CN105334323A - 一种检测齐帕特罗的方法和试纸条及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种检测齐帕特罗的方法和试纸条及其应用。本发明的方法是胶体金免疫层析技术和竞争性免疫层析技术结合得到的方法，抗体为胶体金标记的齐帕特罗单克隆抗体，竞争性抗原齐帕特罗固定在检测试纸条的检测线上；将待检样品和胶体金标记的齐帕特罗单克隆抗体反应，再和竞争性抗原反应：当检测线上没有出现红色条带，说明待检样品含有齐帕特罗；当检测线上出现红色条带，说明待检样品不含齐帕特罗或是齐帕特罗含量很低，没有超过检测限。试纸条包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫，结合垫上设置有金标抗体，层析膜上设置有检测线和质控线，检测线。检测阳性样品时，检测线上无颜色显示。

Description

一种检测齐帕特罗的方法和试纸条及其应用

技术领域

本发明属于食品安全检测领域和免疫检测技术领域，特别涉及一种检测齐帕特罗的方法和试纸条及其应用。

背景技术

食品安全是重大的民生问题，关系着广大人民群众的身体健康、生命安全，也是国家经济发展、社会稳定的重要基础。近年我国各种食品安全性低的问题已经对民众、社会、经济、当地政府形象、我国的国际声誉造成了不良的影响，食品安全的监控以及检测技术的开发尤其需要重视。

齐帕特罗(Zipaterol)是一种β2肾上腺素受体激动剂，能选择性激动平滑肌的β2受体，使牛、猪、羊和家禽等多种动物体内的营养成分由脂肪向肌肉转移，显著增加酮体瘦肉素，具有“瘦肉精”效果。美国、加拿大等20多个国家批准肾上腺素受体激动剂包括齐帕特罗用作新型激素类畜禽饲料添加剂，欧盟(96/22/EC)和中国(农业部公告176号，2002年)禁止使用，现实是国内外非法滥用严重存在。

齐帕特罗是畜禽肌肉和内脏残留的。由于齐帕特罗具有与莱克多巴胺(“瘦肉精”)相似的增加瘦肉率效果，但毒副作用相对低些，用作饲料添加剂的隐蔽性强，加之国内没有检测齐帕特罗的试剂，未对畜禽肉类等进行齐帕特罗残留的检测，齐帕特罗已被作为“瘦肉精”替代品非法使用和蔓延开来，对人民群众的身体健康和生命安全造成危害。

对于齐帕特罗残留，主要检测方法包括仪器分析法和免疫分析法两种。

仪器分析法：仪器分析法主要使用色谱技术对样品进行分离纯化，再采用各种检测器对分离出来的单组分进行检测。分离技术主要有薄层层析、液相色谱、气相色谱、毛细管电泳等，检测器则采用紫外检测器、红外检测器、荧光检测器、质谱等。采用仪器分析法具有准确、灵敏、假阳性率低等特点，但是样品前处理烦琐费时，需要昂贵的仪器，需要有经过专门训练的专业人员在专门的实验室进行操作。一次只能分析一个样品，分析时间长，分析成本高，难以适合基层单位用于大批量样品的分析，限制了其推广应用。

高效液相色谱法：齐帕特罗分子可以与C18或C8反相柱结合，因此可以利用这种柱子对样品进行分离，流动相采用磷酸和乙腈的混合物，分离出的组分主要采用紫外检测器、二极管阵列检测器或质谱进行检测。

气相色谱质谱联用法(GC-MS)：气质联用法是现在公认的对齐帕特罗最灵敏最准确的检测方法。其固定相采用非极性毛细管柱进行分离，以双三甲基硅烷三氟乙酰胺为衍生化试剂，检测器则采用质谱进行检测。

免疫分析法：免疫分析法是“迈向21世纪的医学检验技术”之一，现在已经广泛应用于内分泌学、临床医学、微生物学、植物学以及其他领域，被列为20世纪90年代优先研究、开发和利用的分析技术。免疫分析具有样品前处理简单，特异性强，灵敏度高，分析时间短，分析通量大，成本低等特点，是一种低廉而快速的分析检测技术。然而，免疫分析法中使用的抗体通常对一系列的结构类似物有较高的交叉反应，造成较高的假阳性率，一般适合于多残留分析，并作为初始的筛选手段，单组分的进一步确证还必须使用仪器分析法。而且，有些物质免疫原性差(如半抗原物质)，抗体制备较难，制备周期长，受到很大的限制。近些年来发展起来的单克隆抗体技术和基因工程抗体技术则不断的对这些问题进行改善，使免疫分析技术有了新的进步。根据抗体标记物的不同，免疫分析法主要包括放射免疫分析法(RIA)、酶免疫分析法(EIA)、荧光免疫分析法(FIA)以及金标免疫分析法(GIA)等。

由于齐帕特罗在我国违法滥用的现象仍然非常严重。尽管政府明令禁止克伦特罗的使用，但是中毒事件仍不时有发生，其中一个重要原因就是检测手段滞后，适合基层和消费者使用的快速检测手段更是滞后。因此，研制灵敏、准确、成本低廉、快速且适合于现场使用的克伦特罗分析检测方法，对于加强齐帕特罗的残留监控具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测齐帕特罗的方法。

本发明的另一目的在于提供实现上述检测齐帕特罗的方法的试纸条。

本发明的再一目的在于提供所述试纸条的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测齐帕特罗的方法，是胶体金免疫层析技术和竞争性免疫层析技术结合得到的方法，抗体为胶体金标记的齐帕特罗单克隆抗体，竞争性抗原齐帕特罗固定在检测试纸条的检测线上；将待检样品和胶体金标记的齐帕特罗单克隆抗体反应，再和竞争性抗原反应：当检测线上没有出现红色条带，说明待检样品含有齐帕特罗；当检测线上出现红色条带，说明待检样品不含齐帕特罗或是齐帕特罗含量很低，没有超过检测限；

所述检测齐帕特罗的方法，具体包含如下步骤：

(1)制备齐帕特罗单克隆抗体：采用体内腹水诱导法制备齐帕特罗单克隆抗体；

(2)制备金标抗体：将步骤(1)得到的齐帕特罗单克隆抗体和胶体金结合，得到金标抗体；

(3)固定竞争性抗原：将齐帕特罗固定在检测试纸条的检测线上；

(4)反应：将待检样品与金标抗体反应，再和固定在检测线上的齐帕特罗反应；

(5)判定：当检测线上没有出现红色条带，说明待检样品含有齐帕特罗；当检测线上出现红色条带，说明待检样品不含齐帕特罗或是齐帕特罗含量很低，没有超过检测限；

步骤(1)中所述的齐帕特罗单克隆抗体优选通过如下方法制备得到：将经齐帕特罗免疫的Balb/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用HAT选择性培养基培养筛选杂交瘤细胞，得到能稳定分泌齐帕特罗抗体的杂交瘤细胞的单克隆细胞株，纯化，得到齐帕特罗单克隆抗体；

步骤(2)中所述的胶体金的颗粒大小优选为20～30mm，更优选为29mm；

步骤(2)中所述的金标抗体优选通过如下步骤制备得到：

①用超纯水将氯化金配制成质量百分比0.01％的溶液，加热至沸腾；接着加入浓度为质量体积比1％的柠檬酸三钠水溶液，继续加热到出现透明的橙红色为止，得到胶体金溶液；

②将胶体金溶液的pH值调节至8～9，在搅拌状态下加入齐帕特罗单克隆抗体，反应；

③在搅拌状态下加入牛血清白蛋白，得到反应溶液，牛血清白蛋白在反应溶液中的终浓度为质量体积比1～5％；静置，离心，弃上清，取沉淀，沉淀为金标抗体；

步骤①中所述的氯化金和所述的柠檬酸三钠按质量比1:1～2.4配比；

步骤②中所述的胶体金和所述的齐帕特罗单克隆抗体按3.5×10^-3mol：40g配比；

步骤②中所述的pH值优选通过硼酸溶液调节；

所述的硼酸溶液的浓度优选为0.2～0.5mol/L；

步骤②中所述的pH值优选为8.5；

步骤②中所述的反应的时间优选为30min～1h；更优选为1h；

步骤③中所述的牛血清白蛋白在反应溶液中的终浓度优选为质量体积比1％；

步骤③中所述的静置的时间优选为30～60min；更优选为60min；

步骤③中所述的离心的条件优选为8000～15000rpm离心5～15分钟；更优选为15000rpm离心15min；

实现上述检测齐帕特罗的方法的试纸条，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；其中：结合垫上设置有金标抗体，层析膜上设置有检测线和质控线，检测线、质控线、吸水垫依次排布，检测线上固定有齐帕特罗，质控线上固定有抗鼠的二抗；

所述的底板的材料优选为PVC板；

所述的结合垫的材料优选为玻璃纤维膜或聚酯膜；

所述的层析膜的材料优选为硝酸纤维素膜；

所述的吸水垫的材料优选为吸水纸；

所述的金标抗体优选通过如下步骤制备得到：

①用超纯水将氯化金配制成质量百分比0.01％的溶液，加热至沸腾；接着加入浓度为质量体积比1％的柠檬酸三钠水溶液，继续加热到出现透明的橙红色为止，得到胶体金溶液；

②将胶体金溶液的pH值调节至8～9，在搅拌状态下加入齐帕特罗单克隆抗体，反应；

③在搅拌状态下加入牛血清白蛋白，得到反应溶液，牛血清白蛋白在反应溶液中的终浓度为质量体积比1～5％；静置，离心，弃上清，取沉淀，沉淀为金标抗体；

所述的抗鼠的二抗优选为羊抗鼠IgG或兔抗鼠二抗IgG；

所述的试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)将金标抗体溶液均匀地喷涂于结合垫上；

(2)在层析垫上设置检测线和质控线，检测线上固定齐帕特罗，质控线上固定抗鼠的二抗；

(3)将吸水垫、层析垫、结合垫、样品吸收垫由底板的顶部依次往底部黏贴，其中层析垫的质控线靠近吸水垫，检测线则靠近结合垫；切条，即得检测齐帕特罗的试纸条；

所述的金标抗体溶液通过如下步骤制备得到：

①用超纯水将氯化金配制成质量百分比0.01％的溶液，加热至沸腾；接着加入浓度为质量体积比1％的柠檬酸三钠水溶液，继续加热到出现透明的橙红色为止，得到胶体金溶液；

②将胶体金溶液的pH值调节至8～9，在搅拌状态下加入齐帕特罗单克隆抗体，反应；

③在搅拌状态下加入牛血清白蛋白，得到反应溶液，牛血清白蛋白在反应溶液中的终浓度为质量体积比1～5％；静置，离心，弃上清，取沉淀，沉淀为金标抗体；

④用TBS溶液溶解沉淀，得到金标抗体溶液；

所述的TBS溶液的浓度优选为0.02～0.05mol/L，更优选为0.02mol/L；

所述的TBS溶液的pH值优选为8.2；

所述的试纸条的应用，包括以下步骤：

(1)在样品吸收垫上加入待测样品，在毛细作用下，样品液体向吸水垫一端泳动；

(2)结果的判断：阴性：质控线(C线)出现红色条带，检测线(T线)也出现红色条带，表明样本中不含有齐帕特罗项或是齐帕特罗含量低于检测限；阳性：质控线(C线)出现红色条带，而检测线(T线)无红色条带出现，表明样本中对应的检测项含量高于检测限；无效：质控线(C线)与检测线(T线)均无红色条带出现或者质控线(C线)无红色条带出现但检测线(T线)有红色条带出现，说明此试剂卡已失效。

本发明的原理：

胶体金免疫层析技术是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术。其原理是以胶体金作为示踪标记物，以微孔滤膜为固相载体，包被己知抗原或抗体，加入待检样本后，经滤膜毛细管作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被抗原或抗体结合，胶体金结合物大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。

本发明所提供的纸条，采用竞争抑制免疫层析的原理，当样品溶液滴入样品孔后，样品溶液中的齐帕特罗抗原与金标抗体相结合，进而封闭金标抗体上待检物的抗原结合位点，阻止金标抗体与纤维素膜上待检物蛋白偶联物结合。当样本中待检物质含量高于检测限时，检测线(T线)无红色条带出现，结果为阳性；反之，当样本中不含有待检物或是含量低于检测限时，检测线(T线)有红色条带出现，结果为阴性。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)首先，本发明采用竞争抑制免疫层析的原理，特异性强；

(2)本发明提供的免疫检测方法，特别提供了实现该方法的试纸条，操作简单、检测时间短(15分钟以内)、灵敏度高的特点，能够弥补仪器分析法、高效液相色谱法、气相色谱质谱联用法等操作时间长、仪器昂贵等缺点。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1齐帕特罗单克隆抗体的制备

(1)齐帕特罗抗原合成基本试验步骤

①精确称取齐帕特罗22mg，溶解于2mlpH3.0、0.1mol/L的冰冷盐酸溶液中。缓慢加入pH2.0、30mg/mL的冰冷亚硝酸钠溶液2mL，在0～5℃下重氮化反应20min，得到齐帕特罗重氮盐。同时精确称取100mg牛血清蛋白溶解于5mlpH8.6、0.1mol/L的磷酸缓冲溶液中，将反应好的齐帕特罗重氮盐逐滴加入其中，用1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.5，4℃下反应过夜。将此反应液用pH7.4、0.01mol/L的PBS溶液(含0.15mol/LNaCl)透析3d，每天换水4次，收集透析后的反应液，得到齐帕特罗抗原。采用可见分光光度法测定其结合比。

②包被抗原采用卵清蛋白(OVA)为载体进行制备，方法同步骤①。

(2)使用齐帕特罗抗原免疫小鼠

取健康5周龄雌性二级Balb/c小鼠(广东省医学实验动物中心)6只进行免疫。第一次基础免疫将0.1mL步骤①制备的齐帕特罗抗原(浓度以蛋白计为1mg/mL)与等量完全弗氏佐剂用搅拌器充分混匀乳化，进行腹腔注射(注射量0.2mL/只)。四周后开始进行加强免疫，佐剂换为不完全弗氏佐剂，每隔两周加强免疫一次(采取腹腔、足垫、肌肉结合注射方式)，在每次加强注射后的10d左右从Balb/c小鼠的尾部采血，收集到的血液在37℃下放置1h，10000rpm转速下离心4min，用吸管吸取析出来的血清，用0.5ml离心小管分装，于冰箱中冻存以备检测用。

(3)细胞融合杂交瘤技术筛选齐帕特罗单克隆抗体

①将1×10⁸脾细胞(从步骤(2)免疫后的小鼠脾脏中获取)和2×10⁷SP2/0骨髓瘤细胞按1:5的比例混合，在50mL塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm离心8min，弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。

②用手指轻击离心管底部，使细胞沉淀略加松动，成糊状。然后置37℃水浴中，将吸管***管底，在60s内边搅拌边加入预热的1mL、质量百分比50％的PEG-4000(含体积百分比5％的DMSO)。静置60s后，于37℃水浴中90s内加入10mL预热的完全DMEM培养液(即DMEM+10％v/v小牛血清)，以稀释PEG终止作用。开始时缓慢加，后可稍快。轻轻悬浮一次，以1000rpm离心6min，弃去上清，

③用6mL左右完全培养液轻轻悬浮，切记不能用力吹打以免使融合在一起的细胞散开。根据所用96孔培养板的数量，补加HAT培养液到76.8mL，轻轻混匀，将混匀悬液接种于有饲养细胞的96孔板中，每孔0.1ml，一次接种8块板。将培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

④融合后6～9d，用HT培养基半量换液1次，在12～14d后根据增殖情况改用15～20％的完全DMEM培养液。约6～7d后出现杂交瘤细胞集落，细胞大、圆且透亮。待集落长至孔底1/3时，在培养板的盖板上画上克隆生长的标记，此时即可取上清检测相应的特异性抗体。

⑤用竞争抑制ELISA方法，筛选出分泌齐帕特罗抗体的杂交瘤细胞株。将一株亲和力高的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株1A5。

(4)腹水生产及齐帕特罗单克隆抗体纯化

①选用标准BALB/c小鼠(广东省医学实验动物中心)，先用降植烷进行小鼠腹腔注射，一周后每只小鼠按照5×10⁶杂交瘤细胞1A5接种到小鼠腹腔中去。1周后采集腹水，将腹水置于37℃静置2小时后，13000rpm离心10min，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，再过玻璃纤维柱，收集到澄清的腹水。

②齐帕特罗单克隆抗体纯化：采用辛酸-硫酸铵沉淀法进行初步纯化，取腹水约3mL，加入2倍体积0.06mol/L、pH4.5的醋酸钠缓冲液。将正辛酸(33μg/mL腹水)逐滴慢慢加入样品中，边加边搅拌，加完后继续搅拌30min，4℃下10000rpm离心30min，去沉淀(白蛋白和其它非IgG蛋白)。取上清经0.45μm微孔膜过滤，与1/10体积10×PBS混合(10×PBS：80gNaCl、2gKCl、11.5gNa₂HPO₄、2gKH₂PO₄、0.5845gEDTA、1000ml蒸馏水，pH7.4)，用1mol/LNaOH溶液调pH值到7.4。上清冷却到4℃，加硫酸铵(0.277g/mL，使最终饱和度为45％)。搅拌30min，4℃下10000rpm离心30min，弃上清。用少量PBS溶液溶解沉淀，用50～100倍体积的PBS透析过夜，换液3次。透析后的溶液用PEG-6000适当浓缩，4℃下贮藏备用。采用SDS-PAGE电泳检测其纯度及浓度，同时使用ELISA检测纯化抗体效价。齐帕特罗抗体纯度达到85％以上，浓度为10.25mg/mL，效价达到1∶2.56×10⁵。

实施例2结合垫的制备

1.胶体金的制备

(1)采用柠檬酸三钠法分别制备平均粒径约为20、30、40nm的胶体金。20nm胶体金的制备方法如下：利用冷凝回流装置将50mL质量分数为0.01％的氯金酸溶液加热至沸腾后迅速加入质量分数为1％的柠檬酸三钠溶液1.2ml，待颜色稳定后继续煮沸10min，冷却，4℃保存备用。以同样的方法制备30、40nm的胶体金，不同之处为分别加入0.75、0.5ml的质量分数为1％的柠檬酸三钠溶液。通过光谱扫描、纳米力度激光仪、透射电镜观察3种胶体金的分布和形貌特征。经检测，分别得到平均粒径为20、29、40nm的胶体金。

2.胶体金标记抗体蛋白

(1)抗体蛋白的处理：将待标记的抗体蛋白溶液用pH7.2、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液4℃透析过夜，除去其中多余的盐离子，以12000rpm于4℃离心1h，去除其中的聚合物。

(2)胶体金溶液的准备：本发明用的胶体金的平均粒径是29nm，浓度为0.35mol/L。由于金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞，故不能用pH计测定金溶液的pH值，一般使用精密的pH试纸。用0.2～0.5mol/L硼酸调节胶体金溶液pH至8.5。

(3)胶体金标记抗体蛋白：将10mL胶体金溶液加入50mL的聚塞离心管中，于振荡器中摇匀震荡，恢复至室温；用pH8.6、0.1mol/L的磷酸缓冲溶液中稀释单抗蛋白至合适浓度，含40g抗体蛋白的抗体稀释液加入至胶体金溶液中，于室温条件下震荡混匀30min；逐滴加入1mL质量百分比10％BSA作为封闭液以封闭多余的胶体金结合位点，持续反应震荡15min。

(4)金标抗体的纯化：采用低温高速离心法纯化金标单抗，以除去其中未标记的抗体、未标记的胶体金、未标记的BSA以及标记过程中形成的聚合物。具体操作为：将金标抗体用2000rpm，4℃离心20min，弃去沉淀；将上清以10000rpm，4℃离心30min，弃去上清；将沉淀以原体积的金标稀释液溶解，重复离心2～3次，沉淀溶于原体积1/10金标稀释液中，4℃保存备用。

3.结合垫制备

取进口的玻璃纤维素膜，切成规格大小为0.7×6cm的金垫，然后将50μL金标抗体结合物溶液均匀地喷涂于玻璃纤维素膜上，烘干后备用。

实施例3检测试纸的制备

1.生产检测试纸条所需材料

①硝酸纤维素膜(NC膜)：由美国Millipore/NC进口，硝酸纤维膜的规格为30cm×3m/HAHY00010：

一条免疫荧光试纸条所需硝酸纤维膜面积为：2.5cm×0.6cm。

生产10万次份试纸条所需要硝酸纤维膜总面积为：

2.5cm×0.6cm×10万＝1.56×10⁵cm²；

生产10万次份试纸条所需硝酸纤维膜的总卷数：

2.25×10⁵cm²/30×300cm²＝20卷。

②所需抗原的总量：4mg/mL×2.0μl/cm×0.25cm×10万＝20mg

③所需羊抗兔IgG的总量：1mg/ml×2.0μl/cm×0.25cm×10万＝50mg

2.纤维膜上的C(质控线)、T(检测线)的喷制

选定二抗浓度为1mg/mL，抗原浓度为4mg/mL，用划膜机划到不同的NC膜上，两线相距4mm，制作成试纸条。

3.将实施例2制备好的结合垫组装到上述硝酸纤维膜上结合垫的位置(此时硝酸纤维膜已喷射有C线，T线)。最后，同样原理，将样品垫组装到试纸条中样品垫的位置。

4.分切及成品组装

样品吸收垫、结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维膜(检测线靠近结合垫，质控线靠近吸水垫)、吸水垫，首尾相互衔接，优化衔接条件，按顺序固定于不干胶底板上；用切割机切成4mm宽的试纸条条，装入检测卡中即完成试纸条的组装。

实施例4试纸条检测限的确定

将齐帕特罗浓度为1mg/mL的标准品用阴性样品配制成阴性空白、1、2、3、4、5、8、10μg/kg等标准梯度系列溶液。用吸管吸取80μL标准系列样品液于试纸条的加样孔中，反应3～6min后判断结果，只有质控线出现红色的为阳性，检测线和质控线都出现红色的为阴性。检测结果如表1所示：在测试的第3分钟时试纸条开始出现颜色，4分钟显色明显，在第5分钟后显色达到稳定。同一批次及不同批次重复试验，灵敏度均为2μg/kg。

表1不同时间内观察测试试纸条灵敏度实验结果

注：“；”左右分别表示C线T线显色程度；+表示显色强度；-表示不显色；+/-表示隐约可见

实施例5

1.样本前处理

(1)尿样前处理

直接取澄清新鲜无污染尿样待检(注意：尿样不要在冷藏后立即进行检测。尿样样本必须收集在洁净、干燥、不含有任何防腐剂的塑料尿杯或玻璃容器内，如尿样混浊，可在室温4000rpm条件下离心5min处理后待检。如尿样样本不能及时检测，可于2～8℃冷藏保存24小时，长期保存需冷冻-20℃，切忌反复冻融样本。)

(2)组织前处理

称取5g匀质的肌肉组织样本放于干净的小瓶中，置于90℃以上水浴锅中水浴10分钟；冷却至常温后，取1～2滴煮出的溶液检测(尽量吸取肉汁中上清)。

(3)饲料前处理

称取5g饲料，加入10ml去离子水，再加入5ml乙酸乙酯，振荡3～5min，4000rpm离心10min。取2ml上清于空气/氮气于50℃水浴中干燥，加入0.3ml去离子水与2ml正己烷，振荡1min，4000rpm离心5min，除去上层液体，取下层液体2滴检测。

2.检测效果

(1)尿样有益效果检验

根据尿样前处理方法处理尿样，取尿样液2滴，滴加到检测卡下方小孔上，待5分钟后，若显示2条线(T+C)即判定为阴性，若显示1条线(C)即判定为阳性，若出现其他结果(如未有指示线出现)机判定为检测卡失效。表明本发明的齐帕特罗胶体金试纸条对尿样的检测限为2μg/kg，检测结果如表2所示：

表2

(2)组织有益效果检验

根据组织前处理方法处理组织，取样液2滴，滴加到检测卡下方小孔上，待5分钟后，若显示2条线(T+C)即判定为阴性，若显示1条线(C)即判定为阳性，若出现其他结果(如未有指示线出现)机判定为检测卡失效。表明本发明的齐帕特罗胶体金试纸条对组织的检测限为2μg/kg，检测结果如表3所示：

表3

(3)饲料有益效果检验

根据实施例2饲料前处理方法处理饲料，取样液2滴，滴加到检测卡下方小孔上，待5分钟后，若显示2条线(T+C)即判定为阴性，若显示1条线(C)即判定为阳性，若出现其他结果(如未有指示线出现)机判定为检测卡失效。表明本发明的齐帕特罗胶体金试纸条对饲料的检测限为2μg/kg，检测结果如表4所示：

表4

3.稳定性试验

将密封保存于常温试纸每隔7天检测一次，进行稳定性试验，结果表明120天仍可检出阳性。

从上述实验结果看出，本发明所提供的试纸条操作简单，灵敏度高，特异性强。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测齐帕特罗的方法，其特征在于：所述的方法是胶体金免疫层析技术和竞争性免疫层析技术结合得到的方法，抗体为胶体金标记的齐帕特罗单克隆抗体，竞争性抗原齐帕特罗固定在检测试纸条的检测线上；将待检样品和胶体金标记的齐帕特罗单克隆抗体反应，再和竞争性抗原反应：当检测线上没有出现红色条带，说明待检样品含有齐帕特罗；当检测线上出现红色条带，说明待检样品不含齐帕特罗或是齐帕特罗含量很低，没有超过检测限。

2.根据权利要求1所述检测齐帕特罗的方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)制备齐帕特罗单克隆抗体：采用体内腹水诱导法制备齐帕特罗单克隆抗体；

(2)制备金标抗体：将步骤(1)得到的齐帕特罗单克隆抗体和胶体金结合，得到金标抗体；

(3)固定竞争性抗原：将齐帕特罗固定在检测试纸条的检测线上；

(4)反应：将待检样品与金标抗体反应，再和固定在检测线上的齐帕特罗反应；

(5)判定：当检测线上没有出现红色条带，说明待检样品含有齐帕特罗；当检测线上出现红色条带，说明待检样品不含齐帕特罗或是齐帕特罗含量很低，没有超过检测限。

3.根据权利要求2所述检测齐帕特罗的方法，其特征在于包含如下步骤：

步骤(1)中所述的齐帕特罗单克隆抗体通过如下方法制备得到：将经齐帕特罗免疫的Balb/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用HAT选择性培养基培养筛选杂交瘤细胞，得到能稳定分泌齐帕特罗抗体的杂交瘤细胞的单克隆细胞株，纯化，得到齐帕特罗单克隆抗体；

步骤(2)中所述的胶体金的颗粒大小为20～40mm。

4.根据权利要求3所述检测齐帕特罗的方法，其特征在于包含如下步骤：

步骤(2)中所述的金标抗体通过如下步骤制备得到：

①用超纯水将氯化金配制成质量百分比0.01％的溶液，加热至沸腾；接着加入浓度为质量体积比1％的柠檬酸三钠水溶液，继续加热到出现透明的橙红色为止，得到胶体金溶液；

②将胶体金溶液的pH值调节至8～9，在搅拌状态下加入齐帕特罗单克隆抗体，反应；

③在搅拌状态下加入牛血清白蛋白，得到反应溶液，牛血清白蛋白在反应溶液中的终浓度为质量体积比1～5％；静置，离心，弃上清，取沉淀，沉淀为金标抗体。

5.根据权利要求4所述检测齐帕特罗的方法，其特征在于：

步骤①中所述的氯化金和所述的柠檬酸三钠按质量比1:1～2.4配比；

步骤②中所述的胶体金和所述的齐帕特罗单克隆抗体按3.5×10^-3mol：40g配比；

步骤②中所述的pH值通过硼酸溶液调节；

步骤②中所述的反应的时间为30min～1h；

步骤③中所述的牛血清白蛋白在反应溶液中的终浓度为质量体积比1％；

步骤③中所述的静置的时间为30～60min；

步骤③中所述的离心的条件为8000～15000rpm离心5～15分钟。

6.实现权利要求1～5任一项所述的检测齐帕特罗的方法的试纸条，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫，其特征在于：结合垫上设置有金标抗体，层析膜上设置有检测线和质控线，检测线、质控线、吸水垫依次排布，检测线上固定有齐帕特罗，质控线上固定有抗鼠的二抗。

7.根据权利要求6所述的试纸条，其特征在于：

所述的底板的材料为PVC板；

所述的结合垫的材料为玻璃纤维膜或聚酯膜；

所述的层析膜的材料为硝酸纤维素膜；

所述的吸水垫的材料为吸水纸；

所述的金标抗体通过如下步骤制备得到：

①用超纯水将氯化金配制成质量百分比0.01％的溶液，加热至沸腾；接着加入浓度为质量体积比1％的柠檬酸三钠水溶液，继续加热到出现透明的橙红色为止，得到胶体金溶液；

②将胶体金溶液的pH值调节至8～9，在搅拌状态下加入齐帕特罗单克隆抗体，反应；

③在搅拌状态下加入牛血清白蛋白，得到反应溶液，牛血清白蛋白在反应溶液中的终浓度为质量体积比1～5％；静置，离心，弃上清，取沉淀，沉淀为金标抗体；

所述的抗鼠的二抗为羊抗鼠IgG或兔抗鼠二抗IgG。

8.权利要求6或7所述的试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将金标抗体溶液均匀地喷涂于结合垫上；

(2)在层析垫上设置检测线和质控线，检测线上固定齐帕特罗，质控线上固定抗鼠的二抗；

(3)将吸水垫、层析垫、结合垫、样品吸收垫由底板的顶部依次往底部黏贴，其中层析垫的质控线靠近吸水垫，检测线则靠近结合垫；切条，即得检测齐帕特罗的试纸条；

所述的金标抗体溶液通过如下步骤制备得到：

①用超纯水将氯化金配制成质量百分比0.01％的溶液，加热至沸腾；接着加入浓度为质量体积比1％的柠檬酸三钠水溶液，继续加热到出现透明的橙红色为止，得到胶体金溶液；

②将胶体金溶液的pH值调节至8～9，在搅拌状态下加入齐帕特罗单克隆抗体，反应；

③在搅拌状态下加入牛血清白蛋白，得到反应溶液，牛血清白蛋白在反应溶液中的终浓度为质量体积比1～5％；静置，离心，弃上清，取沉淀，沉淀为金标抗体；

④用TBS溶液溶解沉淀，得到金标抗体溶液。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述的TBS溶液是0.02～0.05mol/L、pH8.2的TBS溶液。

10.权利要求8或9所述的试纸条的应用，其特征在于包括以下步骤：

(1)在样品吸收垫上加入待测样品，在毛细作用下，样品液体向吸水垫一端泳动；

(2)结果的判断：阴性：质控线出现红色条带，检测线也出现红色条带，表明样本中不含有齐帕特罗项或是齐帕特罗含量低于检测限；阳性：质控线出现红色条带，而检测线无红色条带出现，表明样本中对应的检测项含量高于检测限；无效：质控线与检测线均无红色条带出现或者质控线无红色条带出现但检测线有红色条带出现，说明此试剂卡已失效。