CN202486141U - 检测β-内酰胺类抗生素和三聚氰胺的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种检测β-内酰胺类抗生素和三聚氰胺的试剂盒。试剂盒包括微孔条、微孔试剂、试纸条和微孔塞，所述试纸条由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜、底板依次连接组成，所述反应膜上包括两条检测线和一条质控线，两条检测线分别包被有头孢类药物-载体蛋白偶联物和三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物，质控线包被有羊抗鼠抗抗体。用本实用新型试剂盒同时检测β-内酰胺类抗生素和三聚氰胺的方法，简便、快速、直观、准确、便于携带、适用范围广、成本低、易推广使用。

Description

检测β-内酰胺类抗生素和三聚氰胺的试剂盒

技术领域

本实用新型涉及一种检测β-内酰胺类和三聚氰胺的试剂盒及方法。 

背景技术

β-内酰胺类药物是医学和兽医学上的一类重要的抗菌药物，应用十分广泛。但由于过敏反应及细菌产生的耐药性等原因，许多国家都对该类药物在动物上的使用及在动物源性食品中的残留进行了严格控制。美国食品和药品监督管理局（FDA）的调查表明：不注意休药期、用药不合理或是使用违禁药物，是导致动物性食品中抗生素残留的主要原因。长期摄入含抗生素的食品，可造成药物积累，当达到一定浓度后，就会对人体的健康带来一系列负面影响，如产生过敏反应、破坏胃肠道菌群平衡和增强细菌耐药性等。更为重要的是，抗生素被过量食入健康人肠道，会破坏健康人的正常菌群环境，导致人体免疫力的降低，从而危害消费者的身体健康，同时也影响牛奶及乳制品的出口贸易。我国的原料乳中β-内酰胺类抗生素残留严重，对其开展监控检测是我国乳品业发展中极为关注的问题。欧盟、美国等多个国家都制定了牛奶、肌肉和肾脏等动物源性食品中该类药物的最高残留限量（MRL），我国农业部235号文件公告对其MRL也做了严格规定，该类药物在牛奶中的MRL为4~100μg/L，在肌肉、肝脏和肾脏中的MRL为50~1000μg/kg。 

三聚氰胺（melamine），简称三胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物。食品工业中常需要测定食品中的蛋白质含量。由于直接测量蛋白质技术比较复杂，所以常用凯氏定氮法间接确定食品中蛋白质的含量。由于三聚氰胺与蛋白质相比含有更高比例的氮原子，所以三聚氰胺非法添加剂常被一些不法商贩用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标。2008年8月以来，中国一些医院陆续检查到部分婴儿患有胆结石，而这些患有胆结石的婴儿均喝了含有三聚氰胺的奶粉，这是影响全国的“三鹿奶粉”事件。在之后的调查中发现，有些不法商人为获取更高的利润，直接在原料奶中添加三聚氰胺。随后在全国奶粉和液态奶的检测中，发现市场上很大部分产品中均含有三聚氰胺，导致了乳品行业的诚信危机，也给人们的日常生活造成了巨大的负面影响。我国***等五部门联合发布公告，规定了我国婴儿配方食品中三聚氰胺限量值为1mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg。 

乳制品中的抗生素和三聚氰胺添加剂的残留目前已经成为消费者所迫切关注的焦点问题，为使牛奶中抗生素和三聚氰胺添加剂残留问题得到有效监控，符合最大残留限量标准，奶牛场、乳制品厂、政府监督部门、出入境检测、大型食品流通领域等都在努力寻求准确可行的检测方法，许多大型化学试剂和仪器公司也致力于开发β-内酰 胺类和三聚氰胺残留检测的方法和仪器。 

目前，牛奶及生鲜奶中β-内酰胺类和三聚氰胺残留的检测方法依据不同的检测原理，大体可分为三大类：微生物受阻检测、仪器检测法、免疫学分析法。微生物受阻检测方法，主要有抑菌圈试验、浑浊度试验、变色型检测金标试剂盒方法，微生物检测方法检测***低，但是灵敏度低、耗时长、耐药菌的存在容易导致误检；仪器检测方法，是目前检测β-内酰胺类抗生素和三聚氰胺的主要方法，有高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、气相色谱法、气相色谱-串联质谱法等，仪器检测方法精确度高，但其存在检测成本高，检测设备复杂，对检测人员的要求较高，检测耗时长等缺点，目前常用的免疫学分析法，主要为酶联免疫检测法和放射免疫分析法，两种方法的前处理过程较为复杂，对于现场大规模筛查样品还存在着一定局限性。 

中国发明专利200810162588.5（CN101429241A）中公开了“青霉素与载体蛋白偶联产物和β-内酰胺类青霉素抗体制备的方法及用途”，该方法中的青霉素单克隆抗体制备的酶联免疫试剂盒仅能检测青霉素G、氨苄青霉素、羧苄青霉素三种β-内酰胺类抗生素，检测药物种类少，制备的胶体金试纸条检测灵敏度低。目前免疫分析领域缺乏能够同时检测β-内酰胺类抗生素和三聚氰胺的技术及其应用。因此，在实践中有必要建立一种检测药物种类多、敏感度高、操作简单、成本低、适合大规模推广的检测方法。 

实用新型内容

本实用新型的目的是提供一种能够同时检测β-内酰胺类抗生素和三聚氰胺的试剂盒。 

本实用新型所提供的试剂盒包括微孔条、微孔试剂、微孔塞和试纸，试纸包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜，其依次连接；所述微孔试剂的冻干有头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物和三聚氰胺特异性抗体-胶体金标记物；反应膜上具有包被有头孢类药物-载体蛋白偶联物以及三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物的两条检测线和包被羊抗鼠抗抗体的一条质控线。两条检测线和一条质控线互相平行，三聚氰胺检测线靠近样品吸收垫一端，质控线靠近吸水垫一段。β-内酰胺类药物检测线在三聚氰胺检测线和质控线之间。其中三聚氰胺检测线用检测线（T）表示，β-内酰胺类药物检测线用检测线（B）表示，质控线用质控线（C）表示。质控线（C）距离反应膜的末端与吸水垫相连的一端为5-8mm，检测线（B）距离质控线（C）4-6mm，检测线（T）距离检测线（B）4-6mm。在试纸条上标记有MAX标记线的样品吸收垫上的检测端粘贴有保护膜。在装有冻干有头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物和三聚氰胺单克隆抗体-胶体金标记物的微孔条上具有微孔塞。 

为了便于运输和使用，试剂盒还有固定用具及其固定于其中用于盛装试纸条和冻 干有头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物和三聚氰胺特异性抗体-胶体金标记物的微孔条的试剂桶，所述试剂桶上具有密封盖。 

本实用新型试剂盒中试纸条底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；保护膜为PE材质保护膜；试剂盒盒体为硬纸盒；试剂桶为塑料试剂桶；固定用具为硬质支撑材料。 

本实用新型试剂盒具有如下有益效果： 

1.灵敏度高：传统的试纸卡均具有固定试纸条的卡壳固定装置，卡壳固定装置紧紧地将试纸条固定其中，在对样品检测时，由于卡壳与试纸条结合的比较紧密，致使检测样品溶液不能够充分渗透到样品吸收垫一段，并在试纸条上进行层析的速度十分缓慢，导致检测样品中的药物不能够与检测线上包被的包被原充分接触，致使试纸卡的灵敏度下降。本实用新型试剂盒比传统试纸卡的检测灵敏度高，由于本实用新型试剂盒的试纸条为裸条状，无需壳体紧固装置，检测样品可以直接接触试纸条的样品吸收垫一端，并且样品在试纸条上的层析速度比较快，使样品中的待检药物能够充分的与检测线上包被的包被原结合，从而提高了试纸条的检测灵敏度。β-内酰胺类抗生素和三聚氰胺检测试剂盒以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。其中的头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物和三聚氰胺单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂条中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。因此，本实用新型试剂盒具有较高的特异性和灵敏度。本试剂盒对β-内酰胺类药物检测灵敏度分别为：青霉素G 2μg/L、氨苄青霉素3μg/L、阿莫西林4μg/L、苯唑青霉素6μg/L、邻青霉素6μg/L、双青霉素6μg/L、萘夫西林20μg/L、头孢喹肟20μg/L、头孢哌酮40μg/L、头孢曲松50μg/L、头孢噻呋90μg/L、头孢洛宁10μg/L；对三聚氰胺检测灵敏度为50μg/L。 

2.操作简便快速：对于以往的试纸卡检测原料奶必须要将原料奶加入稀释液进行稀释才能够点样检测，原因是由于固定试纸条的塑料壳体紧紧地把试纸条固定在壳体内，而原料奶比较粘稠，所以直接将原料奶在试纸卡的加样孔进行点样检测的话，由于壳体与试纸条结合紧密以及奶液粘稠所致，原料奶样品无法完全渗透到样品吸收垫和结合物释放垫中，并且在试纸条上的层析速度比较缓慢，以至于无法检测，故要将原料奶加入稀释液进行稀释后方可检测。使用本实用新型试剂盒检测时无需任何其它试剂，检测原料奶时，也不需要对原料奶进行稀释，原因由于本实用新型试剂盒中的试纸条为裸条状，即无需用壳体对其进行固定，只要将待检样品溶液直接滴加于冻干 有头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物和三聚氰胺单克隆抗体-胶体金标记物的微孔中，混匀后，孵育5min，再将试纸标有MAX线标记端向下，***孵育后的微孔试剂中，试纸条可以与样品溶液充分接触，5min后观察结果。对于牛奶样品的检测，本实用新型试剂盒比传统试纸卡检测时间短，由于本实用新型试剂盒无需对样品进行稀释，可直接对样品进行检测。 

3.显示检测结果形象、直观准确。检测结果的判定是以试纸条的两条检测线和一条质控线是否显色作为阴性和阳性判断标准。如果反应膜上的三聚氰胺检测线显示一条红色条带，β-内酰胺类药物检测线也显示一条红色条带，同时质控线也显示一条红色条带，表示样品中β-内酰胺类药物和三聚氰胺均分别低于试剂盒对β-内酰胺类药物和三聚氰胺的最低检测限；如果反应膜上的三聚氰胺检测线显示一条红色条带，同时质控线也显示一条红色条带，而β-内酰胺类药物检测线不显色，表示检测样品中只有β-内酰胺类药物含量等于或高于试剂盒对β-内酰胺类药物的最低检测限；如果在反应膜上的β-内酰胺类药物检测线显示一条红色条带，同时质控线也显示一条红色条带，而三聚氰胺检测线不显色，表示检测样品中只有三聚氰胺含量等于或高于试剂盒对三聚氰胺的最低检测限；如果反应膜上只有质控线显示红色条带，而三聚氰胺检测线和β-内酰胺类药物检测线均不显示红色条带，表示检测样品中的三聚氰胺和β-内酰胺类药物的含量同时等于或高于试剂盒对三聚氰胺和β-内酰胺类药物的最低检测限；如果反应膜上的质控线没有显示红色条带，无论三聚氰胺检测线和（或）β-内酰胺类药物检测线是否显示红色条带，试纸条检测结果均视为无效。结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现结果误判。 

4.成本低，投资少：使用本实用新型试剂盒，不需另配仪器设备及其他试剂，也不需要固定试纸条的卡壳固定装置，成本低廉，投资少，见效快，使现场检测一步到位。 

5.易于大范围推广应用：试剂盒操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、卫生防疫、质量监测、乳业企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。 

附图说明

图1  为本实用新型试纸条结构剖面图； 

图2  为本实用新型试纸条俯视图； 

图3  为本实用新型冻干有金标抗体的微孔条； 

图4  为本实用新型微孔塞俯视图； 

图5  为本实用新型微孔塞侧视图； 

图6a、6b、6c、6d、6e1、6e2、6e3、6e4  为本实用新型试纸条检测结果判定图； 

图7  为本实用新型试剂桶结构示意图； 

图8  为本实用新型固定用具的俯视图； 

图9  为本实用新型盒体与固定用具的侧视图。 

具体实施方式

一、β-内酰胺类抗生素和三聚氰胺检测试剂盒的组装制备 

1）试纸条 

样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序黏贴在所述底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，保护膜7覆盖在样品吸收垫的检测端，在检测端保护膜上印有MAX标记线。反应膜上的两条检测线和一条质控线互相平行，并且与试纸条的长相垂直。检测线4-1即为检测线（T），靠近样品吸收垫一端，质控线5即为质控线（C），靠近吸水垫一端，检测线4-2即为检测线（B），在检测线（T）和质控线（C）之间。质控线（C）距离反应膜的末端与吸水垫相连的一端为5-8mm，检测线（B）距离质控线（C）4-6mm，检测线（T）距离检测线（B）4-6mm。检测线（T）包被有三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物，检测线（B）包被有头孢类药物-载体蛋白偶联物，质控线（C）包被有羊抗鼠抗抗体。 

底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水纸，保护膜为PE材质保护膜。 

2）冻干有金标抗体的微孔条 

所述微孔条8的底部冻干有头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物和三聚氰胺特异性抗体-胶体金标记物，即金标抗体9。微孔条8具有微孔塞10。 

3）将1）试纸条和2）微孔条装入具有密封塞的试剂桶11中，将试剂桶放置于试剂盒盒体13内的固定用具12中。 

二、试剂盒的使用 

取待检牛奶样品溶液滴加200μl到微孔试剂中，混匀后，孵育5min，将试纸标有MAX线标记端向下，***孵育后的微孔试剂后计时，5min后观察结果。 

三、检测结果分析 

β-内酰胺类抗生素和（或）三聚氰胺在检测阳性样品中的含量等于或高于试剂盒的对上述两类药物的检测限时，头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物和（或）三聚氰胺特异性抗体-胶体金标记物与对应的药物结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测线上因为竞争反应，不会与对应药物-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样品在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在两条检测线和一条质控线上出现红色条带。如图6所示，其中检测线（T）表示三聚氰胺检测线，检测线 （B）表示β-内酰胺类药物检测线，阴性结果用“-”表示，阳性结果用“+”表示。 

β-内酰胺类药物和三聚氰胺均呈阴性：当质控线（C）显示一条红色条带，检测线（T）和检测限（B）也同时分别出现红色条带，β-内酰胺类药物和三聚氰胺均呈阴性。如图6a所示。 

β-内酰胺类药物或三聚氰胺呈阳性：当质控线（C）显示一条红色条带，同时检测线（T）出现红色条带，而检测线（B）不出现红色条带时，β-内酰胺类药物呈阳性，如图6b所示；当质控线（C）显示一条红色条带，同时检测线（B）出现红色条带，而检测线（T）不出现红色条带时，三聚氰胺呈阳性，如图6c所示。 

β-内酰胺类药物和三聚氰胺均呈阳性：当质控线（C）显示一条红色条带，而检测线（T）和检测线（B）都不出现红色条带时，β-内酰胺类药物和三聚氰胺均呈阳性，如图6d所示。 

试纸条无效：当质控线（C）不显示出红色条带，则无论检测线（T）和（或）检测线（B）显示出红色条带与否，该试纸条判为无效，如图6e1-6e4所示。 

四、检测试剂盒中用到的材料制备方法如下： 

1、抗原的制备 

1）、头孢类药物-载体蛋白偶联物的合成与鉴定 

头孢类药物是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。 

a. 免疫原的制备-头孢类药物与卵清白蛋白偶联物合成 

取头孢菌素C16mg加入1ml二甲基甲酰胺（DMF）溶解得到溶液Ⅰ，取30.5mg的EDC用0.5ml的水完全溶解后，在搅拌条件下加入到溶液Ⅰ中，室温反应24h得到溶液Ⅱ；取40mg牛血清白蛋白（BSA）与5ml 0.01mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）混合，振荡溶解，得到溶液Ⅲ；在磁力搅拌下，将溶液Ⅱ逐滴加入到溶液Ⅲ中，密封，室温下搅拌反应6h得到反应液Ⅳ即为β-内酰胺类药物免疫原；将反应液Ⅳ装入透析袋中，4℃透析三天，分装，于-20℃保存备用。 

b. 包被原的制备-头孢类药物与牛血清白蛋白偶联物合成 

取头孢菌素C12mg加入1ml二甲基甲酰胺（DMF）溶解得到溶液Ⅰ，取24mg的EDC用0.5ml的水完全溶解后，在搅拌条件下加入到溶液Ⅰ中，室温反应24h得到溶液Ⅱ；取40mg卵清白蛋白（OVA）与5ml 0.01mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）混合，振荡溶解，得到溶液Ⅲ；在磁力搅拌下，将溶液Ⅱ逐滴加入到溶液Ⅲ中，密封，室温下搅拌反应6h得到反应液Ⅳ即为β-内酰胺类药物包被原；将反应液Ⅳ装入透析袋中，4℃透析三天，分装，于-20℃保存备用。 

c. 头孢类药物-载体偶联物的鉴定 

将载体蛋白、头孢类药物、头孢类药物-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长200-800 nm范围内扫描，得到载体蛋白、头孢类药物、头孢类药物-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明头孢类药物与载体蛋白偶联成功。 

2）、三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定 

a.三聚氰胺半抗原合成 

取0.64g三聚氰酸二酰胺和1.0g琥珀酸酐，加入10ml吡啶，室温下搅拌12-24h，除去溶剂后在乙醇-水中重结晶得到白色粉末状晶体，为三聚氰酸胺的半琥珀酸酯，即为三聚氰胺半抗原。 

b. 免疫原的制备-三聚氰胺与BSA偶联物合成 

取20mg三聚氰胺半抗原，溶解于1.0ml DMF中得到溶液Ⅰ，再取15mg的EDC用0.1m水充分溶解后加入到溶液Ⅰ中，室温搅拌24h，即可得到溶液Ⅱ；称取BSA30mg，使之充分溶解在7.8ml pH为7.2的PBS中，将溶液Ⅱ逐滴缓慢滴加到上述BSA溶液中，于室温下搅拌24h得到溶液Ⅲ；用0.01mol/L PBS在4℃下透析3天，以除去未反应的小分子物质。将得到的免疫原分装，于-20℃保存备用。 

c. 包被原的制备-三聚氰胺与OVA偶联物合成 

取20mg三聚氰胺半抗原，溶解于1.0ml DMF中得到溶液Ⅰ，再取15mg的EDC用0.1ml水充分溶解后加入到溶液Ⅰ中，室温搅拌24h，即得溶液Ⅱ；称取OVA40mg，使之充分溶解在4.8ml pH为7.2的PBS中，将溶液Ⅱ逐滴缓慢滴加到上述OVA溶液中，并于室温下搅拌24h得到溶液Ⅲ；用0.01mol/L的PBS在4℃下透析3天，以除去未反应的小分子物质；将得到的包被原分装，于-20℃保存备用。 

d、三聚氰胺-载体偶联物的鉴定 

将载体蛋白、三聚氰胺、三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长200-800 nm范围内扫描，得到载体蛋白、三聚氰胺、三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明三聚氰胺半抗原与载体蛋白偶联成功。 

2、头孢类药物和三聚氰胺的单克隆抗体的制备 

（1）制备单抗 

a. 动物免疫 

将步骤1得到的两种免疫原分别注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。 

b. 细胞融合和克隆化 

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9：1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合， 筛选得到稳定分泌头孢类药物单克隆抗体的头孢类药物单克隆杂交瘤细胞株和稳定分泌三聚氰胺单克隆抗体的三聚氰胺单克隆杂交瘤细胞株。 

c. 细胞冻存和复苏 

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁹个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。 

d. 单克隆抗体的制备与纯化 

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。 

所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20%（质量百分含量），使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2%（质量百分含量）；所述细胞培养基的pH为7.4。 

3、羊抗鼠抗抗体的制备 

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。 

4、单克隆抗体-胶体金标记物的制备 

（1）胶体金的制备 

用双蒸去离子水将1%氯金酸（购于sigma公司，产品目录号T09041）稀释成0.01%（质量百分含量），置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，每100ml 0.01%氯金酸加入2.5 ml 1%柠檬酸三钠（购于广州化学试剂厂，产品目录号BG11-AR-01KG），继续搅拌加热反应至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。 

（2）单克隆抗体-胶体金标记物的制备 

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7.0，按50-100μg抗体/ml胶体金的标准向胶体金溶液中加入上述头孢类药物单克隆抗体和三聚氰胺单克隆抗体，继续搅拌混匀30min, 加入15%BSA至BSA在胶体金溶液中的终浓度为1%（体积百分含量），静置30min。12000rpm、4℃离心30min, 弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/20的复溶缓冲液将沉淀重悬，得到的头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物溶液和三聚氰胺单克隆抗体-胶体金标记物溶液的浓度分别为50μg单抗/ml溶液，置4℃备用。 

复溶缓冲液：含酪蛋白、吐温-80 的0.02mol/L、 pH7.2 的磷酸盐溶液，其中酪蛋白在复溶缓冲液中的终浓度为0.05%-0.1％（体积百分含量），吐温-80在复溶缓冲液中的终浓度为0.05%-0.15％（质量百分含量）。 

5、单克隆抗体-胶体金标记物微孔试剂冻干到微孔条的微孔中 

向微孔条的微孔中加入50μl头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物和50μl三聚氰胺单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，冷阱温度为-70℃条件下，预冻4h后，再冻干14h，即可取出，得到的微孔条的微孔中冻干有头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物三聚氰胺单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂。 

6、样品吸收垫的准备 

将样品吸收垫置于含BSA（BSA 在缓冲液中的终浓度为0.5%（体积百分含量））、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘2h备用。 

7、反应膜的制备 

包被过程：用磷酸缓冲液将头孢类药物-牛血清白蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（B）包被量为1.0μg/cm²；用磷酸缓冲液将三聚氰胺半抗原-牛血清白蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T），包被量为1.0μg/cm²；用0.01mol/L、pH 7.4 PBS 缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200μg/ml，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线（C），包被量为1.0μg/cm²。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。 

Claims (9)

1.一种检测β-内酰胺类抗生素和三聚氰胺的试剂盒，其特征在于包括试纸条、微孔条、微孔试剂和微孔塞，所述试纸条包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板，所述反应膜上有两条检测线和一条质控线，两条检测线分别包被有头孢类药物-载体蛋白偶联物和三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物，质控线包被有抗抗体，所述微孔试剂为冻干的头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物和三聚氰胺特异性抗体-胶体金标记物。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述反应膜上的两条检测线和一条质控线互相平行，并且与试纸条的长相垂直。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的三聚氰胺检测线靠近样品吸收垫一端，质控线靠近吸水垫一端，β-内酰胺类药物检测线在三聚氰胺检测线和质控线之间。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次黏贴在底板上组成。

5.根据权利要求1或4所述的试剂盒，其特征在于：所述保护膜粘贴样品吸收垫上的检测端，上面有MAX标记线。

6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述微孔条上具有微孔塞。

7.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括用于盛装试纸条和冻干有头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物和三聚氰胺特异性抗体-胶体金标记物的微孔条的试剂桶和固定试剂桶的固定用具。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂桶上具有密封盖。

9.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于所述试剂盒盒体为硬纸盒，试剂桶为塑料试剂桶，固定用具为硬质支撑材料。

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