CN1984668A - 作为涉及盐和/或体液稳态的疾病的治疗剂和诊断剂的尿鸟苷蛋白原及合成的类似物或自其衍生的蛋白酶解产物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗特征在于盐潴留、体液潴留及其组合的疾病的方法。本发明提供了一种确定特征在于盐潴留、体液潴留、盐流失、体液流失、及其组合的疾病的存在或者进展的方法。本发明提供了一种检测样品中尿鸟苷蛋白原水平的免疫分析试剂盒。

Description

作为涉及盐和/或体液稳态的疾病的治疗剂和诊断剂的尿鸟苷蛋白原及合成的类似物或自其衍生的蛋白酶解产物

相关申请的交叉参考

本申请要求申请日为2004年5月14日的美国临时专利申请系列号60/571,172的优先权，该申请的公开内容通过引用以其全文并入本文作参考。

技术领域

本发明公开的主题涉及使用尿鸟苷蛋白原(prouraguanylin)和/或其活性衍生物治疗或者诊断体液和/或盐失衡的方法。

政府利益

本发明是在National Science Foundation资助号IBN-9808335和National Institutes of Health资助号P30-DK34987-17的美国政府资助下完成的。美国政府在本发明中享有一定权利。

缩写

ACE＝血管紧张素转换酶

ANOVA＝方差分析

ANP＝心房钠尿肽

ATCC＝美国典型培养物保藏中心

BSA＝牛血清白蛋白

℃＝摄氏度

cDNA＝互补DNA

cGMP＝3’，5’-环状单磷酸鸟苷

CGN＝慢性肾小球肾炎

CNP＝C-型钠尿肽

cpm＝每分钟计数

CRF＝慢性肾功能衰竭

DMEM＝Dulbecco’s极限必需培养基

DNA＝脱氧核糖核酸

dpm＝每分钟崩解(disintegrations)

ED50＝引起50％最大应答的有效剂量

EDTA＝乙二胺四乙酸

EC细胞＝肠嗜铬细胞

ELISA＝酶联免疫吸附测定

fmol＝毫微微摩尔

GC-C＝鸟苷酸环化酶C

GI＝胃肠道

Gn＝鸟苷蛋白

HAT＝次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷-敏感性

HCl＝盐酸

HD＝血液透析

HEPES＝4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸

hr＝小时

HPLC＝高压液相层析

ip＝腹膜内

ir-尿鸟苷蛋白＝免疫反应性尿鸟苷蛋白

iv＝静脉内

K＝钾

kDa＝千道尔顿

KO＝敲除

LC＝液相层析

MALDI-TOF＝基质辅助激光解析电离飞行时间

MBP＝麦芽糖结合蛋白

min＝分钟

mL＝毫升

mRNA＝信使核糖核酸

MS＝质谱分析

Na＝钠

NaCl＝氯化钠

NCBI＝国立生物技术信息中心

NLM＝美国国立医学图书馆

nmol＝纳摩尔

OMIM＝在线人类孟德尔遗传

PCR＝聚合酶链反应

PEG＝聚乙二醇

P.I.＝免疫前

pmol＝微微摩尔

proGn＝鸟苷蛋白原

proUGn＝尿鸟苷蛋白原

rGC＝受体/鸟苷酸环化酶

r-proUGn＝重组尿鸟苷蛋白原

RIA＝放射免疫测定

RNA＝核糖核酸

SDS-PAGE＝十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

STa＝稳定毒素，A型

TFA＝三氟乙酸

UGn＝尿鸟苷蛋白

氨基酸缩写

单字母代码     三字母代码     名称

A             Ala           丙氨酸

V             Val           缬氨酸

L             Leu           亮氨酸

I             Ile           异亮氨酸

P             Pro           脯氨酸

F             Phe           苯丙氨酸

W             Trp           色氨酸

M             Met           甲硫氨酸

G             Gly           甘氨酸

S             Ser           丝氨酸

T             Thr           苏氨酸

C             Cys           半胱氨酸

Y             Tyr           酪氨酸

N             Asn           天冬酰胺

Q             Gln           谷氨酰胺

D             Asp           天冬氨酸

E             Glu           谷氨酸

K             Lys           赖氨酸

R             Arg           精氨酸

H             His           组氨酸

背景技术

许多慢性疾病如高血压、心衰、肾病和肝病都与钠潴留和/或水肿相关。常规的利尿剂通过在肾单位的不同部位抑制钠(Na)的重吸收而有助于调节钠和体液稳态以减轻水肿。已知一些不同类别的小分子利尿剂，包括袢利尿剂(loop diuretic)，如呋苯胺酸(furosemide)、布美他尼(bumetamide)和托拉塞米(torasemide)，其作用于上升的亨利氏袢(Loop of Henle)；噻嗪类化合物，包括吲达帕胺(indapamide)、氢***(hydrochlorothiazide)和苄氟噻嗪(bendroflumethiazine)，其作用于远端小管(distal tubule)；及保钾利尿剂，包括阿米洛利(amiloride)和氨苯蝶啶(triamterene)，其作用于皮质集合管。见 Plant，L.，Clinical Medicine，3，517-519(2003)所述。然而，许多高血压或者充血性心力衰竭的患者对常规利尿剂无反应。因此，需要新的治疗策略以在这种患者及其它对象中控制血压和体液体积。

发明概述

本发明涉及尿鸟苷蛋白原(proUGn)自身以及其片段和/或类似物、包括其代谢物和化学衍生物(与先前在大鼠中鉴别的UGn₁₈及在人体中鉴别的UGn₁₆的C末端片段不同)的诊断和治疗应用。

在一些实施方案中，本发明提供了在需要治疗的患者中治疗特征在于盐潴留、体液潴留及其组合的疾病的方法，所述方法包括给予患者有效量的尿鸟苷蛋白原或其片段或类似物。

在一些实施方案中，本发明提供了确定患者中特征在于盐潴留、体液潴留、盐流失、体液流失及其组合的疾病的存在或者进展的方法，所述方法包括检测患者样品(在一些实施方案中是血浆样品)中尿鸟苷蛋白原的水平。在一些实施方案中，通过免疫分析检测尿鸟苷蛋白原的水平。

在一些实施方案中，本发明提供了一种检测样品中尿鸟苷蛋白原的水平的免疫分析试剂盒。

因此，本发明的一个目的是提供一种治疗特征在于盐潴留、体液潴留及其组合的疾病的方法。本发明的另一目的是提供一种确定特征在于盐潴留、体液潴留、盐流失、体液流失及其组合的疾病的存在或者进展的方法。本发明的再一目的是提供检测样品中尿鸟苷蛋白原水平的免疫分析试剂盒。

上述本发明的某些目的在本发明中得以全部或者部分阐述，结合在下文充分描述的所附实施例可以清楚本发明的其它目的和方面。

附图简述

图1示出大鼠proGn的氨基酸序列(SEQ ID NO：9，上方序列，由Currie，M.G.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89，947-951(1992)克隆)和大鼠proUGn的氨基酸序列(SEQ ID No：8，下方序列，由 Li Z.，et al.，Regul.Pept.，68，45-56(1997)克隆)。

图2a和2b示出大鼠肠道提取物对T₈₄细胞的活性。图2a是大鼠十二指肠提取物的HPLC洗脱/T₈₄细胞应答(pmol cGMP/孔)模式图。实心符号相应于在蛋白酶解之前的T₈₄细胞活性级分，空心符号相应于在蛋白酶解之后的T₈₄细胞活性级分。虚线相应于HPLC洗脱液中乙腈％。从 Li，Z.，et al.，Regul.Pept.，68，45-56(1997)复制。图2b是描述在蛋白酶解之前和之后T₈₄细胞对图2a的HPLC级分44-49的净cGMP应答(被刺激的-基础的)的条形图。从 Li，Z.，et al.，Regul.Pept.，68，45-56(1997)复制。

图3a-3d示出抗-proUGn抗体6910和6912的鉴定和确认。图3a是SDS凝胶的放射自显影图，示出抗体6910和6912对放射标记的proUGn的免疫沉淀。分子量标记在放射自显影图左侧以对号√表示。分子量标记的大小在左侧以kDa表示。图3b示出抗-proUGn抗体6910和6912及其在大鼠小肠提取物中检测到的蛋白质的Western印迹。图3c示出放射标记的proUGn的HPLC层析图，各个级分的闪烁计数水平(dpm×10^-3/级分)以实心符号示出。插图示出抗体6910的Western印迹，表明在大鼠小肠的HPLC相应级分中proUGn样8.5 kDa蛋白质的存在。图3d示出使用抗-proUGn抗体(6910和6912)和抗-proGn抗体(2538)的Western印迹，及其能够(2538)或不能识别(6910，6912)重组proGn样品的能力。

图4示出proUGn多肽(上方proUGn抗体6910的Western印迹，proUGn用箭头标示)和尿鸟苷蛋白mRNA(下方通过反义UGn核糖探针(riboprobe)进行的Northern印迹，尿鸟苷蛋白转录体用箭头标示)沿着肠道嘴尾轴(rostrocaudal axis)的分布。

图5a-5d示出proUGn和proGn的细胞分泌和血浆检测情况。图5a示出proUGn和proGn的细胞定位和载体分泌中的差异示意图。图5b是示出抗-proUGn抗体识别血浆proUGn的Western印迹。在进行免疫印迹之前将血浆通过HPLC分级分离，印迹上的数字表示测试的HPLC级分。std泳道表示proUGn的可信样品。图5c是HPLC血浆级分的Western印迹及用抗-proGn抗体对其进行的分析。std泳道含有可信proGn。图5d示出HPLC层析图，其中反相层析柱用HPLC大小排阻层析柱替换，这样提供了将proUGn与其它丰富的血浆蛋白(如白蛋白和免疫球蛋白)的更好地分离，除去这些干扰蛋白质改良Western印迹程序的分辨率。

图6a和6b示出proUGn的定量免疫分析。图6a示出用两种不同抗体(6910和6912)测试的一系列r-proUGn稀释物。图6b示出使用抗体6910一式三份进行的免疫分析。在LiCor ODYSSEY^TM红外线成像***上量化标准物和未知物(分离自大鼠肠道三个区域(即如示出的结肠、回肠、和空肠)的60μg总蛋白质)。线条通过线性回归与标准物匹配，未知物的数值通过内插法确定。在这个免疫分析之前，血浆样品必须预先分级分离，以从丰富的干扰血浆蛋白如白蛋白中分离proUGn。所述预先分级分离是在Amersham Hi-prep sephacryl S200HR柱(16cm直径，60cm长度)上进行，用0.05M磷酸钠+0.15M氯化钠，pH＝7，以0.5mL/分钟流速洗脱。proUGn在135-155分钟之间洗脱。

图7a-7c示出通过急性和慢性口服盐摄取方案诱导的钠(Na)***、血浆proUGn水平和肠道尿鸟苷蛋白mRNA表达的改变。图7a示出在急性模型中，通过30分钟管饲法将经口至胃盐(3mL的300mM NaCl)给予被麻醉的动物。作为对溶质摄取的应答，在30分钟(在胃摄取“之前”)和100分钟(在胃摄取“之后”)测定的血浆proUGn水平大约增加一倍(n＝3)。图7b示出在慢性模型中，将神志清醒的大鼠的饮食盐分从0.5％改变为2％(摄入改变)，由此其尿液盐***在12小时内升高至一个新的稳态水平。同样，高盐摄入与对照盐摄入相比，血浆proUGn水平大约增加一倍(n＝4)。图7c示出在高盐和低盐饮食维持6天的动物空肠中尿鸟苷蛋白mRNA的表达(p＜0.03成对t-检验)。尿鸟苷蛋白mRNA通过Northern印迹测定，并标准化为β-肌动蛋白mRNA水平。

图8a-8c示出在正常和无肾大鼠中被注入的proUGn的结局。图8a示出在60分钟内稳定注入³⁵S-proUGn产生稳定的血浆放射性水平(实心圆表示)。在尿液中的***水平显著高于相同时期(空心圆表示)。图8b示出在60分钟注入结束时，肾中标记的比活性高于任何其它组织。缩写：脑(B)、胸腺(T)、肺(Lu)、小肠(SI)、骨骼肌(M)、脾(S)、心(H)、肾(K)、肝(Li)。图8c示出³⁵S-proUGn的推注剂在正常动物血浆中被快速清除(对照组，空心圆表示)，在肾切除后清除显著减慢(无肾，实心圆表示)。

图9a和9b示出血浆和尿液中proUGn代谢物的HPLC分析。图9a示出在推注后收集的血浆的HPLC分析，其中血浆样品是在向颈动脉中推注³⁵S-标记的proUGn之后2分钟(实心圆表示)、5分钟(阴影圆表示)和10分钟(空心圆表示)取样(每个时间点n＝2)。图9b示出在延长注入后收集的尿液的HPLC分析，其中尿液在60分钟动脉注入结束后收集30分钟(n＝7)。注入的材料中的cpm/μL比用于推注的溶液中的cpm/μL低100倍。将血浆和尿液样品应用于Vydac 218TPC-18反相层析柱，用梯度乙腈洗脱(虚线)。每个HPLC级分中的放射性在闪烁计数仪中测定。Cys、Met和proUGn标准的保留时间用箭头表示。衍生自proUGn的代谢物在图9b中用问号表示。

图10a-10c示出天然proUGn的纯化，及注入的天然proUGn对尿液流量、盐***和血压的生物学作用。图10a示出从大鼠肠道提取物中纯化天然proUGn的最后步骤的UV吸光度模式图。插图示出各个级分的Western印迹，以证实proUGn的位置(用箭头表示)。将级分40干燥，重悬浮于生理盐水中，用于注入研究，如图10b和10c所示。图10b示出在对照动物(空心圆表示，n＝5)、注入纯化的proUGn(实心圆表示，n＝5)的动物、注入免疫中和的proUGn(三角形表示)的动物、或者注入STa(正方形表示)的动物中血压(虚线上方)和尿液产生(虚线下方)的时程。仅在水平线表示的间隔期内将制剂加入注入物中。图10c示出在与图10b所示相同实验中测定的尿钠***的时程(虚线下方)。Western印迹插图(虚线上方)示出尿液proUGn***情况。每个样品代表从代表性动物中在注入肽之前、期间和之后在20分钟期间内所收集的总尿液的50％：对照动物(空心圆，n＝5)，注入纯化的proUGn的动物(实心圆，n＝5)，注入免疫中和的proUGn的动物(三角形)，或者注入STa的动物(正方形)。

图11a-11c示出外源注入的循环抗-proUGn抗体的作用。图11a示出血浆中³⁵S-proUGn的消失，其中循环抗-proUGn抗体减缓推注的³⁵S-proUGn从血浆中消失的速度：急性Ab封闭(实心圆)；24小时慢性Ab封闭(阴影圆)；及非免疫血清(空心圆)。图11b示出proUGn代谢物***进尿液：对照组(实心柱)和急性Ab封闭(空心柱)，其中在将³⁵S-proUGn推注进血浆后，循环抗-proUGn抗体削弱标记的代谢物***进尿液中。图11c示出在胃部摄取后Na***进尿液中，其中循环抗-proUGn抗体抑制口服Na激发的Na***：非免疫血清(空心圆)和急性Ab封闭(实心圆)。

序列表中的序列简述

SEQ ID NO：1是大鼠UGn₁₈的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2是人UGn₁₆的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是大鼠前尿鸟苷蛋白原的氨基酸序列。

SEQ ID NO.4是人前尿鸟苷蛋白原的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是人尿鸟苷蛋白原的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6是大鼠Gn₁₅的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是用于产生多克隆抗proUGn抗体6910的免疫原的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8是大鼠尿鸟苷蛋白原的氨基酸序列，由 Li Z.，et al.，Regul.Pept.，68，45-56(1997))克隆。

SEQ ID NO：9是大鼠鸟苷蛋白原的氨基酸序列，由 Currie，M.G.， et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89，947-951(1992))克隆。

SEQ ID NO：10是用于产生多克隆抗-proUGn抗体6912的免疫原的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11是用于产生多克隆抗-proGn抗体2538的免疫原的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12是用于产生多克隆抗-proGn抗体6240的免疫原的氨基酸序列。

发明详述

本发明部分涉及如下方面：(I)注入的尿鸟苷蛋白原(proUGn)或其衍生物的利尿和促尿钠***作用对于患有导致盐和/或体液稳态扰乱的疾病的患者例如人的益处，所述患者包括患有高血压、心脏病、肾病或者肝病的患者以及对常规利尿剂无反应的患者；(II)测定内源proUGn的血浆水平(和/或内源proUGn与大鼠内源UGn₁₈及人UGn₁₆的比率)对于评价患有这些疾病的患者的状况具有诊断价值。

本发明在后文通过参考所附实施例进行更充分的描述，其中示出了代表性实施方案。然而，本发明可以不同形式实施，非限于本文所述的实施方案。提供这些实施方案是使得本发明揭示更彻底和完全，并向本领域技术人员充分地传授实施方案的范围。

除非特别指出，则本文所用所有技术和学术术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献均以其全文通过引用并入本文。

在本说明书和权利要求书中，指定的化学式或者名称应涵盖所有光学和立体异构体，以及其中存在这些异构体和混合物的外消旋混合物。

I：定义

根据长期专利法惯例，在本申请包括权利要求书中使用的术语“一个”意味着“一或多个”。

如本文所用，术语“利尿剂(diuretic)”是指增加尿液形成速率的化合物。如本文所用，术语“促尿钠***剂(natriuretic)”是指增加尿液钠***速率的化合物。因此，如本文所用，术语“利尿(diuresis)”是指液体***增加，术语“促尿钠***(natriuresis)”是指钠***增加。

如本文所用，术语“多肽”是指包含任何20个蛋白质氨基酸的任何聚合物，无论其大小如何。尽管“蛋白质”通常用于指相对较大的多肽，“肽”通常用于是指较小的多肽，但是这些术语在本领域是重叠的及可变化的的。如本文所用，除非特别指出，则术语“多肽”是指肽、多肽和蛋白质。如本文所用，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”当描述基因产物时可互换应用。

如本文所用，术语“UGn₁₈”(在大鼠中)或者“UGn₁₆”(在人中)是指衍生自尿鸟苷蛋白原C末端结构域的肽，其可以含有15-20个氨基酸，包括15、16、17、18、19和/或20个氨基酸。这些肽是鸟苷酸环化酶C(GC-C)的强激活物，鸟苷酸环化酶C(GC-C)是负责肠道上皮中配体激活的cGMP合成的一种受体/鸟苷酸环化酶。先前已经公布了大鼠序列TIATDECELCINVACTGC(SEQ ID NO：1)。见 Li， Z.，et al.，Reg.Peptides，68，45-56(1997)所述。关于人序列NDDCELCVNVACTGCL(SEQ ID NO：2)的参考是： Kita，T.，et al.，Am.J.Physiol.，266，F342-F348(1994)。如本文所用，在不用(或者不可能)区别前肽与鸟苷酸环化酶C(GC-C)激活肽时应用术语“尿鸟苷蛋白”。如本文所用，术语“尿鸟苷蛋白原”和“proUGn”在大鼠中是指UGn₁₈的前肽，在人体是指UGn₁₆的前肽，可互换使用。

由 Li Z.，et al.，Regul.Pept.，68，45-56(1997))纯化和测序的大鼠前尿鸟苷蛋白原具有如下氨基酸序列：

MSGSQLWAAVLLLLVLQSAQGVYIKYHGFQVQLESVKKLNELEEKQ

MSDPQQQKSGLLPDVCYNPALPLDLQPVCASQEAASTFKALRTIA

TDECELCINVACTGC(SEQ ID NO：3)。信号序列以斜体字示出，UGn₁₈以黑体字示出。除去信号肽产生尿鸟苷蛋白原，其中信号肽的除去通常在该前肽原生成过程中自动发生。

人前尿鸟苷蛋白原具有如下氨基酸序列：

MGCRAASGLLPGVAVVLLLLLQSTQSVYIQYQGFRVQLESMKKLSD

LEAQWAPSPRLQAQSLLPAVCHHPALPQDLQPVCASQEASSIFKTL

RTIANDDCELCVNVACTGCL(SEQ ID NO：4)。信号序列以斜体字示出，UGn₁₆以黑体字示出。在人体中，所述肽的活性C末端形式尿液(非小肠)中纯化，其实际上具有仅由16个氨基酸残基组成的略短的序列(以黑体字示出，由 Kita，T.，et al.，Am.J.Physiol.，266，F342-F348(1994)报道)。因此，人UGn₁₆相应于大鼠UGn₁₈。

人尿鸟苷蛋白原具有如下氨基酸序列：

VYIQYQGFRVQLESMKKLSDLEAQWAPSPRLQAQSLLPAVCHHPA

LPQDLQPVCASQEASSIFKTLRTIANDDCELCVNVACTGCL(SEQID NO：5)。

如本文所用，术语“Gn₁₅”是指激活GC-C的鸟苷蛋白原的C末端序列。大鼠Gn₁₅具有序列PNTCEICAYAACTGC(SEQ ID NO：6)。术语“鸟苷蛋白原”和“proGn”是指Gn₁₅的前肽，可互换使用。在不用(或者不可能)区别前肽与GC-C激活肽时使用术语“鸟苷蛋白”。

如本文所用，术语“片段”是指具有比参考肽或蛋白质的全部氨基酸序列短的氨基酸序列的肽或蛋白质。这种片段可以是代谢物或者蛋白酶解片段。如本文所用，术语“代谢物”和“蛋白酶解片段”是指通过酶(例如蛋白酶等)的作用或者在体内或者体外或者在另外的设施中进行的其它方法产生的肽片段。片段也可以是化学合成的或者重组产生的肽或者蛋白质序列。片段也可以通过酶促方法在体外产生。

在本发明的一些实施方案中，给予需要治疗的患者有效量的具有利尿活性的尿鸟苷蛋白原的“肾代谢物”。如本文所用，“尿鸟苷蛋白原的肾代谢物”是指在肾中所述前肽的生物降解产生的代谢物(在一些实施方案中得自近端小管中存在的刷状缘蛋白酶)，其中所述代谢物在大鼠中不是UGn₁₈在人中不是UGn₁₆。

如本文所用，术语肽“类似物”是指含有相对于天然肽或蛋白质的一或多个结构修饰的肽。这些修饰可以是在肽序列中添加或者缺失一或多个氨基酸基团。修饰也可以涉及改变立体化学，例如包含一或多个D-氨基酸代替天然的L-氨基酸。修饰也可以包括添加非肽基团，这可以包括有助于检测肽或蛋白质的基团，如放射性标记的成分或者荧光部分；可改变肽或蛋白质溶解性的基团，如脂肪酸基团、碳水化合物；或者聚合物基团，或者可以保护肽或蛋白质免于酶降解的基团。

上述术语“片段”和“类似物”可涵盖代谢物和化学衍生物。

如本文所用，术语“表达”通常是指多肽从RNA中产生的细胞过程。

如本文所用，术语“标记的”是指一种组成部分与探针分子的附着，所述组成部分能通过分光光度、放射性或者其它方法检测。

如本文所用，术语“突变”具有其传统的内涵，是指在核酸或者多肽序列中通过遗传、天然发生或者导入进行的改变，以本领域技术人员通常已知的含义应用。

术语“餐后尿钠***”用于描述对经口胃摄入的盐的全部肾尿钠***应答。术语“肠道-肾轴”用于描述在小肠中起源的这种应答的特异组成。

如本文所用，术语“有效量”和“治疗有效量”可互换应用，意味着足以为治疗的疾病状态提供治疗的剂量。这个剂量根据患者、疾病及实现的治疗而变化。

在一些实施方案中，有效量的尿鸟苷蛋白原或其片段或类似物与影响盐平衡、体液平衡或者盐和体液平衡的一或多种其它药物组合给予。术语“组合”可以是指以单一组合物或者一或多种单独的组合物的形式给予活性剂。

如本文所用，术语“大约”当是指体积或者质量、重量、时间、体积的量或者百分比时涵盖特定量的±20％或者±10％的变化，优选±5％，、更优选±1％、更优选±0.1％的变化，这些变化适于进行本发明的方法。

在本发明揭示的许多实施方案中治疗的患者期望是人患者，尽管应理解本发明原则上对于所有脊椎动物物种包括哺乳动物均有效，这些物种均包含在术语“患者”中。在文中，应理解哺乳动物包括任何希望治疗的哺乳动物物种，特别是农业和家庭哺乳动物物种，如马、牛、猪、狗和猫。

II：总则

II.A.尿鸟苷蛋白和鸟苷蛋白

UGn₁₈和proUGn的鉴别始自与肠道电解质处理相关的临床问题的结果。病原性大肠杆菌菌株产生通过与在上皮细胞顶部表面表达的受体结合而导致腹泻的毒素(STa)。见 Sack，R.B.，Annu.Rev.Microbiol.，29，333-353(1975)所述。受体激活刺激cGMP合成，其激活CFTR氯通道并抑制Na/H交换，导致水和电解质无法控制地积聚在肠腔中。见 Vaandrager，A.B.，Mol.Cell Biochem.，230，73-83(2002)所述。在二十世纪九十年代，克隆了STa受体并示出其是受体/鸟苷酸环化酶(rGCs)家族的一个成员。见 Schultz，S.，et al.，Cell，63，941-948(1990)所述。作为这个家族的第三个成员，将Sta受体命名为鸟苷酸环化酶-C或者GC-C。

rGC家族的其它成员(GC-A和GC-B)是钠尿肽的受体：GC-A是心房钠尿肽(ANP)的受体，GC-B是C型钠尿肽(CNP)的受体。见 Kuhn， M.，Circ.Res.，93，700-709(2003)； Koller，K.J.，Science，252，120-123(1991)所述。因此普遍推测最后会发现在生理条件下激活GC-C的内源配体(与通过STa的病理激活相反)。当从尿液和肠道提取物中纯化出两个GC-C-激活配体时实现了这种期望，所述配体是称作鸟苷蛋白(Gn₁₅)的15个氨基酸的肽及称作尿鸟苷蛋白(UGn₁₈)的18个氨基酸的肽。见 Currie，M.G.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，89，947-951(1992)；Hamra，F.K.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，90，10464-10468(1993)； Li， Z.，et al.，Regul.Pept.，68，45-56(1997)； Currie等的美国专利No.5,489,670； Waldman的美国专利No.5,879,656所述。如上所述，在人体中，所述肽的活性C末端形式纯化自尿液(不是小肠)，实际上其具有仅包含16个氨基酸残基的略短的序列。因此，人UGn₁₆相应于大鼠UGn₁₈。

II.B.尿鸟苷蛋白原和鸟苷蛋白原

发现Gn₁₅和UGn₁₈序列分别处于前体前肽一鸟苷蛋白原和尿鸟苷蛋白原的C末端。尿鸟苷蛋白原和鸟苷蛋白原共有一些结构特征(见图1)，包括在其N末端的信号肽、Gn₁₅和UGn₁₈序列所处的C末端的同源性、及与其信号肽相邻的一个短区域的同源性(但未知功能)。除了这些区域之外，这两个前肽的序列是相对不太保守的。

对于许多物种已经公布了proUGn的序列，包括人、猪、大鼠、小鼠、负鼠和豚鼠。见 Hidaka，Y.，et al.，J.Biol.Chem.，275，25155-25162(2000)所述。ProUGn和proGn几乎只在肠道中表达(尽管在肾中也发现少量proUGn多肽)，每种前肽由不同类型肠道细胞产生。见 Perkins，A.，et al.，Gastroenterology，113，1007-1014(1997)； Qian， X.，et al.，Endocrinology，141，3210-3224(2000)； Li.，Z，et al.，Gastroenterology，109，1863-1875(1995)所述。

ProGn由主要在空肠和结肠的杯状细胞产生。见 Qian，X.，et al.，Endocrinology，141，3210-3224(2000)； Li，Z.，et al.，Gastroenterology，109，1863-1875(1995)所述。杯状细胞更为人知的是黏蛋白的来源，所述黏蛋白是分泌进肠腔中的一种糖蛋白，在此其通过吸收水和电解质而形成粘液凝胶。与黏蛋白分泌的外泌性质一致，对分离的腔内和血管灌注的结肠进行研究发现鸟苷蛋白(主要以Gn₁₅形式回收)也优先分泌进肠腔中，肠腔-血浆比率超过40倍。见 Moro，F.，et al.，Endocrinology，141，2594-2599(2000)； Martin，S.，et al.，Endocrinology，140，5022-5029(1999)所述。这些观测结果导致人们设想鸟苷蛋白在黏蛋白的水合作用中起作用，特别是在相对脱水的回肠中，通过在黏蛋白释放物与Gn₁₅诱导的体液流动之间提供密切的空间和时间联系而起作用。见 Qian，X.，et al.，Endocrinology，141，3210-3224(2000)；Li，Z.，et al.，Gastroenterology，109，1863-1875(1995)； Cohen，M.B.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，209，803-808(1995)所述。

相反，肠proUGn是由几乎只在小肠中的肠嗜铬细胞(EC)产生的。见 Perkins，A.，et al.，Gastroenterology，113，1007-1014(1997)； Li，Z.，et al.，Regul.Pept.，68，45-56(1997)； Miyazato，M.，et al.，FEBS Lett.，398，170-174(1996)所述。EC细胞是在胃肠道中最丰富的内分泌细胞。它们含有5-羟色胺，通常还有其他一或多种肽。见 Solcia，E.，et al.，Endocrine Cells in the Digestive System，in  Physiology of the Gastrointestinal Tract(L.R.Johnson，ed.，Raven Press，New York，1987)，111-130所述。EC细胞在基底和顶部都释放5-羟色胺(及推测的共同定位的肽)，主要是基底分泌。见 Nilsson，O.，et al.，Cell Tissue Res.，248，49-54(1987)所述。

尽管前肽在肠组织中表达，但是相同的组织看起来几乎不含有UGn₁₈或者Gn₁₅。UGn₁₈和Gn₁₅太少，以致于通过免疫印迹检测不到。它们通常通过标准RIA方法或者(更通常地)通过生物分析方法检测，所述检测使用“报道细胞”-结肠癌衍生的T₈₄细胞系进行，所述T₈₄细胞系表达高水平的GC-C，并因此当暴露于GC-C-激活配体时合成cGMP。 Guarino，A.，et al.，Am.J.Physiol.，253，G775-G780(1987)； Dharmsathaphom，K.，et al.，Am.J.Physiol.，246，G204-G208(1984)。令人吃惊地，有时小肠或者大肠的水相提取物不能诱导T₈₄细胞中cGMP应答，除非该提取物预先用蛋白酶处理。见 Li，Z.，etal.，Regul.Pept.，68，45-56(1997)所述。例如图2a所示，衍生自大鼠十二指肠提取物的所有HPLC级分当在报道细胞分析中测试时最初均是无活性的(实心符号)；然而，级分44-49(跨越proUGn的保留时间)可以通过蛋白酶解而激活(图2b)，当对该激活物再次进行层析时，其保留时间在层析图中移向较早的点，相应于UGn₁₈的保留时间(图2a，空心符号)。这个发现与proUGn和proGn不能激活GC-C的其它报道一致。见Hamra，F.K.，et al.，Endocrinology，137，257-265(1996)所述。由于肠组织提取物几乎不含有Gn₁₅和UGn₁₈，因此推测加工是在前肽分泌之后发生的。

II.C：肠-肾轴与尿鸟苷蛋白

在新型利尿剂的研究中，一方面的研究着重于确定肠道对钠摄入的应答与肾之间的联系。参与调节溶解物***的肠-肾内分泌轴最初设想于二十世纪七十年代。见 Lennane，R.J.，et al.，Clin.Sci.Mol.Med.，49，433-436(1975)。细胞外钠含量的任何改变(例如通过口服盐产生)引起口渴和抗利尿激素机制，这引起细胞外液体积代偿性改变。见Skorecki，K.L.and Brenner，B.M.，Am.J.Med.，70，77-88(1981)。然而，细胞外体积对盐摄入改变应答缓慢，需要几小时或者几天才可以在钠摄入和尿液***之间建立新平衡。见 Carey，R.M.，Circ.Res.，43，19-23(1978)； Simpson，F.O.，Lancet，2，25-29(1988)所述。有时称作餐后尿钠应答的快速肠-肾反射(见 Ise，T.，et al.，Kidney Int.Suppl.，67，S245-S249(1998)； Villarreal，D.，et al.，Am.J.Physiol.，258，R232-R239(1990)所述)在这样的事实中被表明：即当匹配的溶解物摄取物经口服和静脉内输送时，口服输送更迅速地引起促尿钠***。见Lennane，R.J.，et al.，Clin.Sci.Mol.Med.，49，433-436(1975)； Singer，D. R.，et al.，Am.J.Physiol.，274，F111-F119(1998)； Mu，J.，et al.，PflugersArch.，438，159-164(1999)所述。

这种肠-肾轴的机制仍在积极研究中。已经提出了两个模型：直接机制，其中促尿钠***因子应答腔内刺激而从肠道中释放；间接机制，其中来自肠道的信号引起促尿钠***因子从另外的部位释放。间接机制通常被与应答门静脉中盐水平的肝传入神经联系起来，并且被认为通过肾神经活性的改变，或者也许通过自中枢或者周围位点释放促尿钠***剂而引起反射性促尿钠***。见 Nishida，Y.，et al.，Am.J.Physiol.，274，R97-R103(1998)； Haberle，D.A.，et al.，Kidney Int.Suppl.，67，S242-S244(1998)所述。近年来，对于直接机制也已经有了一个实例，其中通过一种对钠摄入进行应答而释放自肠道的肽在肾中诱导促尿钠***。

III：本发明的肽、多肽和多核苷酸成分

如下章节揭示了形成本发明的一个方面的多种分子。然而，本发明非限于在此列出的这些分子。关于本发明的肽、多肽和多核苷酸分子的生物学信息，包括核苷酸和肽序列信息，可得自公开的数据库，例如位于美国国立医学图书馆(NLM)的国立生物技术信息中心(NCBI)。NCBI网址为 http://www.ncbi.nlm.nih.gov，NLM网址为http://www.nlm.nih.gov。NCBI网站提供许多科学数据库资源的登录，包括：GenB ank、PubMed、Genomes、LocusLink、Online MendelianInheritance in Man(OMIM)、Proteins，以及Structures。多肽和多核苷酸数据库的公用接口是Entrez，可以从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/登录或者通过LocusLink网站登录。

本领域已知尿鸟苷蛋白原和前尿鸟苷蛋白原的氨基酸序列，如上文所述。本发明提供了人尿鸟苷蛋白原以及同源尿鸟苷蛋白原(包括牛、猪、马、犬及其它哺乳动物尿鸟苷蛋白原)的应用。在一些实施方案中，提议可以应用前尿鸟苷蛋白原，因此在本发明的方法和技术中，术语“尿鸟苷蛋白原”包括“前尿鸟苷蛋白原”。本发明还提供了尿鸟苷蛋白原片段，如尿鸟苷蛋白原在对象体内或者在对象体外在给药前经蛋白酶解产生的片段的应用。在一些实施方案中，尿鸟苷蛋白原片段可以根据本领域公认的技术修饰以对抗进一步的降解。这些技术可包括但非限于在片段中包含对抗降解的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明揭示了具有利尿和/或促尿钠***活性的尿鸟苷蛋白原肾代谢物的应用。如上文所提供，“尿鸟苷蛋白原的肾代谢物”是指在肾中前肽生物降解产生的代谢物(例如在一些实施方案中由近端小管中存在的刷状缘蛋白酶降解产生)，附带条件是所述代谢物在大鼠中不是UGn₁₈，在人中不是UGn₁₆。确定尿鸟苷蛋白原的肾代谢物的氨基酸序列的方法在下文实施例中论述。

本发明还描述了具有与尿鸟苷蛋白原和/或尿鸟苷蛋白原片段基本相同的序列的多肽，例如尿鸟苷蛋白原类似物的应用。与给定的参考多肽“基本相同”的多肽是具有与给定的参考多肽序列具有至少85％同一性的序列的多肽。基本相同的多肽也可以具有较高的同一性百分比，例如90％、95％、98％或者99％。本发明还包括与尿鸟苷蛋白原和/或尿鸟苷蛋白原片段功能等价的多肽。这些多肽与尿鸟苷蛋白原和/或尿鸟苷蛋白原片段等价是因为在生物***中它们能实现尿鸟苷蛋白原和/或尿鸟苷蛋白原片段的一或多种功能。这些多肽具有全长尿鸟苷蛋白原和/或尿鸟苷蛋白原片段的一或多种生物学活性的60％、75％、80％或者甚至90％。这种对比通常基于使用和对比相同浓度多肽的生物学活性分析。所述对比也可以基于达到可获得的最大活性的50％所需要的多肽的量。

功能等价的多肽可以是那些例如含有添加或取代的氨基酸残基的多肽。取代可以基于所涉及的残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性性质方面的相似性而进行。例如，功能等价的多肽是其中全长、天然发生的尿鸟苷蛋白原和/或尿鸟苷蛋白原片段的10％或更少的氨基酸通过保守氨基酸取代而被置换的多肽，功能等价的多肽保持全长尿鸟苷蛋白原和/或尿鸟苷蛋白原片段的生物学活性的至少50％。

保守氨基酸取代是指一个氨基酸由相同类别的另一个氨基酸取代(例如缬氨酸取代甘氨酸，或精氨酸取代赖氨酸)。与尿鸟苷蛋白原和/或尿鸟苷蛋白原片段功能等价的多肽可以通过本领域技术人员熟知的技术对编码核酸进行随机诱变而产生。然而，更可能的是这种多肽通过定向诱变产生(还是使用本领域技术人员熟知的技术)。这些多肽可以具有提高的功能性或者降低的功能性。

为了设计功能等价的多肽，辨别保守位置和可变位置是有益的。这种辨别可以通过将来自一个物种的本发明的蛋白质的氨基酸序列与来自另一物种的同系物氨基酸序列进行排列对比而实现。本领域技术人员意识到保守的氨基酸残基很可能是保存功能所必需的。因此，优选地，保守残基不被改变。

可以在编码尿鸟苷蛋白原和/或尿鸟苷蛋白原片段的核酸分子的编码序列中产生突变，以产生更适于在选择的宿主细胞中表达的变体基因。例如可以改变或者消除N联糖基化位点，以实现例如更易于从已知在N联位点高糖基化的酵母宿主中回收和纯化的同源产物的表达。为此，在任一或多个糖基化识别序列的第一或第三氨基酸位置的各种氨基酸取代和/或在任一或多个这种识别序列的第二位置的氨基酸缺失将阻止在所修饰的三肽序列进行糖基化(见例如 Miyajima et al.，EMBO J.，5，1193(1986)所述)。

本发明的尿鸟苷蛋白原和/或多肽尿鸟苷蛋白原类似物和/或尿鸟苷蛋白原片段和/或尿鸟苷蛋白原片段类似物可以融合于另一种多肽而表达，所述另一种多肽例如标记多肽或者融合配体。例如，所述多肽可以与六组氨酸标记融合以促进细菌表达的蛋白质的纯化，或者与血凝素标记融合以促进在真核细胞中表达的蛋白质的纯化。融合蛋白可以通过利用特异于表达的融合蛋白的抗体而容易地纯化。例如Janknecht等描述的***可以易于纯化在人细胞系中表达的非变性的融合蛋白(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8972-8976(1991))。在这个***中，将感兴趣的基因亚克隆进痘苗重组质粒中，由此该基因的开放读框经翻译与由六个组氨酸残基组成的氨基末端标记融合。将用重组痘苗病毒感染的细胞的提取物加样于Ni²⁺次氮基乙酸-琼脂糖柱中，用含有咪唑的缓冲液选择性洗脱组氨酸标记的蛋白质。

用作本发明的成分的尿鸟苷蛋白原和/或多肽尿鸟苷蛋白原类似物和/或尿鸟苷蛋白原片段和/或尿鸟苷蛋白原片段类似物也可以化学合成和/或化学修饰(例如见 Creighton，Proteins：Structures andMolecular Principles，W.H.Freeman & Co.，NY，1983所述)，或者对于较大的肽而言，也许更有利的是通过本文所述重组DNA技术产生。对于另外的指导，本领域技术人员可以参考 Ausubel，F.M.，et al.，Protocols in Molecular Biology，New York：Greene Publishing Associatesand John Wiley & Sons，1992； Sambrook et al.，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)所述。

由于纯度、抗原特异性、无不希望的副产物、便于生产等因素，对于较小的肽优选合成化学技术，如固相Merrifield型合成方法。许多可利用的技术的概述可见于 Steward et al.，Solid Phase PeptideSynthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，California(1969)；Bodanszky et al.，Peptide Synthesis，John Wiley & Sons，Second Edition(1976)； Meienhofer，Hormonal Proteins and Peptides，2：46，AcademicPress，New York，New York(1983)； Merrifield，(1969)Adv.Enzymol.32：221-96； Fields et al.，(1990)Int.J.Peptide Protein Res.35：161-214；及对于固相肽合成的美国专利No.4,244,946，及对于传统溶液合成的Schroder et al.，The Peptides，Vol.1，Academic Press，New York，NewYork，(1965)所述，所述文献均通过引用并入本文。可用于这种合成方法的适当保护性基团在上文及在 McOmie，Protective Groups inOrganic Chemistry，Plenum Press，New York，New York，(1973)中描述，所述文献通过引用并入本文。

通常地，所提供的固相合成方法包括向生长的肽链中相继添加一或多个氨基酸残基或者被适当地保护的氨基酸残基。通常地，第一个氨基酸残基的氨基或者羧基基团是由合适的可选择性除去的保护基团保护的。对于含有反应侧链基团的氨基酸如赖氨酸，使用一种不同的可选择性除去的保护基团。

使用固相合成方法作为示例，将保护的或者衍生的氨基酸通过其未保护的羧基或者氨基基团附着于惰性固体支持物。然后选择性除去所述氨基或者羧基基团的保护基团，接着将具有适当保护的用于连接的(complimentary)(氨基或者羧基)基团的下一个序列中的氨基酸在适于与已经附着于固体支持物的残基形成酰胺键的条件下混和并反应。然后将氨基或者羧基基团的保护基团从这个新加入的氨基酸残基中除去，接着加入下一个氨基酸(被适当保护的)，等等。在所有希望的氨基酸均以正确的序列连接之后，相继或者同时除去任何剩余的末端和侧链基团保护基团(和固体支持物)，提供最终的多肽。

本发明的任何肽均可以药物可接受的盐的形式应用。能与提供的肽形成盐的合适的酸包括无机酸如三氟乙酸(TFA)、盐酸(HCl)、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、延胡索酸、邻氨基苯甲酸、肉桂酸、萘磺酸、磺胺酸等等。特别优选HCl和TFA盐。

能与提供的肽形成盐的合适的碱包括无机碱，如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾等等；有机碱，如一、二和三烷基和芳基胺(例如三乙胺、二异丙胺、甲胺、二甲胺等等)，及任选地取代的乙醇胺(例如乙醇胺、二乙醇胺等等)。

除了多肽尿鸟苷蛋白原类似物和/或尿鸟苷蛋白原片段类似物之外，本发明也可以使用非肽类似物。这些非肽类似物可包括显示与尿鸟苷蛋白原和/或尿鸟苷蛋白原片段等价活性的任何小分子。这些类似物可以通过例如优化其尿鸟苷蛋白原样活性的组合化学技术产生。

可以用本发明的分子治疗的疾病例如包括但非限于肾病或肾功能不全，包括慢性肾小球肾炎及慢性肾功能衰竭，心脏病或者心力衰竭，包括充血性心脏病引起的水肿，肝病，包括肝硬化，及这些疾病的组合。本发明的分子也可用于控制高血压。

IV：治疗方法

本发明部分涉及这样的发现，即与注入UGn₁₈相比，在大鼠中注入proUGn激发更大的利尿和促尿钠***应答。ProUGn或者自其衍生的分子(但是与大鼠中UGn₁₈和人体中UGn₁₆不同)在这些增强的应答中起作用。本发明论证了将外源proUGn注入对象的血液中使得尿液产生增加直至50倍。注入proUGn刺激肾***盐(促尿钠***)和体液(利尿)。因此注入proUGn可用于治疗特征在于盐和体液潴留的疾病。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗患有导致盐和/或体液稳态紊乱、包括盐和体液潴留的疾病的方法，所述疾病即“特征在于盐和体液潴留”的疾病。因此，本发明提供了一种治疗患有肾病或者肾功能失调患者的方法，包括慢性肾小球肾炎及慢性肾功能衰竭，心脏病或者心力衰竭，包括充血性心脏病引起的水肿，肝病，包括肝硬化，和/或高血压，以及可得益于利尿药物但是对常规利尿剂无反应的患者。

目前临床实践中应用许多种利尿剂。然而，许多患者对已知的利尿剂谱有抗性。不希望受任何特殊理论的约束，有提示proUGn通过与其它利尿剂作用机制不同的机制起作用。特别地，对proUGn的应答异常缓慢地发生(在开始注入后20-40分钟)并且具有异常长的持续时间(在结束注入后持续几个小时以上)。这些异常特性使得proUGn是有别于已知利尿剂的一类独特制剂。由于看起来proUGn通过新的机制起作用，因此这对于对常规利尿剂抗性的患者是有益的。

IV.A：对象

在一些实施方案中，本发明的方法可用于治疗如本文所述对象。本发明治疗的对象在很多实施方案中是人，但应理解本发明的原理提示本发明对于所有脊椎动物物种均有效，包括哺乳动物，这些物种均包含在术语“对象”中。在本文中，应理解哺乳动物包括希望治疗的任何哺乳动物物种，特别是农业和家养哺乳动物物种。

因此，本文所用术语“对象”是指任何无脊椎动物或脊椎动物物种。本发明的方法特别用于治疗温血脊椎动物。因此，本发明涉及哺乳动物和鸟类。更特别地，本发明提供了哺乳动物的治疗和/或诊断，所述哺乳动物例如是人以及对于人来说由于濒临灭绝而重要的哺乳动物(如西伯利亚虎)、经济学重要的动物(供给人消费的在农场饲养的动物)和/或社会学重要的动物(宠物或者动物园中动物)，例如除了人之外的食肉动物(如猫和狗)，猪(猪、肉猪和野猪)，反刍动物(如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼)及马。本发明还提供了鸟类的治疗，包括濒临灭绝的、动物园中的以及家禽的治疗，特别是驯养的禽类，例如家禽如火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等，这些动物对于人类具有经济学重要性。因此，本发明提供了家畜的治疗，包括但非限于驯养的猪(猪和公猪)、反刍动物、马、家禽等。

IV. B：配制品

本发明提供了一种治疗组合物(例如包含尿鸟苷蛋白原、尿鸟苷蛋白原的肾代谢物、尿鸟苷蛋白原的类似物或者片段或者其肾代谢物之一、或者这些其组合的组合物)，所述组合物优选包括一种包括药物可接受的载体的组合物。合适的配制品包括水相或者非水相无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、杀菌抗生素及使得所述配制品与指定受体的体液等渗的溶质；及水相和非水相无菌悬浮液，其可包含悬浮剂和增稠剂。

在一些实施方案中，所述治疗组合物可含有与尿鸟苷蛋白原、尿鸟苷蛋白原代谢物、其片段或类似物组合的另外的治疗剂，其中所述另外的治疗剂具有利尿和/或促尿钠***性质。所述另外的治疗剂可在同一或者不同的组合物中给予。因此，术语“组合”可以是指所述活性剂可以以单一组合物或者以一或多种单独的组合物给予。本领域技术人员熟知的普通类型的利尿剂包括碳酸酐酶抑制剂、噻嗪和噻嗪样利尿剂、袢(或者高界(high-ceiling))利尿剂及保钾利尿剂。这些利尿剂特别例如包括但非限于呋苯胺酸、布美他尼、托拉塞米、氢***、氨苯蝶啶、吲达帕胺、依他尼酸(ethocrinic acid)、螺内酯及美托拉宗。

本发明的方法中使用的组合物可以采取于油或者水相载体中的悬浮液、溶液或者乳状液形式，并且可以含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，在使用之前用合适的载体如无菌无热源水重建。

所述配制品可以存在于单位剂量或者多重剂量的容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，可以在冷冻或者冻干条件下贮存，在马上使用之前仅需要加入无菌液体载体即可。

对于口服给予，所述组合物可采取与药物可接受的赋形剂通过常规技术制备的片剂或者胶囊形式，所述赋形剂例如是结合剂(例如预先糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或者羟丙基甲基纤维素)；充填剂(例如乳糖、微晶纤维素或者磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或者硅石)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或者羟基乙酸淀粉钠)；或者增湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。所述片剂可以通过本领域已知方法包被。例如治疗组合物可以与氢***组合配制，作为具有肠道或者缓释包膜的pH稳定核心，保护该组合物直至其达到结肠。

口服给予的液体制品可以采取例如溶液、糖浆或者悬浮液形式，或者它们可以在干燥的产物存在，在使用之前与水或者其它合适载体重建。这些液体制品可以通过常规技术用药物可接受的添加剂制备，所述添加剂如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆，纤维素衍生物或者氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或者***树胶)；非水相载体(例如杏仁油、油脂、乙醇或者分级分离的植物油)；及防腐剂(例如甲基或者丙基-p-羟基安息香酸或者山梨酸)。所述制品也可以含有合适的缓冲盐、香料、色素和甜味剂。口服制品可以适当配制以提供活性化合物的控制释放。对于口腔给予，所述组合物可以采取以常规方式配制的片剂或者锭剂形式。

所述化合物也可以作为植入或者注射制品配制。因此，例如所述化合物可以用合适的聚合物或者疏水性材料(例如于可接受的油中的乳状液)或者离子交换树脂一起配制，或者作为微溶的衍生物(例如微溶的盐)。

所述化合物也可以在直肠组合物(例如含有常规栓剂基质的栓剂或者保持灌肠剂，如可可油或者其它甘油酯)、乳液或者洗剂或者经皮帖剂中配制。

IV.C：剂量

本文所用术语“有效量”是指所述治疗组合物(例如包含尿鸟苷蛋白原、尿鸟苷蛋白原的肾代谢物、尿鸟苷蛋白原的类似物或片段或其肾代谢物之一、或者其组合的的组合物)足以产生可测量的生物学应答(例如利尿剂和/或促尿钠***作用)的量。本发明的治疗组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便对于特定对象和/或应用来说，给予的活性化合物的量足以达到所希望的治疗应答。选择的剂量水平依赖于各种因素，包括治疗组合物的活性、配方、给予途径、与其它药物或者治疗方法的组合、被治疗的疾病的严重程度、及治疗对象的身体状况和治疗之前的病史。优选给予最小剂量，在无剂量限制毒性的条件下逐步增加剂量至最小有效量。治疗有效量的确定和调节以及何时及怎样进行这种调节的估计为医学领域技术人员所已知。

对于本发明揭示的治疗组合物的给予，可以进行基于给予小鼠动物模型的剂量而推断给予人体的剂量的常规方法，使用转换因子将小鼠剂量转变为人体剂量：每公斤人体剂量＝每公斤小鼠剂量×12( Freireich et al.，(1966)Cancer Chemother Rep.50：219-244)。药物剂量也可以每平方米体表面积的毫克数算出，这种方法比基于体重的方法更好地得到某些代谢和***功能的良好相关性。另外，体表面积在成人和儿童以及不同的动物物种中可以用作药物剂量的公分母，如Freireich  et al.( Freireich et al.，(1966)Cancer Chemother Rep.50：219-244)所述。简而言之，在任何给定的物种中，mg/kg剂量可表示为等于mg/sq m剂量乘以合适的km因数。在成人，100mg/kg等于100mg/kg×37kg/sqm＝3700mg/m²。

关于配制品和剂量的其它指导见美国专利No.5,326,902；5,234,933；PCT国际出版物No.WO 93/25521； Berkow et al.，(1997)The Merck Manual of Medical Information，Home ed.Merck ResearchLaboratories，Whitehouse Station，New Jersey； Goodman et al.，(1996)Goodman & Gilman′s the Pharmacological Basis of Therapeutics，9th ed.McGraw-Hill Health Professions Division，New York； Ebadi，(1998)CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology.CRC Press，Boca Raton，Florida； Katzung，(2001) Basic & Clinical Pharmacology，8th ed.LangeMedical Books/McGraw-Hill Medical Pub.Division，New York；Remington et al.，(1975) Remington′s Pharmaceutical Sciences，15th ed.Mack Pub.Co.，Easton，Pennsylvania；and Speight et al.，(1997) Avery′s Drug Treatment：A Guide to the Properties，Choice，Therapeutic Use and Economic Value of Drugs in Disease Management，4th ed.AdisInternational，Auckland/Philadelphia； Duch et al.，(1998)Toxicol.Lett.100-101：255-263所述。

IV.D：给予途径

给予对象本发明组合物的合适方法包括但非限于全身给予、非肠道给予(包括静脉内、肌内、动脉内给药)、口服、含服、皮下给药、吸入、气管内装置、手术植入、经皮肤给药、局部注射及高速注射/轰击。在可应用的情况中，持续注入可以增强药物在靶部位积聚(见例如美国专利No.6,180,082所述)。

本发明方法中使用的特定给药模式依赖于各种因素，包括但非限于应用的治疗剂和/或药物载体，所治疗的疾病的严重程度，及给予后药物的代谢或者清除机制

V.与体液和/或钠稳态相关的疾病的诊断和监测

本发明还论证了血浆中内源proUGn水平随着口服摄入盐而发生变化：口服盐摄入量增加则提高循环proUGn水平，而口服盐摄入量降低则降低循环proUGn水平。因此，血浆proUGn的测定(和/或血浆proUGn与大鼠中血浆UGn₁₈及人体中血浆UGn₁₆的比率的测定)可以作为评价疾病包括肾病、心脏病、肝病、肠道疾病和循环***疾病的发作和进展的诊断工具。因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种诊断和/或监测涉及体液和/或钠稳态的疾病的方法。代表性的疾病包括但非限于导致体积膨胀的疾病、肾功能降低、心功能降低和/或高血压等疾病，所有这些疾病均使血浆中proUGn水平升高。

在一些实施方案中，本发明包括通过使用抗-proUGn特异性免疫分析对生物学样品中尿鸟苷蛋白原进行定量分析。

目前本领域中可利用的尿鸟苷蛋白放射免疫分析(RIA)不适合测定proUGn，因为这种分析使用基于UGn₁₈的标准曲线计算肽水平，并且无一确定了proUGn抗体与UGn₁₈之间的相对亲和性。本发明提供一种修改的精确定量检测proUGn的免疫分析方法，避免了由于同时检测前肽及其熟知的裂解产物UGn₁₈而出现的复杂情况。因此，本发明在一些实施方案中还提供了一种免疫分析程序以测量proUGn血浆水平。

制备免疫分析中使用的组织和血浆样品的一般技术以及进行免疫分析的标准方案为本领域技术人员所已知。

在一些实施方案中，用于检测proUGn生物学水平的本发明提供的抗-proUGn抗体是多克隆抗体。短语“多克隆抗体”是指含有许多种抗体组合位点的一群抗体分子。多克隆抗体群的一部分展示与感兴趣的特定表位的结合亲和性。在本发明中，感兴趣的免疫原是与大鼠中UGn₁₈及人体中UGn₁₆的氨基酸序列不同的部分尿鸟苷蛋白原肽。因此，例如本文描述的抗-proUGn多克隆抗体之一(6910)是使用含有氨基酸序列PALPLDLQPVCASQE(SEQ ID NO：7)的免疫原产生的。

如本文所用，术语“抗原”是指与抗体或者T细胞受体结合的分子。与抗体结合的抗原包括所有类别的分子。如本文所用，术语“表位”是指与抗体结合的大分子抗原的特定部分。在由T细胞识别的蛋白质抗原的情况中，表位是结合由T细胞受体识别的MHC分子的肽部分。多克隆抗体代表对抗原的全部免疫应答，并因此含有与感兴趣的表位之外的表位结合的抗体。

如本文所用，术语“免疫原”是指诱导免疫应答的抗原。

短语“单克隆抗体”是指仅含有一种能与一个特定表位发生免疫反应的抗体组合位点的一群抗体分子。因此单克隆抗体典型呈现与其进行免疫反应的任何表位的单一结合亲和性。

本发明的方法可以使用单克隆抗体，所述单克隆抗体产生自本文所述的用于抗-proUGn抗体的表位。单克隆抗体典型地由抗体组成，所述抗体通过克隆称作杂交瘤的单一细胞而产生，所述杂交瘤仅分泌(产生)一种抗体分子。所述杂交瘤细胞通过将产生抗体的细胞与骨髓瘤或者其它能使自身永生化的细胞系融合而形成。这种抗体的制备首先由 Kohler & Milstein，(1975)Nature 256：495-497描述，将所述描述通过引用并入本文。其它方法由 Zola， Monoclonal Antibodies：a Manual of Techniques，CRC Press，Inc，Boca Raton，Florida(1987)描述。可以对如此制备的杂交瘤上清进行筛选，以检测与尿鸟苷蛋白原或其片段或类似物免疫反应的抗体分子的存在。

简而言之，为了形成从中产生单克隆抗体组合物的杂交瘤，将骨髓瘤或者其它能使自身永生化的细胞系与得自用包含proUGn表位的抗原超免疫的哺乳动物脾的淋巴细胞融合。优选用于制备杂交瘤的骨髓瘤细胞系来自与所述淋巴细胞相同的物种。典型地，小鼠129GlX+品系是优选的哺乳动物。用于本发明的合适小鼠骨髓瘤包括次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷-敏感性(HAT)细胞系P3X63-Ag8.653和Sp2/0-Ag14，这两种细胞系可得自位于弗吉尼亚州马纳萨斯市的美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号分别为CRL 1580和CRL 1581。

使用聚乙二醇(PEG)1500将脾细胞与骨髓瘤细胞典型融合。融合的杂交体通过其对HAT的敏感性加以选择。产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)鉴别。

本发明提供的单克隆抗体也可以通过引发单克隆杂交瘤培养物而产生，所述培养物包含含有分泌合适的特异性的抗体分子的杂交瘤的营养培养基。将培养物保持在足以使得杂交瘤将抗体分子分泌进培养基中的条件下并维持一定时间。然后收集含有抗体的培养基。所述抗体分子随后可通过应用本领域技术人员已知的技术进一步分离。可用于制备这些组合物的培养基为本领域所已知并且可以商购，包括合成的培养基、纯系小鼠等。合成培养基例如是补加了4.5gm/l gm葡萄糖、20mM谷氨酰胺和20％胎牛血清的Dulbecco′s极限必需培养基(DMEM) Dulbecco et al.，(1959)Virol.8：396)。纯系小鼠例如是Balb/C。

产生单克隆抗体、杂交瘤细胞或者杂交瘤细胞培养物的其它方法也是熟知的。见例如 Sastry et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：5728-5732及 Huse et al.，(1989)Science 246：1275-1281描述的从所有免疫学组成成分中分离单克隆抗体的方法。

也可以不用进行过度的实验就确定是否一种单克隆或者多克隆抗体与本发明的抗体具有相同(即等价)特异性(免疫反应特征)，所述确定通过确定前者是否阻止后者与预先选择的靶分子结合而进行。如果测试的抗体与本发明的抗体竞争，如通过在标准竞争分析中本发明的抗体与固相中的靶分子的结合降低而示出，则很可能的是这两种抗体结合相同或者密切相关的表位。

确定一种抗体是否具有本发明抗体的特异性的另一种方式是将本发明的抗体和通常与其反应的靶分子预先温育，然后加入测试的抗体以确定测试的抗体与靶分子结合的能力是否被抑制。如果测试的抗体被抑制，则该测试的抗体很可能具有与本发明的单克隆抗体相同的或者功能等价的表位特异性。

实施例

如下实施例是为本领域技术人员提供实践本发明代表性实施方案的指导。基于本发明公开的内容和本领域的一般技术水平，本领域技术人员明白如下实施例只是例证了本发明，在不偏离本发明范围的前提下可以对本发明进行各种变化、修改和改变。

实施例1-7的材料和方法

大鼠尿鸟苷蛋白原的cDNA序列以及组织和提取物的制备方法及Northern和Western印迹技术先前已经有描述。见 Li，Z.et al.，Regul.Pept.，68，45-56(1997)所述。大鼠proGn先前已经被克隆。见 Currie， M.G.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，89，947-951(1992)所述。

大鼠尿鸟苷蛋白原的序列是：

VYIKYHGFQVQLESVKKLNELEEKQMSDPQQQKSGLLPDVCYNP

ALPLDLQPVCASQEAASTFKALRTIATDECELCINVACTGC(SEQID No.8)。

大鼠鸟苷蛋白原的序列是：

MNAWLLSVLCLLGALAVLVEGVTVQDGDLSFPLESVKQLKHLRE

VQEPTLMSHKKFALRLPKPVAPELCSQSAFPEALRPLCEKPNAEEI

LQRLEAIAQDPNTCEICAYAACTGC(SEQ ID No.9)。

用体重为200-250g的雄性Sprague Dawley大鼠(Charles RiverLaboratories，Wilmington，Massachusetts，United States of America)进行实验。大鼠实验饮食得自商业供应商(Harlan Teklad，Madison，Wisconsin，United States of America)。对于一些实验，无肾动物通过手术急性结扎肾蒂而制备。如果需要，则将动物用Nembutal(60mg/kg体重，腹膜内注射)麻醉。

放射性proUGn通过在存在³⁵S-Cys和³⁵S-Met的条件下体外偶联转录/翻译而从编码全长proUGn(减去信号肽)的cDNA模板中制备。

一般地，将生物学样品通过SDS-PAGE进行分级分离，之后进行免疫分析以确保所有检测到的分子均具有相应于全长proUGn的分子量，从而消除抗体与proUGn裂解产物或者与可以与所述抗体非特异性反应的其它无关蛋白质的任何交叉反应性。

除非特别指出，则检测和鉴别proUGn及相关肽的HPLC条件如下：Vydac 218TP^TM C-18反相层析柱(Grace Vydac，Hesperica，California，United States of America)；用含有0.1％TFA的H₂O将该柱平衡25分钟，随后进行30分钟从0％乙腈(含有0.1％TFA)至50％乙腈(含有0.1％TFA)的梯度，用100％乙腈(0.1％TFA)洗涤5分钟。

Na、K和体液***：Na和K的浓度在IF 943型火焰光度计(Instrumentation Laboratory Company，Lexington，Massachusetts，UnitedStates of America)上分析。从输尿管中或者使用饲养笼收集尿液。尿液体积用重量确定。

当使用蛋白酶抑制剂时，其是得自Sigma(Sigma-Aldrich，Milwaukee，Wisconsin，United States ofAmerica)的商业抑制剂混合物，含有1mM EDTA、0.01％杆菌肽、2.5mM4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟、38μM胃蛋白酶抑制剂A、35μM反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酰酰胺(4-胍基)丁烷、0.1mM苯丁抑制素(bestatin)、55μM亮抑酶肽(leupeptin)和2μM抑酶肽(aprotinin)。

实施例1：抗-proUGn和抗-proGn抗体

如已经被描述的方法针对大鼠proUGn分子的两个不同的15个氨基酸的区域产生抗体。见 Perkins，A.，et al.，Gastroenterology，113，1007-1014(1997)所述。也产生针对大鼠proGn的两个区域的抗体。用作这两个抗-proUGn抗体(6910和6912)及两个抗-proGn抗体(2538和6240)的抗原的序列在图1中示出。

用于产生多克隆抗-proUGn抗体6910的免疫原的氨基酸序列是PALPLDLQPVCASQE(SEQ ID NO：7)。

用于产生多克隆抗-proUGn抗体6912的免疫原的氨基酸序列是QQQKSGLLPDVCYN(SEQ ID NO：10)。

用于产生多克隆抗-proGn抗体2538的免疫原的氨基酸序列是VQDGDLSFPLESVK(SEQ ID NO：11)。

用于产生多克隆抗-proGn抗体6240的免疫原的氨基酸序列是LCEKPNAEEILQRLE(SEQ ID NO：12)。

图3a-3d示出抗-proUGn抗体6910和6912的鉴定和确认。图3a是示出抗体6910和6912使得放射标记的proUGn免疫沉淀的SDSPAGE凝胶的放射自显影图。取自兔的血清中的抗体在免疫之前(在泳道6912 P.I.和6910 P.I.中使用)不能使所述前肽发生免疫沉淀，提示所述免疫反应性是用抗-proUGn抗原免疫的结果，不是在兔血清中已经存在的抗体产生的非特异性反应。如印迹左侧的对号所示，免疫沉淀的蛋白质的分子量为大约8.5kDa，这是在除去信号肽之后全长proUGn的正确大小。因此制备放射性标记的proUGn的反应看起来也提供希望的产物。图3b示出通过抗-proUGn抗体检测到的得自大鼠小肠组织样品中的蛋白质的Western印迹。所述抗体标记一种蛋白质，推测是天然proUGn，其看起来与在图3a中沉淀的8.5kDa放射标记的proUGn大小相同。所述抗体也标记较高分子量的蛋白质，但在这种情况中由一种抗体识别的交叉反应分子看起来不等价于由其他抗体识别的那些分子(因此表明它们是与proUGn不相关的非特异性免疫反应性分子)。免疫前的血清是完全无反应性的。图3c示出实验中使用的图3a中产生的放射标记的proUGn与得自大鼠小肠的免疫反应性8.5kDa蛋白质具有相同的HPLC保留时间。HPLC层析图上的实心符号是从放射标记的proUGn层析中收集的级分的闪烁计数结果。***的Western印迹示出在小肠样品的HPLC中相应时间点收集的级分中存在的8.5kDa蛋白质。图3d是示出抗-proUGn抗体(6910和6912)不识别重组proGn(与放射标记的proUGn相似制备)的Western印迹。抗-proGn抗体(泳道2538)与放射标记的proGn不相互作用。

抗-proUGn抗体也用于确定所述前肽在大鼠肠道的不同节段中的组织中的分布。图4对比了用抗-proUGn抗体6910进行实验的Western印迹数据(上方印迹)和用反义UGn核糖探针进行实验的Northern印迹数据(下方印迹)。实验中使用的组织样品取自大鼠肠道的不同节段，如在印迹下方所标明的；因此，印迹示出proUGn肽和尿鸟苷蛋白mRNA沿着整个嘴尾轴的分布。每个印迹均是多此确定实验的代表性结果，结果可经实验再现(每种技术进行4次实验)。所述前肽和mRNA转录体在肠道中具有基本不可辨别的区域表达模式(图4是Qian，X.，et al.，Endocrinology，141，3210-3224(2000)所述方法的再现)。

在确定抗-proUGn和抗-proGn抗体是否可以检测血浆中的proUGn和proGn的初始测试中，将5mg大鼠血浆蛋白通过反相HPLC分级分离。收集具有已知的用可信标准确定的proUGn和proGn保留时间的级分。将各个级分用抗-proUGn抗体6910或者抗-proGn抗体2538进行免疫印迹。

图5a示出推测的proUGn和proGn细胞分泌示意图。ProGn在杯状细胞中表达，并且从顶部分泌进肠腔中。在肠腔中，推测proGn通过肠道蛋白酶还原为Gn₁₅而激活定向于肠腔的GC-C受体。相反，proUGn在EC细胞中表达，并且经顶部和基底部分泌。因此在血浆中应只检测到proUGn。血浆免疫印迹实验结果看起来与这个示意图一致。图5b示出了使用抗-proUGn抗体6910及得自大鼠血浆HPLC分级分离的11个HPLC级分(42-52)进行的Western印迹。在级分47和48中检测到大约8.5 kDa的蛋白质(用箭头标示)。抗-proGn抗体2538在HPLC级分中检测不到任何蛋白质(图5c)。用箭头标示了应含有proGn的级分(455和46)，所述proGn基于可信样品的HPLC保留时间确定。图5b和5c中std泳道加样了可信proUGn(图5b)或者可信proGn(图5c)作为对照。

随后对这种技术的改良是用HPLC大小排阻层析柱代替反相层析柱。这种改良的程序将proUGn与其它丰富的血浆蛋白如白蛋白和免疫球蛋白更好地分离。除去这些丰富的干扰蛋白质极大地改良了Western印迹程序的分辨率，并因此极大地增加分析的灵敏性(见图5d)。

实施例2：定量的ProUGn-特异性免疫分析

在20个泳道的凝胶上进行定量免疫分析，两个最远的泳道是空白的以避免边缘效应。在左侧的6个泳道用于构建标准曲线，加入系列稀释的r-proUGn(500fmol、250fmol、125fmol、62.5fmol、31.3fmol和15.6fmol)。2个另外的泳道用于分子量标准和内部校准标准。剩余的10个泳道加入实验样品。通过常规的免疫印迹方法将凝胶内容物共同电泳并共同移至硝化纤维捕获膜上。然后将该膜用2％硬骨鱼凝胶封闭过夜，与抗-proUGn初级抗体(6910或者6912)温育、广泛洗涤并与IRDye^TM800-缀合的山羊抗兔二级抗体(Li-Cor Biosciences，Lincoln，Nebraska，United States of America)一起温育。在另外洗涤之后，使用Li-Cor Biosciences Odyssey^_Infrared Imaging System测量与pro-UGn结合的二级抗体的量。

将一条线拟合至通过标准产生的检测到的红外线(IR)强度读数，未知r-proUGn的量通过内插确定。在高至至少8pmol的范围内所述分析确定是线性的，检测限度略高于15.6fmol标准。在相同分析中相同测试样品的平均变异系数为4.2±0.2％。

定量免疫分析的结果示于图6a和6b。图6a示出用两种不同的抗-proUGn抗体(6910和6912)测试的由系列稀释的r-proUGn产生的不同红外线强度。这些泳道的数据用于产生如图6b中示出的标准曲线。取自大鼠结肠、大鼠回肠后段和大鼠空肠前段的实验样品的proUGn量通过将这些样品产生的IR强度数据与标准曲线匹配而确定。因此，如图6b所示，结肠样品几乎不含有proUGn，回肠后段样品含有略低于0.2pmol proUGn/60μg总蛋白，空肠前段样品含有大约1.0pmol proUGn/60μg总蛋白。

实施例3：应答盐摄入的proUGn血浆水平

经口至胃给予盐的急性模型：在开始实验之前，将动物保持正常盐度饮食(标准大鼠食物，0.5％NaCl)。在急性给予盐实验之前12小时禁食，但给予水。在实验开始时，将动物麻醉并***连接压力传感器的胃管以输送测试溶液及监测胃排空，及安置PE240气管插管以保证无障碍的换气。颈静脉内留置导管用于静脉内(iv)注入，将动脉压力传感器与颈动脉内导管连接以监测血压。从每个输尿管中收集尿液以评价肾功能和proUGn***情况。通过拉动肠管及在纱布垫后面上翻肝脏而暴露门静脉。所有动物均接受通过颈静脉导管持续注入含有2％BSA的盐水(30μl/分钟/100g体重)。监测麻醉深度、血压、血细胞比容和尿液产生情况作为可接受的实验条件的指征。一旦这些参数稳定，则开始从门静脉和颈动脉中取血浆样品(150μl)，在每个实验期间以60分钟间隔持续取样。在每个实验全程还顺序收集30分钟尿样。在每个实验结束时，切下近端小肠、近端结肠、肾和肝，以测量proUGn水平和尿鸟苷蛋白mRNA表达。

为了确定基础血浆和尿液proUGn水平是否受到实验条件的影响，根据上述方案不经胃内注入盐而测试一组6只大鼠的对照组。测试组6只动物通过管饲法在30分钟接受3mL的300mM NaCl。

图7a示出在胃内注入盐之后大约100分钟开始出现尿钠***显著增加(实心圆标示)。在对照动物中尿钠***无实质性增加(空心圆标示)。观测到血浆proUGn水平相应提高。图7a右侧的条形图示出在给予盐之后100分钟测量的proUGn血浆浓度(在该图的“之后”条形)是在给予盐之前proUGn血浆浓度(在该图的“之前”条形)的两倍多。

经口至胃给予盐的慢性模型：将动物在各自的饲养笼保持3天，给予标准大鼠食物。然后给予其4天标准食物(0.5％NaCl)或者高Na食物(2％NaCl)(每个处理组6只动物)。饮食的盐浓度不同，但是所有其它方面相同(蛋白质、脂质、碳水化合物和纤维含量)。每日监测食物和水的消耗(随意摄取)。最初3天提供每个动物的对照(刺激前)数据。在前3天每天收集两次血浆和尿液样品，相应于日出(6am)和日落(6pm)时分；在转变饮食后的前24小时期间间隔3小时取样；在剩余的研究期间每天两次取样。通过置于颈动脉内的留置导管取血浆样品(100μL)。将尿液持续收集在预先加入了蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，Milwaukee，Wisconsin，United States of America)的冷冻试管中。通过免疫分析确定血浆和尿液中proUGn水平，尿Na和K的***通过火焰光谱法测量。在实验结束时，取出组织(10cm近端空肠，10cm近端结肠，肾和肝)，尿鸟苷蛋白mRNA水平通过Northern印迹确定。将通过Northern印迹测定的尿鸟苷蛋白mRNA水平标准化为β-肌动蛋白mRNA水平。

慢性给予盐的实验结果示于图7b和7c。图7b示出在改变饮食盐度第3天尿钠***显著增加。得自高盐饮食动物的数据在实心圆中示出，得自对照组的数据在空心圆中示出。与盐摄入的急性改变一样，食物盐摄入的慢性改变也导致血浆proUGn水平上升。图7b右侧的条形图示出高盐饮食的动物的血浆proUGn浓度为大约13pmol/mL，对比之下对照组动物血浆浓度为5-6pmol/mL。图7c示出在高盐饮食6天动物中空肠尿鸟苷蛋白mRNA表达高于维持在低盐饮食6天的动物。

实施例4：血浆ProUGn的肾清除

将含有放射性标记的r-proUGn的溶液在60分钟内经静脉内注入麻醉的大鼠中。血浆和尿液中放射性浓度在全部注入过程中各个时间点通过闪烁技术测量。图8a示出当proUGn的血浆水平(实心圆)保持稳定时，尿液水平(空心圆)在注入过程中显著增加。在60分钟注入结束时，从脑、胸腺、肺、小肠、骨骼肌、脾、心、肾和肝中收集组织样品，通过闪烁计数分析放射性。如图8b所示，只有肾样品中含有显著水平的对应于³⁵S-proUGn存在的放射性。

为了测量proUGn的肾清除率，在推注放射性标记的前肽之后监测³⁵S-proUGn的血浆水平。为对照组(即正常)大鼠和无肾大鼠进行推注给药(大约10⁶cpm)。在注射后的各个时间点，取血样并通过HPLC分级分离。每个HPLC级分中的放射性在闪烁计数仪中测量。图8c示出proUGn在对照动物(空心圆)比在无肾动物(实心圆)中更迅速地清除。总之，这些实验结果表明肾看起来是proUGn清除的主要途径。

实施例5：血浆和肾ProUGn代谢

在将³⁵S-proUGn(大约10⁶cpm)推注进颈动脉之后2、5和10分钟取血浆样品(每个时间点取2份)。在60分钟动脉注入³⁵S-proUGn结束时收集30分钟尿液(n＝7)。注入材料中cpm/μL与用于推注的溶液中cpm/μL相比低大约100倍。血浆和尿液样品应用于HPLC层析柱并洗脱，每个级分的放射性在闪烁计数仪中测量。

作为肾是proUGn清除所必需的的进一步证据，并且作为肾是proUGn或者非-UGn₁₈ proUGn代谢物起作用的部位的可能提示，注射的³⁵S-proUGn的HPLC分析表明proUGn看起来完整无缺地保留在血浆中(图9a)。尽管随着时间的过去浓度降低，但是没有新的放射标记的产物出现。相反，在延长注入³⁵S-proUGn之后，对尿液中放射性物质进行的HPLC分析显示了至少两种、可能三种proUGn-相关产物(图9b)。在43分钟的峰的保留时间与proUGn相似；因此与下文实施例9中提议的那些研究相似的结构研究对于明确确定该峰值是否与新的proUGn片段相关或者就是完整的proUGn而言是必需的。还检测了与游离的放射性标记的半胱氨酸和甲硫氨酸相应的峰。

实施例6：通过注入ProUGn诱导的利尿和尿钠***

天然proUGn纯化自大鼠小肠。将动物通过过高剂量麻醉而处死，取出大约20cm的近端小肠。将组织纵向切开，用盐水漂洗，用显微镜玻片刮擦而分离粘膜层。将刮擦下的材料在金属平板上速冻至-78.5℃，然后在含有蛋白酶抑制剂的50mM HEPES(pH7.4)中形成匀浆。将该匀浆通过在50,000×g离心澄清，将上清相继在MonoQ阴离子交换层析柱和VYDACC-18反相层析柱上通过HPLC分级分离。第二个层析步骤的HPLC层析图在图10a中示出，各个HPLC级分的Western印迹在插图中示出，证实存在proUGn。将纯化的材料干燥以除去HPLC溶剂，并再悬浮于生理盐水中。通过定量proUGn免疫分析测量回收情况。

将天然的proUGn在60分钟内注入一组5只麻醉的大鼠中，采用含有大约180-pmol肽的标准注入。估计大鼠血浆体积为10mL，注入速度为大约3pmol/mL/分钟。监测注入之前40分钟、注入期间和注入后50分钟的血压、尿液产生和钠***情况，以测量proUGn对利尿和促尿钠***的作用。为了进行对比，将对照组5只大鼠注入常规盐水，1只大鼠注入通过与抗体6910和6912一起温育而被中和的proUGn溶液，1只大鼠注入含有5μg/kg/小时的STa溶液。

图10b示出注入提取的proUGn的大鼠中尿液流增加(实心圆标示)。相应于注入的时间在图中用实心水平线条标示。尿液流动增加在注入期间开始，但是在注入结束后仍持续。在对照组动物(空心圆标示)中未见尿液流增加，所述对照组动物是接受免疫中和的proUGn的动物(三角形标示)或者接受STa的动物(方形标示)。如图10c所示，钠***反映出尿液流速增加。图10c中***的Western印迹示出在注入期间检测的尿液proUGn***。图10c中虚线上方的Western印迹中的每个样品代表在注入肽之前、期间和之后在20分钟期间内从代表性动物中收集的总尿液的50％。

这个实验的结果提示注入的proUGn与UGn₁₈相比具有潜在更强的利尿和促尿钠***作用。在注入proUGn之后，钠的***从60nmol/分钟增加至3200nmol/分钟。这个应答与在注入UGn₁₈的动物中报道的应答相比高出许多倍。见 Fonteles，M.C.，et al.，Am.J.Physiol.，275，F191-F197(1998)； Carrithers，S.L.，et al.，Braz.J.Med.Biol.Res.，32，1337-1344(1999)； Carrithers，S.L.，et al.，Kidney Int.，65，40-53(2004)所述。所述利尿和促尿钠***作用通过预吸收具有抗体6910和6912混合物的注入物而消除，表明所述生物学活性确实与proUGn相关，而不是与在proUGn从肠道组织中提取期间获得的共洗脱杂质相关。

实施例7：在急性口服盐摄取之后循环抗-proUGn抗体对proUGn代 谢物的产生和钠***的作用

用标准推注³⁵S-proUGn处理的动物还被先给予一次1mL的兔抗-proUGn抗体(6910和6912均为500μL)的经静脉内注射。给予推注³⁵S-proUGn处理的对照动物被先给予一次1mL非免疫原性兔血清的注射。在接下来的两个小时中的各个时间点取血浆样品，通过闪烁计数分析与起始数值相比³⁵S的消失情况。在实验自始至终收集尿液，分析放射性物质的***情况。如图11a所示，用抗-proUGn抗体进行免疫封闭导致³⁵S-proUGn从血浆中的清除显著延迟。图11b中的条形图示出与对照组相比该免疫封闭还降低尿液中proUGn代谢物的***。

在进一步的实验中，通过实施例3所述管饲法为对照动物组和接受抗-proUGn抗体的动物组给予3mL的300mM NaCl。收集尿液样品并确定Na的量。如图11c所示，在胃摄取之后的促尿钠***应答的产生速度从对照组大鼠的13±1nEq/min²(空心圆)降低至抗体封闭的动物的7±3nEq/min²(实心圆，P＜0.0005)。总之，免疫封闭实验表明抗-proUGn抗体看起来结合proUGn，阻止肾对其的清除。免疫封闭的动物中促尿钠***作用的降低进一步提供了proUGn(或者其肾代谢物之一)是涉及肠-肾轴的钠尿肽的证据。

实施例8：proUGn ED₅₀的确定

重组proUGn(r-proUGn)是与麦芽糖结合蛋白(MBP)符合读框地经细菌合成的(及与麦芽糖结合蛋白(MBP)符合读框地融合)，使用pMAL载体。将一个His标记和一个TEV蛋白酶切割位点***MBP和proUGn之间。该融合蛋白通过与直链淀粉柱结合而纯化，proUGn通过TEV对固定的材料的切割而释放。使用Ni-琼脂糖珠除去任何游离的、未切割的融合蛋白和游离的MBP，以及重组TEV蛋白酶。然后将r-proUGn另外通过反相HPLC纯化。r-proUGn的回收通过Western印迹监测，回收的前肽的绝对量通过在酸性水解之后的定量氨基酸分析确定。

在60分钟对照期之后，将合成的r-proUGn或者纯化的天然proUGn在60分钟内经静脉内注入。以30分钟间隔收集尿液直至proUGn注入结束之后180分钟，确定每个间隔收集的尿液体积、钠***和钾***情况。持续监测血压。由于肾对proUGn的应答缓慢发生及时程较长，因此仅给予每种动物一种浓度的proUGn。给予量通过分析用于制备注入量的原液而计算，并且进行滴定以产生钠***的剂量-应答关系。所得血浆浓度通过分析注入之前和之后取样的血浆而确定。

实施例9：肾 proUGn代谢物的同一性和活性的确定

对在实施例6中延长注入³⁵S-proUGn之后收集的尿液进行的HPLC分析示出proUGn的三种可能的肾代谢物(见图9b)。这三种可能的代谢物的各自同一性通过对相应HPLC级分进行质谱分析而确定。在质谱分析之前，将峰通过阴离子或者阳离子交换层析进行一轮额外的纯化，和/或通过按比例扩大实施例6所述的程序产生更多的样品。在按比例扩大反应中，纯化的天然proUGn中掺入痕量的放射性proUGn并注入一些大鼠中，收集尿液。然后集合尿液并通过两步反相/离子交换纯化方案纯化。将含有每种可能的proUGn代谢物的最终级分冻干，重悬浮于小体积的50％甲醇/0.1％甲酸中。这些样品中肽的质量使用质谱分析仪确定，例如使用Bruker Reflex IIMALDI-TOF设备(Bruker Daltonics，Billerica，Massachusetts，UnitedStates of America)或者Applied Biosystems Voyager^TM 4700MALDI-TOF/TOF设备(Applied Biosystems，Foster City，California，United States of America)进行，衍生自proUGn的那些肽片段使用MASCOT搜索引擎(Matrix Science，Boston，Massachusetts，UnitedStates of America)鉴别。除了这种肽质量指纹识别方法之外，还可以进行串联MS以通过MALDI-TOF/TOF对各个肽进行测序。在其中MALDI-TOF/TOF结果不确定(即在肽序列与亲代序列之间未发现显著匹配)的情况下，串联ESI-MS/MS数据使用均装备了毫微-ESI和毫微-毛细管LC***的ABI QSTAR(Applied Biosystems，Foster City，California，United States of America)或者Waters Micromass Q-TOF^TMAPI-US(Waters，Milford，Massachusetts，United States of America)获得，衍生自proUGn的肽使用MASCOT从串联MS数据中鉴别。

通过MS分析鉴别的肽序列根据已建立的固相或者液相肽合成技术合成。将每种合成的肽以基于摩尔-至-摩尔计算出的相对于proUGn确定的ED₅₀高100倍的剂量注入大鼠中。

如果对于这种高剂量的任何合成的肽检测到活性，则确定完整剂量/应答的关系。另外的实验应用放射性形式的肽，其通过对合成材料进行末端标记或者从放射性proUGn的肾代谢中收集额外的材料而产生。将这种放射性肽导入未经试验的动物肾动脉中，收集尿液，并通过HPLC分析以确定所述肽是否抵抗肾内蛋白酶解。

参考文献

下文列出的参考文献以及本说明书中引用的所有参考文献均通过引用其补充、解释、提供背景或者教导本文应用的方法、技术和/或组合物的范围并入本文。本申请书中所有引用的专利和出版物均通过引用并入本文。所有引用的GenBank登记号、LocusID及其它计算机数据库列表也均通过引用并入本文。

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应理解在不偏离本发明范围的前提下可以对本发明的各种详细内容进行变化。另外，前文描述只是为了例证本发明，而无限制本发明之意。

                              序列表

<110>迈克尔·F·戈伊

尼古拉斯·G·穆斯

钱迅

<120>作为涉及盐和/或体液稳态的疾病的治疗剂和诊断剂的

尿鸟苷蛋白原及合成的类似物或自其衍生的蛋白酶解产物

<130>421-103-PCT

<150>60/571,172

<151>2004-05-14

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>18

<212>PRT

<213>Rattus  norvegicus

<400>1

Thr Ile Ala Thr Asp Glu Cys Glu Leu Cys Ile Asn Val Ala Cys Thr

1               5                   10                   15

Gly Cys

<210>2

<211>16

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

1               5                   10                  15

<210>3

<211>106

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>3

Met Ser Gly Ser Gln Leu Trp Ala Ala Val Leu Leu Leu Leu Val Leu

1                5                  10                   15

Gln Ser Ala Gln Gly Val Tyr Ile Lys Tyr His Gly Phe Gln Val Gln

             20                     25              30

Leu Glu Ser Val Lys Lys Leu Asn Glu Leu Glu Glu Lys Gln Met Ser

        35                      40              45

Asp Pro Gln Gln Gln Lys Ser Gly Leu Leu Pro Asp Val Cys Tyr Asn

    50                      55              60

Pro Ala Leu Pro Leu Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala

65                      70              75                   80

Ala Ser Thr Phe Lys Ala Leu Arg Thr Ile Ala Thr Asp Glu Cys Glu

                85                  90                  95

Leu Cys Ile Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys

            100                 105

<210>4

<211>112

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>4

Met Gly Cys Arg Ala Ala Ser Gly Leu Leu Pro Gly Val Ala Val Val

1               5                   10                  15

Leu Leu Leu Leu Leu Gln Ser Thr Gln Ser Val Tyr Ile Gln Tyr Gln

            20                  25                  30

Gly Phe Arg Val Gln Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu

       35                   40                  45

Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro

    50                  55                  60

Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys

65                  70                  75                  80

Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala

                85                  90                  95

Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

            100                 105                 110

<210>5

<211>86

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>5

Val Tyr Ile Gln Tyr Gln Gly Phe Arg Val Gln Leu Glu Ser Met Lys

1               5                   10                  15

Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln

            20                  25                  30

Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln

        35                  40                  45

Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys

    50                  55                  60

Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val

65                  70                  75                  80

Ala Cys Thr Gly Cys Leu

                85

<210>6

<211>15

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>6

Pro Asn Thr Cys Glu Ile Cys Ala Tyr Ala Ala Cys Thr Gly Cys

1               5           10                          15

<210>7

<211>15

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>7

Pro Ala Leu Pro Leu Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu

1               5                   10                  15

<210>8

<211>85

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>8

Val Tyr Ile Lys Tyr His Gly Phe Gln Val Gln Leu Glu Ser Val Lys

1               5                   10                  15

Lys Leu Asn Glu Leu Glu Glu Lys Gln Met Ser Asp Pro Gln Gln Gln

            20                  25                  30

Lys Ser Gly Leu Leu Pro Asp Val Cys Tyr Asn Pro Ala Leu Pro Leu

        35                  40                  45

Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ala Ser Thr Phe Lys

    50                  55                  60

Ala Leu Arg Thr Ile Ala Thr Asp Glu Cys Glu Leu Cys Ile Asn Val

65                  70                  75                  80

Ala Cys Thr Gly Cys

                85

<210>9

<211>115

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>9

Met Asn Ala Trp Leu Leu Ser Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala Leu Ala

1               5                   10                  15

Val Leu Val Glu Gly Val Thr Val Gln Asp Gly Asp Leu Ser Phe Pro

            20                  25                  30

Leu Glu Ser Val Lys Gln Leu Lys His Leu Arg Glu Val Gln Glu Pro

        35                  40                  45

Thr Leu Met Ser His Lys Lys Phe Ala Leu Arg Leu Pro Lys Pro Val

    50                  55                  60

Ala Pro Glu Leu Cys Ser Gln Ser Ala Phe Pro Glu Ala Leu Arg Pro

65                  70                  75                  80

Leu Cys Glu Lys Pro Asn Ala Glu Glu Ile Leu Gln Arg Leu Glu Ala

                85                  90                  95

Ile Ala Gln Asp Pro Asn Thr Cys Glu Ile Cys Ala Tyr Ala Ala Cys

            100                 105                 110

Thr Gly Cys

        115

<210>10

<211>14

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>10

Gln Gln Gln Lys Ser Gly Leu Leu Pro Asp Val Cys Tyr Asn

1               5                   10

<210>11

<211>14

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>11

Val Gln Asp Gly Asp Leu Ser Phe Pro Leu Glu Ser Val Lys

1               5                   10

<210>12

<211>15

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>12

Leu Cys Glu Lys Pro Asn Ala Glu Glu Ile Leu Gln Arg Leu Glu

1               5                   10                  l5

Claims (13)

1.一种在需要治疗的患者中治疗特征在于盐潴留、体液潴留及其组合的疾病的方法，所述方法包括给予患者有效量的前尿鸟苷蛋白原、尿鸟苷蛋白原或者其片段或者类似物。

2.权利要求1的方法，其中所述疾病选自肾病、心脏病、肝病、高血压、及这些疾病的组合。

3.权利要求1的方法，其中所述前尿鸟苷蛋白原、尿鸟苷蛋白原、或者其片段或类似物通过注入给予。

4.权利要求1的方法，其中所述前尿鸟苷蛋白原、尿鸟苷蛋白原、或者其片段或类似物选自合成的、天然的及重组的前尿鸟苷蛋白原、尿鸟苷蛋白原或者其片段或类似物。

5.权利要求1的方法，其中有效量的前尿鸟苷蛋白原、尿鸟苷蛋白原或者其片段或类似物是与影响盐平衡、体液平衡或者盐和体液平衡的一或多种其它药物组合给予。

6.权利要求5的方法，其中所述一或多种其它药物是利尿剂。

7.权利要求6的方法，其中所述利尿剂选自碳酸酐酶抑制剂、噻嗪样利尿剂、袢或高界利尿剂及保钾利尿剂。

8.权利要求6的方法，其中所述利尿剂选自呋苯胺酸、布美他尼、托拉塞米、氢***、氨苯蝶啶、吲达帕胺、依他尼酸、螺内酯及美托拉宗。

9.一种确定患者中特征在于盐潴留、体液潴留、盐流失、体液流失及其组合的疾病的存在或者进展的方法，所述方法包括检测患者样品中尿鸟苷蛋白原的水平。

10.权利要求9的方法，其中所述样品选自血液样品、尿液样品、及其组合。

11.权利要求9的方法，其中尿鸟苷蛋白原水平通过免疫分析检测。

12.权利要求9的方法，包括测量样品中尿鸟苷蛋白原与尿鸟苷蛋白的比率。

13.一种检测样品中尿鸟苷蛋白原水平的免疫分析试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)包含冻干的抗尿鸟苷蛋白原抗体的第一个小瓶；和

(b)包含药物可接受的稀释剂的第二个小瓶。

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