CN202903794U

CN202903794U - 检测黄曲霉毒素b1残留的胶体金试纸卡

Info

Publication number: CN202903794U
Application number: CN 201220379937
Authority: CN
Inventors: 何方洋; 万宇平; 崔海峰; 张禹; 刘琳; 余厚美; 吴小胜; 尚朋朋
Original assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2012-08-01
Filing date: 2012-08-01
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2022-08-01

Abstract

本实用新型提供了一种检测黄曲霉毒素B1残留的胶体金试纸卡，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，结合物释放垫的部分区域覆盖于样品吸收垫之下。本实用新型试纸卡样品吸收垫可以将检测液体充分吸收，与结合物释放垫上喷涂的金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差，操作简便快速、结果显示形象直观准确、成本低，灵敏度高。

Description

检测黄曲霉毒素B1残留的胶体金试纸卡

技术领域

本实用新型涉及一种检测黄曲霉毒素B1的胶体金试纸卡。

背景技术

黄曲霉毒素（aflatoxin，AF）是迄今发现污染农产品毒素最强的一类生物毒素，也是强致癌物。它是由黄曲霉菌（Aspergillus flavus）和寄生曲霉菌（A．parasiticus）等多种真菌产生的一类代谢产物，一群结构相似的化合物。它易天然存在于花生、棉籽、玉米、小麦和稻米等农作物中，具有强烈的毒性和致癌性，是目前化学致癌物中最强的一种致癌诱变剂，其毒性比***强10倍，其致癌性比二甲基亚硝胺强75倍。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为I类致癌物，其作用的靶器官主要为肝脏。最为常见的有AF B1、B2、G1、G2，其中AF B1的存在量与毒性都是最大的。研究表明，人们食用这些被污染的食品后会导致急性中毒，引起肝坏死；慢性中毒则可引发人的肝癌、胃癌、肾癌或食道癌等严重的疾病。

1995年，世界卫生组织制定的食品中黄曲霉毒素最高允许浓度为15 μg/kg。美国联邦政府有关法律规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒素含量(指AF B1+B2+Gl+G2的总量)不能超过15μg/kg。人类消费的牛奶中的AF总含量不能超过0.5μg/kg，其他动物饲料中的AF总含量不能超过300μg/kg。欧盟国家要求人类生活消费品中的黄曲霉毒素B1的含量不能超过0.05 μg/kg。目前，对黄曲霉毒素检测的方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、免疫分析法、质谱法、免疫亲和荧光法等。高效液相色谱法灵敏度高、分离能力强、特异性好，但有些样品需要作彻底有效的前处理，不适合于大批量样品的检测，并且设备仪器昂贵，不易普及。酶联免疫吸附法是目前常使用的一种检测方法，它具有快速、灵敏、可定量、对样品纯度要求不高等优点，特别适用于大批量样品的检测，但由于需要酶标仪和操作熟练的人员以及检测时间相对较长，所以不适合现场快速检测。胶体金免疫层析法与酶联免疫法相比检测时间更短，稳定性好、操作简便、无需其他仪器设备，结果判断直观可靠，适用于进行现场快速筛选。

实用新型内容

本实用新型的目的在于针对上述不足提供一种灵敏度高、成本低、稳定性好、操作简单、检测时间短、检测黄曲霉毒素B1的试纸卡。

本实用新型的试纸卡包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，结合物释放垫不是完全覆盖在样品吸收垫之下，而是部分区域覆盖于样品吸收垫之下，优选结合物释放垫的三分之一区域覆盖于样品吸收垫之下。这样可以延长检测结果观察时间，样品吸收垫也可以将检测液体充分吸收，与金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差，还可以防止检测样本中一些干扰成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。

所述反应膜上分别包被有黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹。

本实用新型试纸卡的底板可为PVC板或其它硬质而不吸水的材料；反应膜可为硝酸纤维素膜；样品吸收垫可由聚酯材料或玻璃棉制成；吸水垫为吸水纸；结合物释放垫可由纤维制成，结合物释放垫垫喷涂有黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金结合物。

偶联黄曲霉毒素B1的载体蛋白可用牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白等，在反应膜上的检测线和质控线相互平行且与样品液流动方向垂直，检测线位于距离结合物释放垫一侧0.4cm处。

本实用新型试纸卡具有如下有益效果：

1. 灵敏度高。黄曲霉毒素B1药物快速检测试纸卡以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测试纸卡具有较高的灵敏度，对黄豆、玉米等谷物及饲料样品的检测限为5μg/kg。

2. 操作简便快速。使用快速检测试纸卡时无需任何其它试剂，只要将样品前处理后用滴管滴入试纸卡孔内，滴加3滴，加样后计时，5~10min内观察结果。

3. 成本低，投资少。使用快速检测试纸卡，不需另配仪器设备及其他试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。

4. 显示检测结果形象、直观准确。快速检测试纸卡以显示红线印迹作为试纸卡的阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上只有质控线显示红色表示在被检测样品液中黄曲霉毒素B1浓度高于检测限，检测线和质控线均显示红色表示在被检测样品中不含黄曲霉毒素B1或浓度低于检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现误判。

5. 易于大范围推广应用。快速检测试纸卡操作简单，检测范围广，能较好满足不同层次人员的需要，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

附图说明

图1为黄曲霉毒素B1快速检测试纸卡结构示意图，其中，1、样品吸收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测线；6、质控线；7、底板；

图2为黄曲霉毒素B1快速检测试纸卡阴性（图2a）、阳性（图2b）、无效（图2c）显色示意图，其中T为检测线，C为质控线。

具体实施方式

参见图1：样品吸收垫1用聚酯材料制成，结合物释放垫2由纤维制成吸附有黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金标记物，反应膜3为硝酸纤维素膜，吸水垫4为吸水材料制成，检测线5包被有黄曲霉毒素B1半抗原－载体蛋白偶联物，质控线6包被有羊抗鼠抗抗体，底板7为PVC背衬，在PVC背衬上按顺序粘附反应膜、吸水垫、结合物释放垫和样品垫，将样品垫覆盖在结合物释放垫三分之一处。

要制成黄曲霉毒素B1快速检测试纸卡首先需制备黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物，用于制备检测线；制备胶体金，用于制备金标抗体；制备羊抗鼠抗抗体，用于制作质控线。以下是相关材料的制备方法：

1. 黄曲霉毒素B1半抗原

0.10g黄曲霉毒素B1在2ml二甲基亚砜（DMSO）中的混合液，60℃下缓慢滴加入0.1ml 1,3-丙二胺和0.1ml吡啶在2ml DMSO的混合液中，滴加完毕后，继续反应12h，旋蒸除去溶剂和未反应的丙二胺，定量得到黄曲霉毒素B1的丙二胺单缩合物。

2. 黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白的偶联

1）免疫原的制备

取半抗原20mg用2ml水溶解得到溶液Ⅰ；取3%的戊二醛0.5ml逐滴加入到溶液Ⅰ中，室温搅拌反应24h得到溶液Ⅱ；取牛血清白蛋白（BSA）50mg用4ml水溶解得到溶液Ⅲ；将溶液Ⅱ缓慢加入到溶液Ⅲ中，室温搅拌反应过夜得到溶液Ⅳ；加入30mg NaBH₄还原，用0.02mol/L的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得免疫原。

2）包被原的制备

取卵清蛋白（OVA）50mg用4ml水溶解得到溶液Ⅴ；取碳化二亚胺（EDC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）各50mg用2ml水溶解完全后加入溶液Ⅴ中，室温搅拌反应30min得到溶液Ⅵ；取半抗原25mg用3ml水溶解得到溶液Ⅶ；将溶液Ⅵ缓慢加入到溶液Ⅶ中，室温搅拌反应24h，用0.02mol/L的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得包被原。

3. 抗黄曲霉毒素B1药物单克隆抗体的制备

（1）动物免疫

将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为100μg/只，使其产生抗血清。

（2）细胞融合和克隆化

小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

（3）细胞冻存和复苏

将黄曲霉毒素B1单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

（4）单克隆抗体的制备与纯化

将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射黄曲霉毒素B1的单克隆杂交瘤细胞株5×10⁶个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

4. 羊抗鼠抗抗体的制备

以山羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

5. 黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金标记物的制备

5.1胶体金的制备

用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%，置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，在持续搅拌下每100ml 0.01%氯金酸加入1.25ml 1%柠檬酸三钠，继续煮沸，至液体呈透亮的红色时停止加热，冷却至室温后补足失水，4℃保存。

5.2 黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7.0，按每毫升胶体金溶液加入20~50μg黄曲霉毒素B1单克隆抗体，继续搅拌混匀30min, 加入10%BSA至终浓度为1%（体积百分含量），静置10min。12000rpm、4℃离心30min, 弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含酪蛋白0.02%~0.1%、吐温-20 0.05%~0.2%（质量百分含量）、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

6. 黄曲霉毒素B1快速检测试纸卡检测操作方法

6.1样本前处理

称取3.0g±0.05g粉碎的样品至15ml或50ml聚苯乙烯离心管中，加入6ml 乙腈，将瓶塞盖紧，振荡5min；室温（20-25℃）3000g以上离心5min；移取1ml上清液到玻璃离心管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入0.4ml样品复溶液（0.02mol/L磷酸盐缓冲液），涡动30s。

6.2用试纸卡检测

用吸管吸取稀释后的待检样品溶液滴加入试纸卡加样孔内，滴加3滴，加后计时，反应5~10min观察结果。超过15min后样品检测判读无效。

6.3检测结果分析

黄曲霉毒素B1在样本中的含量高于或等于试纸卡对其的最低检测限时，黄曲霉毒素B1 单克隆抗体-胶体金标记物与黄曲霉毒素B1结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测区内因为竞争反应，不会与黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带。如图2所示。

阴性：当质控线显示一条红色条带，检测线同时也显示出一条红色条带，且检测线颜色接近或浅于质控线时，判为阴性，如图2a所示。

阳性；当质控线显示一条红色条带，而检测线不显色，判为阳性，如图2b所示。

无效：当质控线不显示出红色条带，则无论检测线显示出红色条带与否，该试纸卡判为无效，如图2c所示。

Claims

1.一种检测黄曲霉毒素B1残留的胶体金试纸卡，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，其特征在于，结合物释放垫的部分区域覆盖于样品吸收垫之下。

2.如权利要求1所述的试纸卡，其特征在于，结合物释放垫的三分之一区域覆盖于样品吸收垫之下。

3.如权利要求1或2所述的试纸卡，其特征在于，所述反应膜上具有包被有黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹。

4.如权利要求3所述的试纸卡，其特征在于，所述的检测线与质控线平行。

5.如权利要求3所述的试纸卡，其特征在于，检测线位于距离结合物释放垫一侧0.4cm处。

6.如权利要求1或2所述的试纸卡，其特征在于，所述底板为PVC底板或其它硬质不吸水的材料，所述反应膜为硝酸纤维素膜，所述结合物释放垫由纤维制成，所述样品吸收垫由玻璃棉或聚酯材料制成，所述吸水垫为吸水纸。

7.如权利要求1或2所述的试纸卡，其特征在于，所述的结合物释放垫喷涂有黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金结合物。