DE19528544A1

DE19528544A1 - cDNA-Sequenz und daraus abgeleitete Aminosäuresequenz des Vorläuferproteins von humanem GCAP II/Uroguanylin sowie Aminosäuresequenz des im humanen Blut zirkulierenden Fragmentes

Info

Publication number: DE19528544A1
Application number: DE1995128544
Authority: DE
Inventors: Wolf-Georg Prof Dr M Forssmann
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-08-03
Filing date: 1995-08-03
Publication date: 1997-02-06
Also published as: WO1997006258A3; WO1997006258A2; AU6789296A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Eiweißstoffes in reiner oder partiell aufgereinigter Form aus menschlichen und tierischen Körperflüssigkeiten, der die Fähigkeit besitzt, den transepithelialen Transport von Elektrolyten und Wasser zu steuern. Dieser Stoff ist dadurch gekennzeichnet, daß er insbesondere aus Hemofiltrat oder Hemodialysat, das aus menschlichem und tierischem Blut abfiltriert wird, gewonnen werden kann. Der Stoff ist als Guanylatcyclase Activating Peptide II (GCAP-II) bezeichnet und kann zum Zwecke (1) der Analyse von Erkrankungen, (2) zur medizinischen und gewerblichen Verwendung als Medikament benutzt werden.

Der Stoff GCAP-II wurde erstmals aus dem Hemofiltrat Nierenkranker nach Ultrafiltration am Hemodialyseapparat gewonnen und über einen Biotest der Stimulation der Guanylatcyclase-C von Darmzellen (T84-Zellinie) funktionell charakterisiert. Zur Darstellung des GCAP-II wurde ein patentiertes Verfahren (Forssmann, 1988; Offenlegungsschrift DE 36 33 707 A1) verfeinert, welches zuvor für Gewinnung von Eiweißstoffen aus Hemofiltrat erfunden wurde. Aus den mit diesem Verfahren gewonnenen Molekülen von einem Molekulargewicht unter 20 kDalton, die bei veno-ve nöser oder arterio-venöser Shuntverbindung abfiltriert werden, können die Fraktionen enthaltend das GCAP-II überraschenderweise durch einen Funktionstest erkannt werden. Das bisher bekannte Verfahren wurde also benutzt, um die Rohpeptidextrakte zu gewinnen, mit denen überraschenderweise bei der Anwendung an T84-Kolonkarzinomzellen in Zellkultur ein starker Effekt bemerkt wurde, indem die Generierung des Second Messengers cGMP unter dem Einfluß dieser Substanz überraschend stark aktiviert wurde. Es wurde weiter festgestellt, daß bei speziellen weiteren Aufreinigungsverfahren diese biologische Aktivität konzentriert werden konnte, bis schließlich ein einheitlicher Eiweißstoff identifiziert und in seiner Struktur aufgeklärt wurde. Der Wert dieser Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß dieser Stoff aus dem bisher als wertlos betrachteten Hemofiltrat aufgereinigt werden kann, um als wirtschaftlich verwertbare Substanz benutzt zu werden. Der genannte Stoff GCAP-II ist weiter dadurch gekennzeichnet, daß er durch chemische Synthese und durch gentechnologische Produktion gewonnen werden kann und überraschenderweise für zahlreiche weitere Belange genutzt werden kann, u. a. für die Analyse im menschlichen Blut als pathognomonisches Diagnosemerkmal von Erkrankungen des Magen-Darm- und Urogenitaltraktes sowie des Respirationstraktes, cardiovasculären Systems und des Nervenapparates.

Die vorliegende Erfindung betrifft also ein neues Peptid, das GCAP-II (Guanylatcyclase Activating Peptide II), seine Herstellung, dieses enthaltende Arzneimittel sowie dieses enthaltende Aufbereitungen und seine Verwendung dafür. Sie betrifft weiterhin die cDNA des Vorläuferproteins und die sich daraus ergebenden Anwendungen, nämlich die biotechnologische Herstellung und die Konstruktion von Sonden für gendiagnostische Zwecke.

In jüngster Zeit hat sich immer mehr gezeigt, daß Stoffe für die Regulation der Funktion des Magendarmtraktes diagnostisch und therapeutisch von großem Interesse sind und daß wahrscheinlich noch eine große Zahl unbekannter Faktoren existieren, die von klinisch verwertbarer Bedeutung sind. Dazu könnten auch Faktoren gehören, die sowohl bei der Behandlung von Verdauungs-, Kreislauf- und Atemwegserkrankungen als auch bei der Hormonsubstitution bei vielen Erkrankungen durch regelmäßige Gabe über einen langen Zeitraum, gegebenenfalls lebenslang, verabreicht werden könnten, um diese Krankheitsvorgänge im positiven Sinne zu steuern.

In einigen Arbeiten (Guarino, Cohen, Thompson, Dharmsathaphorn and Giannella, Am.J.Physiol. 253: G775-G780, 1987) wurde nun nachgewiesen, daß bestimmte Zellinien aus Epithelien (z. B. T84 Zellen des Dickdarm, menschliche Coloncarcinomzellen) des Magendarmtraktes durch ein bereits bekanntes Peptid, das aus Bakterien abgegeben wird (hitzestabile Enterotoxine) über Membranrezeptoren spezifisch beeinflußt werden.

Bei der Suche nach der Existenz weiterer auf diese Weise charakterisierbarer Wirkstoffe wurde überraschenderweise das GCAP-II als biologisch aktives Molekül im menschlichen Plasma gesunder und kranker Menschen gefunden. Damit wurde ein Molekül entdeckt, dessen Struktur bisher unbekannt war und dessen Bildungsstätte im Körper noch ungeklärt ist. Die therapeutische und wirtschaftliche Verwendung wurde geprüft und das GCAP-II wurde überraschenderweise als wichtiges zirkulierendes Peptid des menschlichen Blutes erkannt. Außerdem wurde erstmals die komplette cDNA des GCAP-II-Vorläufers kloniert und sequenziert. Daraus konnte die Aminosäuresequenz des Vorläuferproteins abgeleitet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit:
Ein Blutpeptid GCAP-II mit der Aminosäurensequenz

Phe - Lys - Thr - Leu - Arg -Thr - Ile - Ala - Asn - Asp - Asp - Cys - Glu - Leu - Cyc - Val - Asn - Val - Ala - Cys - Thr - Gly - Cyc - Leu

sowie seine natürlichen und pharmakologisch verträglichen Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, phosphorylierte und glycosylierte GCAP-II Derivate und weitere Fragmente des Peptides. Durch Massenspektrometrie konnte ein Molekulargewicht von 2597,7 Dalton festgestellt werden (Beispiel 1). Die ermittelte Aminosäuresequenz für GCAP-II entspricht der von der cDNA abgeleiteten Aminosäuresequenz von Position 89 bis Position 112 (COOH- Terminus).

Damit ist weiter Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Peptid, das GCAP-II, bereitzustellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es als ein gut zugängliches Arzneimittel mit biologisch und therapeutischer Aktivität eines natürlichen Analogons des im Blut vorkommenden Stoffes verwandt werden kann.

Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Herstellungsverfahrens für dieses GCAP-II sowie die Anwendung des GCAP-II als Arzneimittel für verschiedene therapeutische und diagnostische Indikationen. Dazu kann das CAP-II als hochreiner Stoff oder - wenn für die bestimmte Verwendung ausreichend - innerhalb eines teilweise aufgereinigten Peptidgemisches (Beispiel 1) verwandt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiter verschiedene Verfahren zur Herstellung dieses GCAP-II oder seiner Derivate dadurch gekennzeichnet, daß dieses über eine prokaryontische oder eine eukaryontische Expression hergestellt und chromatographisch gereinigt wird, sowie ein weiteres Verfahren zur Herstellung der GCAP-II bezogenen Moleküle bzw. seiner Derivate, indem man es aus menschlichem Blut über Chromatographie-Verfahren in bekannter Weise isoliert, und schließlich ein Verfahren zur Herstellung des GCAP-II oder seiner Derivate, indem man diese GCAP-II-Moleküle durch die üblichen Verfahren der Festphasen- und Flüssigphasen-Synthese aus den geschützten Aminosäuren, die in der angegebenen Sequenz enthalten sind, herstellt, deblockiert und es mit den gängigen Chromatographie-Verfahren reinigt (Beispiel 2).

Die GCAP-II-Moleküle wurden chemisch synthetisiert (vgl. Beispiel 2) und als Arzneimittel zubereitet. Auch die gentechnologische Herstellung über übliche Vektoren ist erarbeitet: auf gentechnologischem Wege wird das GCAP-II-Peptid sowohl (1) in pro- als auch (2) in eukaryontischen Organismen hergestellt. Hierfür stehen u. a. Expressionsvektoren zur sekretorischen Expression (z. B. pSP6, pRit-Derivate, Pharmacia), zur direkten cytoplasmatischen Expression (z. B. pKK-Derivate, Pharmacia) oder Expression als Fusionsprotein (pMC1871, Pharmacia). Für die eukaryontische Expression haben wir verschiedene Organismen und Vektoren zur Verfügung, z. B. Insektenzellen (Summers and Smith, Tex.Agric.Exp.Stn.(bull) 1555, 1987), Hefen (Hitzeman et al., Nature, 293, 717-722, 1981), filamentöse Pilze (Yelton et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 81, 1470-1474, 1984)) und Säugerzellen (Zettlmeissl et al., Biotechnology, 5, 720-725, 1987), von denen wir vorzugsweise die Insektenzellen benutzen. Die exprimierten Peptide der GCAP-II werden mit Methoden der Chromatographie gereinigt, vorzugsweise wie in Beispiel 1 angegeben.

Die Arzneimittelzubereitung enthält GCAP-II oder ein physiologisch verträgliches Salz des GCAP-II. Die Form und Zusammensetzung des Arzneimittels, welches das GCAP-II enthält, richtet sich nach der Art der Verabreichung. Das humane GCAP-II kann parenteral, intranasal, oral und mittels Inhalation verabreicht werden. Vorzugsweise wird GCAP-II zu einem Injektionspräparat, entweder als Lösung oder als Lyophilisat zur Auflösung unmittelbar vor Gebrauch, konfektioniert. Die Arzneimittelzubereitung kann außerdem Hilfsstoffe enthalten, die abfülltechnisch bedingt sind, einen Beitrag zur Löslichkeit, Stabilität oder Sterilität des Arzneimittels leisten oder den Wirkungsgrad der Aufnahme in den Körper erhöhen.

Die zu verabreichende Tagesdosis für GCAP-II hängt von der Indikation und der Anwendung bestimmter Derivate ab. Bei i.v./i.m. Injektion liegt sie im Bereich von 100 bis 1200 Einheiten (µg)/Tag, bei täglicher subcutaner Injektion vorzugsweise bei 300-2400 Einheiten (µg)/Tag.

Die Bestimmung der biologischen Aktivität für das GCAP-II basiert auf Messungen gegen internationale und hauseigene Referenzpräparationen für humanes GCAP-II oder seiner Analoga in einem gebräuchlichen biologischen Testverfahren für dieselben. Dazu wird vorzugsweise ein standardisierter cGMP Generationstest mit T84-Zellen benutzt (Beispiel 3).

Das erfindungsgemäße Peptid GCAP-II ist dadurch gekennzeichnet, daß es sich besonders auch für die Langzeit-Therapie bei Durchfallerkrankungen eignet, da es über eine ausgezeichnete biologische Wirksamkeit verfügt und andererseits auch bei Dauerbehandlung keine Immunreaktion auslöst.

Aufgrund der biologischen Wirkung ist gezeigt, daß das erfindungsgemäße Präparat weiter als Mittel zur Therapie von Nierenerkrankungen, Herzerkrankungen, Erkrankungen endokriner Organe, in der Intensivpflege und bei Lungenerkrankungen anzuwenden (vgl. Beispiel 3) ist.

Das erfindungsgemäße Präparat ist weiter als Mittel zur Therapie und Diagnose bei Stoffwechselerkrankungen des Magen-Darm-Traktes (insbesondere Dünndarm und Bauchspeicheldrüse), der Atemwege, des Herz-Kreislaufsystems und Urogenitalapparates, endokriner Organe sowie des Nervensystems einzusetzen, da es zur Herstellung von human verträglichen Antikörpern verwandt werden kann, die geeignet sind, Änderungen der Stoffwechsellage dieser Organe festzustellen oder zu beeinflussen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen und den folgenden Abbildungen, auf die in den Beispielen (und teilweise den Ansprüchen) Bezug genommen wird, erläutert:
Es zeigen:

Abb. 1

Sequenzanalyse: Nach Auftragen von 1/20 des Materials aus dem endgereinigten GCAP-II nach Chromatographie in Abbildung 7, ca. 50-100 pmol, konnten die Reste von Position 1 bis 24 deutlich ohne nachweisbare Nebensequenz festgestellt werden. Die Art der Sequenzierung ist im Text ausführlich beschrieben.

Positionen 1 bis 24 aus direkter Sequenzierung:

Phe - Lys - Thr - Leu - Arg - Thr - Ile - Ala - Asn - Asp - Asp - Cys - Glu - Leu - Cyc - Val - Asn - Val - Ala - Cys - Thr - Gly - Cyc - Leu

Abb. 2

Verwendete Primer in 5′→3′ Orientierung. Unterstrichene Bereiche enthalten Erkennungs sequenzen für Restriktionsendonukleasen, die eine effiziente Klonierung der PCR-Produkte gewährleisten.

Abb. 3

cDNA-Sequenz des GCAP-II/Uroguanylin-Vorläufers und abgeleitete Aminosäuresequenz. Die translatierten Bereiche sind in Großbuchstaben, die nichttranslatierten Bereiche in Kleinbuchstaben dargestellt. Das ATG-Startcodon, das TGA-Stopcodon sowie das AATAAA-Polyadenylierungs signal sind unterstrichen. Die Positionen der verwendeten Primer sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Die erste Aminosäure des isolierten GCAP-II ist mit einem Dreieck, die erste Aminosäure des Uroguanylins mit einer Raute gekennzeichnet.

Abb. 4

Durch Spaltung mit spezifischen Endoproteasen erhaltbare C-terminale Fragmente des Uro guanylin-Vorläuferproteins. Die entsprechende Endoprotease ist über den Sequenzen der damit generierten Teilfragmente aufgeführt.

Endoprotease Arg-C

1.
Ala Ala Ser Gly Leu Leu Pro Gly Val Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Gln Ser Thr Gln Ser Val Tyr Ile Gln Tyr Gln Gly Phe Arg Val Gln Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

2.
Val Gln Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

3.
Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

4.
Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

Endoprotease Lys-C

1.
Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

2.
Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

3.
Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

Endoprotease Asp-N

1.
Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

2.
Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

3.
Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

4.
Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

Trypsin

3.
Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

4.
Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

5.
Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

6.
Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

Chymotrypsin

1.
Ile Gln Tyr Gln Gly Phe Arg Val Gln Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

2.
Gln Gly Phe Arg Val Gln Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

3.
Arg Val Gln Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

4.
Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

Endoprotease für 2 basische Aminosäuren

1.
Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

2.
Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

Endoprotease Glu-C bzw. S. aureus U8

1.
Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

2.
Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

3.
Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

4.
Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

5.
Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

6.
Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

7.
Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

8.
Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

Beispiel 1

Direkter Nachweis der Aminosäuren-Sequenz des zirkulierenden, biologisch aktiven GCAP-II nach Isolierung aus Hemofiltrat.

Als Ausgangsmaterial wurde Hemofiltrat verwendet, das in großen Mengen bei der Behandlung niereninsuffizienter Patienten anfällt und alle Plasmabestandteile bis zu einer Molekülgröße von ca. 20.000 Dalton enthält.

I. Gewinnung des Rohpeptidmaterials

Das Hemofiltrat wurde mittels einer Hemofiltrationsanlage der Firma Sartorius unter Verwendung von Cellulosetriacetat-Filtern mit einer Ausschlußgröße von 20.000 Dalton (Typ SM 40042, Sartorius, Göttingen, BRD) gewonnen. Das Filtrat stammte von niereninsuffizienten Patienten, die sich durch Langzeit-Hemofiltration in einer stabilen Stoffwechsellage befanden. 3000 l Hemofiltrat wurden gewonnen und unmittelbar nach der Gewinnung mittels Ansäuern und Abkühlung auf 4°C gegen proteolytischen Abbau geschützt. Anschließend wurde durch vier Kationenaustauscher extraktionen eine Rohpeptidfraktion (570,5 g) gewonnen. Durch die folgende Ultrafiltration mittels einer Ultrafiltrationsanlage der Firma Sartorius unter Verwendung eines Cellulosetriacetat-Filters mit einer Ausschlußgröße von 20.000 Dalton (Typ SM 3031454901E, Sartorius) wurde ein von Plasmabestandteilen größer 20.000 Dalton weitestgehend befreites Filtrat gewonnen.

II. Isolierung einer Fraktion mit cGMP-generierender Wirkung auf T84-Zellen 1. Entsalzen und Fraktionierung des Rohpeptidmaterials über RP-C18 Festphase (Stufe 1)

Die Rohpeptidfraktion aus der Ultrafiltration wurde über eine mit RP-C18 Material (Vydac, Hesperia, CA, USA) gefüllte Kartusche, die mit 0,01 N Salzsäure equilibriert war, chromatographisch mittels HPLC aufgetrennt:

Die cGMP generierende Wirkung der Fraktionen wurde an T84 Zeilen, gezüchtet in Fischer- Medium (Gibco) gemessen, indem die Zunahme mittels eines Radioimmunoassays nach 60 min festgestellt wurde und mit Kontrollen verglichen, bei denen zum Kulturmedium statt der HF- Peptide 0,9% NaCl gegeben wurde. Die im cGMP-Gernerations-Test meßbar bioaktiven Fraktionen aus 11 Läufen dieser Reinigungsstufe wurden im Pool VI zusammengefaßt.

Der betreffende Pool VI wurde für die weitere Isolierung eingesetzt.

2. Präparative Large-Scale-RP-Chromatographie II von Pool VI (Stufe 2)

Eine weitere präparative Aufreinigung der GCAP-II-haltigen Peptidfraktionen erfolgte bei Raumtemperatur über eine RP-C18 Material (Vydac, Hesperia, CA, USA) gefüllte Kartusche mittels einer HPLC-Anlage (BioCAD, PerSeptive Biosystems, Freiburg, BRD) wobei die cGMP-ge nerierende wirksame Peptidfraktion wieder eingeengt werden konnte. Das Material des Pools VI wurde dabei als abrotierte Flüssigkeit in einem Lauf aufgetragen. Die Fraktionen 4-6 enthielten Bioaktivität bezüglich des cGMP-Generationstestes an T84-Zellen. Die Fraktion 5 wurde für die weitere Auftrennung verwendet. Bedingungen:

3. Analytische Kationenaustauscher-Chromatographie der GCAP-II-haltigen Fraktion aus der präparativen RP-C18-Chromatographie II (Stufe 3)

Die bioaktive GCAP-II-haltige immunreaktive Fraktion (50 ml) wurde über eine analytische Kationenaustauscher-Chromatographie weiter gereinigt. Die biologische Aktivität erscheint dabei im Bereich einer Retentionszeit von 8 und 9% des Eluenten B. Diese Fraktionen aus 17 identischen Läufen wurden gepoolt. Bedingungen:

4. Analytische HPLC-RP-C4-Chromatographie des GCAP-II-haltigen Pools aus der analytischen Kationenaustauscher-Chromatographie (Stufe 4)

Die Aufarbeitung des Pools, der die cGMP-generierende, bioaktive Wirkung zeigte, wurde durch eine RP-C4-Chromatographie in weitere Unterbestandteile aufgetrennt, wobei sich deutlich eine GCAP-II-Aktivität nach einer Chromatographiezeit von 34-36 min nach Programmstart feststellen ließ (2 Fraktionen). Diese je zwei hochaktiven Fraktionen von fünf Chromatographieläufen wurden wieder gepoolt und direkt weiter verarbeitet. Bedingungen:

5. Analytische RP-C18-Chromatographie des GCAP-II-bioaktiven Pools aus der analytischen HPLC-RP-C4-Chromatographie (Stufe 5)

Die gesamte Substanz der fünf Läufe aus Reinigungsstufe 4 wurde in Lösung gelassen, mit Eluent A verdünnt und auf einer Vydac RP-C18-HPLC-Anlage (Kontron) in drei gleichartigen Läufen chromatographiert. Das T84-Zellen aktivierende Peptid war in einem Bereich nachzuweisen, der innerhalb von einer Minute eluierte. Das gesamte weitere Material der bioaktiven Fraktionen wurde schließlich mit der gleichen Säule rechromatographiert (s. Stufe 6). Bedingungen:

6. Analytische RP-Chromatographie III der GCAP-II-bioaktiven Fraktionen Pools aus der analytischen RP-Chromatographie II (Stufe 6, Endreinigung)

Die gesamte Substanz der drei Läufe aus Reinigungsstufe 5 wurde in Lösung gelassen, mit Eluent A verdünnt und dann auf einer Vydac RP-C18-HPLC-Anlage (Kontron) in zwei Läufen rechromatographiert. Das gesuchte cGMP-aktivierende Peptid (GCAP-II) war nun in einem Peak nachzuweisen, der in drei Teilfraktionen per Hand gesammelt wurde. Jede Fraktion wurde im Bioassay getestet (siehe Beispiel 3), ansequenziert und im Massenspektrometer mittels LC-MS- Kopplung analysiert. Bedingungen:

7. Sequenzanalytische Bestimmung der Primärstruktur des GCAP-II

Aus Fraktion 8 des 1. Laufes und Fraktion 26 der Reinigungsstufe 6 wurden je 14 µl aus der Gesamtmenge von je 280 µl zur Aminosäuren-Sequenz-Analyse benutzt. Nach Isolierung aus Hemofiltrat wie oben beschrieben, wurden mit Hilfe des Gasphasensequenators Typ ABI 473 A (Applied Biosystems) sequenziert. Der EDMAN-Abbau (Edman und Begg, Eur. J. Biochem. L 80-91, 1967) erfolgte mit dem Standardprogramm PTHRUN. Die Analyse der derivatisierten Aminosäuren wurde im on-line-Verfahren unter Verwendung des Standardprotokolls ABI durchgeführt.

Für diese Fraktionen konnte eine Sequenz von 24 Aminosäuren bestimmt werden (Abb. 1). Bei der gefundenen Sequenz handelt es sich um die NH₂-terminal verlängerte Form des humanen Uroguanylins. Sie besitzt strukturelle Homologien zu denen des humanen Guanylins und der hitzestabilen Enterotoxine aus Bakterien. Für diese Peptide ist die aktivierende Wirkung auf die Guanylatcyclase-C beschrieben.

Des weiteren wurde nun aus dem Endprodukt der Aufreinigung nach Stufe 6 alle bioaktiven Unterfraktion des per Hand gesammelten Peaks einer Microbore-HPLC-MS-Kopplung unterworfen, um über die Masse 2597,7 Dalton die Identität des GCAP-II in diesen Unterfraktionen zu bestätigen. Nach dieser Bestimmung war abzuleiten, daß GCAP-II für die Bioaktivität in den Unterfraktionen verantwortlich ist.

Der äußerst geringe Kontaminierungsgrad des nativen GCAP-II konnte somit in den Unterfraktion festgestellt werden, woraus hervorging, daß das Peptid in hochreiner Form vorlag und die biologische Wirkung nach dem derzeitigen Stand der Kenntnis nicht auf eine Verunreinigung zu beziehen war.

8. Nachweis des Molekulargewichtes des nativen GCAP-II durch Microbore- HPLC-Massenspektrometrie-Kopplung

Aus dem Endprodukt der Aufreinigung nach Stufe 6 wurden weiter alle Unterfraktionen des per Hand gesammelten Peaks massenspektrometrisch untersucht. Die Analysen wurden unter Verwendung des Dual Syringe Solvent Delivery System ABI 140A (Applied Biosystems, Weiterstadt, BRD), einer RP-C18-Säule AQS 1.0 × 250 mm (YMC, Schernbeck, BRD) und einem mit einem Articulated Ion Spray inlet ausgestatteten API III Biomolecular Mass Analyser (Sciex, Perkin Elmer, Langen, BRD) durchgeführt. Die molekularen Massen wurden im Positiv-Ion-Mode gemessen. Mittels dieser Bestimmung wurde festgestellt, daß alle Unterfraktionen GCAP-II mit einem MG von 2597,7 Dalton enthielten. In allen Fraktion war die Substanz dieses Molekulargewichtes quantitativ dominierend.

Beispiel 2

Chemische Synthese des humanen Guanylatcyclase-Aktivierenden Peptides II (GCAP-II).

1. Strategie der Synthese des humanen GCAP-II

Für die Synthese des Peptids mit der Formel:

Phe - Lys - Thr - Leu - Arg - Thr - Ile - Ala - Asn - Asp - Asp - Cys - Glu - Leu - Cyc- Val - Asn - Val - Ala - Cys - Thr - Gly - Cyc - Leu

wurde die Durchflußmethode (Atherton und Sheppard, Solid phase peptide synthesis. IRL Press, Oxford, 1989) angewendet. Die genannte Peptidsequenz wurde mit Hilfe einer automatischen Peptidsynthese-Apparatur (Model 9050, Biosearch/PerSeptive) unter Verwendung von Fmoc- Aminosäuren synthetisiert. Folgende Fmoc-Aminosäuren wurden im Überschuß (4 Äquivalente) eingesetzt (verwendet wurden jeweils die Derivate der L-Aminosäuren):
Fmoc-Ala, Fmoc-Asp(OBu^t), Fmoc-Glu(OBu_t), Fmoc-Leu, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Gly, Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Gln-OPfp, Fmoc- Gln(Trt), Fmoc-Val-OPfp, Fmoc-Val.

Die Synthese wurde durch in situ-Aktivierung unter Zugabe von 4,4 Äquivalenten TBTU [O-(1H- Benzotriazol-1-yl)-N,N,N,N′-tetramethyluronium-tetrafluoroborat], 4,4 Äquivalenten 1- Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 8,8 Äquivalenten Diisopropylethylamingebildeten in N,N- Dimethylformamid durchgeführt. Als Träger-Harz für die Synthese wurde vorbelegtes Fmoc-L- Cys(Acm)-PEG-PS-Harz (0.20 mmol/g Belegungsgrad, Biosearch/PerSeptive) eingesetzt. Zur regioselektiven Einführung der beiden Disulfidbrücken wurden die Cysteinreste in Position 15 und 23 als Acetamidomethyl(Acm)-geschützte Cysteinderivate eingesetzt während die Cysteinreste in den Positionen 12 und 20 als Trityl-geschützte Derivate eingesetzt wurden. Nach Abspaltung und Entblockierung des Peptides vom Träger bleiben die Acm-Gruppen erhalten, so daß die erste Disulfidbrücke durch Luftoxidation eingeführt werden kann. Anschließend wird die zweite Disulfidbrücke durch Oxidation mit Iod gebildet, so daß keine falsch verbrückten Guanylin- Isomere entstehen können.

2. Praktische Durchführung der Synthese des humanen GCAP-II

Die Synthese von

Phe - Lys - Thr - Leu - Arg - Thr - Ile - Ala - Asn - Asp - Asp - Cys - Glu - Leu - Cyc - Val - Asn - Val - Ala - Cys -Thr - Gly - Cyc - Leu GCAP-II

wurde mit dem automatischen 9050 PepSynthesizer (Programm Version 1.3, Biosearch/PerSeptive) nach der continuousflow-Methode durchgeführt. Fmoc-Aminosäuren waren L-konfiguriert und in 0,8 mmol-Portionen verwendet. Alle zur Synthese notwendigen Reagenzien wurden von Biosearch/PerSeptive bezogen: N,N-Dimethylformamid, 20% Piperidin in N,N- Dimethylformamid und 1-Hydroxybenzotriazol. Die L-Aminosäurederivate wurden in vierfachem Überschuß bezogen auf das harzgebundene Fmoc-L-Leucin eingesetzt, durchgeführt. Folgender Synthesecyclus wurde verwendet: Fmoc-Abspaltung mit 20% Piperidin in DMF (10 min), waschen mit DMF (12 min), Acylierung (30 min) und waschen mit DMF (8 min). Die fortschreitende Synthese wurde durch kontinuierliche UV-Detektion verfolgt. Die Synthese wurde mit der Abspaltung des N-terminalen Fmoc-Restes abgeschlossen. Das harzgebundene Peptid wurde dreimal mit je 50 ml Isopropanol, Isopropanol und tert-Butylmethylether gewaschen und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

Die Abspaltung vom Harz erfolgte mit Trifluoressigsäure/Ethandithiol/Wasser im Verhältnis 94 : 3 : 3 (10 ml, v/v/v) innerhalb von 90 Minuten. Die Lösung wird in vacuo eingeengt und das Produkt durch Zugabe von Diethylether ausgefällt. Das erhaltene Rohpeptid wird mehrere Male mit Diethylether gewaschen, getrocknet und anschließend in Wasser aufgenommen und gefriergetrocknet. Aus 490 mg Peptid-Harz werden 85 mg Rohpeptid erhalten.

Zur Einführung der ersten Disulfidbrücke wird das Rohpeptid mit einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,1 M wäßrige Ammoniumcarbonat-Lösung bei pH=8,3 gegeben. Bei Raumtemperatur wird diese Mischung 48 Stunden an der Luft gerührt und anschließend lyophilisiert. Zur Einführung der zweiten Disulfidbrücke wird das erhaltene Produkt in 80% Methanol in Wasser aufgenommen und mit 5 Äquivalenten festem Iod versetzt. Diese tiefbraune Mischung wird unter Stickstoffatmosphäre 3 Stunden heftig gerührt. Das überschüssige Iod wird anschließend unter tropfenweiser Zugabe von 0,1 M Natriumthiosulfat-Lösung bis zur Entfärbung versetzt. Die erhaltene Lösung wird mit einem Volumenteil Wasser verdünnt und das Peptid dann gereinigt.

Die Reinigung erfolgte unter Benutzung eines in unabhängiger Synthese hergestellten Standards von GCAP-II, dessen korrekte Sequenz durch MS (Massenspektrometrie) und Sequenzanalyse bestätigt war. Hierzu wurde eine Reversed-phase-HPLC (Vydac C18, 22 × 250 mm, 10 µ, 300 Å, Flußrate 8 ml/min, Detektion bei 230 nm, Elutionsmittel A=0,06% Trifluoressigsäure in Wasser, B=0.055% Trifluoressigsäure in Acetonitril/Wasser 4 : 1 (v/v), Gradient: 0-100% B in 70 min).

Die Ausbeute betrug 3,6 mg.

Das erhaltene Material coeluiert in einer analytischen RP-HPLC mit C18-Material mit dem unabhängig hergestellten Standard. Die Identität des synthetisierten Materials mit der vorgegebenen Primärstruktur von GCAP-II wurde durch Massenspektrometrie (Sciex API III, Perkin-Elmer) und Sequenzierung in einem Gassphasensequenator (Modell 470, Perkin-Elmer) bestätigt. Die biologische Aktivität des synthetischen GCAP-II wurde im Funktionstest durch die cGMP- Generations-stimulierende Wirkung an T84-Koloncarcinom-Zellen nachgewiesen. Dieser zeigte, daß das synthetische Material eine korrekte biologische Aktivität aufweist.

Beispiel 3 Biologische Wirkung und Anwendung des GCAP-II

Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde Hemofiltrat chromatographisch aufgearbeitet, wobei GCAP- II-enthaltende Fraktionen in allen Reinigungsstufen gefunden wurden. Das gemäß Beispiel 2 synthetisierte GCAP-II wurden für den folgenden Test als Substanz eingesetzt. Auf gleiche Weise konnten aus dem Hemofiltrat in allen Reinigungsstufen Fraktionen nachgewiesen werden, die die biologische, cGMP-generierende Wirkung wie GCAP-II zeigte.

Die Zellen wurden nach Aussaat in 24 Well-Platten nach ca. 2-3 Tagen verwendet. Die Inkubation erfolgte mit 0,5 ml Zellmedium in Gegenwart von 1 mM IBMX (Sigma) bei 37°C. Die GCAP-II- Peptid enthaltenden Präparate wurden unmittelbar vor Versuchsbeginn im Zellmedium aufgenommen. Im Versuchsansatz wurden 1,5 × 105 Zellen mit 0,1 mM GCAP-II bzw. während der Aufarbeitung Aliquots GCAP-II-Peptid enthaltender Fraktionen für 60 min inkubiert und die cGMP-generierende Wirkung gegenüber Kontrollen gemessen. Zur Kontrolle wurden Zellen mit Fischer-Medium (1.) ohne jeglichen Zusatz, und (2.) mit verschiedenen Konzentrationen an GCAP-II pro Wells (0,5 ml) inkubiert. Die erhaltenen Werte der cGMP-Generation sind als Mittelwerte von Vierfachansätzen ± S.D. angegeben.

Der Zusatz von GCAP-II bzw. die Zusammensetzung des Mediums wurde zu Beginn der Inkulation vorgenommen und während der Versuchszeit bleiben die Proben im Inkubator bei 37°C.

Die Ergebnisse zeigten, daß signifikante Unterschiede in der Wirksamkeit des GCAP-II im Vergleich zu den Kontrollen mit den untersuchten Zellsystem bestehen. Außerdem besteht eine Dosis abhängige Wirkung. Dieses Ergebnis läßt auf Unterschiede in der Wirkungsweise dieses Peptides schließen, die sich auf den Aktivierungsmechanismus des GCAP-II beziehen. Damit ist gezeigt, daß GCAP-II die cGMP Generation in T84-Zellen über einen bereits früher identifizierten Receptor für hitzestabile Enterotoxine beeinflussen muß.

In ähnlicher Weise wurde festgestellt daß auch weitere Zellarten auf GCAP-II ansprechen, u. a. Belegzellen des Magens, Kryptenzellen des Dünndarms, Schaltzellen der Pankreasgänge und Leber, die unter Verwendung des GCAP-II auch die intracelluläre Ca⁺⁺ Konzentration ändern.

Beispiel 4 Darstellung der cDNA für das Vorläuferprotein von humanem GCAP-II/Uroguanylin

Aus acht humanen Geweben (Duodenum, Colon, Magen, Leber, Pankreas, Niere, Nebenniere und Harnblase) wurde mit Standardmethoden die Gesamt-RNA gewonnen. Mit Hilfe MMLV-Reverser Transkriptase und des Oligo(dT)-Primers UNIP-5 (siehe Abb. 2 u. 3), der teilweise komplementär zum Poly(A)-Schwanz eukaryontischer mRNA ist, erfolgte eine Umschreibung in cDNA- Erststrang.

Ausgehend von der GCAP II-Aminosäuresequenz (FKTLRTIANDDCELCVNVACTGCL) wurde der degenerierte PCR-Primer HUGU-5 (siehe Abb. 2 u. 3) konstruiert, der die Codons für das C- terminale Fragment CVNVAC beinhaltet. Mit Hilfe dieses Primers und des Primers UMP-6 (siehe Abb. 2 u. 3), dessen Sequenz in UNIP-5 enthalten ist, wurden anschließend unter Verwendung der verschiedenen cDNAs Polymerase-Kettenreaktionen (PCRs) (Saiki, R.K. et al., Science, 239, 487-491, 1988) durchgeführt. Nur im Falle der Colon-cDNA erhielten wir ein 280 bp großes Amplifikationsprodukt. Dieses DNA-Fragment wurde kloniert und sequenziert. Die Analyse der Nucleotidsequenz ergab, daß in 3′-Richtung hinter der Region, welche dem Primer HUGU-5 entspricht, ein Bereich folgt, der im korrekten Leseraster für die Aminosäuren codiert, die aus den Peptidsequenzen zu erwarten sind. Dies bestätigte die Klonierung eines GCAP-II/Uroguanylin-spe zifischen cDNA-Fragmentes. Auf das Codon für Leucin in Position 24 von GCAP II bzw. in Position 16 von Uroguanylin folgt dann ein TGA-Translationsstopcodon, was ein Beweis dafür darstellt, daß die isolierten Peptide den C-Terminus eines Vorläuferproteins repräsentieren.

Um mögliche Syntheseorte des GCAP-II/Uroguanylin-Vorläuferproteins zu identifizieren, wurde eine Northern-Hybridisierung (Thomas, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5201-5205, 1980) mit Gesamt-RNA aus einer Reihe humaner Gewebe (Tonsillen, Parotis, Herzaurikel, Magen, Pankreas, Leber, Colon, Niere und Nebenniere) durchgeführt. Als Hybridisierungsprobe wurde ein inneres, mit den Primern HUGU-8 und HUGU-9 (siehe Abb. 2 u. 3) erhaltenes PCR- Fragment verwendet, welches nicht mehr die Oligo(dT)-Sequenz des Primers HUGU-5 enthält und daher nicht zu einem unspezifischen Hintergrund durch Kreuzhybridisierung mit den Poly(A)- Schwänzen eukaryontischer mRNAs führt. Von den untersuchten Geweben zeigte nur Colon ein relativ starkes Signal, was für eine hohe Expressionsrate des DCAP-II/Uroguanylin-Gens in diesem Gewebe spricht.

Die Kenntnis des Syntheseortes erlaubte nun die Durchführung einer sogenannten 5′-RACE-PCR (Frohmann, M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988) zur Amplifikation des 5′-terminalen Restes der GCAP-II/Uroguanylin-cDNA. Hierzu wurden die selbstkonstruierten Primer HUGU-7, HUGU-9 und HUGU-10, humane Colon-Gesamt-RNA und das 5′-RACE-System von Gibco BRL (Eggenstein) verwendet. Tatsächlich wurde ein 500 bp großes homogenes Fragment im letzten Amplifikationsschritt erhalten. Durch Klonierung und Sequenzierung konnte die Spezifität für GCAP-II/Uroguanylin bestätigt und zusammen mit der zuerst erhaltenen Sequenz eine komplette, 583 Basenpaare große cDNA-Sequenz des GCAP- II/Uroguanylin-Vorläufers zusammengesetzt werden (siehe Abb. 3).

Das erste in der Sequenz erscheinende potentielle Translationsstartcodon ATG ist tatsächlich der Beginn eines offenen Leserasters von 336 Basenpaaren, das für einen 112 Aminosäuren großen GCAP-II/Uroguanylin-Vorläufer codiert. Die N-terminal ersten 21 Aminosäuren zeigen erwartungsgemäß die typischen Charakteristika (hohe Hydrophobizität) eines sekretorischen Signalpeptides (Von Heÿne, G., Eur. i. Biochem., 133, 17-21, 1983). Der 3′-Terminus der cDNA-Sequenz codiert wie bereits erwähnt für die isolierten Peptide GCAP-II und Uroguanylin.

Claims

1. GCAP-II mit der Aminosäurensequenz Phe - Lys - Thr - Leu - Arg - Thr - Ile - Ala - Asn - Asp - Asp - Cys - Glu - Leu - Cyc - Val - Asn - Val - Ala - Cys -Thr - Gly - Cvc - Leu GCAP-IIsowie seine natürlichen und pharmakologisch verträglichen Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, phosphorylierte und glycosylierte GCAP-II-Derivate. Weiterhin natürliche und künstliche Fragmente mit biologischer Wirkung, die aus der Aminosäurensequenz abgeleitet werden.

2. GCAP-II-Vorläufer-cDNA-Sequenz und daraus abgeleitete Aminosäuresequenz des GCAP-II- Vorläufers gemäß Abb. 3.

3. Durch spezifische endoproteolytische Spaltung erhaltene C-terminale Teilfragmente des aus der cDNA-Sequenz abgeleiteten GCAP-II-Vorläufers mit biologischer Aktivität gemäß Abb. 4.

4. Verfahren zur Herstellung des GCAP-II oder seiner Derivate und seiner Fragmente nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß dieses über eine prokaryontische oder eine eukaryontische Expression hergestellt und chromatographisch gereinigt wird.

5. Verfahren zur Herstellung des GCAP-II oder seiner Derivate und seiner Fragmente nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß man es aus menschlichem Blut über übliche Chromatographie-Verfahren in bekannter Weise isoliert.

6. Verfahren zur Herstellung des GCAP-II oder seiner Derivate und seiner Fragmente nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß man das GCAP-II oder seine Derivate durch die üblichen Verfahren der Festphasen- und Flüssigphasen-Synthese aus den geschützten Aminosäuren, die in der ausgegebenen Sequenz enthalten sind, herstellt, deblockiert und es mit den gängigen Chromatographie-Verfahren reinigt.

7. Arzneimittel, enthaltend das humane, zirkulierende GCAP-II oder seiner Derivate und seiner Fragmente nach Anspruch 1 und 3 oder hergestellt nach Ansprüchen 4 bis 6, das GCAP-II als aktiven Wirkstoff neben üblichen Hilfs- und Zusatzstoffen.

8. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 7 zur Behandlung von Erkrankungen, die bei Funktionsstörungen des Elektrolyt-Wasser-Haushaltes auftreten (Nieren- und Darmerkrankungen).

9. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 7 zur Behandlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Magen-Darm-Traktes, der Atemwege und des Urogenitalapparates.

10. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 7 zur Behandlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Herzkreislauf- und Nervensystems.

11. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 7 zur Behandlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Intugementes und der Sinnesorgane.

12. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 7 zur Behandlung von Systemerkrankungen bei Überproduktion oder Mangel von GCAP-II, insbesondere bei z. B. durch Anwendung gegen dieses gebildete Antikörper oder zur Verwendung von GCAP-II zur Substitutionstherapie.

13. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 7 zur Behandlung von chronischen Erkrankungen, teils vergesellschaftet mit Erkrankungen gemäß Ansprüchen 8 bis 12, indem es in geeigneter Form für die Behandlung für die Elektrolytwirkung bei Erkrankungen auf den Knochenumbau (Osteoporose) oder am Zahnapparat benutzt wird.

14. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 7 zur Behandlung von endokrinen Erkrankungen, die durch Stimulation des cGMP-Spiegels in endokrinen Zellen einhergehen wie z. B. die Erkrankungen des endokrinen Pankreas (Diabetes), der Hypophyse und des endokrinen Magen-Darmtraktes.

15. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 7 zur Behandlung von akuten Erkrankungen, gemäß Ansprüchen 8 bis 14, indem es in geeigneter Form für die Behandlung in der Intensivpflege dieser Erkrankungen benutzt wird.

16. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 7 zur Diagnose von Erkrankungen, insbesondere nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 14, indem spezifische Antikörper gegen das synthetische Peptid oder seiner Derivate und seiner Fragmente hergestellt werden und die Blutkonzentration GCAP-II über Immuntests gemessen wird.

17. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 7 in verschiedenen galenischen Applikationsformen, insbesondere der lyophilisierten, mit Mannit aufgenommenen Form in sterilen Ampullen zur Auflösung in physiologischer Kochsalzlösung und/oder Infusionslösungen zur wiederholten Einzelinjektion und/oder Dauerinfusion in Mengen von 300 Mikrogramm bis 30 Milligramm reines GCAP-II pro Therapie-Einheit.

18. Verwendung der humanen cDNA für die Erkennung und Behandlung der in Ansprüchen 8 bis 14 genannten Erkrankungen, indem Gensonden aus dem sequenzierten Bereich abgeleitet, synthetisch oder biotechnologisch hergestellt und zur Diagnose über Hybridisierungstechniken (z. B. Southern- und Northern-Blots) sowie mit spezifischer PCR-Reaktion benutzt werden.

19. Verwendung der humanen cDNA als Hybridisiersonde bzw. zur Herstellung von Oligonukleotiden als Hybridisiersonden, die der Klonierung des humanen GCAP-II-Gens dienen.

20. Verwendung des Gens nach Anspruch 18 zur Konstruktion von Vektoren, die speziell in der Gentherapie für GCAP-II abhängige Erkrankungen eingesetzt werden können.

21. Verwendung der cDNA oder des Gens nach Anspruch 18 mit den erarbeiteten Nukleotidsequenzen zur Konstruktion von Expressionssystemen, bestehend aus den in diesen Sequenzen enthaltenen Nukleotidfragmenten zur Produktion von GCAP-II-bezogenen Peptiden für die wirtschaftliche Verwertung, insbesondere die Behandlung der in Ansprüchen 8 bis 14 genannten Erkrankungen.

22. Verwendung des humanen GCAP-II-Gens nach Anspruch 18 mit seiner erarbeiteten Nukleotidsequenz zur Veränderung des Genoms bei Tieren, die wirtschaftliche Verwendung finden, z. B. in Form von transgenen Spezies oder modifizierten Tierarten, die besonders resistent gegen die in Ansprüchen 8 bis 14 genannten Erkrankungen sind.

23. Zu Anspruch 14 wird auch die Anwendung weiterer bekannter Peptide dieser Stoffgruppe namentlich Guanylin-I (GCAP-I) beansprucht, da die genannten endokrinen Organe im Rahmen dieser Studie miterfaßt wurden. Hierzu zählen die Stoffe Guanylin I (GCAP-I) und dessen Vorläuferprotein mit ihren Primärstrukturen und den natürlichen Spaltprodukten.