DE4339100A1 - Endothelinkonversionsenzym-1 (ECE-1) - Google Patents
Endothelinkonversionsenzym-1 (ECE-1)Info
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- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Endothelinkonversionsenzyme,
Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.
Erhöhte Endothelinspiegel werden mit einer Vielzahl von Erkran
kungen wie essentielle Hypertonie, Herzinfarkt, akutes Nierenver
sagen, Schock oder Herzversagen in Zusammenhang gebracht. Auf
einen solchen Zusammenhang lassen auch mit Endothelin-Antikörpern
erzielbare Ergebnisse schließen. In Tiermodellen konnte damit die
Größe eines Herzinfarktes dosisabhängig verringert (Watanabe et
al., Nature 344, 114 (1990)), die Nierenfunktion positiv beein
flußt (Kon et al., J. Clin. Invest. 83, 1762 (1989)), und die
Nephrotoxizität von Cyclosporin herabgesetzt werden (Kon et al.,
Kidney Int. 37, 1487 (1990)).
Endothelinkonversionsenzym (ECE-1) setzt Endothelin 1 aus dem 38
Aminosäuren bestehenden Vorläufermolekül Big-Endothelin-1 frei.
Den von Endothelin-1 hervorgerufenen unerwünschten biologischen
Effekten läßt sich z. B. durch Inhibierung des Endothelinkonver
sionsenzyms und damit der Endothelin-1 Biosynthese entgegenwir
ken.
Es sind Enzymaktivitäten, die Endotheline bzw. endothelinähnliche
Moleküle aus den entsprechenden Vorläufermolekülen, den Big-En
dothelinen freisetzen, aus verschiedenen Zellinien isoliert wor
den (Takeda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 176, 860 (1991),
Ohnaka et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 168, 1128 (1990);
Matsumura et al. FEBS Lett. 293, 45 (1992), Ahn et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89, 8606 (1992), PCT WO 92/13944, Ohnaka et
al. Clin. Exp. Hypertension A 14; Nr. 4 (1992), Okada et al.
Biochem. Biophys. Res. Comm. 180, 1019 (1991), Takada et al.
Biochem. Biophys. Res. Comm. 182, 1383 (1992), Opgenorth et al.
FASEB 6, 2653 (1992)).
Diese Enzymaktivitäten sind jedoch bisher unzureichend charakte
risiert worden. Sie liegen als wenig angereicherte Enzymmischun
gen vor. Solche unreinen Enzymmischungen sind jedoch für die Ver
wendung in Testverfahren zum Auffinden von spezifischen ECE-
Inhibitoren schlecht geeignet, da andere, physiologisch nicht
relevante Fremdproteasen den Enzymtest erheblich stören.
So wird Big-Endothelin beispielsweise auch durch die Serinpro
tease Chymothrypsin sowie durch Papain und Thermolysin zu
Endothelin und endothelinähnlichen Produkten gespalten, die in
Testverfahren fälschlicherweise dem Enzym ECE zugeordnet werden.
Infolgedessen ist die Beschreibung des Endothelinkonversionsen
zyms in der Literatur widersprüchlich.
Die Angaben über das Molekulargewicht des Endothelinkonversions
enzyms variieren von 65 KDalton bis 540 KDalton; die Angaben der
Km und vmax Werte weichen ebenfalls erheblich voneinander ab (Op
genorth et al. FASEB 6, 2653 (1992); Sawamura et al. Biochem.
Biophys. Acta 1161,295 (1993)). Auch gibt es Widersprüche dar
über, ob das Endothelinkonversionsenzym in die Familie der Aspar
tatproteasen oder der Metalloproteasen einzuordnen ist (Sawamura
et al. Biochem. Biophys. Acta 1161,295 (1993); Biochem. Pharma
col. 43,845 (1992). Ferner finden sich in der Literatur wider
sprüchliche Aussagen über charakteristische Angaben, ob es sich
bei der Metalloprotease um ein cytoplasmatisches oder membrange
bundenes Enzym handelt und welche Substrate von dem jeweiligen
ECE umgesetzt werden (Big-Et-1; Big-Et-3):
Matsumura et al. (FEBS Lett. 293, 45 (1992));
Takahashi et al. (J. Biol. Chem. 268;21394 (1993));
Okada et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 180, 1019 (1991));
Ohnaka et al. (Clin. Exp. Hypertension A 14; Nr. 4 (1992));
Matsumura et al. (FEBS Lett. 305;86 (1992)).
Matsumura et al. (FEBS Lett. 293, 45 (1992));
Takahashi et al. (J. Biol. Chem. 268;21394 (1993));
Okada et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 180, 1019 (1991));
Ohnaka et al. (Clin. Exp. Hypertension A 14; Nr. 4 (1992));
Matsumura et al. (FEBS Lett. 305;86 (1992)).
Bisher wurde keine eindeutige Beschreibung des ECE gezeigt, die
es ermöglicht, ECE-1 einwandfrei zu definieren. Eine solche
Definition kann möglicherweise erst durch das Bestimmen der Pri
märstruktur, der Aminosäuresequenz, des ECE erfolgen. Hierzu ist
es notwendig, ECE zunächst in reiner Form herzustellen.
Es bestand daher die Aufgabe, Endothelinkonversionsenzym in rei
ner Form bereitzustellen.
Es wurde ein Endothelinkonversionsenzym, gekennzeichnet durch ein
Molekulargewicht von 250 000 Dalton und die Aminosäurepartialse
quenz SEQ ID NO: 1 gefunden.
Das erfindungsgemäße Endothelinkonversionsenzym weist folgende
Merkmale auf: Es besitzt ein mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelek
trophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen ermitteltes
Molekulargewicht von etwa 250 000 Dalton.
Unter reduzierenden Bedingungen zeigt es in der SDS-Polyacryla
midgelelektrophorese eine Bande von 125 000 Dalton; es besteht
vermutlich aus einem Homodimer.
Das Endothelinkonversionsenzym ist glykosyliert. Die enzymatische
Entfernung der Zuckerreste bewirkt eine Veränderung des apparen
ten Molekulargewichts von 125 000 Dalton auf etwa 82 000 Dalton.
Die Sequenzierung von tryptischen Peptiden des Endothelinkonver
sionsenzyms liefert folgende Aminosäurepartialsequenzen
SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5.
Eine weitere Charakterisierung des erfindungsgemäßen Endothelin
konversionsenzyms ist in den Beispielen vorgenommen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Endothelinkonversions
enzyme, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von etwa
250 000 Dalton und eine Aminosäurepartialsequenz, die mindestens
80% Homologie zu SEQ ID NO: 1 aufweisen.
Solche Endothelinkonversionsenzyme lassen sich aus anderen
Organismen als Rind, beispielsweise aus menschlichen Zellen, iso
lieren.
Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung der
Endothelinkonversionsenzyme, die dadurch gekennzeichnet sind, daß
Säugerzellen, bevorzugt Endothelzellen, mit einem Inhibitor des
Endothelinkonversionsenzyms zur Endothelinkonversionsenzym-Über
produktion stimuliert werden und aus diesen Zellen Endothelinkon
versionsenzym mit üblichen proteinchemischen Maßnahmen isoliert
wird.
Für die Induktion des ECE in Säugerzellen können alle ECE-
Inhibitoren Verwendung finden. Hierfür geeignete ECE-Inhibitoren
sind z. B. beschrieben in JP-146737; JP 05148277-A1; Jpn J.
Biochem. 64; (8) Abst. 2367 (1992); Derwent NCE-93-0956 (1993);
Derwent NCE-93-0971 (1993); J. Med. Chem. 36,173 (1993);
EP 518299-A2. Vorzugsweise findet Phosphoramidon Verwendung.
Stimuliert werden die Zellen in Kultur durch Zugabe dieser
Inhibitoren zum Zellkulturmedium für 6 Stunden bis zu 6 Tagen.
Vorzugsweise wird die Stimulierung jedoch über 2-3 Tage durchge
führt. Die angewandten Inhibitorkonzentrationen betragen 10-2 M
bis 10-7 M, vorzugsweise 10-3 M bis 10-4 M.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Endothelinkonversionsenzyme
ist jedoch auch auf gentechnischem Weg möglich. Aufgrund der be
schriebenen Aminosäurepartialsequenzen lassen sich synthetische
Oligonukleotide, die diese Sequenzen codieren oder komplementär
zu dafür codierenden Sequenzen sind, herstellen. Diese Oligonu
kleotide können als Hybridisierungsprobe zur Isolierung der ent
sprechenden Gene oder der cDNA-Moleküle aus Genpools wie Genban
ken oder cDNA-Pools verwendet werden. Diese Art der Genisolierung
ist dem Fachmann aus Lehrbüchern der Molekularbiologie wie Sam
brook, Fritsch, Maniatis; Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989, USA bekannt.
Mit Hilfe geeigneter synthetischer Oligonukleotide und der Poly
merase-Chain-Reaction (PCR) können ebenfalls Teile des Gens bei
spielsweise aus cDNA-Banken oder Erststrang cDNA erhalten werden
(PCR-Protocols; Academic Press; San Diego; USA; 1990). Oligonu
kleotide, die hierfür geeignet sind, lassen sich aus den unter
Seq ID No. 1 bis No. 5 beschriebenen Peptiden herleiten durch
Übersetzen der Aminosäuresequenz in die doppelsträngige DNA-Se
quenz (mit sense und antisense). Hierbei können aufgrund des de
generierten genetischen Codes entweder degenerierte Oligonukleo
tidgemische aus einem Peptid abgeleitet werden und als Primer
Verwendung finden. Die Oligonukleotide können aus den Peptiden
auch unter Berücksichtigung der sogenannten "codon usage"; des
preferentiellen Gebrauchs in einer Spezies- in diesem Fall Rind,
von bestimmten Nukleotid-Tripletts für eine Aminosäure, abgelei
tet werden. Die PCR wird dann mit zwei verschiedenen Oligonukleo
tiden als Primern durchgeführt, wobei die für die PCR notwendigen
zwei Primer sich aus Strang (sense) und Gegenstrang (antisense)
der Oligonukleotide zusammensetzen können. Ebenso Verwendung fin
den können Oligonukleotide, die von Teilen des cDNA-Vektors her
geleitet sind, oder Oligo-dT für den 3′Teil von RNA.
Diese Genteile können dann wiederum eingesetzt werden, um mit dem
Verfahren der Genisolierung das komplette Gen oder die vollstän
dige cDNA zu erhalten.
Auf diese Art lassen sich nicht nur Gene für die Endothelinkon
versionsenzyme, die exakt die in SEQ ID NO: 1 beschriebene Amino
säurepartialsequenz besitzen, isolieren, sondern auch Gene für
Varianten bzw. Endothelinkonversionsenzyme aus anderen Organis
men, beispielsweise dem Menschen, die mindestens 80% Homologie
auf der Proteinebene zu SEQ ID NO: 1 aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Endothelinkonversionsenzyme lassen sich be
sonders gut herstellen, indem man die entsprechenden Gene iso
liert und diese Gene in einem Wirtsorganismus mit üblichen gen
technischen Methoden exprimiert.
Die erfindungsgemäßen Endothelinkonversionsenzyme können
verwendet werden zur Herstellung von Antikörpern, die beispiels
weise zur Bestimmung von ECE oder in Testverfahren zur Identifi
zierung von ECE-Hemmern eingesetzt werden können.
Mit Hilfe der erhaltenen Gene können in einer dem Fachmann be
kannten Art und Weise Tiere in ihrem Gengut so verändert werden,
daß sie ein oder mehrere Extrakopien dieses Gens erhalten oder
daß das normale ECE-Gen ausgeschaltet wird. Diese transgenen
Tiere eignen sich u. a. für Versuchszwecke.
Bevorzugt finden die Endothelinkonversionsenzyme in Testverfahren
zur Identifizierung von ECE-Hemmstoffen Verwendung. Diese Test
verfahren sind in der Regel enzymatische Reaktionen, bei denen
die ECE-katalysierte Umsetzung eines Endothelinvorläufers zu
einem Endothelin in Gegenwart von potentiellen Hemmstoffen gemes
sen wird.
3 Röhrchen mit eingefrorenen FBHE-Rinderendothelzellen (ATCC CRL
1395) wurden in der 14. Passage aufgetaut und in 3 T175-Zellkul
turflaschen (Fa. Sarstedt) mit je 40 ml Wachstumsmedium DMEM
(Gibco Nr. 041-01965)
+ 5 ml/500 ml Glutamin (200 mM; Gibco 043-05030)
+ 1 ml/500 ml Gentamycin (Gibco 043-05750)
+ Non-Essentielle Aminosäuren; Endkonzentration: 1 × (Gibco Nr. 043-01140)
+ 10% FCS (Gibco Nr. 011-06290; inaktiviert für 37 Minuten bei 56°C) + 25 ng/ml Basischer FGF (Intergen 4125-80))
gegeben. Diese Zellen wurden nach Standardverfahren bei 37°C; in einer Atmosphäre aus 7% CO₂; 100% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Am darauffolgenden Tag erfolgte ein Mediumswechsel. Bei Erreichen der Konfluenz - in diesem Fall nach 4 Tagen - wurden die Zellen nach Standardverfahren durch Trypsinbehandlung passagiert und in 9 T-175-Flaschen aufgeteilt und zum Wachstum bei 37°C wie be schrieben inkubiert. Nach 3 Tagen und Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen erneut nach Standardverfahren durch Trypsinbe handlung aufgeteilt auf 20 T-Flaschen. Nach weiteren 3 Tagen konnten die Zellen auf 40 T-Flaschen aufgeteilt werden. Nach wei teren 3 Tagen wurden 39 dieser T-Flaschen auf 78 T-Flaschen auf geteilt. Da diese 78 T-Flaschen zur Ernte der Zellen verwendet werden, werden hierfür geeignete Zellkulturflaschen (Fa. Costar; Accell; Nr. 3155) benutzt. Am Tag nach dem Beimpfen dieser T-Flaschen wurden 68 Flaschen mit Phosphoramidon (Fa. Peptide In stitute; Nr. 4082; abgekürzt als PHAM) in einer Endkonzentration von 10-4M versetzt (+ PHAM). Diese Behandlung führt zur Induktion der ECE-Aktivität. Die restlichen 10 T-Flaschen wurden als nicht induzierte Kontrollzellen mitgeführt (-PHAM). Nach weiteren 2 Tagen Inkubation unter den beschriebenen Bedingungen wurden die PHAM-induzierten Zellen und die Kontrollzellen (-PHAM) getrennt geerntet. Hierzu wurden die Flaschen geöffnet und das Medium ab gekippt. Die Zellen wurden in der T-Flasche mit je 10 ml BPS (Boehringer Mannheim Nr. 210331) gewaschen (d. h. über Zellrasen vorsichtig geschwenkt). Das PBS wurde abgekippt. Erneut wurden 5 ml PBS pro T-Flasche gegeben. Die Zellen wurden mit einem Cell- Scraper (Fa. Costar Nr. 3010) vom Boden der Kulturflasche ge kratzt und als Zellsuspension in ein 150 ml Zentrifugenröhrchen (Falcon Nr. 2076) überführt, wo sie auf Eis aufbewahrt wurden. Jede T-Flasche wurde mit 10 ml PBS nachgespült. Die Zellsuspen sion aus dem Nachspülen wurde mit der vorhandenen Zellsuspension in den Zentrifugenröhrchen vereinigt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (1200 RPM; 10 Minuten; Heraeus Christ Minifuge GL Nr. 4400; Rotor 2150) sedimentiert. Der zellfreie Überstand wurde verworfen und das Pellet im 3-fachen Volumen PBS des Zellsedimen tes aufgenommen. Nach erneutem Zentrifugieren wurde der zellfreie Überstand erneut verworfen. Das Pellet blieb bis zur Aufarbeitung auf Eis.
+ 5 ml/500 ml Glutamin (200 mM; Gibco 043-05030)
+ 1 ml/500 ml Gentamycin (Gibco 043-05750)
+ Non-Essentielle Aminosäuren; Endkonzentration: 1 × (Gibco Nr. 043-01140)
+ 10% FCS (Gibco Nr. 011-06290; inaktiviert für 37 Minuten bei 56°C) + 25 ng/ml Basischer FGF (Intergen 4125-80))
gegeben. Diese Zellen wurden nach Standardverfahren bei 37°C; in einer Atmosphäre aus 7% CO₂; 100% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Am darauffolgenden Tag erfolgte ein Mediumswechsel. Bei Erreichen der Konfluenz - in diesem Fall nach 4 Tagen - wurden die Zellen nach Standardverfahren durch Trypsinbehandlung passagiert und in 9 T-175-Flaschen aufgeteilt und zum Wachstum bei 37°C wie be schrieben inkubiert. Nach 3 Tagen und Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen erneut nach Standardverfahren durch Trypsinbe handlung aufgeteilt auf 20 T-Flaschen. Nach weiteren 3 Tagen konnten die Zellen auf 40 T-Flaschen aufgeteilt werden. Nach wei teren 3 Tagen wurden 39 dieser T-Flaschen auf 78 T-Flaschen auf geteilt. Da diese 78 T-Flaschen zur Ernte der Zellen verwendet werden, werden hierfür geeignete Zellkulturflaschen (Fa. Costar; Accell; Nr. 3155) benutzt. Am Tag nach dem Beimpfen dieser T-Flaschen wurden 68 Flaschen mit Phosphoramidon (Fa. Peptide In stitute; Nr. 4082; abgekürzt als PHAM) in einer Endkonzentration von 10-4M versetzt (+ PHAM). Diese Behandlung führt zur Induktion der ECE-Aktivität. Die restlichen 10 T-Flaschen wurden als nicht induzierte Kontrollzellen mitgeführt (-PHAM). Nach weiteren 2 Tagen Inkubation unter den beschriebenen Bedingungen wurden die PHAM-induzierten Zellen und die Kontrollzellen (-PHAM) getrennt geerntet. Hierzu wurden die Flaschen geöffnet und das Medium ab gekippt. Die Zellen wurden in der T-Flasche mit je 10 ml BPS (Boehringer Mannheim Nr. 210331) gewaschen (d. h. über Zellrasen vorsichtig geschwenkt). Das PBS wurde abgekippt. Erneut wurden 5 ml PBS pro T-Flasche gegeben. Die Zellen wurden mit einem Cell- Scraper (Fa. Costar Nr. 3010) vom Boden der Kulturflasche ge kratzt und als Zellsuspension in ein 150 ml Zentrifugenröhrchen (Falcon Nr. 2076) überführt, wo sie auf Eis aufbewahrt wurden. Jede T-Flasche wurde mit 10 ml PBS nachgespült. Die Zellsuspen sion aus dem Nachspülen wurde mit der vorhandenen Zellsuspension in den Zentrifugenröhrchen vereinigt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (1200 RPM; 10 Minuten; Heraeus Christ Minifuge GL Nr. 4400; Rotor 2150) sedimentiert. Der zellfreie Überstand wurde verworfen und das Pellet im 3-fachen Volumen PBS des Zellsedimen tes aufgenommen. Nach erneutem Zentrifugieren wurde der zellfreie Überstand erneut verworfen. Das Pellet blieb bis zur Aufarbeitung auf Eis.
Die nach Beispiel 1 erhaltenen FBHE-Zellen mit und ohne Phospho
ramidon-Induktion (jeweils 500 µl Feuchtmasse) wurden in 15 ml
PBS-Puffer, 0,5 mM Diisopropylfluorophosphat 20 Minuten im Eisbad
mit Ultraschall behandelt. Nach Zentrifugation (20 Min. 1000 g)
werden die Membranen durch Zugabe von 5% Pluriol F68® zum Über
stand gefällt und durch erneute Zentrifugation bei 10 000 g ge
wonnen. Die Membranen werden mit 2 ml 100 mM Tris-Puffer, pH 8,0
digeriert und mit 1% Triton X-100® solubilisiert. Die Solubili
sate (jeweils 2,5 ml) wurden zentrifugiert, die Rückstände ver
worfen.
Die Solubilisate der +/--Phosphoramidon-induzierten Zellen wur
den getrennt auf eine Mono-Q®-HR 5/5-Säule (Fa. Pharmacia) unter
exakt gleichen Bedingungen chromatographiert. Die Säule wird mit
50 ml Tris-Puffer, pH 8,0, 0,1% Triton X-100 (A-Puffer) äquili
briert. Nach Auftrag des Solubilisates wird 15 Min. mit A-Puffer
gewaschen und ein 50 Min-Gradient linear mit B-Puffer (A-Puffer +
1 M NaCl gefahren (Fluß 0,2 ml/min). 20 Fraktionen a 0,5 ml wer
den gesammelt und mit Human Big Et-1 als Substrat getestet. Das
gebildete Et-1 wird mittels Reversed-Phase-HPLC in beschriebener
Weise (Beispiel 3) nachgewiesen und quantifiziert. Die beiden
Fraktionen mit der höchsten Enzymaktivität werden jeweils verein
igt.
Die Eluate aus den Mono-Q®-Chromatographien werden mittels Cen
tricon®-Röhrchen (Fa. Amicon) auf 250 µl konzentriert und je
weils über eine Superose 12 HR10/36 gelchromatographiert.
Bedingungen | |
Puffer: | |
20 mM Natriumphosphat, | |
250 mM NaCl, pH 7,4, | |
0,05% Triton × 100 | |
Fluß: | 0,5 ml/min |
Fraktion: | 0,5 ml |
Nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Test werden die Fraktionen
getestet und die jeweils 2 Fraktionen mit der höchsten Enzymakti
vität vereinigt.
Proteinbestimmungen aller Fraktionen erfolgten nach der Methode
von Bradford (Anal. Biochem. 72, 248 (1976)).
Die Reinigung von stimulierten und unstimulierten Zellen ergab
folgende Ergebnisse auf den verschiedenen Stufen der Reinigung:
Die beiden aktiven Fraktionen der Superose-12®-Chromatographie
wurden vergleichend auf ein 8%iges SDS-Polyacrylamidgel geladen.
Das Gelmuster von gereinigtem ECE-1 aus Phosphoramidon behandel
ten Zellen zeigt im Vergleich zu den nicht behandelten Zellen
eine zusätzliche Bande bei 250 000 Dalton. Trägt man die Proteine
mit dem Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT) auf, so zeigt sich
im Vergleich eine zusätzliche Bande bei 125 000 Dalton.
1 µl Enzymlösung, erhalten nach Beispiel 4, wurde mit 21 µl 50 mM
Tris, 50 mM Imidazol, 250 mM NaCl, pH 7,4 Puffer und 2,5 µl huma
nem Big-Endothelin (2 mg/ml in 0,1% Essigsäure in Wasser) ver
setzt. Nach 2 Stunden wurde die Reaktion zwecks Analyse des ge
bildeten Endothelins mit 72 µl 0,5% Trifluoressigsäure abge
stoppt. Die Probe wurde zentrifugiert und der Überstand durch
Analyse mittels Reversed Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatogra
phie (RP-HPLC), wie in (J. Takada et al., Biochem. Biophys. Res.
Comm. 176, 860 (1991), K. Ohnaka et al., Biochem. Biophys. Res.
Comm. 168, 1128 (1990)) beschrieben, identifiziert und durch Ver
gleich mit einem Endothelin-Standard mittels UV-Detektion (205
nm) quantifiziert.
Die Enzymaktivität läßt sich dann berechnen in Aktivität
Nach diesem Verfahren wurde die ECE-Aktivität der Aufarbeitung
von FBHE-Zellen zu verschiedenen Stufen der Reinigung bestimmt.
Gleichzeitig wurden die Proteinmengen nach der Methode von Brad
ford (Anal. Biochem. 72, 248 (1976)) bestimmt.
6 ml FBHE-Zellpellet (nach Beispiel 1) werden in 25 ml PBS-
Puffer digeriert und 15 Minuten im Ultraschallbad unter Eis
kühlung aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden durch Abzen
trifugation bei 10 000 g, 20 Min., entfernt. Der Überstand
wurde unter Rühren mit 3,6 mg Trypsin versetzt und 1,5 h bei
Raumtemperatur gerührt. Die Probe wurde 1 h bei 100 000 g
zentrifugiert und die im Rückstand befindlichen Membranen mit
25 ml 100 mM Tris-Puffer, pH 8,0 suspendiert.
Die 25 ml Membransuspension wurden auf 0,5 mM Diisopropylflu
orphosphat und anschließend 0,5% Triton X-100® eingestellt
und über Nacht im Eisbad aufbewahrt.
Eine Mono-Q®-FPLC-Säule, HR16/10, Fa. Pharmacia wurde mit
50 mM Tris-Puffer, pH 8,0; 0,05% Triton X-100® (A-Puf
fer) äquilibriert.
Nach Auftrag des Solubilisates wurde 30 Min. mit A-Puffer ge
waschen und danach mit einem linearen Gradienten innerhalb
100 Minuten nach Puffer B (Puffer A + 1 m NaCl) eluiert. Es
werden 30 Fraktionen je 10 ml gesammelt. Der Proteingehalt
der Proben wird nach der Bradford-Methode, die ECE-1
Aktivität nach Beispiel 3 bestimmt.
Die beiden Fraktionen mit der höchsten spezifischen Aktivität
wurden vereinigt.
Die vereinigten Mono-Q®-Eluate nach 4c) wurden über eine
30 KDa-Centricon-Membran (Fa. Amicon) auf 500 µl konzentriert.
Eine Superose-12®, HR 10/30-Säule (Fa. Pharmacia) wird mit 20
mM Na-Phosphat-Puffer, pH 7,4, 250 mM NaCl, 0,05% Triton X
100 äquilibriert und die konzentrierte Probe aufgetragen. Bei
einem Fluß von 0,5 ml wird mit dem Äquilibrierungspuffer
chromatographiert und 0,5 ml-Fraktionen gesammelt.
Die Bestimmung der spezifischen Aktivität der Fraktionen er
folgt wie in 4c). Die Fraktion mit der höchsten spezifischen
Aktivität ist unter e) angegeben; sie eluiert bei ca. 250 000
Dalton, geeicht an Standardproteinen unter gleichen Chromato graphiebedingungen.
Dalton, geeicht an Standardproteinen unter gleichen Chromato graphiebedingungen.
Das nach Beispiel 4 gereinigte ECE-1 wird auf einem 8%igen SDS-
Gel nach Lämmli (Nature 227, 680 (1979)) unter nicht reduzieren
den und reduzierenden Bedingungen (+DTT) analysiert. ECE-1 hat
danach im nicht reduzierten Zustand ein Molekulargewicht von
250 000 Dalton und zerfällt nach Reduktion in eine breite Bande
um 125 000 Dalton.
50 µl der nach Beispiel 4 gereinigten ECE-1-Lösung wurden mit
10%iger SDS-Lösung auf 0,25%-SDS-Gehalt eingestellt. Die Proben
wurden 20 Min. bei Raumtemperatur inkubiert und auf 1% Triton
X-100 eingestellt. Nach 20 Min. bei RT wurden 5 µl 250 mM Na-
Phosphatpuffer, pH 4,7 zugegeben. Danach wurden 0,25 µl PNGase
und 0,5 µg Endo F zugegeben. Die Proben wurden 8 h bei 37°C
inkubiert. Anschließend wurden die gleichen Enzymmengen erneut
zugegeben und 8 weitere Stunden bei 37°C inkubiert. Danach wurden
die Proben auf 50 µl einkonzentriert und im 4-12%igen SDS Gel
analysiert.
Im reduzierten Zustand verändert sich das apparente Molekularge
wicht von 125 000 Dalton durch Abspaltung der Zuckerreste mit der
Mischung von PNGase F/Endo F auf ca. 82 000 Dalton.
16 × 25 µg der nach Beispiel 4 erhaltenen ECE-1-Lösung wurden in
4-12%igen SDS-Polyacrylamid-Gradientengelen präparativ aufgetra
gen. Nach üblicher Färbung mit Coomassie blue wird das Gel ent
färbt und 4 × 40 Minuten in reinem Wasser gewässert. Die bei 250
KDa gefärbten Banden wurden mit einem Skalpell ausgeschnitten und
mit 200 µl 100 mM NH₄HCO₃-Lösung digeriert. Nach Zugabe von 0,5 µg
Trypsin wird über Nacht inkubiert, der Überstand danach abgenom
men. Der Rückstand wird erneut mit 0,5 µg Trypsin 5 h bei Raumtem
peratur in 200 µl 100 mM NH₄HCO₃-Puffer inkubiert. Danach wird die
Probe im speed-vac-Konzentrator zur Trockene eingeengt. Der Rück
stand wird mit 40 µl Wasser aufgenommen und mit 4 µl 40 mM Di
thiothreitol-Lösung 30 Min. gerührt. Danach wurden bei 37°C 4 µl
100 mM Jodacetamid-Lösung zugegeben. Nach 2 Stunden wird die
Probe zur Trockne eingeengt.
Die entstandenen Peptide wurden über eine 1 mm x 15 cm Reversed-
Phase-HPLC-Säule in einem linearen 3-Stunden-Gradienten von 0,5%
Trifluoressigsäure in Wasser nach 0,5% Trifluoressigsäure in 90%
Acetonitril aufgetrennt. UV-aktive Fraktionen wurden gesammelt
und die Primärsequenzen auf einem Gasphasen-Sequenzer bestimmt.
Folgende Partialsequenzen wurden bestimmt:
SEQ ID NO: 1:
Xaa-Xaa-Pro-Asn-Ala-Leu-Asn-Phe-Gly-Gly-Ile-Gly-Val- Val-Val-Gly-His-Glu-Leu-Thr-His-Ala-Phe . . .
Xaa-Xaa-Pro-Asn-Ala-Leu-Asn-Phe-Gly-Gly-Ile-Gly-Val- Val-Val-Gly-His-Glu-Leu-Thr-His-Ala-Phe . . .
SEQ ID NO: 2:
Xaa-Tyr-Xaa-Lys-Xaa-Gly-Asn-Leu-Arg-Pro
Xaa-Tyr-Xaa-Lys-Xaa-Gly-Asn-Leu-Arg-Pro
SEQ ID NO: 3:
Xaa-Ile-Ala-Xaa-Glu-Thr-Gl-Leu-Glu-Ile . . . (Ile) (Ile)
Xaa-Ile-Ala-Xaa-Glu-Thr-Gl-Leu-Glu-Ile . . . (Ile) (Ile)
SEQ ID NO: 4:
Xaa-Pro-Glu-Phe-Leu-Leu-Glu-Gly-Leu-Ile-Thr-Asp-Pro . . .
Xaa-Pro-Glu-Phe-Leu-Leu-Glu-Gly-Leu-Ile-Thr-Asp-Pro . . .
SEQ ID NO: 5:
Xaa-(Gln)-(Ala)-(Glu)-Asn-Val-Ile-Gln-Val-Xaa-Gln . . .
Xaa-(Gln)-(Ala)-(Glu)-Asn-Val-Ile-Gln-Val-Xaa-Gln . . .
SEQ ID NO: 6:
Val-Glu-Ile-Val-Phe-Pro-Ala-Gly-Ile-Leu-Gln-Ala-Pro-(Phe)-Tyr-Thr (Thr).
Val-Glu-Ile-Val-Phe-Pro-Ala-Gly-Ile-Leu-Gln-Ala-Pro-(Phe)-Tyr-Thr (Thr).
Die in Klammern angegebenen Aminosäuren wurden nicht absolut
sicher identifiziert.
SEQ ID NO: 1 belegt, daß es sich beim ECE-1 um ein neues Protein
aus der Familie der Metalloproteasen handelt da es im Vergleich
mit Sequenzen der Metallendopeptidasen NEP 24.11 und Thermolysin
signifikante Homologien von 72% bzw. 40% aufweist.
- (i) ANMELDER:
- (A) NAME: BASF Aktiengesellschaft
- (B) STRASSE: Carl-Bosch-Straße 38
- (C) ORT: Ludwigshafen
- (E) LAND: Bundesrepublik Deutschland
- (F) POSTLEITZAHL: D-67056
- (G) TELEPHON: 0621/6048526
- (H) TELEFAX: 0621/6043123
- (I) TELEX: 1762175170
- (ii) ANMELDETITEL: Endothelinkonversionsenzym-1 (ECE-1)
- (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 6
- (iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
- (A) DATENTRÄGER: Floppy disk
- (B) COMPUTER: IBM PC compatible
- (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
- (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 23 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
- (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
- (v) ART DES FRAGMENTS: inneres
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
- (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
- (v) ART DES FRAGMENTS: inneres
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
- (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
- (v) ART DES FRAGMENTS: inneres
- (ix) MERKMALE:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
- (B) LAGE: 7
- (D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Xaa=Glu oder Ile"
- (ix) MERKMALE:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
- (B) LAGE: 8
- (D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Xaa=Leu oder Ile"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
- (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
- (v) ART DES FRAGMENTS: inneres
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
- (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
- (v) ART DES FRAGMENTS: inneres
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
- (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
- (iii) ANTISENSE: NEIN
- (v) ART DES FRAGMENTS: inneres
- (ix) MERKMALE:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
- (B) LAGE: 7
- (D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Xaa=Ala oder Thr"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
Claims (6)
1. Endothelinkonversionsenzym, gekennzeichnet durch ein Moleku
largewicht von 250 000 Dalton und eine Aminosäurepartialse
quenz, die mindestens 80% Homologie zu SEQ ID NO:1 aufweist.
2. Verfahren zur Herstellung von Endothelinkonversionsenzym ge
mäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Säugerzellen mit
einem Inhibitor des Endothelinkonversionsenzyms zur Endothe
linkonversionsenzym-Überproduktion stimuliert werden und aus
diesen Zellen Endothelinkonversionsenzym mit üblichen pro
teinchemischen Maßnahmen isoliert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als
Inhibitor Phosphoramidon verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß
als Endothelzelle die Rinderzellinie FBHE verwendet wird.
5. Verfahren zur Herstellung von Endothelinkonversionsenzym ge
mäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein für die in
SEQ ID NO: 1 dargestellte Aminosäuresequenz codierendes Oligo
nukleotid als Hybridisierungsprobe verwendet wird, um ein Gen
für ein Endothelinkonversionsenzym aus einem Genpool zu iso
lieren und dieses Gen mit üblichen gentechnischen Methoden in
einem Wirtsorganismus exprimiert wird.
6. Verwendung von Endothelinkonversionsenzym gemäß Anspruch 1 in
Testverfahren zur Identifizierung von Hemmstoffen des Endo
thelinkonversionsenzym.
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SK598-96A SK59896A3 (en) | 1993-11-16 | 1994-11-10 | Endothelin-converting enzyme |
NZ275817A NZ275817A (en) | 1993-11-16 | 1994-11-10 | Endothelin converting enzymes, preparation and use |
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AU81070/94A AU8107094A (en) | 1993-11-16 | 1994-11-10 | Endothelin-converting enzyme |
JP7514199A JPH09505733A (ja) | 1993-11-16 | 1994-11-10 | エンドテリン変換酵素 |
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CN94194828A CN1141651A (zh) | 1993-11-16 | 1994-11-10 | 内皮素转化酶(ece) |
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