ961394A CZ139496A CZ139496A3 CZ 139496 A3 CZ139496 A3 CZ 139496A3 CZ 961394 A CZ961394 A CZ 961394A CZ 139496 A CZ139496 A CZ 139496A CZ 139496 A3 CZ139496 A3 CZ 139496A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- leu
- seq
- glu
- asn
- ala
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
- C12N9/6497—Endothelin-converting enzyme (3.4.24.71)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
- C12Y304/24071—Endothelin-converting enzyme 1 (3.4.24.71)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Psychiatry (AREA)
Description
Oblast techniky
Předložený vynález se týká enzymů, způsobů jejich výroby a endothelin konvertujících jej ich použití.
Dosavadní stav techniky
Zvýšená hladina endothelinu se vyskytuje v souvislosti s mnoha chorobami jako je základní hypertonie, srdeční infarkt, akutní selhání ledvin, šok a srdeční selhání. Na takové souvislosti je možno také usuzovat podle výsledků dosažených s endothelin-proti látkami. Ve zvířecích modelech mohla tak být snížena velikost srdečního infarktu v závislosti na dávce (Watanabe a spol., Nátuře 344, 114 (1990), pozitivně ovlivněna funkce ledvin (Kon a spol., J.Clin.Invest. 83, 1762 (1989)) a snížena nefrotoxicita cyklosporinu (Kon a spol., Kidney Int. 37, 1487 (1990)).
Endothelin konvertující enzym (ECE-1) uvolňuje endothelin 1 ze 38 aminokyselin složené prekurzorové molekuly Big-endothelin-1. Proti endothelinem-1 působeným nežádoucím biologickým účinkům je možno např. působit inhibici endothelin konvertujíčího enzymu a tím biosyntézy endothelinu.
Existují enzymové aktivity, které uvolňují endothelin popř. endothelinu podobné molekuly z odpovídajících prekurzorových molekul, big-endothelinu, které byly izolovány z různých buněčných linií (Takeda a spol., Biochem.Biophys.
Res.Comm..176, 860 (1991), Ohnaka a spol.,
Biochem.Biophys.Res.Comm. 168, 1128 (1990), Matsumura a spol., FEBS Lett. 293, 45 (1992), Ahn a spol., Proč.Nat1.Acad.Sci.
USA 89, 8606 (1992), PCT WO 92/13944, Ohnaka a spol., Clin.Exp.Hypertension A 14; č. 4 (1992), Okada a spol., Biochem.Biophys.Res.Comm. 180, 1019 (1991), Takada a spol., Biochem.Biophys.Res.Comm. 182, 1383 (1992), Opgenorth a spol FASEB 6, 2653 (1992)).
Tyto enzymové aktivity jsou však dosud nedostatečně charakterizovány. Jsou považovány za málo bohaté enzymové směsi. Takové nečisté enzymové směsi jsou však pro použití ve zkušebních postupech pro zjištění specifických ECE-inhibitorů málo vhodné, protože jiný, fyziologicky nerelevantní cizí proteásy významně ruší enzymový test.
Například se tak štěpí big-endothelin také serinproteásou chymotrypsinem jakož i papainem, thermolysinem a NEP 24.11 na endothelin a endothelinu podobné produkty, které ve zkušebním postupu byly falešně přiřazeny enzymu ECE. Proto je popis endothelin konvertujíčího enzymu v literatuře rozporuplný.
údaje o molekulové hmotnosti endothelin konvertujíčího enzymu se mění od 65 kDalton do 540 kDalton; údaje o hodnotách Km a vmax se rovněž vzájemně liší (Opgenorth a spol., FASEB 6, 2653 (1992); Sawamura a spol., Biochem.Biophys.Act 1161, 295 (1993)). Je tak rozpor v tom, zda endothelin konvertující enzym zařadit do rodiny aspartatproteas nebo metaloproteas (Sawamura a spol., Biochem.Biophys.Acta 1161, 295 (1993); Biochem. Pharmacol. 43, 845 (1992). Dále jsou v literatuře rozporuplné údaje o charakteristických údajích, zda se u metaloproteas jedná o cytoplasmatický nebo membránově navázaný enzym a které substráty jsou příslušným ECE přeměňovány (Big-Et-1; Big-Et-3: Matsumura a spol. (FEBS Lett. 293, 45 (1992)): Takahashi a spol., (J.Biol.Chem. 268; 21394 (1993)); Okada a spol., (Biochem.Biophys.Res.Comm. 180, 1019 (1991));Ohnaka a spol. (Clin.Exp.Hypertension A 14; č. 4 (1992)); Matsumura a spol. (FEBS Lett. 305; 86 (1992)).
Dosud nebyl uveden jednoznačný popis ECE, který by umožňoval jednoznačně definovat ECE. Takovou definici bude možno provést teprve určenín primární struktury, aminokyselinové sekvence, ECE. Proto je nutné ECE nejprve vyrobit v čisté formě.
Vyvstala tak úloha připravit endothelin konvertující enzym v čisté formě.
Podstata vynálezu
Byl nalezen endothelin konvertující enzym, který se vyznačuje molekulovou hmotností 250 000 Dalton a parciální aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO; 1.
Endothelin konvertující enzym podle předloženého vynálezu vykazuje následující znaky: vykazuje molekulovou hmotnost stanovenou pomocí SDS-polyakrylamid-gelové elektroforézy za neredukčních podmínek přibližně 250000 Dalton.
Za redukčních podmínek vykazuje při SDS-polyakrylamidové elektroforéze pruh 125000 Dalton; sestává podle všeho z homodimeru.
Endothelin konvertující enzym je glykosylován.
Enzymatické odstranění zbytku cukru působí změnu zjevné molekulové hmotnosti ze 125000 Dalton na asi 82000 Dalton.
Sekvencování tryptických peptidů endothelin konvertujícího enzymu poskytuje následující aminokyselinové parciální sekvence SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6.
Další charakterizace endothelin konvertujíčího enzymu podle předloženého vynálezu je uvedena v příkladech.
Další podstatou vynálezu jsou endothelin konvertující enzymy, vyznačující se molekulovou hmotností asi 250000 Dalton a aminokyselinovou parciální sekvencí, která vykazuje alespoň 50% homologii se SEQ ID NO: 1.
Takové endothelin konvertující enzymy je možno izolovat z jiných organismů než je hovězí dobytče, například z lidských buněk.
Vynález se týká dále endothelin konvertujících enzymů, které obsahují v SEQ ID NO: 30 a SEQ ID NO: 36 popsanou polypeptidovou sekvenci nebo její funkční fragment.
Funkčními fragmenty se rozumí takové parciální sekvence, které ještě vykazují enzymatickou aktivitu endothelin konvertujíčího enzymu, antigenní vlastnosti nebo afinitu k ligandům, například vazebným proteinům.
Další funkční fragmenty jsou takové polypeptidové sekvence, které jsou připravítelné ze SEQ ID NO: 30 nebo NO:
inzercí, delecí nebo substitucí aminokyselin nebo peptidů a které ještě v podstatě vykazují enzymatickou aktivitu endothelin konvertujíčího enzymu a/nebo imunologicky křížově reagují s endothelin konvertujícím enzymem vzorce SEQ ID NO:30 nebo NO:36.
Další podstatou vynálezu jsou DNA-sekvence, které kódují endothelin konvertující enzym a které jsou zvoleny ze skupiny
a) DNA-sekvence se strukturou popsanou v SEQ ID NO: 29 nebo SEQ ID NO: 35,
b) DNA-sekvence, které kódují protein se strukturou popsanou v SEQ ID NO: 30 nebo SEQ ID NO: 36 a
c) DNA-sekvence, které za standardních podmínek hybridizují s DNA-sekvencemi a) nebo b),
d) DNA-sekvence, které kódují proteinový produkt, který může být rozpoznáván protilátkami, které se vytvoří proti proteinu SEQ ID NO: 30 nebo 36 nebo z něj generovaným fragmentům.
Standardními podmínkami jsou například míněny teploty mezi 42 a 58 0C ve vodném tlumivém roztoku s koncentrací mezi 0,1 a 1 x SSC (1 x SSC; 0,15M NaCI, 15 mM citrát sodný pH 7,2). Experimentální podmínky pro DNA-hybridizaci jsou uvedeny v učebniůích genové techniky, například v práci Sambrooka a spol., Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
Výroba takových DNA sekvencí je popsána v příkladu 8. DNA sekvence, jejichž proteinové produkty jsou rozpoznávány protilátkami, které byly generovány proti proteinům SEQ ID NO: 30 nebo 36 nebo jejich fragmentům, je možno získat podle dobře známých metod.
Výroba protilátek proti takovým proteinům je např. popsána v práci Hudsona L. a Haye F.C., Practical Immunology, Blackwell Sci.Pub., Oxford, 1980.
Použití protilátek k vyhledání cDNA-sekvencí, které kódují s těmito protilátkami křížově reagující proteiny, je například popsáno v: DNA Cloning Vol.I, Glover D.M.,Ed., IRL
Press Oxford, 1985.
Vynález se dále týká způsobů výroby endothelin konvertujícího enzymu, které se vyznačují tím, že se savčí buňky, výhodně endothelové buňky, stimulují s inhibitorem endothelin konvertujícího enzymu k nadměrné produkci endothelin konvertujícího enzymu a z těchto buněk se endothelin konvertující enzym izoluje běžnými prostředky proteinové chemie.
Pro indukci ECE v savčích buňkách mohou být použity všechny ECE inhibitory. Jsou proto vhodné ECE-inhibitory například popsané v JP-146737; JP 05148277-A1; Jpn.J.Biochem. 64; (8) Abst.2367 (1992); Derwent NCE-93-0956 (1993); Derwent NCE-93-0971 (1993); J.Med.Chem. 36, 173 (1993); EP518299-A2. Výhodně se používá fosforamidon. Stimulují se buňky v kultuře přídavkem těchto inhibitorů k mediu pro kultivaci buněk po 6 hodin až 6 dnů. Výhodně se však stimulace provádí po 2-3 dny. Použité koncentrace inhibitorů činí 10-2 M až ΙΟ7 M, výhodně 10-3 až ΙΟ-·* m.
Výroba endothelin konvertujícího enzymu podle předloženého vynálezu je však také možná genově technickou cestou. Na základě popsaných aminokyselinových parciálních sekvencí je možno vyrobit syntetické oligonukleotidy, které kódují tyto sekvence nebo jsou komplementární k těmto kódujícím sekvencím. Tyto oligonukleotidy mohou být použity jako hybridizační sondy k izolaci odpovídajících genů nebo cDNA-molekul z genového poolu jako jsou genové banky nebo cDNA-pooly. Tento typ genové izolace je znám odborníkovi z učebnic molekulární biologie jako je Sambrook, Fritsch, Maniatis; Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory
Ί
Press, 1989, USA.
Za pomoci vhodných syntetických oligonukleotidů a polymerasové řetězové reakce (PCR) mohou být získány rovněž části genů například z cDNA-bank nebo prvního řetězce cDNA (PCR-protokoly); Academie Press; San Diego; USA; 1990). Oligonukleotidy, které jsou k tomuto vhodné je možno odvodit z peptidů popsaných pod SEQ ID NO.l až 6 převedením aminokyselinové sekvence do dvoj řetězcové DNA sekvence (sense a antisense). Přitom mohou na základě degenerovaného genetického kódu být odvozeny degenerované oligonukleotidové směsi z peptidů a nalézt pak použití jako primer.
Oligonukleotidy mohou být odvozeny z peptidů také s ohledem na takzvané codon usage; preferenčně užitého u jednoho druhu, v tomto případě hovězího dobytka, z určitých nukleotid-tripletů pro aminokyselinu. PCR se pak provádí se dvěma odlišnými oligonukleotidy jako primery, přičemž mohou být pro PCR potřebné dva primery složeny ze řetězce (sense) a protiřetězce (antisense) oligonukleotidu. Rovněž použití mohou nalézt oligonukleotidy, které jsou odvozeny z částí cDNA-vektorú, nebo oligo-dT pro 3' část mRNA.
Tyto genové části mohou pak být opět použity pro získání kompletního genu nebo úplné cDNA způsobem genové izolace.
Tímto způsobem je možno nejen izolovat geny pro endothelin konvertující enzym , ale také geny popř. varianty endothelin konvertujícího enzymu z jiných organismů, například lidí, které vykazují nejméně 80% homologii v oblasti proteinů vzhledem k SEQ ID NO:1.
Endothelin konvertující enzymy podle předloženého vynálezu je možno zvláště dobře připravit tak, že se izoluje odpovídající gen a tento gen se exprimuje v hostitelském organismu obvyklými genovětechnickými metodami.
ECE podle předloženého vynálezu nebo z nich odvozené peptidy mohou být použity pro výrobu protilátek nebo fragmentů ptotilátek jako jsou např. Fv-fragmenty, které například mohou být použity ke stanovení ECE, ve zkušebních postupech pro identifikaci látek, potlačujících ECE nebo jako inhibitory ECE.
Takové protilátky jsou obecně užívané v diagnostice chorob, na kterých se podílí endothelin konvertujicí enzym, jako cenná pomocná činidla.
Pro tyto účely mohou být také použity PCR-primery, které jsou odvozeny od DNA sekvencí podle předloženého vynálezu, například pro měření ECE-transkripce nebo stanovení genotypu.
Za pomoci získaných genů mohou být odborníkovi známým typem a způsobem zvířata změněna ve své genové podstatě tak, že obsahují jednu nebo více extrakopií tohoto genu nebo že normální ECE-gen byl vypnut. Tato transgenní zvířata jsou mezi jiným vhodná k pokusným účelům.
Samy endothelin konvertujicí enzymy jsou vhodné také jako účinná látka pro výrobu léčiv, například u onemocnění, která jsou provázena zvýšenou hladinou ECE-substrátů jako je např. bradykinin, substance P, somatostatin, neuropeptid Y. Takové choroby jsou například záněty, astma, migréna, rheuma, celulární procesy a buněčná proliferace, které probíhají za účasti peptidu jako růstových faktorů. Použití mohou ECE nalézt také jako léčivo při chorobách, na kterých se podílí vasodilatace, která může být potlačena podáním ECE, např.
septickém šoku, migréně, poruchách potence.
Pro použití ECE jako léčiva může být za určitých okolností nutné část ECE mutačně změnit. Tyto mutační změny mohou například vést s ECE-derivátu, který není glykosylován nebo který neobsahuje žádnou membránovou kotvu (rozpustný ECE). Takový rozpustný ECE, který již neobsahuje žádnou membránovou kotvu, může například být vyroben expresí ECE-fragmentu, který obsahuje extracelulární, katalyticky účinnou doménu. Mohou být například získány takové ECE-fragmenty, ve kterých je kódující sekvence mezi aminokyselinami 20 a 703 ze SEQ ID NO: 25, výhodně mezi aminokyselinami 27 a 703 ze SEP ID NO: 25 spojena se DNA sekvencí in vivo odštěpítelného signálního peptidu a zavedena ve vhodném expresním vektoru do eukaryotických buněk. Jako signální peptid je vhodná např. sekvence lidského tkáňového plasminogenového aktivátoru (Tissue Plasminogen Activator) mezi polohami aminokyseliny -35 a -4 (Collen D., Nátuře 301, 214 až 221 (1983)). Změny přitom mohou ovlivňovat například specifičnost, dobu působení, příjem. Dále mohou funkční části ECE být kopulovány s částmi jiných proteinů pro získání nových proteinů, které mohou nalézt použití jako léčiva. Změněna mohou být také ECE kovalentní modifikací s nepeptidickými molekulami jako např. je PEG, dextran, mastné kyseliny.
DNA-sekvence podle předloženého vynálezu jsou vhodné také pro použití v genové terapii, například pro výrobu genověterapeutických léčiv. Choroby se zvýšenými hodnotami endothelinu mohou být také léčeny oligonukleotidy odvozenými od ECE-DNA-sekvence. Tyto oligonukleotidy jsou odvozeny z nekódujícího DNA-řetězce (anti-sense) a mohou být použity jako léčiva. Na nich založená anti-sense-terapie výhodně využívá stabilnější chemické deriváty odvozené od oligonukleotidů.
Mohou být například použity anti-sense-oligonukleotidy, které byly syntetizovány vhodně z oblasti, která je definována polohami 31 až 100 Seq ID 35. Anti-sense-oligonukleotidy výhodně mají délku 15 až 30 zbytků. Anti-sense terapie nebo prevence nachází použití u chorob se stejnými indikacemi jako ECE-inhibitory, např. cerebrální ischemie; subarachnoidální krvácení; vasospasmy; koronární ischemie; choroby, které jsou spojeny s buněčnými proliferačními procesy jako hyperplasie prostaty, jako atheroskleroza, jako restenoza; astma; hypertenze; pulmonální krevní vysoký tlak; orgánové selhání jako srdeční selhání a ledvinové selhání; ledvinová ischemie; nefrotoxicita; infarkt myokardu; koronární srdeční onemocnění; sepse.
Z DNA-sekvence ECE mohou být také odvozeny sekvence, s nimiž mohou být vyrobeny katalytické RNA-molekuly, takzvané ribozymy. Tyto katalytické RNA-molekuly působí tím, že se po aplikaci ECE-RNA nebo ECE-DNA štěpí nebo inaktivují a tak brání proteinové syntéze ECE.
ECE-DNA-sekvence mohou být využity pro ustavení vhodných expresních vektorů do buněk, které exprimují tento enzym. Tyto buňky nacházejí použití mezi jiným jako léčiva.
Výhodně nacházejí endothelin konvertující enzymy použití v analytických postupech k identifikaci ECE potlačujících látek. Tyto analytické postupy jsou obvykle enzymatické reakce, při kterých se měří ECE-katalyzované štěpení substrátu za přítomnosti potenciálních potlačujících látek.
Další podstatou vynálezu jsou látky, potlačující endothelin konvertující enzym, které jsou identifikovány enzymovým testem za použití endothelin konvertujíčího enzymu podle předloženého vynálezu.
K vynálezu také patří způsob výroby léčiv, která inhibují konverzi endothelin konvertujícího enzymu, vyznačující se tím, že se známé chemické sloučeniny použijí v enzymovém testu zy použití endothelin konvertujícího enzymu podle předloženého vynálezu a identifikují se ty, které mají inhibující účinek a takto identifikované sloučeniny se formulují s běžnými nosičovými nebo pomocnými látkami jako léčivo.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Stimulace ECE-1 v primárních buňkách hovězího endothelu FBHE fosforamidonem trubičky se zmrazenými FBHE-hovězími endothelovými buňkami (ATCC CRL 1395) se ve 14.pasáži roztaví a umístí do 3 T175-lahví pro buněčnou kultivaci (fa. Sarstedt) se 40 ml růstového media DMEM (Gibco č. 041-01965) + 5 ml/500 ml glutaminu (200 mM; Gibco 043-05030) + 1 ml/500 ml gentamycinu (Gibco 043-05750) + neesenciální aminokyseliny; konečná koncentrace: 1 x (Gibco č. 043-01140) + 10 % FCS (Gibco č. 011-06290; inaktivováno 37 minut při 56 °C) + 25 ng/ml bázického FGF (Intergen 4125-80)).
Tyto buNky se inkubují standardním způsobem při 37 °C; v atmosféře ze 7 % CO2; 100% vzdušné vlhkosti. Následující den se provede výměna media. Při dosažení konfluence - v tomto případě po 4 dnech - se buňky pasážují standardním způsobem zpracováním trypsinem a rozdělí se do 9 T-175-lahví a inkubují za účelem růstu při 37 °C jak bylo popsáno. Po 3 dnech a dosažení konfluence se buňky znovu po standardním zpracování s trypsinem rozdělí do 20 T-lahví. Po dalších 3 dnech mohou být buňky rozděleny do 40 T-lahví. Po dalších 3 dnech se těchto 39 T-lahví rozdělí do 78 T-lahví. Protože se těchto 78 T-lahví použije ke sklizení buněk, jsou zapotření lahve vhodné pro buněčnou kultivaci (fa. Costar; Accell; č. 3155). Den po naočkování těchto T-lahví se do 68 lahví přidá fosforamidon (fy Peptide Institute; č. 4082; zkráceně PHAM) v konečné koncentraci 10-4M (+PHAM). Toto ošetření vede k vyvolání ECE-aktivity. Zbylých 10 T-lahví představuje neindukované kontrolní buňky (-PHAM). Po dalších 2 dnech inkubace za ppsaných podmínek se PHAM-indukované buňky a kontrolní buňky (-PHAM) odděleně sklidí. Za tím účelem se lahve otevřou a medium se vyklopí. Buňky se v T-lahvích promyjí vždy s 10 ml PBS (Boehringer Mannheim č. 210331) (tj. nad buněčnými rasami opatrně natáčí). PBS se vyklopí. Znovu se přidá 5 ml PBS na T-lahev. Buňky se odtrhnou ode dna kultivační buňky pomocí buněčného škrabáku (Cel1-Scraper, fa Costar č. 3010) a jako buněčná suspenze se převedou do 150ml odstředivkových zkumavek (Falcon č. 2076), a uloží se na led. Každá T-lahev se pak vypláchne 10 ml PBS. Buněčná suspenze se po vypláchnutí spojí s předchozí buněčnou suspenzí v odstředivkových zkumavkách. Buňky sedimentují odstředěním (1200 ot./min, 10 minut, Heraeus Christ Minifuge GL č. 4400, rotor 2150). Buněk prostý supernatant se odloží a peleta vyjme do 3-násobných objemů PBS buněčného sedimentu. Po novém odstředění se buněk prostý supernatant znovu odloží. Peleta se až do zpracování uloží na led.
Příklad 2
Srovnávací obohacení nestimulovaných a fosforamidem stimulovaných buněk hovězího endothelu; identifikace proteinu
Podle příkladu 1 získané FBHE-buňky s nebo bez fosforamidonové indukce (vždy 500 μ vlhké hmoty) byly zpracovávány ultrazvukem v 15 ml PBS-pufru, 0,5 mM diisopropylfluofosfátu 20 minut v ledové lázni. Po odstředění (20 min, 1000 g) se-membrány přídavkem 5 % Pluriolu F68R vysráží do supernatantu a získají novým odstředěním při 10000 g. Membrány se digerují se 2 ml 100 mM Tris-pufru, pH 8,0 a solubilizují s 1 % Tritonu X-100R. Solubilizáty (vždy 2,5 ml) se odstředí, zbytky se odloží.
Mono-Q + -chromatografi e
Solubilizáty +/- -fosformaidonem indukovaných buněk se oddělí na sloupci mono Q+ HR 5/5 (fa Pharmacia) za přesně stejných podmínek chromatografie. Sloupce se ekvilibrují 50 ml Tris-pufru, pH 8,0, 0,1 % Triton X-100 (A-pufr). Po nanesení solubilizátů se 15 min promývá A-pufrem a 50 min gradientem lineárně B-pufrem (A pufr + 1 M NaCI (průtok 0,2 ml/min). 20 frakcí po 0,5 ml se odebere a testuje s lidským Big Et-1 jako substrátem. Vytvořený Et-1 se prokazuje pomocí HPLC s reverzní fází popsaným způsobem (příklad 3) a kvantifikuje se. Obě frakce s nejvyšší enzymovou aktivtou se vždy spojí.
Superose 12R-gelová chromatografie
Eluáty z Mono G-chromatografií se koncentrují pomocí CentriconR-trubiček (Fa.Amicon) na 250 μί a vždy gelově chromatografují přes Superosu 12 HR10/36.
Podmínky: pufr:
tok: f rakce:
mM fosforečnan sodný 250 mM NaCI, pH 7,4 0,05 % Triton X 100 0,5 ml/min 0,5 ml
Podle testu popsaného v příkladu 3 se testují frakce a vždy se spojí 2 frakce s nejvyšší enzymovou aktivitou.
Stanovení proteinu všech frakcí se provede metodou podle Bradforda (Anal.Biochem. 72, 248 (1976)).
Výsledky
Čištění stimulovaných a nestimulovaných buněk poskytlo následující výsledky v různých stupních čištění:
Stupeň čištění | spec.akt.(pj/mg) FBHE-buňky + fosforamidon | Pg/mg FBHE-buňky - fosforamidon |
membrány | 129 | 44 |
solubi1 i zát | 188 | 22 |
Mono Q-chromat. | 1470 | 78 |
Superose 12-chromat. | 4500 | 130 |
Obě aktivní frakce Superose 12R-chromatografie se pro porovnání vloží na 8% SDS-polyakrylamidový gel. Průběh na gelu u přečištěného ECE-1 z fosforamidonem zpracovaných buněk ukazuje ve srovnání s neošetřenými bňkami přídavné pásy při 250000 Dalton. Při nanesení proteinů s redukčním činidlem dithiothreitolem (DTT), ukazuje se ve srovnání přídavný pás při 125000 Dalton.
Příklad 3
Test ECE-l-aktivity pomocí HPLC
Přeměna Big-endothelinu-1 na endothelin-1 pomocí endothelin konvertujícího enzymu (ECE-1) μΐ roztoku enzymu získaného podle příkladu 4 se smísí se 21 μΐ 50 mM Tris, 50 mM imidazolu, 250 mM NaCI, pH 7,4 pufru a 2,5 μΐ lidského Big-endothelinu (2 mg/ml v 0,1% kyselině octové ve vodě). Po 2 hodinách se reakce za účelem analýzy vytvořeného endothelinu ukončí 72 μΐ 0,5% kyseliny trifluoroctové. Vzorky se odstředí a supernatant seidentifikuje analýzou pomocí vysokotlakové chromatografie s reverzní fázi (RP-HPLC), jak je popsáno (J.Takada a spol., Biochem.Biophys.Res.Comm. 176, 860 (1991), K.Ohnaka a spol., Biochem. Biophys.Res.Comm. 168, 1128 (1990)) a kvantifikuje se porovnáním s endothelinovými standardy pomocí UV-detekce (205 nm) .
Enzymová aktivita se pak spočte jako aktivita 10~μΜ endothelin
ECE[pj] = min
Po tomto způsobu se stanoví ECE-aktivita zpracování PBHE-buněk k různým stupňům čištění. Současně se stanoví množství proteinu metodou podle Bradforda (Anal.Biochem. 72, 248 (1976)).
Příklad 4
Čištění ECe-1 z buněk hovězího endothelu, FBHE
a) Získání membrán, trypsinizace cizího proteinu ml FBHE-buněčných pelet (podle příkladu 1) se digeruje ve 25 ml PBS-pufru a 15 min uzavře v ultrazvukové lázni za chlazení ledem. Buněčné zlomky se odstraní odstředěním při 10000 g, 20 min. Supernatant se smísí za míchání s 3,6 g trypsinu a 1,5 h míchá při teplotě místnosti. Vzorky se odstředují 1 h při 100000 g a ve zbytku se nacházející membrány se suspendují se 25 ml 100 mM Tris-pufru, pH 8,0.
b) Solubilizace ECE-1 ml membránové suspenze se upraví na 0,5 mM diisopropylfluorfosfátu a pak 0,5 % Tritonu X-100R a uchovávají se přes noc v ledové lázni.
c) Mono-QR-chromatografie
Mono QR-FPLC-sloupec, HR16/10, fa Pharmacia se ekvilibruje s 50 mM Tris-pufru, pH 8,0; 0,05 % Tritonu X 100R (A-pufr).
Po nanesení solubilizátů se 30 min promývá A-pufrem a pak lineárními gradienty během 100 minut až do pufru B (pufr A + 1 M NaCI). Odebere se 30 frakcí po 10 ml. Obsah proteinu ve vzorcích se stanoví Bradfordovou metodou, ECE-1 aktivita jako v příkladu 1.
Obě frakce s nejvyššími specifickými aktivitami se spojí.
d) Gelová filtrace
Spojené Mono QR-eluáty podle 4c) se koncentrují přes 30 KDa-Centricon-membránu (fa Amicon) na 500 μϊ.
Sloupec Superosy 12R, HR 10/30 (fy Pharmacia) se ekvilibruje se 20 mM Na-fosfátového pufru, pH 7,4, 250 mM NaCI, 0,05 % Tritonu X 100 a koncentrované vzorky se nanesou Při průtoku 0,5 ml se chromatografuje ekvi1ibračním pufrem a odebírají se frakce 0,5 ml.
Stanovení specifické aktivity frakcí se provede jako ve 4c). Frakce s nejvyšší specifickou aktivitou je uvedena pod
e); eluuje při asi 250000 Dalton, kalibrováno na standardní proteiny za stejných chromatografických podmínek.
e) Výsledky
Stupeň čištění membrány solubi1izát Mono Q-eluát Superose 12-eluát protein (mg)
6,6
0,35 spec.aktivita (Uj/mg)
410
360
3760
15100
Příklad 5
SDS-gel-analýza přečištěného ECE-1 z FBHE-buněk
Podle příkladu 4 přečištěný ECE-1 se analyzuje na 8% SDS-gelu podle Lámmliho (Nátuře 227, 680 (1979)) za neredukujicích a redukujících podmínek (+DTT). ECE-1 má v neredukovaném stavu molekulovou hmotnost 250000 Dalton a rozpadá se po redukci na široký pás kolem 125000 Dalton.
Příklad 6
Deglykosylace ECE-1 μΐ podle příkladu 4 přečištěného ECE-l-roztoku se upraví 10% SDS-roztokem na obsah 0,25 %-SDS. Vzorky se inkubují 20 min při teplotě místnosti a upraví na 1 % Tritonu X-100. Po 20 min při teplotě místnosti se přidá 5 μΐ 250 mM Na-fosfátového pufru, pH 7,4. Potom se přidá 0,25 μΐ PNGasy a přidá se 0,5 pg Endo F. Vzorky se inkubují při 37 °C 8 h. Potom se znovu přidají stejná množství enzymu a inkubuje se dalších 8 hodin při 37 °C. Pak se vzorky koncentrují na 50 μΐ a analyzují ve 4-12% SDS gelu.
Výsledky:
V redukovaném stavu se změní zjevná molekulová hmotnost ze 125000 Dalton odštěpením cukrového zbytku se směsí PNasy F/Endo F na asi 82000 Dalton.
Příklad 7
Parciální sekvence ECE-1 z buněk hovězího endothelu x 25 pg podle příkladu 4 získaného ECE-l-roztoku se preparativně nanese na 4-12% SDS-polyakrylamid-gradientové gely. Po obvyklém vybarvení pomocí Coomassie blue se gel odbarví a zavodní po 4 x 40 minut v čisté vodě. Při 250 kDa vybarvené pásy se vyříznou skalpelem a digerují se 200 μΐ 100 mM NHáHCCb-roztoku. Po přídavku 0,5 pg trypsinu se inkubují přes noc, supernatant se pak odloží. Zbytek se znovu inkubuje s 0,6 pg trypsinu 5 h při teplotě místnosti ve 200 pl NHáHCOs-pufru. Potom se vzorky odtáhnou dosucha ve speed-vac-zahušťovači. Zbytek se vyjme do 40 μϊ vody a míchá se 4 μϊ 40 mM roztoku dithiothreitolu. Potom se přidá při 37 °C 4 μϊ 100 mM roztoku jodacetamidu. Po 2 hodinách se vzorek odtáhne dosucha.
Vzniklé peptidy se oddělí přes 1 mm x 15 cm HPLC-sloupec s reverzní fází v lineárních 3-hodinových gradientech 0,5 % kyseliny trifluoroctové ve vodě po 0,5% kyselinu trifluoroctovou v 90% acetonitrilu. UV-aktivní frakce se spojí a stanoví se primární sekvence na sekvenátoru v plynné fázi.
Výsledky:
Byly stanoveny následující parciální sekvence:
SEQ ID NO: 1:
Xaa-Xaa-Pro-Asn-Ala-Leu-Asn-Phe-Gly-Gly-Ile-Gly-ValVal-Val-Gly-His-Glu-Leu-Thr-His-Ala-Phe...
SEQ ID NO: 2:
Xaa-Tyr-Xaa-Lys-Xaa-Gly-Asn-Leu-Arg-Pro
SEQ ID NO: 3:
Xaa-Ile-Ala-Xaa-Glu-Thr-Glu-Leu-Glu-Ile...
(Ile) (Ile)
SEQ ID NO: 4:
Xaa-Pro-Glu-Phe-Leu-Leu-Glu-Gly-Leu-Ile-Thr-Asp-Pro...
SEQ ID NO: 5:
Xaa-(Gln)-(Ala)“(Glu)“Asn~Val-Ile-Gln-Val-Xaa-Gln...
SEQ ID NO: 6:
Val-Glu-Ile-Val-Phe-Pro-Ala-Gly-Ile-Leu-Gln-Ala-Pro-(Phe)-Tyr-Thr (Thr)
V závorkách uvedené aminokyseliny nebyly absolutně jistě ident i f ikovány.
SEQ ID NO:1 dokládá, že se u ECE-1 jedná o nový protein z rodiny metaloproteás, protože ve srovnání se sekvencemi metalendopeptidasami NEP 24.11 a thermolysinu vykazuje významné homologie 72 % a 40 %.
Příklad 8
Výroba cDNA-sekvence, která kóduje endothelin konvertující enzym
a) Izolace RNA a výroba cDNA-banky
Celková RNA z FBH-buněk, které podle příkladu 1 byly stimulovány s fosforamidonem, nebo z HeLa-buněk, které podle příkladu 1 byly stimulovány s fosforamidonem, byla získána rozkladem ve guanidiumthiokyanátu. Přitom se pracovalo s materiály a podle návodu RNA Isolation Kit firmy Stratagene,
La Jolla, CA, USA (katalogové číslo 200345).
Polyadenylovaná messenger RNA byla selektována z celkové RNA z FBHE-buněk oligo(dT)-afinitní separací. Tento způsob byl prováděn s materiály a podle návodu PolyATract mRNA Isolation System firmy Promega, Madison, WI, USA (katalogové číslo
Z5200). Z polyadenylované messenger RNA byla s materiály a podle návodu ZAP-cDNA Synthesis Kit firmy Stratagene, La Jolla, CA, USA (katalogové číslo 200400) syntetizována cDNA, která pak byla s materiály a podle návodu Uni-ZAP XR GigapacklI Cloning Kit firmy Stratagene, La Jolla, CA, USA (katalogové číslo 237611) umístěna do lambda fágů.
b) Výroba oligonukleotidových sond pro RCE-PCR
Při klonování cDNA-fragmentů za pomocí polymerasové řetězové reakce (PCR, viz Molecular Cloning, 2.vyd (1989), Sambrook J, a spol., CSH-Press, str.14.1 a dále) se vycházelo z peptidů uvedených v příkladu 7 se SEQ ID NO: 1 a NO:6.
Na základě genetického kódu se nechá ze SEQ ID NO: 1, poloha 16 až 22 odvodit oligonukleotidová směs s nukleokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 7:
5'-GGSCAYGARYTNACNCAYGC-3'.
Stejně je možno odvodit ze SEQ ID NO: 6, poloha 2 až 8 oligonukleotidovou směs se SEQ ID NO: 8:
5'-GARATYGTSTTYCCZGCZGG-3', jakož i ze SEQ ID NO:6, polohy 9 až 16 oligonukleotidovou směs se SEQ ID NO: 9:
5'-ATYCTSCAGGCYCCYTTYTAYAC-3'.
SEQ ID NO: 7 až NO:9 přitom odpovídají sekvenci kódujícího DNA-řetězce. Z důvodu degenerace genetického kódu může na různých polohách být přítomno více nukleotidů. Tím se získává pro SEQ ID NO:7 až 9 až 512násobná směsná komplexnost. Uvedené sekvence se syntefczují jako oligonukleotidy.
Následující oligonukleotidy byly přídavně syntetizovány jako 3' primer v RACE-PCR:
jakož i
A (z A-B-T18) (SEQ ID NO: 11):
jakož i
B (z A-B-T18) (SEQ ID NO: 12):
Syntézy se provádějí s DNA-syntetizérem Applied Biosystems Typ 360A. 01igonukleotidy se přečistí po odstranění chránících skupin elektroforeticky přes gel akrylamid/močovina.
c) Výroba DNA-templátů pro PCR pg celkové RNA nebo 1 pg Póly(A(+-RNA pod a) uvedených RNA-preparátů z fosforamidonstimulovaných FBHE buněk se převedou s 1 pg oligonukleotidu A-B-T18 (SEQ ID NO: 10) a za pomoci enzymu reverzní transkriptázy, do jednořetězcové DNA (i°cDNA). Pracuje se přitom s materiály a podle návodu SuperScript Preamplification System firmy Gibco BRL, Eggenstein, Německo (katalogové číslo 8089SA). Po ukončení reakce se produkty syntézy pomocí Geneclean II Kitu firmy BIO 101, La Jolla, CA, USA, vyčistí od menších molekul a přebytečných oligonukleotidů.
d) PCR a klonování části cDNA-sekvence
Polymerasová řetězová reakce se provede podle známých protokolů (viz Molecular Cloning, 2.vydání (1989), Sambrook J. a spol., CSH-Press, str. 14.1 a další). K tomu se použije princip proloženého primeru podle Frohmana M.A. a spol., (Proč.Nati.Acad.Sci. USA (1988) 85, 8998-9002) a mdifikovaný podle Fritze J.D. a spol. (Nucl.Acids Res. (1991) 19, 3747).
Jednotlivě se l°cDNA z c) amplifikuje vždy se 20 pmol oligonukleotidu SEQ ID NO: 8 a A (z A-B-T18). Podmínky přitom byly: 1’ 95 °C, 2* 55 °C, 3' 72 °C pro 35 cyklů.
PCR-produkty byly elektroforeticky rozděleny na 1,2% LMP-agarosa/TBE-gelu.
Z gelu bylo vyříznuto po celé délce skvrny asi 10 gelových lístků a tyto byly roztaveny jako separátní frakce s DNA-fragmenty stoupající molekulové hmotnosti.
Podíly těchto frakcí pak byly odděleně použity ve dvou PCR vždy se 20 pmol oligonukleotidu SEQ ID NO: 9 a B (s A-B-T18). Podíl agarosy přitom nepřekročí 1/10 objemu PCR-vsádky. Reakční podmínky: 1' 95 °C; 2' 50 °C; 3' 72 °C pro 35 cyklů.
Elektroforetické dělení amplifikačních produktů této frakce umožňuje rozpoznat významnou redukci komplexního spektra produktu první PCR k definovanému pásu délky asi 1000 bp po druhé PCR.
Takovým způsobem selektovaný PCR-produkt se eluuje standardními metodami. Identita 1000 bp velkého pásu jako fragment hovězí endothelin konvertující enzym cDNA se nejprve přezkouší další, třetí PCR-amplifikací s oligonukleotidy SEQ ID NO: 7 a 8 ( z A-B-T18). Produkt této PCR byl pás velikosti asi 950 bp.
Po subklonování 1000 bp velkých pásů ze druhé PCR-reakce do vektoru pCR II (TA Cloning Kit, Invitrogen Corp., San Diego, kat.č. K2000-01) a pomnožení plasmidu v E.coli DH5alfa poskytne sekvenční analýza klonu otevřený čtecí rámec 189 aminokyselin SEQ ID NO: 13, NO:14). Ve stejném čtecím rámci se také nacházejí sekvence peptidů SEQ ID NO: 1, NO:2 a NO:4, čímž je jednoznačně definována identita cDNA fragmentů.
e) Klonování hovězí cDNA pro endothelin konvertující enzym
Podle protokolu uvedeného v příkladu la) se generuje cDNA-knihovna se statistickou směsí primerů ve stupni syntézy prvního řetězce. Primery byly syntetizovány jako sekvence:
5'-GAGAGAGAGTCGACGGTACCN7; SEQ ID NO: 15.
Odlišně od uvedeného protokolu cDNA-syntézy se dvojřetězcová cDNA frakcionuje přes 2 ml sloupec S-1000 Sephakrylu (kvalitaSuperfine; Pharmacia, Freiburg; kat.číslo 17-0476-01). Frakce s cDNA-fragmenty velikosti alespoň 1 kb se koncentrují známým způsobem alkoholovým srážením a dále zpracovávají podle návodu v cDNA-Synthese Kitu, přičemž se cDNA-preparáty následně štěpí s restrikční endonukleásou Sáli místo Xhol a integruji se do lambda vektoru.
x 106 klonů banky hybridizováno s DNA-sondou, která byla vyrobena s oligonukleotidy 5’-CGGCCCTGGTGGAAGAACTCG-3' (SEQ ID NO: 16) a 5'-TGCGGACGGAACACCAGACCT-3' (SEQ ID NO: 17) z parciálních hovězích cDNA (SEQ ID NO 13), poloha 136 až 156, popř. 391 až 412, po transferu na nylonových membránách.
DNA-sondy byly značeny v polymerasové řetězové reakci (PCR) za přítomnosti digoxigenin-dUTP, jak je popsáno v příkladu lf). Hybridizace byla prováděna za přísných podmínek (viz příklad lf)), přičemž poslední promývací krok byl prováděn po provedené hybridizaci v 0,1 x SSC, 60 °C a pak byl proveden imunologický průkaz navázané DNA-sondy. Sekvenování zvolených klonů poskytlo hovězí cDNA-sekvenci C60, SEQ ID NO: 18, s otevřeným čtecím rámcem, SEQ ID NO: 19.
Potom bylo za stejných podmínek hybridizováno 2 x 106 klonů banky s DNA-sondou, která byla vyrobena s oligonukleot idy
5'-GCCAGCGCCGTCTCAAAGTCCAG-3' (SEQ ID NO: 20) a
5'-TGGGGGACCTTCAGCAACCTCT-31 (SEQ ID NO: 21) z cDNA-klonu C60, SEQ ID NO: 18, poloha 500 až 522, popř. 14 až 35, jak je popsáno výše, za stejných podmínek. Sekvenování zvolených klonů poskytlo hovězí cDNA-sekvenci SEQ ID NO: 22 s otevřeným čtecím rámečkem 708 aminokyselin (SEQ ID NO: 23).
x 108 plakotvorných jednotek obchodně dostupné cDNA banky hovězích plic v lambda gtíl (Clontech Laboratories, lne.; 4030 Fabian Way; Palo Alto CA 94303-4607, USA; katalogové číslo BL1006b) se po vysrážení s 10% polyethylenglykolem 6000, 1 M NaCl koncentrují ve 100 μΐ dvakrát destilované vody resuspendují a 5 min se zahřívají na 70 °C. 5 μΐ tohoto lyzátu se použije v 50 μΐ standardní PCR reakci (příklad 8d) s primery gtll fwd a
5'-GGTGCTTGATGATGGCTTGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 26). Primer gtll fwd odpovídá polohám 2979-3003 β-galaktosidasového genu (genová banka: ECLACZ) a leží v klonovacím vektoru lambda gtll bezprostředně před jediným EcoRI-integračním místem, které bylo použito při konstrukci banky (Young R.A. a Davis R.W.
(1985) Genetic Engineering, vyd. Setlow J. a Hollander A., Plenům Press, N.Y. 29-41). Primer SEQ ID NO: 26 odpovídá poloze 280-303 SEQ ID NO: 22.
Vzniklé PCR-fragmenty se sekvenují po subklonování v plasmidovém vektoru pUC18 (Yanisch-Perron D., Vieira J. a Messing J. (1985) Gene 33, 103-119)(SEQ ID NO: 28).
Tyto sekvence se překrývají s nukleotidy 175-324 SEQ ID NO: 22 v polohách 1-150 a prodlužují se o 14 nukleotidů ve směru 5'.
f) Klonování lidské cDNA pro endothelin konvertující enzym
Protože endothelin-1 byl prokázán v lidské placentě, bylo přijato, že se endothelin konvertující enzym exprimuje také v plasmě. Byla proto screenována za použití značené hovězí-cDNA-sondy lambda gt-11 placentová cDNA banka. Pro výrobu digoxigenin-dUTP značené hovězí-cDNA-sondy se v PCR reakci (viz Molecular Cloning, 2.vydání (1989), Sambrook J. a spol., CSH-Press, str, 14.1 a další) použije jako 'templát' ng (1 ng/ml) parciální hovězí-cDNA-sekvence (SEQ ID NO: 13).
'Sense'-oligonukleotid (SEQ ID NO: 16) zahrnuje nukleotidy od polohy 136 do 156 v SEQ ID NO: 13, 'antisense'-oligonukleotid SEQ ID NO: 17) polohy 392 až 412 v SEQ ID NO: 13. v 'DNA Therma Cycler' (Perkin Elmer) proběhnou 35krát následující cykly: 2 min 94 °C, 2 min 60 °C a 3 min 72 °C. Značená cDNA-sonda se pak přečistí přes agarosový gel a denaturuje se povařením. Za použití méně přísných podmínek se touto sondou screenuje asi 650000 kSQ,nů lidské lambdagt-11 cDNA-banky (Clontech, HL 1008b). Hybridizace filtrových odtahů se sondou provádí přes noc v 5 x SSC, 2 % blokovacího činidla (Boehringer Mannheim; č. 1096176), 0,1 % Na-laury1sarkosin,
2Ί
0,02 % SDS při 60 °C. Filtry se pak promývají 20 min při 60 °C s 0,5 x SSC, 0,1 % SDS. Další vyvíjení filtrů pro identifikaci navázaných DIG-sond se provádí podle protokolu Boehringer Mannheim (DIG - detekční kit pro nukleové kyseliny, č.
1175041).
Izolují se klony s cDNA-sekvencí uvedenouv SEQ ID NO: 24. Nukleotidy v poloze 1 až poloze 2109 cDNA-sekvence se SEQ ID NO: 24, kódují v SEQ ID NO: 25 uvedené aminokyselinové sekvence. Aminokyselinová sekvence odpovídá největší části primární sekvence endothelin konvertujícího enzymu, protože peptidy SEQ ID NO: 1 až SEQ ID NO: 6 ze trypsinpeptidového sekvenování izolovaného endothelin konvertujícího enzymu je možno v sekvenci opět najít. Také metaloproteinasa-konsensussekvence HEXXH může být také jako HELTH identifikována na polohách 540 až 544 v aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO: 25.
Ze 3 pg placenta póly A(+) RNA se vyrobí jak popsáno v příkladu 8 e) s oligonukleotidem
5' -gagagagagagagagagagaactagtctcgagccaagcaggccaccagtcctg-3 1 (SEQ ID NO: 31) jako první řetězec cDNA syntézní primer cDNA-knihovna. Nukleotidy 32 až 53 odpovídají polohám 32 až 53 SEQ ID NO: 24. cDNA-preparát se integruje jak popsáno v příkladu 8a) do lambda-vektoru Uni-ZAP XR. Výsledné 4 x 105 nezávislé klony se amplifikují a 5 x 108 plakotvorných jednotek se, jak popsáno v příkladu 8 e), nasadí do 100 μΐ PCR-reakce. Primer C leží v lambda-vektoru v Bluescript SK(-)-části, pol. 881-904, Sequenzf i 1 e· Genbank: ARBLSKM.
PCR-reakce se provádí 40 cyklů při hybridizační teplotě 65 °C. 1 pl reakčního produktu se vloží do čerstvých 50 μΐ
PCR-reakční vsádky a provádí se 40 cyklů při hybridizační teplotě 60 °C. Jako primer byly použity oligonukleotidy D a
5--CCTGCCGCCAGAAGTACCACCAACA-3' (SEQIDNO: 32)
Primer D leží v Bluescript SK(-)-části lambda Uni-ZAP XR-vektoru (pol. 857-880, Sequenzfile Genbabk: ARBLSKM), příměrová SEQ ID NO: 32 odpovídá polohám 11-35 v SEQ ID NO:
24. Reakční produkt se subklonuje v plasmidovém vektoru pUC18 jak popsáno výše. Vybrané klony se sekvenují.
Jako sekvence se získá nový 5'- podíl lidské ECE cDNA (SEQ ID NO: 33, jehož 3'-terminální oblast (pol.188-222) se překrývají s polohami 1-35 SEQ ID NO: 24. Prodlužuje se o 187 nukleotidů v 5'-směru a poskytuje celkovou lidskou ECE-sekvenci SEQ ID NO: 35, která kóduje otevřený čtecí rámec 753 aminokyselin (SEQ ID NO: 36).
Příklad 9
Výroba rekombinantního ECE v savčích buňkách
1. Konstrukce expresního vektoru pro membránový lidský ECE
Pro expresi úplného lidského ECE se zavede cDNA-sekvence (SEQ ID NO: 35) od nukleotidu 29 do 2720 se vhodnými adaptory do expresního vektoru pcDNA3neo fy. Invitrogen (3985 B Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA 92121, USA; produkt č. V790-20) mezi místa Κρη I a Xba I. ECE-sekvence nese své vlastní translačni start- a stgosekvence jakož i konsensus-Kozak-sekvenci (Kozák M. (1989), J.Cell Biol. 108, 229-241). Transkripce ECE-messenger RNA probíhá v tomto viru pod kontrolou silného cytomegalievirového promotoru. Selekce transfikovaných buněk se provádí přes gen neomycinové rezistence, ležící v plasmidu, který umožňuje růst jen G418-rezistentních kolonií.
2. Konstrukce expresního systému pro secernovaný lidský ECE
a) Klonování se provádí v obchodně dostupném eukaryotickém expresním vektoru pcDNA3neo fy Invitrogen (3985 Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA, 92121, USA; produkt č. V790-20. Proto se vektor nejprve štěpí s restrikčními enzymy Eco RI a Eco RV.
b) Potom se z cDNA lidského ECE (SEQ ID NO: 35) získá fragment nukleové kyseliny poloha 241 - poloha 2396 polymerasovou řetězovou reakcí se vhodnými oligonukleotidprimery. Podle volby sekvence 5' primeru se změní sekvence nukleové kyseliny mezi polohami 241 a 245 (SEQ ID NO: 35) ve sledu bází 5'-ACGCG-3'. Za zahrnutí polohy 246 se tímto krokem generuje rozpoznávací sekvence pro restrikční endonukleasu Mlu I. Vzniklý ECE-fragment se štěpí v dalším kroku s Mlu I.
c) Jako další fragment se vyrobí ze dvou syntetických oligonukleotidů (řetězec/protiřetězec) kódující sekvence lidského tkáňového plasminogenového aktivátoru (t-PA) mezi nukleotidem 74 a nukleotidem 176 publikované sekvence (D.Collen, Nátuře 301, 214-221 (1983)). Přídavně k uvedené sekvenci byly syntetické oligonukleotidy opatřeny adaptory, které vedou ke 5' Eco RI a 3' Mlu I přesahu.
Ligace fragmentů generovaných pod b) a c) přes společné Mlu I místo restrikčního štěpeni vede k fúzi čtecího rastru signálního peptidu lidského t-PA genu a extracelulární domény lidského ECE genu. Ligace tohoto fuzního proteinu do Eco RI a Eco RV štěpeného pcDNA3 vektoru z a) vede k expresnímu systému pro secernovaný lidský ECE.
3. Exprese v savčích buňkách
DNA expresní vektory byly transfikovány s 1ipofektaminem (fa Gibco; Life Technologies GmbH; Dieselstrape 5, 76334 Eggenstein, Německo; č. 530-8324SA) do savčích buněk. Použité buňky byly CHO-K1 (ATCC CCL 61); BHK-21 (ATCC CCL 10); 293 (ATCC CEL 1573) a C127I (ATCC CEL 1616).
Vždy 2xl05 buněk se nasaje ve 3 ml růstového media na jamku 6-jamkové kultivační plotny. Další den se provede transfekce. Za tím účelem se buňky jednou promyji PBS. Transfekce 1ipofektinaminem se provede podle pokynů výrobce, firmy Gibco (Focus (1993), 15 č.3, 73-78). Každá jamka obsahuje 1 pg DNA a 6 μΐ 1ipofektaminu, které byly uvedeny do celkem 1000 μΐ sera prostého buněčného kultivačního media. Po 6-hodinové inkubaci při 37 °C se buňky promyji jednou s PBS a inkubují v normálním růstovém mediu. Další den se buňky z jedné jamky po oddělení trypsinem rozdělí na 1, 5 nebo 10 Petriho misek (průměr 10 cm). Den na to se transfektované buňky selektují zpracováním s G418 (fa Gibco; kat.č.
066—01811Y; obchodní označení: Geneticin), tj. růstové medium se vymění za medium, které obsahuje 1,2 mg/ml G418. Po 7 až 10 dnech byly v Petriho miskách pozorovány kolonie G418-rezistentních buněk. Tyto byly izolovány metodou clonin-cylinder (DNA-cloning Vol.III; vyd. D.M.Glover, IRL press, 1985; str.220). Izolované kolonie byly umístěny vždy do jedné jamky 24-jamkové misky s asi 1,5 ml růstového media (včetně G418). Při dosažení konfluence byly buňky tryptinizací převedny do větších kultivačních nádob.
a) Membránový ECE
Buňky, které exprimují membránový ECE, byly zkoušeny na přítomnost ECE po rozbití buněk a frakcionaci jak je popsáno v příkladu 1 a 2. (Fosforamidonová stimulace není provedena). Specifická aktivita analyzovaných kolonií činí na membránové bázi až 1550 pj/mg proteinu. Membrány kolonie 38 byly dále zpracovávány. Byly přitom získány následující výsledky:
Stupeň čištění spec.akt ivita membrány solubi1 i zát mono-Q-chromatograf i e (M-j/rng proteinu) 1550 2010 12000
b) Secernovaný ECE
Buňky, které exprimují ECE bez membránové kotvy a secernují jej do buněčného kultivačního media, byly testovány na přítomnost rekombinantního ECE, přičemž byl zkoušen buněčný supernatant konfluentních buněk na ECE-aktivitu. Buněčný supernatant byl po 2 dnech kultivace odebrán a odstředováním při 1000 g zbaven buněčných zlomků. 6 ml supernatantu bylo pak koncentrováno pomocí zařízení Centricon 10.000 (fy Amicon, W.R.Grace + Co., Danver, Ma. 01923, USA; produkt č. 4206) a odstředěním při 3220 g (asi 30 min). Vytékající kapalina s nízkomolekulárními substancemi byla odebrána (Centricon-Eluat). Centricon byl promyt jednou s 1 ml PBS + 10 mM Tris + 150 mM NaCI; pH 7,5. Koncentrát byl vyjmut do 300 μΐ Centricon-Eluates.
pl koncentrátu bylo použito v ECE-testu jak je popsán v příkladu 3.
Objemová aktivita secernovaného ECE činila podle zkoušené kolonie rekombinantních buněk až 10 pjednotek/ml buněčného kultivačního media.
Sekvenční protokol (1) Obecná informace:
(i) Přihlašovatel:
(A) Jméno: BASF Aktiengesellschaft (B) Ulice: Car1-Bosch-Strasse 38 (C) Místo: Ludwigshafen (E) Země: Spolková republika Německo (F) Poštovní směrovací číslo: D-67056 (G) Telefon: 0621/6048526 (H) Telefax: 0621/6043123 (I) Telex: 1762175170 (ii) Název přihlášky: Endothelin konvertující enzym (ECE) (iii) Počet sekvencí: 25 (iv) Počítačově čtecí forma:
(A) Nosič dat: floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Pracovní systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPA) (2) Informace o SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 23 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (B) Typ tkáně: endotheliálnl (H) Buněčná linie: buněčná linie endothelu fetálního hovězího srdce (xi): Popis ekvence: SHQ II) NO: 1:
Xaa Xaa Pro Asn Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val Gly 1 5 10- 15
His Glu Leu Thr His Ala Phe 20 (2) lnL>i íitace o SHQ ID NO: 2:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 10 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Setězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (B) Typ tkáně: endotheliální (H) Buněčná linie: buněčná linie endothelu fetálního hovězího srdce (xi): Popis ekvence: SEQ ID NO: 2:
Xaa Tyr Xaa Lys Xaa Gly Asn Leu Arg Pro
5 10 (2) Informace o SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 10 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (H) Buněčná linie: buněčná linie endothelu fetálního hovězího srdce (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: modifikované místo (B) Poloha: 8 (D) Zvláštní údaje: /pozn.=Xaa = Leu nebo Ile (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: modifikované místo (B) Poloha: 7 (D) Zvláštní údaje: /pozn.=Xaa = Glu nebo Ile (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
Xaa Ile Ala Xaa Glu Thr Xaa Xaa Glu Ile 1 5. 10 (2) Informace o SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 13 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (H) Buněčná linie: buněčná linie endothelu fetálního hovězího srdce (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
Xaa Pro Glu Phe Leu Leu Glu Gly Leu Ile Thr Asp Pro 1 -5 10 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (H) Buněčná linie: buněčná linie endothelu fetálního hovězího srdce (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
Xa'a Gin Ala Glu Asn Val Ile Gin Val Xaa Gin
5 10 (2) Informace o SEQ ID NO: 6:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (H) Buněčná linie: buněčná linie endothelu fetálního hovězího srdce (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: modifikované místo (B) Poloha: 7 (D) Zvláštní údaje: /pozn.=Xaa = Ala nebo Thr (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
Val Glu Ile Val Phe Pro Xaa Gly Ile Leu Gin Ala Pro Phe Tyr Thr 15 10 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 7:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (denomická) (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
COSCAYGARY tnacncaygc (2) Informace o SEQ ID NO: 8:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
garatygtst tyccygcygg (2) Informace o SEQ ID NO: 9:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 23 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
atyctscagg cyccyttyta yac (2) Informace o SEQ ID NO: 10:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 45 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:
QGAGGGGGAT GGTCGACGGA AGCGACCTTT TTTTTTTTTT TTTTT
45' (2) Informace o SEQ ID NO: 11:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 19 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi): Popis sekvence
CGÁGGGGGAT GGTCGACGG (2) Informace o SEQ ID NO
SEQ ID NO:
12:
okvence:
(A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:
GATGGTCGAC GGAAGCGACC (2) Informace o SEQ ID NO: 13:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 570 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNS k mENS (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (B) Buněčná linie: buněčná linie endothelu fetálního hovězího srdce (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 1..567 (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:
ATC Ile 1 | CTG CAG | GCG CCA TTC TAC ACC CGC TCT TCA CCC AAT GCC TTA AAC | 48 | |||||||||||||
Leu | Gin | Ala | Pro 5 | Phe Tyr | Thr | Arg | Ser 10 | Ser | Pro Asn Ala | Leu 15 | Asn | |||||
TTC | GGC | GGC | ATC | GGC | GTC | GTC | GTG | GGC | CAC | GAG | CTG | ACT | CAT | GCT | TTT | 96 |
Phe | Gly | Gly | Ile | Gly | Val | Val | Val | Gly | His | Glu | Leu | Thr | His | Ala | Phe | |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
GAT | GAT | CAA | GGC | CGA | GAG | TAC | GAC | AAG | GAT | GGG | AAC | CTC | CGG | CCC | TGG | 144 |
Asp | Asp | Gin | Gly | Arg | Glu | Tyr | Asp | Lys | Asp | Gly | Asn | Leu | Arg | Pro | Trp | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
TGG | AAG | AAC | TCG | TCC | GTG | GAG | GCG | TTC | AAG | CAG | CAG | ACC | GCG | TGC | ATG | 192 |
Trp | Lys | Asn | Ser | Ser | Val | Glu | Ala | Phe | Lys | Gin | Gin | Thr | Ala | Cys | Met | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
GTG | GAG | CAG | TAC | GGC | AAC | TAT | AGC | GTG | AAC | GGG | GAG | CCG | GTG | AAC | GGC | 240 |
Val | Glu | Gin | Tyr | Gly | Asn | Tyr | Ser | Val | Asn | Gly | Glu | Pro | Val | Asn | Gly | |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
CGG | CAC | ACC | CTC | GGC | GAA | AAC | ATC | GCC | GAC | AAC | GGG | GGC | CTC | AAG | GCG | 288 |
Arg | His | Thr | Leu | Gly | Glu | Asn | Ile | Ala | Asp | Asn | Gly | Gly | Leu | Lys | Ala | |
85. | 90 | 95 | ||||||||||||||
GCC | TAT | CGG | GCC | TAC | CAG | AAC | TGG | GTC | AAG | AAG | AAT | GGG | GCT | GAG | CAG | 336 |
Ala | Tyr | Arg | Ala | Tyr | Gin | Asn | Trp | Val | Lys | Lys | Asn | Gly | Ala | Glu | Gin | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
ACA | CTG | CCC | ACC | CTG | GGT | CTC | ACC | AAC | AAC | CAG | CTC | TTC | TTC | CTG | AGT | 384 |
Thr | Leu | Pro | Thr | Leu | Gly | Leu | Thr | Asn | Asn | Gin | Leu | Phe | Phe | Leu | Ser | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
TTT | GCA | CAG | GTC | TGG | TGT | TCC | GTC | CGC | ACC | CCC | GAG | AGT | TCG | CAC | GAA | 432 |
Phe | Ala | Gin | Val | Trp | Cys | Ser | Val | Arg | Thr | Pro | Glu | Ser | Ser | His | Glu | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
GGT | CTC | ATC | ACC | GAT | CCC | CAC | AGC | CCC | TCC | CGC | TTC | CGG | GTC | ATC | GGC | 480 |
Gly | Leu | Ile | Thr | Asp | Pro | His | Ser | Pro | Ser | Arg | Phe | Arg | Val | Ile | Gly | |
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
TCC | ATC | TCC | AAC | TCC | AAG | GAG | TTC | TCG | GAA | CAC | TTC | CAC | TGC | CCG | CCC | 528 |
Ser | Ile | Ser | Asn | Ser | Lys | Glu | Phe | Ser | Glu | His | Phe | His | Cys | Pro | Pro |
165 170 175
GGC TCA Gly Ser
CCC ATG Pro Met
180
AAC CCG Asn Pro
CAT CAC His His
AAG TGT Lys Cys 185
GAA GTC Glu Val
TGG TGA Trp
57C (2)
Informace o SEQ ID NO: l(f· (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: l£> párů bázi (B) Typ' nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO:
Ile 1 | Leu Gin | Ala | Pro Phe Tyr Thr Arg Ser Ser Pro Asn Ala | Leu 15 | Asn | ||||||||||
5 | 10 | ||||||||||||||
Phe | Gly | Gly | Ile | Gly | Val | Val | Val | Gly | His | Glu | Leu | Thr | His | Ala | Phe |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Asp | Asp | Gin | Gly | Arg | Glu | Tyr | Asp | Lys | Asp | Gly | Asn | Leu | Arg | Pro | Trp |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Trp | Lys | Asn | Ser | Ser | Val | Glu | Ala | Phe | Lys | Gin | Gin | Thr | Ala | Cys | Met |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Val | Glu | Gin | Tyr | Gly | Asn | Tyr | Ser | Val | Asn | Gly | Glu | Pro | Val | Asn | Gly |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Arg | His | Thr | Leu | Gly | Glu | Asn | Ile | Ala | Asp | Asn | Gly | Gly | Leu | Lys | Ala |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ala | Tyr | Arg | Ala | Tyr | Gin | Asn | Trp | Val | Lys | Lys | Asn | Gly | Ala | Glu | Gin |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Thr | Leu | Pro | Thr | Leu | Gly | Leu | Thr | Asn | Asn | Gin | Leu | Phe | Phe | Leu | Ser |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Phe | Ala | Gin | Val | Trp | Cys | Ser | Val | Arg | Thr | Pro | Glu | Ser | Ser | His | Glu |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Gly | Leu | Ile | Thr | Asp | Pro | His | Ser | Pro | Ser | Arg | Phe | Arg | Val | Ile | Gly |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Ser | Ile | Ser | Asn | Ser | Lys | Glu | Phe | Ser | Glu | His | Phe | His | Cys | Pro | Pro |
165 | 170 | 175 |
Gly Ser Pro Met Asn Pro His His Lys Cys Glu Val Trp 180 185 · (2) Informace o SEQ ID NO: 15:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 27 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (iii) Hypotetická: ano (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 15: GAGAGAGAGT cgacggtacc nnnnnnn
2) Informace o SEQ ID NO: 16:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 21 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:
CGGCCCTGGT GGAAGAACTC G (2) Informace o SEQ ID NO: 17:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 21 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (iii) Antisense: ano (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 17: TGC<?GÁČGGA acaccagacc t (2) Informace o SEQ ID NO: 18:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 1703 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (i i) Typ molekuly: cDNS k mRNS (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (B) Buněčná linie: buněčná linie endothelu fetálního hovězího srdce (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 2..1703 (xi)
Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:
T GGC CAC TCG CGC TGG GGG ACC TTC AGC AAC CTC TGG GAA CAC AAC 46
Gly His Ser Arg Trp Gly Thr Phe Ser Asn Leu Trp Glu His Asn
5 10 15
CAA GCC ATC ATC AAG CAC | CTC CTT GAA AAC TCC ACG GCC AGC | GTG Val 30 | AGC Ser | 94 ( | ||||||||||||
Gin Ala | Ile | Ile Lys 20 | His | Leu | Leu Glu | Asn 25 | Ser | Thr | Ala | Ser | ||||||
GAG | GCA | GAG | AGG | AAG | GAC | CAG | GAG | TAC | TAC | CGA | GCC | TGC | ATG | AAC | GAA | 142 |
Glu | Ala | Glu | Arg | Lys | Asp | Gin | Glu | Tyr | Tyr | Arg | Ala | Cys | Met | Asn | Glu | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
ACC | AGG | ATT | GAG | GAG | CTC | AAG | GCC | AAA | CCC | GTG | ATG | GAG | CTC | ATT | GAG | 190 |
Thr | Arg | Ile | Glu | Glu | Leu | Lys | Ala | Lys | Pro | Leu | Met | Glu | Leu | Ile | Glu | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
AAG | CTC | GGC | GGC | TGG | AAC | ATC | ACG | GGG | CCC | TGG | GAC | AAG | GAC | AAC | TTC | 238 |
Lys | Leu | Gly | Gly | Trp | Asn | Ile | Thr | Gly | Pro | Trp | Asp | Lys | Asp | Asn | Phe | |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
CAG | GAC | ACC | CTG | CAG. | GTG | GTC | ACA | TCC | CAC | TAC | CAC | ACC | TCC | CCC | TTC | 286 |
Gin | Asp | Thr | Leu | Gin | Val | Val | Thr | Ser | His | Tyr | His | Thr | Ser | Pro | Phe | |
80 | 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
TTC | TCC | GTC | TAC | GTC | AGT | GCC | GAC | TCC | AAG | AAT | TCC | AAC | AGC | AAC | GTG | 334 |
Phe | Ser | Val | Tyr | Val | Ser | Ala | Asp | Ser | Lys | Asn | Ser | Asn | Ser | Asn | val | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
ATC | CAA | GTG | GAC | CAG | TCT | GGC | CTG | GGC | TTA | CCC | TCA | AGA | GAT | TAT | TAC | 382 |
Ile | Gin | Val | Asp | Gin | Ser | Gly | Leu | Gly | Leu | Pro | Ser | Arg | Asp | Tyr | Tyr | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
CTG | AAC | AAA | ACC | GAG | AAT | GAG | AAG | GTG | CTG | ACG | GGA | TAC | CTG | AAC | TAC | 430 |
Leu | Asn | Lys | Thr | Glu | Asn | Glu | Lys | Val | Leu | Thr | Gly | iyr | Leu | Asn | Tyr | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
ATG | GTC | CAG | CTG | GGG | AAG | CTG | CTG | GGA | GGA | GGG | GCC | GAG | GAC | ACC | ATC | 478 |
Met | Val | Gin | Leu | Gly | Lys | Leu | Leu | Gly | Gly | Gly | Ala | Glu | Asp | Thr | Ile |
145 150 155
> | CGG CCC CAG Arg Pro Gin 160 | ATG CAG | CAG ATC CTG GAC TTT GAG ACG | GCG CTG | GCC AAC Ala Asn 175 | 526 | |||||||||||
Met | Gin | Gin 165 | Ile | Leu Asp | Phe | Glu 170 | Thr | Ala | Leu | ||||||||
ATC | ACC | ATC | CCC | CAG | GAG | AAG | CGC | CGG | GAC | GAG | GAA | CTC | ATC | TAC | CAC | 574 | |
Ile | Thr | Ile | Pro | Gin | Glu | Lys | Arg | Arg | Asp | Glu | Glu | Leu | Ile | Tyr | His | ||
180 | 185 | 190 | |||||||||||||||
AAA | GTG | ACG | GCG | GCT | GAG | TTG | CAG | ACC | TTG | GCG | CCC | GCC | ATC | AAC | TGG | 622 | |
Lys | Val | Thr | Ala | Ala | Glu | Leu | Gin | Thr | Leu | Ala | Pro | Ala | Ile | Asn | Trp | ||
195 | 200 | 205 | |||||||||||||||
CTG | CCC | TTC | CTC | AAC | ACC | ATC | TTC | TAC | CCC | GTG | GAG | ATC | AAT | GAA | TCA | 670 | |
Leu | Pro | p.ie | Leu | Asn | Thr | Ile | Phe | Tyr | Pro | Val | Glu | Ile | Asn | Glu | Ser | ||
210 | 215 | 220 | |||||||||||||||
v | GAG | CCT | ATT | GTC | ATC | TAC | GAC | AAA | GAA | TAC | CTG | AGC | AAG | GTC | TCC | ACC | 718 |
Glu | Pro | Ile | Val | Ile | Tyr | Asp | Lys | Glu | Tyr | Leu | Ser | Lys | Val | Ser | Thr | ||
225 | 230 | 235 | |||||||||||||||
CTC | ATC | AAC | AGC | ACA | GAC | AAA | TGC | CTG | CTG | AAC | AAC | TAC | ATG | ATC | TGG | 766 | |
Leu | Ile | Asn | Ser | Thr | Asp | Lys | Cys | Leu | Leu | Asn | Asn | Tyr | Met | Ile | Trp | ||
240 | 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
AAC | CTG | GTA | CGG | AAG | ACG | AGC | TCC | TTC | CTC | GAT | CAG | CGC | TTC | CAG | GAC | 814 | |
Asn | Leu | Val | Arg | Lys | Thr | Ser | Ser | Phe | Leu | Asp | Gin | Arg | Phe | Gin | Asp | ||
260 | 265 | 270 | |||||||||||||||
GCC | GAC | GAG | AAG | TTC | ATG | GAA | GTC | ATG | TAT | GGG | ACC | AAG | AAG | ACG | TGT | 862 | |
Ala | Asp | Glu | Lys | Phe | Met | Glu | Val | Met | Tyr | Gly | Thr | Lys | Lys | Thr | Cys | ||
275 | 280 | 285 | |||||||||||||||
CTT | CCC | CGC | TGG | AAG | TTT | TGT | GTG | AGT | GAT | ACA | GAG | AAC | ACC | TTG | GGC | 910 | |
Leu | Pro | Arg | Trp | Lys | Phe | Cys | Val | Ser | Asp | Thr | Glu | Asn | Thr | Leu | Gly | ||
290 | 295 | 300 | |||||||||||||||
TTC | GCC | CTG | GGC | CCC | ATG | TTC | GTC | AAA | GCG | ACC | TTC | GCT | GAG | GAC | AGC | 958 | |
Phe | Ala | Leu | Gly | Pro | Met | Phe | Val | Lys | Ala | Thr | Phe | Ala | Glu | Asp | Ser | ||
w | 305 | 310 | 315 | ||||||||||||||
AAG | AAC | ATA | GCC | AGC | GAG | ATC | ATC | CTG | GAG | ATC | AAG | AAG | GCG | TTT | GAA | 1006 | |
, | Lys | Asn | Ile | Ala | Ser | Glu | Ile | Ile | Leu | Glu | Ile | Lys | Lys | Ala | Phe | Glu | |
320 | 325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
GAG | AGC | CTG | AGC | ACC | CTG | AAG | TGG | ATG | GAT | GAA | GAT | ACT | CGG | AAA | TCG | 1054 | |
Glu | Ser | Leu | Ser | Thr | Leu | Lys | Trp | Met | Asp | Glu | Asp | Thr | Arg | Lys | Ser | ||
340 | 345 | 350 | |||||||||||||||
GCC | AAG | GAA | AAG | GCG | GAC | GCG | ATC | TAC | AAC | ATG | ATA | GGC | TAC | CCC | AAC | 1102 | |
Ala | Lys | Glu | Lys | Ala | Asp | Ala | Ile | Tyr | Asn | Met | Ile | Gly | Tyr | Pro | Asn |
355 360 365
τττ Phe | ATC ATG GAC | CCC Pro | AAG GAG CTG GAC AAA GTG TTC AAT GAC TAC ACC | 1150 | ||||||||||||
Ile Met 370 | Asp | Lys | Glu | Leu 375 | Asp Lys Val | Phe | Asn 380 | Asp | Tyr | Thr | ||||||
GCT | GTG | CCA | GAC | CTC | TAC | TTC | GAG | AAC | GCC | ATG | CGG | TTT | TTC | AAC | TTC | 119£ |
Ala | Val | Pro | Asp | Leu | Tyr | Phe | Glu | Asn | Ala | Met | Arg | Phe | Phe | Asn | Phe | |
385 | 390 | 395 | ||||||||||||||
TCC | TGG | AGG | GTC | ACT | GCC | GAC | CAG | CTC | CGG | AAA | GCG | CCC | AAC | AGA | GAT | 1246 |
Ser | Trp | Arg | Val | Thr | Ala | Asp | Gin | Leu | Arg | Lys | Ala | Pro | Asn | Arg | Asp | |
400 | 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
CAG | TGG | AGC | ATG | ACC | CCG | CCC | ATG | GTG | AAC | GCC | TAC | TAC | TCG | CCC | ACC | 1294 |
Gin | Trp | Ser | Met | Thr | Pro | Pro | Met | Val | Asn | Ala | Tyr | Tyr | Ser | Pro | Thr | |
420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
AAG | AAC | GAG | ATC | GTG | TTT | CCG | GCC | GGA | ATC | CTG | CAG | GCG | CCA | TTC | TAC | 1342 |
Lys | Asn | Glu | Ile | Val | Phe | Pro | Ala | Gly | Ile | Leu | Gin | Ala | Pro | Phe | Tyr | |
435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
ACC | CGC | TCT | TCA | CCC | AAT | GCC | TTA | AAC | TTC | GGC | GGC | ATC | GGC | GTC | GTC | . 139C |
Thr | Arg | Ser | Ser | Pro | Asn | Ala | Leu | Asn | Phe | Gly | Gly | Ile | Gly | Val | Val | |
450 | 455 | 460 | ||||||||||||||
GTG | GGC | CAC | GAG | CTG | ACT | CAT | GCT | TTT | GAT | GAT | CAA | GGC | CGA | GAG | TAC | 143Ě |
Val | Gly | His | Glu | Leu | Thr | His | Ala | Phe | Asp | Asp | Gin | Gly | Arg | Glu | Tyr | |
465 | 470 | 475 | ||||||||||||||
GAC | AAG | GAT | GGG | AAC | CTC | CGG | CCC | TGG | TGG | AAG | AAC | TCG | TCC | GTG | GAG | 1486 |
Asp | Lys | Asp | Gly | Asn | Leu | Arg | Pro | Trp | Trp | Lys | Asn | Ser | Ser | Val | Glu | |
480 | 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
GCG | TTC | AAG | CAG | CAG | ACC | GCG | TGC | ATG | GTG | GAG | CAG | TAC | GGC | AAC | TAT | 1534 |
Ala | Phe | Lys | Gin | Gin | Thr | Ala | Cys | Met | Val | Glu | Gin | Tyr | Gly | Asn | Tyr | |
500 | 505 | 510 | ||||||||||||||
AGC | GTG | AAC | GGG | GAG | CCG | GTG | AAC | GGC | CGG | CAC | ACC | CTC | GGC | GAA | AAC | 158? |
Ser | Val | Asn | Gly | Glu | Pro | Val | Asn | Gly | Arg | His | Thr | Leu | Gly | Glu | Asn | |
515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
ATC | GCC | GAC | AAC | GGG | GGC | CTC | AAG | GCG | GCC | TAT | CGG | GCC | TAC | CAG | AAC | 1631 |
Ile | Ala | Asp | Asn | Gly | Gly | Leu | Lys | Ala | Ala | Tyr | Arg | Ala | Tyr | Gin | Asn | |
530 | 535 | 540 | ||||||||||||||
TGG | GTC | AAG | AAG | AAT | GGG | GCT | GAG | CAG | ACA | CTG | CCC | ACC | CTG | GGT | CTC | 167 |
Trp | Val | Lys | Lys | Asn | Gly | Ala | Glu | Gin | Thr | Leu | Pro | Thr | Leu | Gly | Leu | |
545 | 550 | 555 | ||||||||||||||
ACC | AAC | AAC | CAG | CTC | TTC | TTC | CTG | A | 170 | |||||||
Thr | Asn | Asn | Gin | Leu | Phe | Phe | Leu | |||||||||
560 | 565 |
(2) Informace o SEQ ID NO: 19:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 567 párů bází (B) Typ: aminokyselina (C) Eetězec: jeden (D) Topologie: lineární
(ii) Typ molekuly: protein | |||||
(xi): Popi: | 3 sekvence: | SEQ | ID NO: | 19: | |
Gly His 1 | Ser Arg Trp 5 | Gly Thr Phe | Ser | Asn Leu 10 | Trp Glu His Asn Gin 15 |
Ala Ile | Ile Lys His 20 | Leu Leu Glu | Asn 25 | Ser Thr | Ala Ser Val Ser Glu 30 |
Ala Glu | Arg Lys Asp 35 | Gin Glu Tyr 40 | Tyr | Arg Ala | Cys Met Asn Glu Thr 45 |
Arg Ile 50 | Glu Glu Leu | Lys Ala Lys 55 | Pro | Leu Met | Glu Leu Ile Glu Lys 60 |
Leu Gly 65 | Gly Trp Asn | Ile Thr Gly 70 | Pro | Trp Asp 75 | Lys Asp Asn Phe Gin 80 |
Asp Thr | Leu Gin Val 85 | Val Thr Ser | His | Tyr His 90 | Thr Ser Pro Phe Phe 95 |
Ser Val | Tyr Val Ser 100 | Ala Asp Ser | Lys *105 | Asn Ser | Asn Ser Asn Val Ile 110 |
Gin Val | Asp Gin Ser 115 | Gly Leu Gly 120 | Leu | Pro Ser | Arg Asp Tyr Tyr Leu 125 |
Asn Lys 130 | Thr Glu Asn | Glu Lys Val 135 | Leu | Thr Gly | Tyr Leu Asn Tyr Met 140 |
Val Gin 145 | Leu Gly Lys | Leu Leu Gly 150 | Gly | Gly Ala 155 | Glu Asp Thr Ile Arg 160 |
Pro Gin | Met Gin Gin 165 | Ile Leu Asp | Phe | Glu Thr 170 | Ala Leu Ala Asn Ile 175 |
Thr Ile | Pro Gin Glu 180 | Lys Arg Arg | Asp 185 | Glu Glu | Leu Ile Tyr His Lys 190 |
Val Thr | Ala Ala Glu 195 | Leu Gin Thr 200 | Leu | Ala Pro | Ala Ile Asn Trp Leu 205 |
Pro Phe 210 | Leu Asn Thr | Ile Phe Tyr 215 | Pro | Val Glu | Ile Asn Glu Ser Glu 220 |
Pro 225 | Ile | Val | Ile | Tyr | Asp 230 | Lys | Glu | Tyr | Leu | Ser 235 | Lys | val | ser | Thr | Leu 240 |
Ile | Asn | Ser | Thr | Asp 245 | Lys | Cys | Leu | Leu | Asn 250 | Asn | Tyr | Met | Ile | Trp 255 | Asn |
Leu | Val | Arg | Lys 260 | Thr | Ser | Ser | Phe | Leu 265 | Asp | Gin | Arg | Phe | Gin 270 | Asp | Ala |
Asp | Glu | Lys 275 | Phe | Met | Glu | Val | Met 280 | Tyr | Gly | Thr | Lys | Lys 285 | Thr | Cys | Leu |
Pro | Arg 290 | Trp | Lys | Phe | Cys | Val 295 | Ser | Asp | Thr | Glu | Asn 300 | Thr | Leu | Gly | Phe |
Ala 305 | Leu | Gly | Pro | Met | Phe 310 | Val | Lys | Ala | Thr | Phe 315 | Ala | Glu | Asp | Ser | Lys 320 |
Asn | íle | Ala | Ser | Glu 325 | Ile | Ile | Leu | Glu | Ile 330 | Lys | Lys | Ala | Phe | Glu 335 | Glu |
Ser | Leu | Ser | Thr 340 | Leu | Lys | Trp | Met | Asp 345 | Glu | Asp | Thr | Arg | Lys 350 | Ser | Ala |
Lys | Glu | Lys 355 | Ala | Asp | Ala | Ile | iyr 360 | Asn | Met | Ile | Gly | Tyr 365 | Pro | Asn | Phe |
Ile | Met 370 | Asp | Pro | Lys | Glu | Leu 375 | Asp | Lys | Val | Phe | Asn 380 | Asp | Tyr | Thr | Ala |
val 385 | Pro | Asp | Leu | Tyr | Phe 390 | Glu | Asn | Ala | Mét | Arg 395 | Phe | Phe | Asn | Phe | Ser 400 |
Trp | Arg | Val | Thr | Ala 405 | Asp | Gin | Leu | Arg | Lys 410 | Ala | Pro | Asn | Arg | Asp 415 | Gin |
Trp | Ser | Met | Thr 420 | Pro | Pro | Met | Val | Asn 425 | Ala | Tyr | Tyr | Ser | Pro 430 | Thr | Lys |
Asn | Glu | Ile | Val | Phe | Pro | Ala | Gly | Ile | Leu | Gin | Ala | Pro | Phe | Tyr | Thr |
435 440 445
Arg Ser 450 | Ser | Pro Asn | Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val | ||||||||||||
455 | 460 | ||||||||||||||
Gly | His | Glu | Leu | Thr | His | Ala | Phe | Asp | Asp | Gin | Gly | Arg | Glu | Tyr | Asp |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Lys | Asp | Gly | Asn | Leu | Arg | Pro | Trp | Trp | Lys | Asn | Ser | Ser | Val | Glu | Ala |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Phe | Lys | Gin | Gin | Thr | Ala | Cys | Met | Val | Glu | Gin | Tyr | Gly | Asn | Tyr | Ser |
500 | 505 | 510 |
Val | Asn | Gly 515 | Glu | Pro | Val | Asn | Gly 520 | Arg' | His | Thr | Leu | Gly 525 | Glu | Asn | Ile |
Ala | Asp 530 | Asn | Gly | Gly | Leu | Lys 535 | Ala | Ala | Tyr | Arg | Ala 540 | Tyr | Gin | Asn | Trp |
Val 545 | Lys | Lys | Asn | Gly | Ala 550 | Glu | Gin | Thr | Leu | Pro 555 | Thr | Leu | Gly | Leu | Thr 560 |
Asn | Asn | Gin | Leu | Phe | Phe | Leu |
565 (2) Informace o SEQ ID NO: 20:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 23 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (i i i)Ant isense: ano (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 20: GCCAGCGCCG TCTCAAAGTC CAG (2) Informace o SEQ ID NO: 21:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 22 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (i i i) Ani; i sense : ne (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:
TGGGGGACCT TCAGCAACCT CT 22 (2) Informace o SEQ ID NO: 22:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 2129 párů bází (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (i i) Typ molekuly: cDNS k mRNS (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (B) Buněčná linie: buněčná linie endothelu fetálního hovězího srdce (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 3..2126 (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:
GG ACC CCG GTG GAG AAG CGG CTG GTG GTG CTG GTG GCG CTC CTG GCG Thr Pro Val Glu Lys Arg Leu Val Val Leu Val Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15
GCG GCA TTG GTG GCC TGT TTG GCA GTA | CTG GGC Leu Gly 25 | ATC CAA TAC CAG ACA | |||||||||||||
Ala | Ala | Leu | Val | Ala Cys Leu 20 | Ala | Val | Ile | Gin Tyr | Gin 30 | Thr | |||||
AGA | ACG | CCC | TCG | GTG | TGC | CTA | AGT | GAG | GCC | TGC | ATC | TCG | GTG | ACC | AGC |
Arg | Thr | Pro | Ser | Val | Cys | Leu | Ser | Glu | Ala | Cys | Ile | Ser | Val | Thr | Ser |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
TCC | ATC | TTG | AGT | TCC | ATG | GAC | CCC | ACG | GTG | GAC | CCC | TGC | CAG | GAC | TTC |
Ser | Ile | Leu | Ser | Ser | Met | Asp | Pro | Thr | Val | Asp | Pro | Cys | Gin | Asp | Phe |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
TTC. | ACC | TAT | GCC | TGT | GGC | GGC | TGG | ATC | AAA | GCC | AAC | CCC | GTG | CCG | GAT |
Phe | Thr | Tyr | Ala | Cys | Gly | Gly | Trp | Ile | Lys | Ala | Asn | Pro | Val | Pro | Asp |
65 | 70 | 75 | |||||||||||||
GGC | CAC | TCG | CGC | TGG | GGG | ACC | TTC | AGC | AAC | CTC | TGG | GAA | CAC | AAC | CAA |
Gly | His | Ser | Arg | Trp | Gly | Thr | Phe | Ser | Asn | Leu | Trp | Glu | His | Asn | Gin |
80 | 85 | 90 | 95 | ||||||||||||
GCC | ATC | ATC | AAG | CAC | CTC | CTT | GAA | AAC | TCC | ACG | GCC | AGC | GTG | AGC | GAG |
Ala | Ile | Ile | Lys | His | Leu | Leu | Glu | Asn | Ser | Thr | Ala | Ser | Val | Ser | Glu |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
GCA | GAG | AGG | AAG | GAC | CAG | GAG | TAC | TAC | CGA | GCC | TGC | ATG | AAC | GAA | ACC |
Ala | Glu | Arg | Lys | Asp | Gin | Glu | Tyr | Tyr | Arg | Ala | Cys | Met | Asn | Glu | Thr |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
AGG | ATT | GAG | GAG | CTC | AAG | GCC | AAA | CCC | CTG | ATG | GAG | CTC | ATT | GAG | AAG |
Arg | Ile | Glu | Glu | Leu | Lys | Ala | Lys | Pro | Leu | Met | Glu | Leu | Ile | Glu | Lys |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
CTC | GGC | GGC | TGG | AAC | ATC | ACG | GGG | CCC | TGG | GAC | AAG | GAC | AAC | TTC | CAG |
Leu | Gly | Gly | Trp | Asn | Ile | Thr | Gly | Pro | Trp | Asp | Lys | Asp | Asn | Phe | Gin |
145 | 150 | 155 | > | ||||||||||||
GAC | ACC | CTG | CAG | GTG | GTC | ACA | TCC | CAC | TAC | CAC | ACC | TCC | CCC | TTC | TTC |
Asp | Thr | Leu | Gin | Val | Val | Thr | Ser | His | Tyr | His | Thr | Ser | Pro | Phe | Phe |
160 | 165 | 170 | 17:5 |
143f
191
239
287
335
383
431
479
527
TCC GTC TAC GTC | AGT GCC GAC TCC | AAG AAT TCC AAC | AGC AAC GTG Ser Asn Val 190 | ATC lle · | 575 | |||||||||||
Ser Val | Tyr | Val' | 'Ser Ala Asp 180 | Ser | Lys Asn 185 | Ser | Asn | |||||||||
CAA | GTG | GAC | CAG | TCT | GGC | CTG | GGC | TTA | CCC | TCA | AGA | GAT | TAT | TAC | CTG | 623 |
Gin | Val | Asp | Gin | Ser | Gly | Leu | Gly | Leu | Pro | Ser | Arg | Asp | Tyr | Tyr | Leu | |
195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
AAC | AAA | ACC | GAG | AAT | GAG | AAG | GTG | CTG | ACG | GGA | TAC | CTG | AAC | TAC | ATG | 671 |
Asn | Lys | Thr | Glu | Asn | Glu | Lys | Val | Leu | Thr | Gly | Tyr | Leu | Asn | Tyr | Met | |
210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
GTC | CAG | CTG | GGG | AAG | CTG | CTG | GGA | GGA | GGG | GCC | GAG | GAC | ACC | ATC | CGG | 719 |
Val | Gin | Leu | Gly | Lys | Leu | Leu | Gly | Gly | Gly | Ala | Glu | Asp | Thr | lle | Arg | |
225 | 230 | 235 | ||||||||||||||
CCC | CAG | ATG | CAG | CAG | ATC | CTG | GAC | TTT | GAG | ACG | GCG | CTG | GCC | AAC | ATC | 767 |
Pro | Gin | Met | Gin | Gin | lle | Leu | Asp | Phe | Glu | Thr | Ala | Leu | Ala | Asn | lle | |
240 | 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
ACC | ATC | CCC | CAG | GAG | AAG | CGC | CGG | GAC | GAG | GAA | CTC | ATC | TAC | CAC | AAA | 815 |
Thr | lle | Pro | Gin | Glu | Lys | Arg | Arg | Asp | Glu | Glu | Leu | lle | Tyr | His | Lys | |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
GTG | ACG | GCG | GCT | GAG | TTG | CAG | ACC | TTG | GCG | CCC | GCC | ATC | AAC | TGG | CTG | 863 |
Val | Thr | Ala | Ala | Glu | Leu | Gin | Thr | Leu | Ala | Pro | Ala | lle | Asn | Trp | Leu | |
275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
CCC | TTC | CTC | AAC | ACC | ATC | TTC | TAC | CCC | GTG | GAG | ATC | AAT | GAA | TCA | GAG | ,911 |
Pro | Phe | Leu | Asn | Thr | lle | Phe | Tyr | Pro | Val | Glu | lle | Asn | Glu | Ser | Glu | |
290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
CCT | ATT | GTC | ATC | TAC· | GAC | AAA | GAA | TAC | CTG | AGC | AAG | GTC | TCC | ACC | CTC | 959 |
Pro | lle | Val | lle | Tyr | Asp | Lys | Glu | Tyr | Leu | Ser | Lys | Val | Ser | Thr | Leu | |
305 | 310 | 315 | ||||||||||||||
ATC | AAC | AGC | ACA | GAC | AAA | TGC | CTG | CTG | AAC | AAC | TAC | ATG | ATC | TGG | AAC | 1007 |
lle | Asn | Ser | Thr | Asp | Lys | Cys | Leu | Leu | Asn | Asn | Tyr | Met | lle | Trp | Asn | |
320 | 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
CTG | GTA | CGG | AAG | ACG | AGC | TCC | TTC | CTC | GAT | CAG | CGC | TTC | CAG | GAC | GCC | 1055 |
Leu | Val | Arg | Lys | Thr | Ser | Ser | Phe | Leu | Asp | Gin | Arg | Phe | Gin | Asp | Ala | |
340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
GAC- | GAG | AAG | TTC | ATG | GAA | GTC | ATG | TAT | GGG | ACC | AAG | AAG | ACG | TGT | CTT | 1103 |
Asp | Glu | Lys | Phe | Met | Glu | Val | Met | Tyr | Gly | Thr | Lys | Lys | Thr | Cys | Leu | |
355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
CCC | CGC | TGG | AAG | TTT | TGT | GTG | AGT | GAT | ACA | GAG | AAC | ACC | TTG | GGC | TTC | 1151 |
Pro | Arg | Trp | Lys | 'Phe | Cys | Val | Ser | Asp | Thr | Glu | Asn | Thr | Leu | Gly | Phe · |
370 375 380
GCC CTG Ala Leu | GGC Gly | CCC Pro | ATG Met | TTC Phe | GTC AAA GCG ACC TTC GCT GAG | GAC Asp | AGC Ser | AAG Lys | 1 | |||||||
Val 390 | Lys | Ala Thr | Phe | Ala 395 | Glu | |||||||||||
385 | ||||||||||||||||
AAC | ATA | GCC | AGC | GAG | ATC | ATC | CTG | GAG | ATC | AAG | AAG | GCG | TTT | GAA | GAG | i; |
Asn | Ile | Ala | Ser | Glu | Ile | Ile | Leu | Glu | Ile | Lys | Lys | Ala | Phe | Glu | Glu | |
400 | 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
AGC | CTG | AGC | ACC | CTG | AAG | TGG | ATG | GAT | GAA | GAT | ACT | CGG | AAA | TCG | GCC | i; |
Ser | Leu | Ser | Thr | Leu | Lys | Trp | Met | Asp | Glu | Asp | Thr | Arg | Lys | Ser | Ala | |
420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
AAG | GAA | AAG | GCG | GAC | GCG | ATC | TAC | AAC | ATG | ATA | GGC | TAC | CCC | AAC | TTT | 12 |
Lys | Glu | Lys | Ala | Asp | Ala | Ile | Tyr | Asn | Met | Ile | Gly | Tyr | Pro | Asn | Phe | |
435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
ATC | ATG | GAC | CCC | AAG | GAG | CTG | GAC | AAA | GTG | TTC | AAT | GAC | TAC | ACC | GCT | 13 |
Ile | Met | Asp | Pro | Lys | Glu | Leu | Asp | Lys | Val | Phe | Asn | Asp | Tyr | Thr | Ala | |
450 | 455 | 460 | ||||||||||||||
GTG | CCA | GAC | CTC | TAC | TTC | GAG | AAC | GCC | ATG | CGG | TTT | TTC | AAC | TTC | TCC | 14 |
Val | Pro | Asp | Leu | Tyr | Phe | Glu | Asn | Ala | Met | Arg | Phe | Phe | Asn | Phe | Ser | |
465 | 470 | 475 | ||||||||||||||
TGG | AGG | GTC | ACT | GCC | GAC | CAG | CTC | CGG | AAA | GCG | CCC | AAC | AGA | GAT | CAG | 14 |
Trp | Arg | Val | Thr | Ala | Asp | Gin | Leu | Arg | Lys | Ala | Pro | Asn | Arg | Asp | Gin | |
480 | 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
TGG | AGC | ATG | ACC | CCG | CCC | ATG | GTG | AAC | GCC | TAC | TAC | TCG | CCC | ACC | AAG | 15 |
Trp | Ser | Met | Thr | Pro | Pro | Met | Val | Asn | Ala | Tyr | Tyr | Ser | Pro | Thr | Lys | |
500 | 505 | 510 | ||||||||||||||
AAC | GAG | ATC | GTG | TTT | CCG | GCC | GGA | ATC | CTG | CAG | GCG | CCA | TTC | TAC | ACC | 15 |
Asn | Glu | Ile | Val | Phe | Pro | Ala | Gly | Ile | Leu | Gin | Ala | Pro | Phe | Tyr | Thr | |
515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
CGC | TCT | TCA | CCC | AAT | GCC | TTA | AAC | TTC | GGC | GGC | ATC | GGC | GTC | GTC | GTG | 16 |
Arg | Ser | Ser | Pro | Asn | Ala | Leu | Asn | Phe | Gly | Gly | Ile | Gly | Val | Val | Val |
530 535 540
GGC | CAC | GAG | CTG | ACT | CAT | GCT | TTT | GAT | GAT | CAA | GGC | CGA | GAG | TAC | GAC |
Gly | His 545 | Glu | Leu | Thr | His | Ala 550 | Phe | Asp | Asp | Gin | Gly 555 | Arg | Glu | Tyr | Asp |
AAG | GAT | GGG | .AAC | CTC | CGG | CCC | TGG | TGG | AAG | AAC | TCG | TCC | GTG | GAG | GCG |
Lys 560 | Asp | Gly | Asn | Leu | Arg 565 | Pro | Trp | Trp | Lys | Asn 570 | Ser | Ser | Val | Glu | • Ala '575 |
TTC | AAG | CAG | CAG | ACC | GCG | TGC | ATG | GTG | GAG | CAG | TAC | GGC | AAC | TAT | AGC |
Phe | Lys | Gin | Gin | Thr 580 | Ala | Cys | Met | Val | Glu 585 | Gin | Tyr | Gly | Asn | Tyr 590 | Ser |
BHŠBW í>3
GTG AAC | GGG GAG CCG | GTG Val | AAC Asn | GGC CGG | CAC ACC CTC GGC GAA AAC ATC | 1823 | ||||||||||
val | Asn | Gly Glu 595 | Pro | Gly | Arg 600 | His | Thr | Leu | Gly | Glu 605 | Asn | Ile | ||||
GCC | GAC | AAC | GGG | GGC | CTC | AAG | GCG | GCC | TAT | CGG | GCC | TAC | CAG | AAC | TGG | 1871 |
Ala | Asp | Asn | Gly | Gly | Leu | Lys | Ala | Ala | Tyr | Arg | Ala | Tyr | Gin | Asn | -Trp | |
610 | 615 | 620 | ||||||||||||||
GTC | AAG | AAG | AAT | GGG | GCT | GAG | CAG | ACA | CTG | CCC | ACC | CTG | GGT | CTC | ACC | 1919 |
Val | Lys | Lys | Asn | Gly | Ala | Glu | Gin | Thr | Leu | Pro | Thr | Leu | Gly | Leu | Thr | |
625 | 630 | 635 | ||||||||||||||
AAC | AAC | CAG | CTC | TTC | TTC | GTG | AGT | TTT | GCA | CAG | GTC | TGG | TGT | TCC | GTC | 1967 |
Asn | Asn | Gin | Leu | Phe | Phe | Leu | Ser | Phe | Ala | Gin | Val | Trp | Cys | Ser | Val | |
640 | 645 | 650 | 655 | |||||||||||||
CGC | ACC | CCC | GAG | AGT | TCG | CAC | GAA | GGT | CTC | ATC | ACC | GAT | CCC | CAC | AGC | 2015 |
'Arg | Thr | Pro | Glu | Ser | Ser | His | Glu | Gly | Leu | Ile | Thr | Asp | Pro | His | Ser | |
660 | 665 | 670 | ||||||||||||||
CCC | TCC | CGC | TTC | CGG | GTC | ATC | GGC | TCC | ATC | TCC | AAC | TCC | AAG | GAG | TTC | 2063 |
Pro | Ser | Arg | Phe | Arg | Val | Ile | Gly | Ser | Ile | Ser | Asn | Ser | Lys | Glu | Phe | |
675 | 680 | 685 | ||||||||||||||
TCG | GAA | CAC | TTC | CAC | TGC. | CCG | CCC | GGC | TCA | CCC | ATG | AAC | CCG | CAT | CAC | 2111 |
Ser | Glu | His | Phe | His | Cys | Pro | Pro | Gly | Ser | Pro | Met | Asn | Pro | His | His | |
690 | 695 | 700 | ||||||||||||||
AAG | TGT | GAA | GTC | TGG | TGA | 2129 | ||||||||||
Lys | Cys | Glu | Val | Trp |
(2) Informace ο SEQ ID NO: 23:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 708 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:
Thr Pro Val Glu Lys Arg Leu Val Val Leu val Ala Leu Leu Ala Ala ! 5 1θ 15
Ala Leu Val Ala Cys Leu Ala Val Leu Gly Ile Gin Tyr Gin Thr Arg
25 30
Thr Pro Ser Val Cys Leu Ser Glu Ala Cys Ile Ser Val Thr Ser Ser
Ile | Leu 50 | Ser Ser Met Asp Pro Thr Val Asp Pro Cys Gin Asp | Phe | Phe | |||||||||||
55 | 60 | ||||||||||||||
Thr | Tyr | Ala | Cys | Gly | Gly | Trp | Ile | Lys | Ala | Asn | Pro | Val | Pro | Asp | Gly |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
His | Ser | Arg | Trp | Gly | Thr | Phe | Ser | Asn | Leu | Trp | Glu | His | Asn | Gin | Ala |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ile | Ile | Lys | His | Leu | Leu | Glu | Asn | Ser | Thr | Ala | Ser | Val | Ser | Glu | Ala |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Glu | Arg | Lys | Asp | Gin | Glu | Tyr | Tyr | Arg | Ala | Cys | Met | Asn | Glu | Thr | Arg |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Ile | Glu | Glu | Leu | Lys | Ala | Lys | Pro | Leu | Met | Glu | Leu | Ile | Glu | Lys | Leu |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Gly | Gly | Trp | Asn | Ile | Thr | Gly | Pro | Trp | Asp | Lys | Asp | Asn | Phe | Gin | Asp |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Thr | Leu | Gin | Val | Val | Thr | Ser | His | Tyr | His | Thr | Ser | Pro | Phe | Phe | Ser |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Val | Tyr | Val | Ser | Ala | Asp | Ser | Lys | Asn | Ser | Asn | Ser | Asn | Val | Ile | Gin |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Val | Asp | Gin | Ser | Gly | Leu | Gly | Leu | Pro | Ser | Arg | Asp | Tyr | Tyr | Leu | Asn |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Lys | Thr | Glu | Asn | Glu | Lys | Val | Leu | Thr | Gly | Tyr | Leu | Asn | Tyr | Met | Val |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Gin | Leu | Gly | Lys | Leu· | Leu | Gly | Gly | Gly | Ala | Glu | Asp | Thr | Ile | Arg | Pro |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Gin | Met | Gin | Gin | Ile | Leu | Asp | Phe | Glu | Thr | Ala | Leu | Ala | Asn | Ile | Thr |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Ile | Pro | Gin | Glu | Lys | Arg | Arg | Asp | Glu | Glu | Leu | Ile | Tyr | His | Lys | Val |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Thr | Ala | Ala | Glu | Leu | Gin | Thr | Leu | Ala | Pro | Ala | Ile | Asn | Trp | Leu | Pro |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Phe | Leu | Asn | Thr | Ile | Phe | Tyr | Pro | Val | Glu | Ile | Asn | Glu | Ser | Glu | Pro |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Ile | Val | Ile | Tyr | Asp | Lys | Glu | Tyr | Leu | Ser | Lys | Val | Ser | Thr | Leu | Ile |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Asn | Ser | Thr | Asp | Lys | Cys | Leu | Leu | Asn | Asn | Tyr | Met | Ile | Trp | Asn | Leu |
325 | 330 | 335 |
8BB
Val | Arg | Lys | Thr 340 | Ser | Ser | Phe | Leu | Asp 345 | Gin | Arg | Phe | Gin | Asp 350 | Ala | Asp |
Glu | Lys | Phe 355 | Met | Glu | Val | Met | Tyr 360 | Gly | Thr | Lys | Lys | Thr 365 | Cys | Leu | Pro |
Arg | Trp 370 | Lys | Phe | Cys | Val | Ser 375 | Asp | Thr | Glu | Asn | Thr 380 | Leu | Gly | Phe | Ala |
Leu 385 | Gly | Pro | Met | Phe | Val 390 | Lys | Ala | Thr | Phe | Ala 395 | Glu | Asp | Ser | Lys | Asn 400 |
Ile | Ala | Ser | Glu | Ile 405 | Ile | Leu | Glu | Ile | Lys 410 | Lys | Ala | Phe | Glu | Glu 415 | Ser |
Leu | Ser | Thr | Leu 420 | Lys | Trp | Met | Asp | Glu 425 | Asp | Thr | Arg | Lys | Ser 430 | Ala | Lys |
Glu | Lys | Ala 435 | Asp | Ala | Ile | Tyr | Asn 440 | Met | Ile | Gly | Tyr | Pro 445 | Asn | Phe | Ile |
Met | Asp 450 | Pro | Lys | Glu | Leu | Asp 455 | Lys | Val | Phe | Asn | Asp 460 | Tyr | Thr | Ala | Val |
Pro 465 | Asp | Leu | Tyr | Phe | Glu 470 | Asn | Ala | Met | Arg | Phe 475 | Phe | Asn | Phe | Ser | Trp 480 |
Arg | Val | Thr | Ala | Asp 485 | Gin | Leu | Arg | Lys | Ala 490 | Pro | Asn | Arg | Asp | Gin 495 | Trp |
£ r | Met | Thr | Pro 500 | Pro | Met | Val | Asn | Ala 505 | Tyr | Tyr | Ser | Pro | Thr 510 | Lys | Asn |
Glu | Ile | Val 515 | Phe | Pro | Ala | Gly | Ile 520 | Leu | Gin | Ala | Pro | Phe 525 | Tyr | Thr | Arg |
Ser | Ser 530 | Pro | Asn | Ala | Leu | Asn 53 5 | Phe | Gly | Gly | Ile | Gly 540 | Val | Val | Val | Gly |
His 545 | Glu | Leu | Thr | His | Ala 550 | Phe | Asp | Asp | Gin | Gly 555 | Arg | Glu | Tyr | Asp | Lys 560 |
Asp | Gly | Asn | Leu | Arg 565 | Pro | Trp | Trp | Lys | Asn 570 | Ser | Ser | Val | Glu | Ala 575 | Phe |
Lys | Gin | Gin | Thr 580 | Ala | Cys | Met | Val | Glu 585 | Gin | Tyr | Gly | Asn | Tyr 590 | Ser | Val |
Asn | Gly | Glu 595 | Pro | Val | Asn | Gly | Arg 600 | His | Thr | Leu | Gly | Glu 605 | Asn | Ile | Ala |
Asp Asn Gly Gly Leu Lys Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn Trp Val 610 615 620
Lys | Lys | Asn | Gly | Ala | Glu | Gin | Thr | Leu | Pro | Thr | Leu | Gly | Leu | Thr | Asn |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Asn | Gin | Leu | Phe | Phe | Leu | Ser | Phe | Ala | Gin | Val | Trp | Cys | Ser | Val | Arg |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Thr | Pro | Glu | Ser | Sar | His | Glu | Gly | Leu | Ile | Thr | Asp | Pro | His | Ser | Pro |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Ser | Arg | Phe | Arg | Val | Ile | Gly | Ser | Ile | Ser | Asn | Ser | Lys | Glu | Phe | Ser |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Glu | His | Phe | His | Cys | Pro | Pro | Gly | Ser | Pro | Met | Asn | Pro | His | His | Lys |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Cys | Glu | Val | Trp |
705 (2) Informace o SEQ ID NO: 24:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 2533 aminokyselin (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNS k mRNS (vi) Původ:
(A) Organismus: Homo sapiens (B) Typ tkáně: placenta (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 1..2109 (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:
CGG Arg 1 | CTG Leu | GTG GTG TTG | GTG Val | GTA CTT | CTG GCG GCA GGA CTG GTG GCC TGC Leu Ala Ala Gly Leu Val Ala Cys | 48 | ||||||||||
Val | Val | Leu 5 | Val | Leu | ||||||||||||
10 | 15 | |||||||||||||||
TTG | GCA | GCA | CTG | GGC | ATC | CAG | TAC | CAG | ACA | AGA | TCC | CCC | TCT | GTG | TGC | 96 |
Leu | Ala | Ala | Leu | Gly | Ile | Gin | Tyr | Gin | Thr | Arg | Ser | Pro | Ser | Val | Cys | |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
CTG | AGC | GAA | GCT | TGT | GTC | TCA | GTG | ACC | AGC | TCC | ATC | TTG | AGC | TCC | ATG | 144 |
Leu | Ser | Glu | Ala | Cys | Val | Ser | Val | Thr | Ser | Ser | Ile | Leu | Ser | Ser | Met | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
GAC | CCC | ACA | GTG | GAC | CCC | TGC | CAT | GAC | TTC | TTC | AGC | TAC | GCC | TGT | GGG | 192 |
ASP | Pro | Thr | Val | Asp | Pro | Cys | His | Asp | Phe | Phe | Ser | Tyr | Ala | Cys | Gly |
55 60
GGC TGG ATC AAG GCC AAC CCA GTC | CCT GAT GGC CAC TCA CGC TGG | GGG Gly 80 | 240 | |||||||||||||
Gly Trp 65 | Ile Lys | Ala | Asn 70 | Pro | Val | Pro | Asp | Gly 75 | His | Ser | Arg | Trp | ||||
ACC | TTC | AGC | AAC | CTC | TGG | GAA | CAC | AAC | CAA | GCA | ATC | ATC | AAG | CAC | CTC | 288 |
Thr | Phe | Ser | Asn | Leu | Trp | Glu | His | Asn | Gin | Ala | Ile | Ile | Lys | His | Leu | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
CTC | GAA | AAC | TCC. | ACG | GCC | AGC | GTG | AGC | GAG | GCA | GAG | AGA | AAG | GCG | CAA | 336 |
Leu | Glu | Asn | Ser | Thr | Ala | Ser | Val | Ser | Glu | Ala | Glu | Arg | Lys | Ala | Gin | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
GTA | TAC | TAC | CGT | GCG | TGC | ATG | AAC | GAG | ACC | AGG | ATC | GAG | GAG | CTC. | AGG | 384 |
Val | Tyr | Tyr | Arg | Ala | Cys | Met | Asn | Glu | Thr | Arg | Ile | Glu | Glu | Leu | Arg | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
GCC | AAA | CCT | CTA | ATG | GAG | TTG | ATT | GAG | AGG | CTC | GGG | GGC | TGG | AAC | ATC | 432 |
Ala | Lys | Pro | Leu | Met | Glu | Leu | Ile | Glu | Arg | Leu | Gly | Gly | Trp | Asn | Ile | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
ACA | GGT | CCC | TGG | GCC | AAG | GAC | AAC | TTC | CAG | GAC | ACC | CTG | CAG | GTG | GTC | 480 |
Thr | Gly | Pro | Trp | Ala | Lys | Asp | Asn | Phe | Gin | Asp | Thr | Leu | Gin | Val | Val | |
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
ACC | GCC | CAC | TAC | CGC | ACC | TCA | CCC | TTC | TTC | TCT | GTC | TAT | GTC | AGT | GCC | 528 |
Thr | Ala | His | Tyr | Arg | Thr | Ser | Pro | Phe | Phe | Ser | Val | Tyr | Val | Ser | Ala | |
165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
GAT | TCC | AAG | AAC | TCC | AAC | AGC | AAC | GTG | ATC | CAG | GTG | GAC | CAG | TCT | GGC | 576 |
Asp | Ser | Lys | Asn | Ser | Asn | Ser | Asn | Val | Ile | Gin | Val | Asp | Gin | Ser | Gly | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
CTG | GGC | TTG | CCC | TCG | AGA | GAC | TAT | TAC | CTG | AAC | AAA | ACT | GAA | AAC | GAG | 624 |
Leu | Gly | Leu | Pro | Ser | Arg | Asp | Tyr | Tyr | Leu | Asn | Lys | Thr | Glu | Asn | Glu | |
195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
AAG | GTG | CTG | ACC | GGA | TAT | CTG | AAC | TAC | ATG | GTC | CAG | CTG | GGG | AAG | CTG | 672 |
Lys | Val | Leu | Thr | Gly | Tyr | Leu | Asn | Tyr | Met | Val | Gin | Leu | Gly | Lys | Leu | |
210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
CTG | GGC | GGC | GGG | GAC | GAG | GAG | GCC | ATC | CGG | CCC | CAG | ATG | CAG | CAG | ATC | 720 |
Leu | Gly | Gly | Gly | Asp | Glu | Glu | Ala | Ile | Arg | Pro | Gin | Met | Gin | Gin | Ile | |
225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
TTG | GAC | TTT | GAG | ACG | GCA | CTG | GCC | AAC | ATC | ACC | ATC | CCA | CAG | GAG | AAG | 768 |
Leu | Asp | Phe | Glu | Thr | Ala | Leu | Ala | Asn | Ile | Thr | Ile | Pro | Gin | Glu | Lys | |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
CGC | CGT | GAT | GAG | GAG | CTC | ATC | TAC | CAC | AAA | GTG | ACG | GCA | GCC | GAG | CTG | 816 |
Arg | Arg | Asp | Glu | Glu | Leu | Ile | Tyr | His | Lys | Val | Thr | Ala | Ala | Glu | Leu | |
260 | 265 | 270 |
CAG Gin | ACC TTG | GCA CCC | GCC Ala | ATC Ile | AAC TGG TTG CCT TTT CTC AAC | ACC Thr | ATC Ile | 8 | ||||||||
Thr | Leu 275 | Ala | Pro | Asn 280 | Trp | Leu | Pro | Phe | Leu 285 | Asn | ||||||
TTC | TAC | CCC | GTG | GAG | ATC | AAT | GAA | TCC | GAG | CCT | ATT | GTG | GTC | TAT | GAC | 9 |
Phe | Tyr | Pro | Val | Glu | Ile | Asn | Glu | Ser | Glu | Pro | Ile | Val | Val | Tyr | Asp | |
290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
AAG | GAA | TAC | CTT | GAG | CAG | ATC | TCC | ACT | CTC | ATC | AAC | ACC | ACC | GAC | AGA | 9 |
Lys | Glu | Tyr | Leu | Glu | Gin | Ile | Ser | Thr | Leu | Ile | Asn | Thr | Thr | Asp | Arg | |
305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
TGC | CTG | CTC | AAC | AAC | TAC | ATG | ATC | TGG | AAC | CTG | GTG | CGG | AAA | ACA | AGC | 10 |
Cys | Leu | Leu | Asn | Asn | Tyr | Met | Ile | Trp | Asn | Leu | Val | Arg | Lys | Thr | Ser | |
325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
TCC | TTC | CTT | GAC | CAG | CGC | TTT | CAG | GAC | GCC | GAT | GAG | AAG | TTC | ATG | GAA | 10 |
Ser | Phe | Leu | Asp | Gin | Arg | Phe | Gin | Asp | Ala | Asp | Glu | Lys | Phe | Met | Glu | |
340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
GTC | ATG | TAC | GGG | ACC | AAG | AAG | ACC | TGT | CTT | CCT | CGC | TGG | AAG | TTT | TGC | 11 |
Val | Met | Tyr | Gly | Thr | Lys | Lys | Thr | Cys | Leu | Pro | Arg | Trp | Lys | Phe | Cys | |
355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
GTG | AGT | GAC | ACA | GAA | AAC | AAC | CTG | GGC | TTT | GCG | TTG | GGC | CCC | ATG | TTT | 11 |
Val | Ser | Asp | Thr | Glu | Asn | Asn | Leu | Gly | Phe | Ala | Leu | Gly | Pro | Met | Phe | |
370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
GTC | AAA | GCA | ACC | TTC | GCC | GAG | GAC | AGC | AAG | AGC | ATA | GCC | ACC | GAG | ATC | 12 |
Val | Lys | Ala | Thr | Phe | Ala | Glu | Asp | Ser | Lys | Ser | Ile | Ala | Thr | Glu | Ile | |
385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||||
ATC | CTG | GAG | ATT | AAG | AAG | GCA | TTT | GAG | GAA | AGC | CTG | AGC | ACC | CTG | AAG | 12 |
Ile | Leu | Glu | Ile | Lys | Lys | Ala | Phe | Glu | Glu | Ser | Leu | Ser | Thr | Leu | Lys | |
405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
TGG | ATG | GAT | GAG | GAA | ACC | CGA | AAA | TCA | GCC | AAG | GAA | AAG | GCC | GAT | GCC | 12 |
Trp | Met | Asp | Glu | Glu | Thr | Arg | Lys | Ser | Ala | Lys | Glu | Lys | Ala | Asp | Ala | |
420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
ATC | TAC | AAC | ATG | ATA | GGA | TAC | CCC | AAC | TTC | ATC | ATG | GAT | CCC | AAG | GAG | 13 |
Ile | Tyr | Asn | Met | Ile | Gly | Tyr | Pro | Asn | Phe | Ile | Met | Asp | Pro | Lys | Glu | |
435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
CTG | GAC | AAA | GTG | TTT | AAT | GAC | TAC | ACT | GCA | GTT | CCA | GAC | CTC | TAC | TTT | 13 |
Leu | Asp | Lys | Val | Phe | Asn | Asp | Tyr | Thr | Ala | Val | Pro | Asp | Leu | Tyr | Phe | |
450 | 455 | 460 | ||||||||||||||
GAA | AAT | GCC | ATG | CGG | TTT | TTC | AAC | TTC | TCA | TGG | AGG | GTC | ACT | GCC | GAT | 14 |
Glu | Asn | Ala | Met | Arg | Phe | Phe | Asn | Phe | Ser | Trp | Arg | Val | Thr | Ala | Asp | |
465 | 470 | 475 | 480 |
CAG CTC | AGG AAA GCC | CCC Pro | AAC Asn | AGA Arg | GAT CAG TGG AGC ATG ACC | CCG Pro 495 | CCC Pro | 1488 | ||||||||
Gin | Leu | Arg Lys | Ala 485 | Asp Gin 490 | Trp | Ser | Met | Thr | ||||||||
ATG | GTG | AAC | GCC | TAC | TAC | TCG | CCC | ACC | AAG | AAT | GAG | ATT | GTG | TTT | CCG | 1536 |
Met | Val | Asn | Ala | Tyr | Tyr | Ser | Pro | Thr | Lys | Asn | Glu | Ile | Val | Phe | Pro | |
500 | 505 | 510 | ||||||||||||||
GCC | GGG | ATC | CTG | CAG | GCA | CCA | TTC | TAC | ACA | CGC | TCC | TCA | CCC | AAG | GCC | 1584 |
Ala | Gly | Ile | Leu | Gin | Ala | Pro | Phe | iyr | Thr | Arg | Ser | Ser | Pro | Lys | Ala | |
515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
TTA | AAC | TTT | GGT | GGC | ATA | GGT | GTC | GTC | GTG | GGC | CAT | GAG | CTG | ACT | CAT | 1632 |
Leu | Asn | Phe | Gly Gly | Ile | Gly | Val | Val | Val | Gly | His | Glu | Leu | Thr | His | ||
530 | 535 | 540 | ||||||||||||||
GCT | TTT | GAT | GAT | CAA | GGA | CGG | GAG | TAT | GAC | AAG | GAC | GGG | AAC | CTC | CGG | 1680 |
Ala | Phe | Asp | Asp | Gin | Gly | Arg | Glu | Tyr | Asp | Lys | Asp | Gly | Asn | Leu | Arg | |
545 | 550 | 555 | 560 | |||||||||||||
CCA | TGG | TGG | AAG | AAC | TCA | TCC | GTG | GAG | GCC | TTC | AAG | CGT | CAG | ACC | GAG | 1728 |
Pro | Trp | Trp | Lys | Asn | Ser | Ser | Val | Glu | Ala | Phe | Lys | Arg | Gin | Thr | Glu | |
565 | 570 | 575 | ||||||||||||||
TGC | ATG | GTA | GAG | CAG | TAC | AGC | AAC | TAC | AGC | GTG | AAC | GGG | GAG | CCG | GTG | 1776 |
Cys | Met | Val | Glu | Gin | Tyr | Ser | Asn | iyr | Ser | Val | Asn | Gly | Glu | Pro | Val | |
580 | 585 | 590 | ||||||||||||||
AAC | GGG | CGG | CAC | ACC | CTG | GGG | GAG | AAC | ATC | GCC | GAC | AAC | GGG | GGT | CTC | 1824 |
Asn | Gly | Arg | His | Thr | Leu | Gly | Glu | Asn | Ile | Ala | Asp | Asn | Gly | Gly | Leu | |
595 | 600 | 605 | ||||||||||||||
AAG | GCG | GCC | TAT | CGG | GCT | TAC | CAG | AAC | TGG | GTG | AAG | AAG | AAC | GGG | GCT | 1872 |
Lys | Ala | Ala | Tyr | Arg | Ala | Tyr | Gin | Asn | Trp | Val | Lys | Lys | Asn | Gly | Ala | |
610 | 615 | 620 | ||||||||||||||
GAG | CAC | TCG | CTC | CCC | ACC | CTG | GGC | CTC | ACC | AAT | AAC | CAG | CTC | TTC | TTC | 1920 |
Glu | His | Ser | Leu | Pro | Thr | Leu | Gly | Leu | Thr | Asn | Asn | Gin | Leu | Phe | Phe | |
625 | 630 | 635 | 640 | |||||||||||||
CTG | GGC | TTT | GCA | CAG | GTC | TGG | TGC | TCC | GTC | CGC | ACA | CCT | GAG | AGC | TCC | 1968 |
Leu | Gly | Phe | Ala | Gin | Val | Trp | Cys | Ser | Val | Arg | Thr | Pro | Glu | Ser | Ser | |
645 | 650 | 655 | ||||||||||||||
CAC | GAA | GGC | CTC | ATC | ACC | GAT | CCC | CAC | AGC | CCC | TCT | CGC | TTC | CGG | GTC | 2016 |
His | Glu | Gly | Leu | Ile | Thr | Asp | Pro | His | Ser | Pro | Ser | Arg | Phe | Arg | Val | |
660 | 665 | 670 | ||||||||||||||
ATC | GGC | TCC | CTC | TCC | AAT | TCC | AAG | GAG | TTC | TCA | GAA | CAC | TTC | CGC | TGC | 2064 |
Ile | Gly | Ser | Leu | Ser | Asn | Ser | Lys | Glu | Phe | Ser | Glu | His | Phe | Arg | Cys |
675 680 685
CCA CCT GGC TCA CCC ATG AAC CCG Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro 690 695
CCT CAC AAG TGC GAA GTC TGG Pro His Lys Cys Glu Val Trp 700
2109
TAAGGACGAA GCGGAGAGAG CCAAGACGGA GGAGGGGAAG GGGCTGAGGA CGAGACCCCC 2169 ATCCAGCCTC CAGGGCATTG CTCAGCCCGC TTGGCCACCC GGGGCCCTGC TTCCTCACAC 2229 TGGCGGGTTT' TCAGCCGGAA CCGAGCCCAT GGTGTTGGCT CTCAACGTGA CCCGCAGTCT 2289 GATCCCCTGT GAAGAGCCGG ACATCCCAGG CACACGTGTG CGCCACCTTC AGCAGGCATT 2349 CGGGTGCTGG GCTGGTGGCT CATCAGGCCT GGGCCCCACA CTGACAAGCG CCAGATACGC 2409 CACAAATACC ACTGTGTCAA ATGCTTTCAA GATATATTTT TGGGGAAACT ATTTTTTAAA 2469 CACTGTGGAA TACACTGGAA ATCTTCAGGG AAAAACACAT TTAAACACTT TTTTTTTTAA 2529 (2) Informace o SEQ ID NO: 25:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 703 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:
Arg Leu Val Val Leu 1 5
Leu Ala Ala Leu Gly 20
Val | Leu | Leu | Ala 10 | Ala | Gly | Leu | val | Ala 15 |
Gin | Tyr | Gin 25 | Thr | Arg | Ser | Pro | Ser 30 | Val |
Ser | val | Thr | Ser | Ser | Ile | Leu | Ser | Ser |
35 | 40 | |||||||
Asp | Pro 50 | Thr | Val | Asp | Pro | Cys 55 | His | Asp |
Gly 65 | Trp | Ile | Lys | Ala | Asn 70 | Pro | Val | Pro |
Thr | Phe | Ser | Asn | Leu 85 | Trp | Glu | His | Asn |
Leu | Glu | Asn | Ser 100 | Thr | Ala | Ser | val | Ser 105 |
Val | Tyr | Tyr | Arg | Ala | Cys | Met | Asn | Glu |
110
125
120
115
Ala | Lys 130 | Pro | Leu | Met | Glu | Leu 135 | Ile | Glu | Arg | Leu | Gly 140 | Gly | Trp | Asn | ixe |
Thr | Gly | Pro | Trp | Ala | Lys | Asp | Asn | Phe | Gin | Asp | Thr | Leu | Gin | Val | Val |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Thr | Ala | His | Tyr | Arg | Thr | Ser | Pro | Phe | Phe | Ser | Val | Tyr | Val | Ser | Ala |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Asp | Ser | Lys | Asn | Ser | Asn | Ser | Asn | Val | Ile | Gin | Val | Asp | Gin | Ser | Gly |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Leu | Gly | Leu | Pro | Ser | Arg | Asp | Tyr | Tyr | Leu | Asn | Lys | Thr | Glu | Asn | Glu |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Lys | Val | Leu | Thr | Gly | Tyr | Leu | Asn | Tyr | Met | Val | Gin | Leu | Gly | Lys | Leu |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Leu | Gly | Gly | Gly | Asp | Glu | Glu | Ala | Ile | Arg | Pro | Gin | Met | Gin | Gin | Ile |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Leu | Asp | Phe | Glu | Thr | Ala | Leu | Ala | Asn | Ile | Thr | Ile | Pro | Gin | Glu | Lys |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Arg | Arg | Asp | Glu | Glu | Leu | Ile | Tyr | His | Lys | Val | Thr | Ala | Ala | Glu | Leu |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Gin | Thr | Leu | Ala | Pro | Ala | Ile | Asn | Trp | Leu | Pro | Phe | Leu | Asn | Thr | Ile |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Phe | Tyr | Pro | Val | Glu | Ile | Asn | Glu | Ser | Glu | Pro | Ile | Val | Val | Tyr | Asp |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Lys | Glu | Tyr | Leu | Glu | Gin | Ile | Ser | Thr | Leu | Ile | Asn | Thr | Thr | Asp | Arg |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Cys | Leu | Leu | Asn | Asn | Tyr | Met | Ile | Trp | Asn | Leu | Val | Arg | Lys | Thr | Ser |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Ser | Phe | Leu | Asp | Gin | Arg | Phe | Gin | Asp | Ala | Asp | Glu | Lys | Phe | Met | Glu |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Val | Met | Tyr | Gly | Thr | Lys | Lys | Thr | Cys | Leu | Pro | Arg | Trp | Lys | Phe | Cys |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Val | Ser | Asp | Thr | Glu | Asn | Asn | Leu | Gly | Phe | Ala | Leu | Gly | Pro | Met | Phe |
370. | 375 | 380 | |||||||||||||
Val | Lys | Ala | Thr | Phe | Ala | Glu | Asp | Ser | Lys | Ser | Ile | Ala | Thr | Glu | Ile |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Ile | Leu | Glu | Ile | Lys | Lys | Ala | Phe | Glu | Glu | Ser | Leu | Ser | Thr | Leu | Lys |
405 | 410 | 415 |
Trp Met Asp Glu 420 | Glu Thr Arg Lys | Ser 425 | Ala | Lys Glu Lys | Ala 430 | Asp | Ala | ||||||||
Ile | Tyr | Asn | Met | Ile | Gly | Tyr | Pro | Asn | Phe | Ile | Met | Asp | Pro | Lys | Glu |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Leu | Asp | Lys | Val | Phe | Asn | Asp | Tyr | Thr | Ala | Val | Pro | Asp | Leu | Tyr | Phe |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Glu | Asn | Ala | Met | Arg | Phe | Phe | Asn | Phe | Ser | Trp | Arg | Val | Thr | Ala | Asp |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Gin | Leu | Arg | Lys | Ala | Pro | Asn | Arg | Asp | Gin | Trp | Ser | Met | Thr | Pro | Pro |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Met | Val | Asn | Ala | Tyr | Tyr | Ser | Pro | Thr | Lys | Asn | Glu | Ile | Val | Phe | Pro |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Ala | Gly | Ile | Leu | Gin | Ala | Pro | Phe | Tyr | Thr | Arg | Ser | Ser | Pro | Lys | Ala |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Leu | Asn | Phe | Gly | Gly | Ile | Gly | Val | Val | Val | Gly | His | Glu | Leu | Thr | His |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Ala | Phe | Asp | Asp | Gin | Gly | Arg | Glu | Tyr | Asp | Lys | Asp | Gly | Asn | Leu | Arg |
545 | 550' | 555 | 560 | ||||||||||||
Pro | Trp | Trp | Lys | Asn | Ser | Ser | Val | Glu | Ala | Phe | Lys | Arg | Gin | Thr | Glu |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Cys | Met | Val | Glu | Gin | Tyr | Ser | Asn | Tyr | Ser | Val | Asn | Gly | Glu | Pro | Val |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Asn | Gly | Arg | His | Thr | Leu | Gly | Glu | Asn | Ile | Ala | Asp | Asn | Gly | Gly | Leu |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Lys | Ala | Ala | Tyr | Arg | Ala | Tyr | Gin | Asn | Trp | Val | Lys | Lys | Asn | Gly | Ala |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Glu | His | Ser | Leu | Pro | Thr | Leu | Gly | Leu | Thr | Asn | Asn | Gin | Leu | Phe | Phe |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Leu | Gly | Phe | Ala | Gin | Val | Trp | Cys | Ser | Val | Arg | Thr | Pro | Glu | Ser | Ser |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
His | Glu | Gly | Leu | Ile | Thr | Asp | Pro | His | Ser | Pro | Ser | Arg | Phe | Arg | Val |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Ile | Gly | Ser | Leu | Ser | Asn | Ser | Lys | Glu | Phe | Ser | Glu | His | Phe | Arg | Cys |
675
680
685
Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro Pro His Lys Cys Glu Val Trp 690 695 700 (2) Informace o SEQ ID NO: 26:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomický) (iii) Hypotetická: ne (iii) Antisense: ano (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:
GGTGCTTGAT GATGGCTTGG TTGT 24 (2) Informace o SEQ ID NO: 27:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomický) (iii) Hypotetická: ne (iii) Antisense: ano (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 27:
AGATGGAGCT GGTCACCGAG ATGC (2) Informace o SEQ ID NO: 28:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 324 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNS k mRNS (iii) Hypotetická: ne (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (B) Typ tkáně: plíce (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 28:
GGGAGCGCGG CGCGGGGCCG GAGCGGAGCG CGCGAGCGAT GATGTCTACC TACAAGCGGC
2213
GGT Gly 710 | CTC ATC ACC | GAT Asp | CCC CAC AGC CCC TCC CGC TTC CGG GTC ATC | GGC Gly 725 | |||||||
Leu | Ile | Thr | Pro His 715 | Ser Pro | Ser Arg Phe 720 | Arg | Val | Ile | |||
TCC | ATC | TCC | AAC | TCC | AAG GAG | TTC TCG | GAA CAC TTC | CAC | TGC | CCG | CCC |
Ser | Ile | Ser | Asn | Ser | Lys Glu | Phe Ser | Glu His Phe | His | Cys | Pro | Pro |
730 | 735 | 740 | |||||||||
GGC | TCA | CCC' | ATG | AAC | CCG CAT | CAC AAG | TGT GAA GTC | TGG | T GAAGGGCCAG | ||
Gly | Ser | Pro | Met | Asn | Pro His | His Lys | Cys Glu Val | Trp | |||
745 | 750 | ||||||||||
GCA | |||||||||||
(2) Informace o | SEQ | ID NO: | 30: | ||||||||
(i) | Charakteristika sekvence: |
(A) Délka: 754 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 30:
2261
2311 • 2314
Met 1 | Met | Ser | Thr | Tyr 5 | Lys | Arg | Pro | Thr | Leu 10 | Asp | Glu | Glu | Asp | Leu 15 | Val |
Asp | Ser | Leu | Ser 20 | Glu | Ser | Asp | Val | Tyr 25 | Pro | Asn | His | Leu | Gin 30 | Val | Asn |
Phe | Arg | Gly 35 | Pro | Arg | Asn | Gly | Gin 40 | Arg | Cys | Trp | Ala | Ala 45 | Arg | Thr | Pro |
Val | Glu 50 | Lys | Arg | Leu | Val | Val 55 | Leu | Val | Ala | Leu | Leu 60 | Ala | Ala | Ala | Leu |
Val 65 | Ala | Cys | Leu | Ala | Val 70 | Leu | Gly | Ile | Gin | Tyr 75 | Gin | Thr | Arg | Thr | Pro 80 |
Ser | Val | Cys | Leu | Ser 85 | Glu | Ala | Cys | Ile | Ser 90 | Val | Thr | Ser | Ser | Ile 95 | Leu |
Ser | Ser | Met | Asp 100 | Pro | Thr | Val | Asp | Pro 105 | Cys | Gin | Asp | Phe | Phe 110 | Thr | Tyr |
Ala | Cys | Gly 115 | Gly | Trp | Ile | Lys | Ala 120 | Asn | Pro | Val | Pro | Asp 125 | Gly | His | Ser |
Arg | Trp 130 | Gly | Thr | Phe | Ser | Asn 135 | Leu | Trp | Glu | His | Asn 140 | Gin | Ala | Ile | Ile |
Lys | His | Leu | Leu | Glu | Asn | Ser | Thr | Ala | Ser | Val | Ser | Glu | Ala | Glu | Arg |
145 150 155 160
Lys Asp Gin Glu Tyr Tyr Arg Ala Cys Met Asn Glu Thr | Arg lle 175 | Glu | |||||||||||||
165 | 170 | ||||||||||||||
Glu | Leu | Lys | Ala | Lys | Pro | Leu | Met | Glu | Leu | lle | Glu | Lys | Leu | Gly | Gly |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Trp | Asn | lle | Thr | Gly | Pro | Trp | Asp | Lys | Asp | Asn | Phe | Gin | Asp | Thr | Leu |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Gin | Val | Val | Thr | Ser | His | Tyr | His | Thr | Ser | Pro | Phe | Phe | Ser | Val | Tyr |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Val | Ser | Ala | Asp | Ser | Lys | Asn | Ser | Asn | Ser | Asn | Val | lle | Gin | Val | Asp |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Gin | Ser | Gly | Leu | Gly | Leu | Pro | Ser | Arg | Asp | Tyr | Tyr | Leu | Asn | Lys | Thr |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Glu | Asn | Glu | Lys | Val | Leu | Thr | Gly | Tyr | Leu | Asn | Tyr | Met | Val | Gin | Leu |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Gly | Lys | Leu | Leu | Gly | Gly | Gly | Ala | Glu | Asp | Thr | lle | Arg | Pro | Gin | Met |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Gin | Gin | lle | Leu | Asp | Phe | Glu | Thr | Ala | Leu | Ala | Asn | lle | Thr | lle | Pro |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Gin | Glu | Lys | Arg | Arg | Asp | Glu | Glu | Leu | lle | Tyr | His | Lys | Val | Thr | Ala |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Ala | Glu | Leu | Gin | Thr | Leu | Ala | Pro | Ala | lle | Asn | Trp | Leu | Pro | Phe | Leu |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Asn | Thr | lle | Phe | Tyr | Pro | Val | Glu | lle | Asn | Glu | Ser | Glu | Pro | lle | Val |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
lle | Tyr | ASp | Lys | Glu | Tyr | Leu | Ser | Lys | Val | Ser | Thr | Leu | lle | Asn | Ser |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Thr | Asp | Lys | Cys | Leu | Leu | Asn | Asn | Tyr | Met | lle | Trp | Asn | Leu | Val | Arg |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Lys | Thr | Ser | Ser | Phe | Leu | Asp | Gin | Arg | Phe | Gin | Asp | Ala | Asp | Glu | Lys |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Phe | Met | Glu | Val | Met | Tyr | Gly | Thr | Lys | Lys | Thr | Cys | Leu | Pro | Arg | Trp |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Lys | Phe | Cys | val | Ser | Asp | Thr | Glu | Asn | Thr | Leu | Gly | Phe | Ala | Leu | Gly |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Pro | Met | Phe | Val | Lys | Ala | Thr | Phe | Ala | Glu | Asp | Ser | Lys | Asn | lle | Ala |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Ser Glu Ile Ile Leu Glu Ile Lys 450 455
Thr Leu Lys Trp Met Asp Glu Asp 465 470
Ala Asp Ala Ile Tyr Asn Met Ile 485
Pro Lys Glu Leu Asp Lys Val Phe 500
Leu Tyr Phe Glu Asn Ala Met Arg 515 520
Thr Ala Asp Gin Leu Arg Lys Ala 530 535
Thr Pro Pro Met Val Asn Ala Tyr 545 550
Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gin 565
Pro Asn Ala Leu Asn Phe Gly Gly 580
Leu Thr His Ala Phe Asp Asp Gin 595 600
Asn Leu Arg Pro Trp Trp Lys Asn 610 615
Gin Thr Ala Cys Met Val Glu Gin 625 630
Glu Pro Val Asn Gly Arg His Thr 645
Gly Gly Leu Lys Ala Ala Tyr Arg 660
Asn Gly Ala Glu Gin Thr Leu Pro 675 680
Leu Phe Phe Leu Ser Phe Ala Gin 690 695
Glu Ser Ser His Glu Gly Leu Ile 705 710
Phe Arg Val Ile Gly Ser Ile Ser 725
Lys Ala Phe Glu Glu Ser Leu Ser
460
Thr Arg Lys Ser Ala Lys Glu Lys 475 480
Gly Tyr Pro Asn Phe Ile Met Asp 490 495
Asn Asp Tyr Thr Ala Val Pro Asp 505 510
Phe Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val 525
Pro Asn Arg Asp Gin Trp Ser Met 540
Tyr Ser Pro Thr Lys Asn Glu Ile 555 560
Ala Pro Phe Tyr Thr Arg Ser Ser '570 57 5
Ile Gly Val Val Val Gly His Glu 585 590
Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly 605
Ser Ser Val Glu Ala Phe Lys Gin 620
Tyr Gly Asn Tyr Ser Val Asn Gly 635 640
Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn 650 655
Ala Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys 665 670
Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gin 685
Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro 700
Thr Asp Pro His Ser Pro Ser Arg 715 .720
Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His 730 735
Phe His Cys Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro His His Lys Cys Glu 740 745 750
Val Trp (2) Informace o SEQ ID NO: 31:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 53 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomický) (iii) Hypotetická: ne (iii) Antisense: ano (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 31:
(2) Informace o SEQ ID NO: 32:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 25 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomický) (iii) Hypotetická: ne (iii) Antisense: ano (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 32:
GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA ACTAGTCTCG AGCCAAGCAG GCCACCAGTC CTG (2) Informace o SEQ ID NO: 33:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 222 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNS k mRNS (iii) Hypotetická: ne (iii) Antisense: ano (vi) Původ:
(A) Organismus: Homo sapiens (B) Typ tkáně: placenta (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 38..222 (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 33:
CGCCCCCCCG GTGTCCGCCC TGCTGTCGGC GCTGGGG ATG TCG ACG TAC AAG CGG 55
Met Ser Thr Tyr Lys Arg
5
GCC Ala | ACG CTG GAC GAG | GAG Glu | GAC CTG GTG GAC TCG CTC TCC | GAG GGC GAC | 103 | |||||||||||
Thr Leu | Asp Glu 10 | Asp Leu Val 15 | Asp | Ser | Leu | Ser | Glu 20 | Gly | Asp | |||||||
GCA | TAC | CCC | AAC | GGC | CTG | CAG | GTG | AAC | TTC | CAC | AGC | CCC | CGG | AGT | GGC | 151 |
Ala | Tyr | Pro | Asn | Gly | Leu | Gin | Val | Asn | Phe | His | Ser | Pro | Arg | Ser | Gly | |
25 | 30 | 35 | ||||||||||||||
CAG | AGG | TGC | TGG | GCT | GCA | CGG | ACC | CAG | GTG | GAG | AAG | CGG | CTG | GTG | GTG | 199 |
Gin | Arg | Cys | Trp | Ala | Ala | Arg | Thr | Gin | Val | Glu | Lys | Arg | Leu | Val | Val | |
40 | • 45 | 50 | ||||||||||||||
TTG | GTG | GTA | CTT | CTG | GCG | GCA | GG | 222 | ||||||||
Leu | Val | Val | Leu | Leu | Ala | Ala |
60 (2) Informace o SEQ ID NO: 34:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 61 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 34:
« | Met 1 | Ser | Thr | Tyr | Lys 5 | Arg | Ala | Thr | Leu | Asp 10 | Glu | Glu | Asp | Leu | Val 15 | Asp |
Ser | Leu | Ser | Glu 20 | Gly | Asp | Ala | Tyr | Pro 25 | Asn | Gly | Leu | Gin | Val 30 | Asn | Phe | |
His | Ser | Pro 35 | Arg | Ser | Gly | Gin | Arg 40 | Cys | Trp | Ala | Ala | Arg 45 | Thr | Gin | Val | |
Glu | Lys | Arg | Leu | Val | Val | Leu | Val | Val | Leu | Leu | Ala | Ala |
55 60 (2) Informace o SEQ ID NO: 35:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 2720 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNS k mRNS (iii) Hypotetická: ne (vi) Původ:
(A) Organismus: Homo sapiens (B) Typ tkáně: placenta (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 38..2297 (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 35:
CGCCCCCCCG GTGTCCGCCC TGCTGTCGGC GCTGGGG ATG TCG ACG TAC AAG CGG 55
Met Ser Thr Tyr Lys Arg
5
GCC ACG CTG GAC GAG GAG GAC CTG GTG GAC TCG CTC TCC GAG GGC | GAC Asp | 103 | ||||||||||||||
Ala Thr Leu Asp | Glu Glu | Asp | Leu | Val 15 | Asp | Ser | Leu | Ser | Glu 20 | Gly | ||||||
10 | ||||||||||||||||
GCA | TAC | CCC | AAC | GGC | CTG | CAG | GTG | AAC | TTC | CAC | AGC | CCC | CGG | AGT | GGC | 151 |
Ala | Tyr | Pro | Asn | Gly | Leu | Gin | Val | Asn | Phe | His | Ser | Pro | Arg | Ser | Gly | |
25 | 30 | 35 | ||||||||||||||
CAG | AGG | TGC | TGG | GCT | GCA | CGG | ACC | CAG | GTG | GAG | AAG | CGG | CTG | GTG | GTG | 199 |
Gin | Arg | Cys | Trp | Ala | Ala | Arg | Thr | Gin | Val | Glu | Lys | Arg | Leu | Val | Val | |
40 | 45 | 50 | ||||||||||||||
TTG | GTG | GTA | CTT | CTG | GCG | GCA | GGA | CTG | GTG | GCC | TGC | TTG | GCA | GCA | CTG | 247 |
Leu | Val | Val | Leu | Leu | Ala | Ala | Gly | Leu | Val | Ala | Cys | Leu | Ala | Ala | Leu | |
55 | 60 | 65 | 70 | |||||||||||||
GGC | ATC | CAG | TAC | CAG | ACA | AGA | TCC | CCC | TCT | GTG | TGC | CTG | AGC | GAA | GCT | 295 |
Gly | Ile | Gin | Tyr | Gin | Thr | Arg | Ser | Pro | Ser | Val | Cys | Leu | Ser | Glu | Ala | |
75 | 80 | 85 | ||||||||||||||
TGT | GTC | TCA | GTG | ACC | AGC | TCC | ATC | TTG | AGC | TCC | ATG | GAC | CCC | ACA | GTG | 343 |
Cys | Val | Ser | Val | Thr | Ser | Ser | Ile | Leu | Ser | Ser | Met | Asp | Pro | Thr | Val | |
90 | 95 | 100 | ||||||||||||||
GAC | CCC | TGC | CAT | GAC | TTC | TTC | AGC | TAC | GCC | TGT | GGG | GGC | TGG | ATC | AAG | 391 |
Asp | Pro | Cys | His | Asp | Phe | Phe | Ser | Tyr | Ala | Cys | Gly | Gly | Trp | Ile | Lys | |
105 | 110 | 115 |
GCC AAC Ala Asn | CCA Pro | GTC Val | CCT Pro | GAT GGC CAC TCA CGC TGG GGG ACC TTC AGC | AAC Asn | 42 | ||||||||||
Asp | Gly 125 | His | Ser | Arg | Trp Gly 130 | Thr | Phe | Ser | ||||||||
120 | ||||||||||||||||
CTC | TGG | GAA | CAC | AAC | CAA | GCA | ATC | ATC | AAG | CAC | CTC | CTC | GAA | AAC | TCC | 48 |
Leu | Trp | Glu | His | Asn | Gin | Ala | íle | Ile | Lys | His | Leu | Leu | Glu | Asn | Ser | |
135 | 140 | 145 | 150 | |||||||||||||
ACG | GCC | AGC | GTG | AGC | GAG | GCA | GAG | AGA | AAG | GCG | CAA | GTA | TAC | TAC | CGT | 53 |
Thr | Ala | Ser | Val | Ser | Glu | Ala | Glu | Arg | Lys | Ala | Gin | Val | Tyr | Tyr | Arg | |
155 | 160 | 165 | ||||||||||||||
GCG | TGC | ATG | AAC | GAG | ACC | AGG | ATC | GAG | GAG | CTC | AGG | GCC | AAA | CCT | CTA | 58. |
Ala | Cys | Met | Asn | Glu | Thr | Arg | Ile | Glu | Glu | Leu | Arg | Ala | Lys | Pro | Leu | |
170 | 175 | 180 | ||||||||||||||
ATG | GAG | TTG | ATT | GAG | AGG | CTC | GGG | GGC | TGG | AAC | ATC | ACA | GGT | CCC | TGG | 632 |
Met | Glu | Leu | Ile | Glu | Arg | Leu | Gly | Gly | Trp | Asn | Ile | Thr | Gly | Pro | Trp | |
185 | 190 | 195 | ( | |||||||||||||
GCC | AAG | GAC | AAC | TTC | CAG | GAC | ACC | CTG | CAG | GTG | GTC | ACC | GCC | CAC | TAC | 67S |
Ala | Lys | Asp | Asn | Phe | Gin | Asp | Thr | Leu | Gin | Val | Val | Thr | Ala | His | Tyr | |
200 | 205 | 210 | ||||||||||||||
CGC | ACC | TCA | CCC | TTC | TTC | TCT | GTC | TAT | GTC | AGT | GCC | GAT | TCC | AAG | AAC | - , 727 |
Arg | Thr | Ser | Pro | Phe | Phe | Ser | Val | Tyr | Val | Ser | Ala | Asp | Ser | Lys | Asn | |
215 | 220 | 225 | 230 | |||||||||||||
TCC | AAC | AGC | AAC | GTG | ATC | CAG | GTG | GAC | CAG | TCT | GGC | CTG | GGC | TTG | CCC | 775 |
Ser | Asn | Ser | Asn | Val | ile | Gin | Val | Asp | Gin | Ser | Gly | Leu | Gly | Leu | Pro | |
235 | 240 | 245 | ||||||||||||||
TCG | AGA | GAC | TAT | TAC | CTG | AAC | AAA | ACT | GAA | AAC | GAG | AAG | GTG | CTG | ACC | 823 |
Ser | Arg | Asp | Tyr | Tyr | Leu | Asn | Lys | Thr | Glu | Asn | Glu | Lys | Val | Leu | Thr | |
250 | 255 | 260 | ||||||||||||||
GGA | TAT | CTG | AAC | TAC | ATG | GTC | CAG | CTG | GGG | AAG | CTG | CTG | GGC | GGC | GGG | 871 |
Gly | Tyr | Leu | Asn | Tyr | Met | Val | Gin | Leu | Gly | Lys | Leu | Leu | Gly | Gly | Gly | |
265 | 270 | 275 | ||||||||||||||
GAC | GAG | GAG | GCC | ATC | CGG | CCC | CAG | ATG | CAG | CAG | ATC | TTG | GAC | TTT | GAG | 919 |
Asp | Glu | Glu | Ala | Ile | Arg | Pro | Gin | Met | Gin | Gin | Ile | Leu | Asp | Phe | Glu | |
280 | 285 | 290 | ||||||||||||||
ACG | GCA | CTG | GCC | AAC | ATC | ACC | ATC | CCA | CAG | GAG | AAG | CGC | CGT | GAT | GAG | 967 |
Thr | Ala | Leu | Ala | Asn | Ile | Thr | Ile | Pro | Gin | Glu | Lys | Arg | Arg | Asp | Glu | |
295 | 300 | 305 | 310 | |||||||||||||
GAG | CTC | ATC | TAC | CAC | AAA | GTG | ACG | GCA | GCC | GAG | CTG | CAG | ACC | TTG | GCA | 1015 |
Glu | Leu | Ile | Tyr | His | Lys | Val | Thr | Ala | Ala | Glu | Leu | Gin | Thr | Leu | Ala |
315 320 325
CCC Pro | GCC. Ala | ATC Ile | AAC Asn. 330 | TGG Trp | TTG Leu | CCT Pro | TTT Phe | CTC Leu 335 | AAC Asn | ACC Thr | ATC Ile | TTC Phe | TAC Tyr 340 | CCC Pro | Val | |
GAG | ATC | AAT | GAA | TCC | GAG | CCT | ATT | GTG | GTC | TAT | GAC | AAG | GAA | TAC | CTT | 1111 |
Glu | Ile | Asn 345 | Glu | Ser | Glu | Pro | Ile 350 | Val | Val | Tyr | Asp | Lys 355 | Glu | Tyr | Leu | |
GAG | CAG | ATC | TCC | ACT | CTC | ATC | AAC | ACC | ACC | GAC | AGA | TGC | CTG | CTC | AAC | 1159 |
Glu | Gin 360 | Ile | Ser | Thr | Leu | Ile 365 | Asn | Thr | Thr | Asp | Arg 370 | Cys | Leu | Leu | Asn | |
AAC | TAC | ATG | ATC | TGG | AAC | CTG | GTG | CGG | AAA | ACA | AGC | TCC | TTC | CTT | GAC | 1207 |
Asn 375 | Tyr | Met | Ile | Trp | Asn 380 | Leu | Val | Arg | Lys | Thr 385 | Ser | Ser | Phe | Leu | Asp 390 | |
CAG | CGC | TTT | CAG | GAC | GCC | GAT | GAG | AAG | TTC | ATG | GAA | GTC | ATG | TAC | GGG | 1255 |
Gin | Arg | Phe | Gin | Asp 395 | Ala | Asp | Glu | Lys | Phe 400 | Met | Glu | Val | Met | Tyr 405 | Gly | |
ACC | AAG | AAG | ACC | TGT | CTT | CCT | CGC | TGG | AAG | TTT | TGC | GTG | AGT | GAC | ACA | 1303 |
Thr | Lys | Lys | Thr 410 | Cys | Leu | Pro | Arg | Trp 415 | Lys | Phe | Cys | Val | Ser 420 | Asp | Thr | |
GAA | AAC | AAC | CTG | GGC | TTT | GCG | TTG | GGC | CCC | ATG | TTT | GTC | AAA | GCA | ACC | 1351 |
Glu | Asn | Asn 425 | Leu | Gly | Phe | Ala | Leu 430 | Gly | Pro | Met | Phe | Val 435 | Lys | Ala | Thr | |
TTC | GCC | GAG | GAC | AGC | AAG | AGC | ATA | GCC | ACC | GAG | ATC | ATC | CTG | GAG | ATT | 1399 |
Phe | Ala 440 | Glu | Asp | Ser | Lys | Ser 445 | Ile | Ala | Thr | Glu | Ile 450 | Ile | Leu | Glu | Ile | |
AAG | AAG | GCA | TTT | GAG | GAA | AGC | CTG | AGC | ACC | CTG | AAG | TGG | ATG | GAT | GAG | 1447 |
Lys 455 | Lys | Ala | Phe | Glu | Glu 460 | Ser | Leu | Ser | Thr | Leu 465 | Lys | Trp | Met | Asp | Glu 470 | |
GAA | ACC | CGA | AAA | TCA | GCC | AAG | GAA | AAG | GCC | GAT | GCC | ATC | TAC | AAC | ATG | 1495 |
Glu | Thr | Arg | Lys | Ser 475 | Ala | Lys | Glu | Lys | Ala 480 | Asp | Ala | Ile | Tyr | Asn 485 | Met | |
ATA | GGA | TAC | CCC | AAC | TTC | ATC | ATG | GAT | CCC | AAG | GAG | CTG | GAC | AAA' | GTG | 1543 |
Ile | Gly | Tyr | Pro 490 | Asn | Phe | Ile | Met | Asp 495 | Pro | Lys | Glu | Leu | Asp 500 | Lys | Val | |
TTT | AAT | GAC | TAC | ACT | GCA | GTT | CCA | GAC | CTC | TAC | TTT | GAA | AAT | GCC | ATG | 1591 |
Phe | Asn | Asp 505 | Tyr | Thr | Ala | val | Pro 510 | Asp | Leu | Tyr | Phe | Glu 515 | Asn | Ala | Met | |
CGG | TTT | TTC | AAC | TTC | TCA | TGG | AGG | GTC | ACT | GCC | GAT | CAG | CTC | AGG | AAA | 1639 |
Arg | Phe | Phe | Asn | Phe | Ser | Trp | Arg | Val | Thr | Ala | Asp | Gin | Leu | Arg | Lys |
520 525 530
GCC CCC AAC | AGA GAT CAG TGG | AGC ATG ACC CCG CCC ATG GTG AAC | GCC Ala 550 | 168 | ||||||||||||
Ala 535 | Pro Asn | Arg Asp Gin 540 | Trp | Ser Met Thr | Pro 545 | Pro | Met | Val | Asn | |||||||
TAC | TAC | TCG | CCC | ACC | AAG | AAT | GAG | ATT | GTG | TTT | CCG | GCC | GGG | ATC | CTG | 173 |
Tyr | Tyr | Ser | Pro | Thr | Lys | Asn | Glu | Ile | Val | Phe | Pro | Ala | Gly | Ile | Leu | |
555 | 560 | 565 | ||||||||||||||
CAG | GCA | CCA | TTC | TAC | ACA | CGC | TCC | TCA | CCC | AAG | GCC | TTA | AAC | TTT | GGT | 178 |
Gin | Ala | Pro | Phe | Tyr | Thr | Arg | Ser | Ser | Pro | Lys | Ala | Leu | Asn | Phe | Gly | |
570 | 575 | 580 | ||||||||||||||
GGC | ATA | GGT | GTC | GTC | GTG | GGC | CAT | GAG | CTG | ACT | CAT | GCT | TTT | GAT | GAT | 183: |
Gly | Ile | Gly | Val | Val | Val | Gly | His | Glu | Leu | Thr | His | Ala | Phe | Asp | Asp | |
585 | 590 | 595 | ||||||||||||||
CAA | GGA | CGG | GAG | TAT | GAC | AAG | GAC | GGG | AAC | CTC | CGG | CCA | TGG | TGG | AAG | 187S |
Gin | Gly | Arg | Glu | Tyr | Asp | Lys | Asp | Gly | Asn | Leu | Arg | Pro | Trp | Trp | Lys | |
600 | 605 | 610 | ||||||||||||||
AAC | TCA | TCC | GTG | GAG | GCC | TTC | AAG | CGT | CAG | ACC | GAG | TGC | ATG | GTA | GAG | 1927 |
Asn | Ser | Ser | Val | Glu | Ala | Phe | Lys | Arg | Gin | Thr | Glu | Cys | Met | Val | Glu | |
615 | 620 | 625 | 630 | |||||||||||||
CAG | TAC | AGC | AAC | TAC | AGC | GTG | AAC | GGG | GAG | CCG | GTG | AAC | GGG | CGG | CAC | 1975 |
Gin | Tyr | Ser | Asn | Tyr | Ser | Val | Asn | Gly | Glu | Pro | Val | Asn | Gly | Arg | His' | |
635 | 640 | 645 | ||||||||||||||
ACC | CTG | GGG | GAG | AAC | ATC | GCC | GAC | AAC | GGG | GGT | CTC | AAG | GCG | GCC | TAT | 2023 |
Thr | Leu | Gly | Glu | Asn | Ile | Ala | Asp | Asn | Gly | Gly | Leu | Lys | Ala | Ala | Tyr | |
650 | 655 | 660 | ||||||||||||||
CGG | GCT | TAC | CAG | AAC | TGG | GTG | AAG | AAG | AAC | GGG | GCT | GAG | CAC | TCG | CTC | 2071 |
Arg | Ala | Tyr | Gin | Asn | Trp | Val | Lys | Lys | Asn | Gly | Ala | Glu | His | Ser | Leu | |
665 | 670 | 675 | ||||||||||||||
CCC | ACC | CTG | GGC | CTC | ACC | AAT | AAC | CAG | CTC | TTC | TTC | CTG | GGC | TTT | GCA | 2119 |
Pro | Thr | Leu | Gly | Leu | Thr | Asn | Asn | Gin | Leu | Phe | Phe | Leu | Gly | Phe | Ala | |
680 | 685 | 690 | ||||||||||||||
CAG | GTC | TGG | TGC | TCC | GTC | CGC | ACA | CCT | GAG | AGC | TCC | CAC | GAA | GGC | CTC | 2167 |
Gin | Val | Trp | Cys | Ser | val | Arg | Thr | Pro | Glu | Ser | Ser | His | Glu | Gly | Leu | |
695 | 700 | 705 | 710 | |||||||||||||
ATC | ACC | GAT | CCC | CAC | AGC | CCC | TCT | CGC | TTC | CGG | GTC | ATC | GGC | TCC | CTC | 2215 |
Ile | Thr | Asp | Pro | His | Ser | Pro | Ser | Arg | Phe | Arg | Val | Ile | Gly | Ser | Leu | |
715 | 720 | 725 | ||||||||||||||
TCC | AAT | TCC | AAG | GAG | TTC | TCA | GAA | CAC | TTC | CGC | TGC | CCA | CCT | GGC | TCA | 2263 |
Ser | Asn | Ser | Lys | Glu | Phe | Ser | Glu | His | Phe | Arg | Cys | Pro | Pro | Gly | Ser | |
730 | 735 | 740 |
CCC ATG AAC CCG CCT CAC AAG TGC GAA GTC TGG T AAGGACGAAG
Pro Met Asn Pro Pro His Lys Cys Glu Val Trp 745 750
CGGAGAGAGC CAAGACGGAG GAGGGGAAGG GGCTGAGGAC GAGACCCCCA TCCAGCCTCC AGGGCATTGC TCAGCCCGCT TGGCCACCCG GGGCCCTGCT TCCTCACACT GGCGGGTTTT CAGCCGGAAC CGAGCCCATG GTGTTGGCTC TCAACGTGAC CCGCAGTCTG ATCCCCTGTG AAGAGCCGGA CATCCCAGGC ACACGTGTGC GCCACCTTCA GCAGGCATTC GGGTGCTGGG CTGGTGGCTC ATCAGGCCTG GGCCCCACAC TGACAAGCGC CAGATACGCC ACAAATACCA CTGTGTCAAA TGCTTTCAAG ATATATTTTT GGGGAAACTA TTTTTTAAAC ACTGTGGAAT ACACTGGAAA TCTTCAGGGA AAAACACATT TAAACACTTT TTTTTTTAAG CCC
2307
2367
2427
2487
2547
2607
2667
2720 (2) Informace o SEQ ID NO: 36:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 753 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 36:
Met 1 | Ser | Thr | Tyr | Lys 5 | Arg | Ala | Thr | Leu | Asp 10 | Glu | Glu | Asp | Leu | Val 15 | Asp |
Ser | Leu | Ser | Glu | Gly | Asp | Ala | Tyr | Pro | Asn | Gly | Leu | Gin | Val | Asn | Phe |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
His | Ser | Pro | Arg | Ser | Gly | Gin | Arg | Cys | Trp | Ala | Ala | Arg | Thr | Gin | Val |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Glu | Lys | Arg | Leu | Val | Val | Leu | Val | Val | Leu | Leu | Ala | Ala | Gly | Leu | Val |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Ala | Cys | Leu | Ala | Ala | Leu | Gly | Ile | Gin | Tyr | Gin | Thr | Arg | Ser | Pro | Ser |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Val | Cys | Leu | Ser | Glu | Ala | Cys | Val | Ser | Val | Thr | Ser | Ser | Ile | Leu | Ser |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ser | Met | Asp | Pro | Thr | Val | Asp | Pro | Cys | His | Asp | Phe | Phe | Ser | Tyr | Ala |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Cys | Gly | Gly | Trp | Ile | Lys | Ala | Asn | Pro | Val | Pro | Asp | Gly | His | Ser | Arg |
115
120
125
Trp Gly Thr Phe Ser Asn Leu Trp Glu His Asn Gin Ala Ile Ile Lys 130 135 140
His Leu Leu 145 | Glu Asn | Ser Thr Ala Ser Val 150 | Ser 155 | Glu Ala | Glu | Arg | Lys 160 | ||||||||
Ala | Gin | Val | Tyr | Tyr | Arg | Ala | Cys | Met | Asn | Glu | Thr | Arg | Ile | Glu | Glu |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Leu | Arg | Ala | Lys | Pro | Leu | Met | Glu | Leu | Ile | Glu | Arg | Leu | Gly | Gly | Trp |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Asn | Ile | Thr | Gly | Pro | Trp | Ala | Lys | Asp | Asn | Phe | Gin | Asp | Thr | Leu | Gin |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Val | Val | Thr | Ala | His | Tyr | Arg | Thr | Ser | Pro | Phe | Phe | Ser | Val | Tyr | Val |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Ser | Ala | Asp | Ser | Lys | Asn | Ser | Asn | Ser | Asn | Val | Ile | Gin | Val | Asp | Gin |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Ser | Gly | Leu | Gly | Leu | Pro | Ser | Arg | Asp | Tyr | Tyr | Leu | Asn | Lys | Thr | Glu |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Asn | Glu | Lys | Val | Leu | Thr | Gly | Tyr | Leu | Asn | Tyr | Met | Val | Gin | Leu | Gly |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Lys | Leu | Leu | Gly | Gly | Gly | Asp | Glu | Glu | Ala | Ile | Arg | Pro | Gin | Met | Gin |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Gin. | Ile | Leu | Asp | Phe | Glu | Thr | Ala | Leu | Ala | Asn | Ile | Thr | Ile | Pro | Gin |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Glu | Lys | Arg | Arg | Asp | Glu | Glu | Leu | Ile | Tyr | His | Lys | Val | Thr | Ala | Ala |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Glu | Leu | Gin | Thr | Leu | Ala | Pro | Ala | Ile | Asn | Trp | Leu | Pro | Phe | Leu | Asn |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Thr | Ile | Phe | Tyr | Pro | Val | Glu | Ile | Asn | Glu | Ser | Glu | Pro | Ile | Val | Val |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Tyr | Asp | Lys | Glu | Tyr | Leu | Glu | Gin | Ile | Ser | Thr | Leu | Ile | Asn | Thr | Thr |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Asp | Arg | Cys | Leu | Leu | Asn | Asn | Tyr | Met | Ile | Trp | Asn | Leu | Val | Arg | Lys |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Thr | Ser | Ser | Phe | Leu | Asp | Gin | Arg | Phe | Gin | Asp | Ala | Asp | Glu | Lys | Phe |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Met | Glu | Val | Met | Tyr | Gly | Thr | Lys | Lys | Thr | Cys | Leu | Pro | Arg | Trp | Lys |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Phe | Cys | Val | Ser | Asp | Thr | Glu | Asn | Asn | Leu | Gly | Phe | Ala | Leu | Gly | Pro |
420 | 425 | 430 |
•Ί»
Met | Phe | Val 435 | Lys | Ala | Thr | Phe | Ala 440 | Glu | Asp | Ser | Lys | Ser 445 | Ile | Ala | Thr |
Glu | Ile 450 | Ile | Leu | Glu | Ile | Lys 455 | Lys | Ala | Phe | Glu | Glu 460 | Ser | Leu | Ser | Thr |
Leu 465 | Lys | Trp | Met | Asp | Glu 470 | Glu | Thr | Arg | Lys | Ser 475 | Ala | Lys | Glu | Lys | Ala 480 |
Asp | Ala | Ile | Tyr | Asn 485 | Met | Ile | Gly | Tyr | Pro 490 | Asn | Phe | Ile | Met | Asp 495 | Pro |
Lys | Glu | Leu | Asp 500 | Lys | Val | Phe | Asn | Asp 505 | Tyr | Thr | Ala | Val | Pro 510 | Asp | Leu |
Tyr | Phe | Glu 515 | Asn | Ala | Met | Arg | Phe 520 | Phe | Asn | Phe | Ser | Trp 525 | Arg | Val | Thr |
Ala | Asp 530 | Gin | Leu | Arg | Lys | Ala 535 | Pro | Asn | Arg | Asp | Gin 540 | Trp | Ser | Met | Thr |
Pro 545 | Pro | Met | Val | Asn | Ala 550 | Tyr | Tyr | Ser | Pro | Thr 555 | Lys | Asn | Glu | Ile | Val 560 |
Phe | Pro | Ala | Gly | Ile 565 | Leu | Gin | Ala | Pro | Phe 570 | Tyr | Thr | Arg | Ser | Ser 575 | Pro |
Lys | Ala | Leu | Asn 580 | Phe | Gly | Gly | Ile | Gly 585 | Val | Val | Val | Gly | His 590 | Glu | Leu |
Thr | His | Ala 595 | Phe | Asp | Asp | Gin | Gly 600 | Arg | Glu | Tyr | Asp | Lys 605 | Asp | Gly | Asn |
Leu | Arg 610 | Pro | Trp | Trp | Lys | Asn 615 | Ser | Ser | Val | Glu | Ala 620 | Phe | Lys | Arg | Gin |
Thr 625 | Glu | Cys | Met | Val | Glu 630 | Gin | Tyr | Ser | Asn | Tyr 635 | Ser | Val | Asn | Gly | Glu 640 |
Pro | Val | Asn | Gly | Arg 645 | His | Thr | Leu | Gly | Glu 650 | Asn | Ile | Ala | Asp | Asn 655 | Gly |
Gly | Leu | Lys | Ala 660 | Ala | Tyr | Arg | Ala | Tyr 665 | Gin | Asn | Trp | Val | Lys 670 | Lys | Asn |
Gly | Ala | Glu 675 | His | Ser | Leu | Pro | Thr 680 | Leu | Gly | Leu | Thr | Asn 685 | Asn | Gin | Leu |
Phe | Phe 690 | Leu | Gly | Phe | Ala | Gin 695 | Val | Trp | Cys | Ser | Val 700 | Arg | Thr | Pro | Glu |
Ser | Ser | His | Glu | Gly | Leu | Ile | Thr | Asp | Pro | His | Ser | Pro | Ser | Arg | Phe |
705
710
715
720
Arg | Val | Ile | Gly | Ser | Leu | Ser | Asn | Ser | Lys | Glu | Phe | Ser | Glu | His | Phe |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Arg | Cys | Pro | Pro | Gly | Ser | Pro | Met | Asn | Pro | Pro | His | Lys | Cys | Glu | Val |
740 745 750
Trp
< O | |||||||||
* | u | r~ JQ | í\> | ||||||
F' | ω | G | .v | ! OO | |||||
• | Ή · < | Xt > | :>< | σ o c/x | cr: | n< | |||
- o | D | r— | |||||||
.—| < 1 m | to | O | |||||||
< □- | cn | ||||||||
• | -5 O | H-* | |||||||
E A T E NT O | v | 13 | N | A | R | O K | Y |
1. Endothelin konvertující enzym, vyznačující se t í m, že obsahuje v SEQ ID NO: 30 nebo SEQ ID NO: 36 popsanou polypeptidovou sekvenci nebo její funkční fragment.
2. DNA sekvence, která kóduje endothelin konvertující enzym podle nároku 1 a je vybrána ze skupiny, zahrnující
a) DNA-sekvence se strukturou popsanou v SEQ ID NO: 29 nebo SEQ ID NO: 35,
b) DNA-sekvence, které kódují protein se strukturou popsanou v SEQ ID NO: 30 nebo SEQ ID NO: 36 a
c) DNA-sekvence, které za standardních podmínek hybridizují s DNA-sekvencemi a) nebo b),
d) DNA-sekvence, které kódují proteinový produkt, který může být rozpoznáván protilátkami, které se vytvoří proti proteinu SEQ ID NO: 30 nebo 36 nebo z něj generovaným fragmentům.
3. Způsob genově technické výroby endothelin konvertujících enzymů za použiti DNA sekvencí podle nároku 2.
4. Způsob výroby endothelin konvertujícího enzymu podle nároku 1,vyznačující se tím, žese savčí buňky stimulují inhibitorem endothelin konvertujícího enzymu pro nadměrnou produkci endothelin konvertujícího enzymu a z těchto buněk se izoluje endothelin konvertující enzym běžnými způsoby.
5. Způsob podle nároku 4,vyznačuj ící se t í m, že se jako inhibitor použije fosforamidon.
6. Způsob výroby endothelin konvertujíčího enzymu podle nároku 1,vyznačující se tím, že se použije parciální sekvenci SEQ ID NO: 36 kódující nebo sekvenčně komplementární oligonukleotid jako hybridizační sonda, pro izolaci genu pro endothelin konvertující enzym z genového poolu a tento gen se běžnými genovětechnickými metodami exprimuje v hostitelském organismu.
7. Použití endothelin konvertujíčího enzymu podle nároku 1 pro identifikaci inhibitorů endothelin konvertujících enzymů.
8. Inhibitory endothelin konvertujících enzymů, které jsou identifikovány s enzymovým testem za použití endothelin konvertujících enzymů podle nároku 1.
9. Použití inhibitorů podle nároku 8 jako léčiv.
10. Způsob výroby léčiv, která inhibují endothelin konvertující enzym, vyznačující se tím, že se známé chemické sloučeniny použijí v enzymovém testu za použití endothelin konvertujících enzymů podle nároku 1 a identifikují se ty, které mají inhibující působení a takto identifikované sloučeniny se formulují s běžnými nosičovými a pomocnými látkami jako léčivo.
11. Použití endothelin konvertujíčího enzymu podle nároku 1 pro výrobu protilátek.
12. Použití protilátek podle nároku 11 k diagnóze chorob.
13. Použití DNA-sekvenze podle nároku 2 pro výrobu transgenních zvířat, která tuto DNA-sekvenci obsahují v jedné nebo více extrakopiích nebo u kterých je normální EXE-gen vypnut.
14. Použití endothelin konvertujíčího enzymu podle nároku 1 pro výrobu léčiv.
15. Použití parciálních sekvencí sekvence SEQ ID NO 35 pro výrobu anti-sense oligonukleotidů.
16. Použití parciálnícch sekvencí podle nároku 15 pro výrobu léčiv.
změněný list
RATENTOVÉ
Claims (10)
- NÁROKY1. Endothelin konvertující enzym, vyznačující se t í m, že obsahuje v SEQ ID NO: 36 popsanou polypeptidovou sekvenci nebo parciální sekvenci, která ještě vykazuje enzymatickou aktivitu endothelin konvertujícího enzymu, antigenní vlastnosti nebo afinitu k ligandům.
- 2. DNA sekvence, které kódují endothelin konvertující enzym podle nároku 1 a jsou vybrány ze skupiny, zahrnujícía) DNA-sekvence se strukturou popsanou v SEQ ID NO: 35,b) DNA-sekvence, které kódují protein se strukturou popsanou v SEQ ID NO: 36.
- 3. Způsob genovětechnické výroby endothelin konvertujících enzymů za použití DNA sekvencí podle nároku 2.
- 4. Způsob výroby endothelin konvertujícího enzymu podle nároku 1,vyznačující se tím, že se savčí buňky stimulují inhibitorem endothelin konvertujícího enzymu pro nadměrnou produkci endothelin konvertujícího enzymu a z těchto buněk se izoluje endothelin konvertující enzym běžnými způsoby.
- 5. Způsob podle nároku 4,vyznačuj ící se t í m, že se jako inhibitor použije fosforamidon.
- 6. Způsob výroby endothelin konvertujícího enzymu podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije parciální změněný list sekvenci SEQ ID NO: 36 kódující nebo sekvenčně komplementární hybridizační sonda, pro izolaci genu pro endothelin konvertující enzym z genového poolu a tento gen se běžnými genovětechnickými metodami exprimuje v hostitelském organismu.
- 7. Použití endothelin konvertujícího enzymu podle nároku 1 pro identifikaci inhibitorů endothelin konvertujícího enzym.*
- 8. Použití endothelin konvertujícího enzymu podle nároku 1 pro výrobu protilátek.*
- 9. Použití DNA-sekvenze podle nároku 2 pro výrobu transgenních zvířat, která tuto DNA-sekvenci obsahují v jedné nebo více extrakopiích nebo u kterých je normální EXE-gen vypnut.
- 10. Použití endothelin konvertujícího enzymu podle nároku 1 pro výrobu léčiv.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19934339100 DE4339100A1 (de) | 1993-11-16 | 1993-11-16 | Endothelinkonversionsenzym-1 (ECE-1) |
DE19944403665 DE4403665A1 (de) | 1994-02-07 | 1994-02-07 | Endothelinkonversionsenzym (ECE) |
DE19944412372 DE4412372A1 (de) | 1994-04-12 | 1994-04-12 | Endothelinkonversionsenzym (ECE) |
PCT/EP1994/003706 WO1995014095A1 (de) | 1993-11-16 | 1994-11-10 | Endothelinkonversionsenzym (ece) |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ139496A3 true CZ139496A3 (en) | 1997-10-15 |
Family
ID=27205762
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ961394A CZ139496A3 (en) | 1993-11-16 | 1994-11-10 | Endothelin-converting enzyme |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6066502A (cs) |
EP (1) | EP0728209B1 (cs) |
JP (1) | JPH09505733A (cs) |
KR (1) | KR960705934A (cs) |
CN (1) | CN1141651A (cs) |
AT (1) | ATE315656T1 (cs) |
AU (1) | AU8107094A (cs) |
BR (1) | BR9408077A (cs) |
CA (1) | CA2176507A1 (cs) |
CZ (1) | CZ139496A3 (cs) |
DE (1) | DE59410427D1 (cs) |
FI (1) | FI962047A (cs) |
HU (1) | HUT75554A (cs) |
NO (1) | NO962023L (cs) |
NZ (1) | NZ275817A (cs) |
PL (1) | PL314480A1 (cs) |
SK (1) | SK59896A3 (cs) |
WO (1) | WO1995014095A1 (cs) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6255468B1 (en) * | 1998-05-07 | 2001-07-03 | Smithkline Beecham Plc | MPROT12 polynucleotides and methods thereof |
EP1409690A2 (en) | 1999-09-24 | 2004-04-21 | Lexicon Genetics Incorporated | Human endothelin converting enzyme-like proteins and polynucleotides encoding the same |
ES2255003T3 (es) * | 2004-02-13 | 2006-06-16 | B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft | Procedimiento para determinar la formacion de endotelinas con fines diagnostico medico, y anticuerpos y kits para realizar un procedimiento de este tipo. |
WO2009018209A1 (en) | 2007-07-27 | 2009-02-05 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | ENDOTHELIN SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS AND METHODS OF PREDICTING β-ADRENERGIC RECEPTOR TARGETING AGENT EFFICACY |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2966939B2 (ja) * | 1990-12-07 | 1999-10-25 | 日清製粉株式会社 | ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素 |
CA2100355A1 (en) * | 1991-02-04 | 1992-08-05 | Lynne H. Parker Botehlo | Endothelin converting enzyme |
-
1994
- 1994-11-10 US US08/646,273 patent/US6066502A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-10 AT AT95900130T patent/ATE315656T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-11-10 BR BR9408077A patent/BR9408077A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-11-10 WO PCT/EP1994/003706 patent/WO1995014095A1/de active IP Right Grant
- 1994-11-10 AU AU81070/94A patent/AU8107094A/en not_active Abandoned
- 1994-11-10 HU HU9601298A patent/HUT75554A/hu unknown
- 1994-11-10 SK SK598-96A patent/SK59896A3/sk unknown
- 1994-11-10 PL PL94314480A patent/PL314480A1/xx unknown
- 1994-11-10 CN CN94194828A patent/CN1141651A/zh active Pending
- 1994-11-10 CZ CZ961394A patent/CZ139496A3/cs unknown
- 1994-11-10 EP EP95900130A patent/EP0728209B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-10 CA CA002176507A patent/CA2176507A1/en not_active Abandoned
- 1994-11-10 DE DE59410427T patent/DE59410427D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-11-10 NZ NZ275817A patent/NZ275817A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-11-10 KR KR1019960702556A patent/KR960705934A/ko not_active Application Discontinuation
- 1994-11-10 JP JP7514199A patent/JPH09505733A/ja not_active Ceased
-
1996
- 1996-05-14 FI FI962047A patent/FI962047A/fi unknown
- 1996-05-15 NO NO962023A patent/NO962023L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0728209B1 (de) | 2006-01-11 |
HUT75554A (en) | 1997-05-28 |
CN1141651A (zh) | 1997-01-29 |
EP0728209A1 (de) | 1996-08-28 |
FI962047A0 (fi) | 1996-05-14 |
ATE315656T1 (de) | 2006-02-15 |
NZ275817A (en) | 1997-02-24 |
BR9408077A (pt) | 1997-08-12 |
AU8107094A (en) | 1995-06-06 |
KR960705934A (ko) | 1996-11-08 |
WO1995014095A1 (de) | 1995-05-26 |
HU9601298D0 (en) | 1996-07-29 |
NO962023D0 (no) | 1996-05-15 |
PL314480A1 (en) | 1996-09-16 |
US6066502A (en) | 2000-05-23 |
FI962047A (fi) | 1996-07-12 |
CA2176507A1 (en) | 1995-05-26 |
NO962023L (no) | 1996-07-16 |
DE59410427D1 (en) | 2006-04-06 |
SK59896A3 (en) | 1997-07-09 |
JPH09505733A (ja) | 1997-06-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Galjart et al. | Human lysosomal protective protein has cathepsin A-like activity distinct from its protective function | |
KR101126423B1 (ko) | 보체 활성화를 억제하는 변형된 프로테아제 | |
Faucheu et al. | A novel human protease similar to the interleukin‐1 beta converting enzyme induces apoptosis in transfected cells. | |
KR101476458B1 (ko) | 프로테아제 스크리닝 방법 및 이에 의해 확인된 프로테아제 | |
US20020064856A1 (en) | Novel proteases | |
CN101517074B (zh) | 蛋白酶筛选方法及由此鉴别的蛋白酶 | |
US20030108998A1 (en) | Aggrecan degrading metallo proteases | |
Fumagalli et al. | Human NRD convertase: a highly conserved metalloendopeptidase expressed at specific sites during development and in adult tissues | |
JPH09149790A (ja) | 新規セリンプロテアーゼ | |
CZ139496A3 (en) | Endothelin-converting enzyme | |
WO1997005256A2 (en) | Mammalian pro-hormone convertase | |
US6548284B1 (en) | Membrane-bound metalloprotease and soluble secreted form thereof | |
JP2002034566A (ja) | ミミズ由来セリンプロテアーゼの遺伝子、当該遺伝子を含むプラスミドベクター及び形質転換体 | |
EP1895001B1 (en) | Novel trypsin family serine proteases | |
JPH11225765A (ja) | 新規セリンプロテアーゼ | |
JP2004256436A (ja) | アグリカナーゼ−1阻害剤 | |
JP2001286289A (ja) | トロンボスポンジンドメインを有する新規メタロプロテアーゼとこれをコードする核酸組成物 | |
JP2001046065A (ja) | 新規セリンプロテアーゼ | |
JP2001046072A (ja) | Ace類似遺伝子 | |
JP2003146905A (ja) | アグリカナーゼ活性を有する新規な金属プロテアーゼ | |
Pesquero et al. | Expression and localization of N-domain ANG | |
CA2235575A1 (en) | Novel human cysteine protease |