CN102272163A - 瘦素和瘦素类似物结合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明特征在于一种具有通式A-X-B的化合物，其中，A是能够增强所述化合物转运穿过血脑屏障或进入特定细胞类型的肽载体，X是连接子，而B是瘦素、瘦素类似物或OB受体激动剂。本发明的化合物可用于治疗其中需要增加的瘦素量的任何疾病，如代谢疾病，包括肥胖症和糖尿病。

Description

瘦素和瘦素类似物结合物及其用途
技术领域
本发明涉及包括结合至肽载体的瘦素(leptin)、瘦素类似物或OB受体激动剂的化合物及其用途。
背景技术
纵观世界，肥胖症流行正趋上升。根据世界卫生组织(World HealthOrganization)(报道)，全世界有超过3亿的肥胖成年人(身体质量指数(BMI)＞30)，和11亿体重超重人群(BMI＞25)。在美国，超过半数的成年人体重超重(64.5％)，以及近1/3(30.5％)肥胖。肥胖症与如2型糖尿病、冠状动脉疾病、某些癌症的发病率提高、呼吸道综合症和骨关节炎的病症有关。体重过重或肥胖是缩短预期寿命的公认因素并据估计导致美国每年300,000人过早死亡。治疗肥胖症患者的医疗指导建议改变进食习惯并增加体力活动。现有一些治疗药剂辅助治疗肥胖症，然而，它们不能代替生活方式的改变。
由于肥胖症和相关紊乱据信涉及到大脑的变化，且由于肥胖症的治疗需要影响神经传递的治疗，因而作用于大脑的疗法需要具有能够进入大脑的能力才能发挥疗效。血脑屏障(BBB)被认为是潜在使用药物治疗中枢神经***(CNS)的紊乱症的主要障碍。CNS药物的全球市场在2006年有$680亿，这大致是心血管药物全球市场的一半，即使是在美国，患有心血管疾病的人群是患有CNS紊乱症人群的接近2倍。这种失衡的原因，部分在于超过98％的所有潜在CNS药物不能穿过BBB。另外，超过99％的全世界CNS药物开发专注于CNS药物的发现，而涉及CNS药物递送的则不到1％。这可以解释为什么缺乏可用于主要神经学疾病的治疗选择。
大脑由于两种屏障***的存在而受到庇护以防止潜在的有毒物质：BBB和血-脑脊髓液屏障(BCSFB)。BBB被认为是摄取血清配体的主要途径，因为其表面积为BCSFB的约5000倍。构成BBB的大脑内皮，代表了使用潜在药物对抗许多CNS紊乱症的主要障碍。通常，仅较小的亲脂性分子可以穿过BBB，即从循环***的血液进入到大脑。而具有较大尺寸或较高疏水性的多种药物，对于CNS靶表现出高效能，但却不能在动物中发挥功效，因为这些药物不能有效穿过BBB。因此，肽和蛋白疗法通常不能从血液转运到大脑中，这是由于大脑毛细血管内皮壁对这些药物的可渗透性微乎其微。大脑毛细血管内皮细胞(BCEC)由于紧密连接而被严密密封，相比于其它器官的毛细血管，具有极少的窗孔(fenestrae)和细胞内小泡(endocytic vesicles)。BCEC被胞外基质、星形细胞、周细胞和微胶质细胞包围。内皮细胞与星形细胞脚突起(foot processes)以及毛细血管基膜的紧密联合(association)对于开发和维持容许血-脑交换的紧密控制的BBB性质是重要的。
因此，仍然需要改善抗肥胖症治疗剂如瘦素和瘦素类似物向大脑、以及其它组织的递送。
发明内容
为了改善瘦素转运穿过BBB，我们已经开发了包括(a)瘦素、瘦素类似物、或OB受体激动剂和(b)肽载体的化合物。这些化合物适用于治疗任何其中需要提高多肽治疗剂转运穿过BBB或进入特定细胞类型的瘦素相关性紊乱(例如，肥胖症)。肽载体能够将多肽治疗剂转运穿过血脑屏障(BBB)或进入特定的细胞类型(例如，肝、肺、肾、脾和肌肉)。令人惊讶的是，我们已经证实，较低剂量的示例性多肽治疗剂，瘦素116-130，在如本文所述结合于肽载体时，比未结合的药剂更有效地降低体重和减少食物摄取。因为结合物靶向穿过BBB或进入特定的细胞类型，相比于未结合的瘦素、瘦素类似物或OB受体激动剂，采用较小剂量或较低频率的给予即可实现治疗功效，由此降低了副作用的严重性或发生率和/或提高了疗效。该化合物，相比于未结合的多肽治疗剂，也可表现出稳定性提高、药代动力学改善或体内降解降低。
因此，在第一方面中，本发明的特征在于一种具有以下通式的化合物：
A-X-B
其中A是能够被转运穿过所述血脑屏障(BBB)或进入特定细胞类型(例如，肝、肺、肾、脾和肌肉)的肽载体，X是连接子，而B是选自由瘦素、瘦素类似物和OB受体激动剂构成的组中的多肽治疗剂。转运穿过BBB或进入细胞可以提高至少10％、25％、50％、75％、100％、200％、500％、750％、1000％、1500％、2000％、5000％或10,000％。所述化合物可以是基本上纯的。所述化合物可以与药用载体配制(例如，本文中描述的任何药用载体)。
在另一方面，本发明特征在于制备所述化合物A-X-B的方法。在一个实施方式中，该方法包括将所述肽载体(A)结合于连接子(X)，并将肽载体-连接子(A-X)结合于瘦素、瘦素类似物或OB受体激动剂(B)，由此形成所述化合物A-X-B。在另一实施方式中，该方法包括将B结合于连接子(X)，并将X-B结合于肽载体(A)，由此形成所述化合物A-X-B。在另一实施方式中，该方法包括将所述肽载体(A)结合于瘦素、瘦素类似物或结合于OB受体(B)，其中A或B可选地包含连接子(X)，而形成所述化合物A-X-B。
在另一方面，本发明特征在于编码所述化合物A-X-B的核酸分子，其中所述化合物是多肽。核酸分子可以可操作地连接至启动子并可以是核酸载体的一部分。这种载体可以是在细胞中，如原核细胞(例如，细菌细胞)或真核细胞(例如，酵母或哺乳动物细胞，如人细胞)。
在另一方面，本发明特征在于制备通式A-X-B的化合物的方法，其中A-X-B是多肽。在一个实施方式中，该方法包括在细胞中表达前述方面的核酸载体而产生所述多肽；以及纯化所述多肽。
在另一方面，本发明特征在于治疗(例如，预防性地)患有代谢紊乱症的主体的方法。该方法包括以足以治疗所述紊乱症的量给予第一方面的化合物。这种代谢紊乱症可以是糖尿病(例如，I型或II型)、肥胖症、肥胖症所致的糖尿病、高血糖症、血脂异常症、高甘油三酯血症、X综合症、胰岛素抗性、葡萄糖耐量降低(葡萄糖耐受不良，IGT)、糖尿病性血脂异常症、高血脂症、心血管疾病或高血压。
在另一方面，本发明特征在于减少主体食物摄取或降低主体体重的方法。该方法包括以足以减少食物摄取或降低体重的量向主体给予本发明第一方面的化合物。该主体可以是体重过重、肥胖或食欲过盛。
在涉及向主体给予化合物的任何方法中，足够的量可以是低于未结合至肽载体的多肽治疗剂(例如，本文中描述的任何多肽治疗剂)的相当剂量所需量的90％、75％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或0.1％。这种足够的量相比于给予有效量的未结合至肽载体的多肽治疗剂，可降低副作用(例如，呕吐、恶心或腹泻)。主体可以是哺乳动物，如人类。
在以上任何方面中，肽载体可以是基本上同一于表1所列任何序列的多肽或其片段。在某些实施方式中，肽载体具有血管肽-1(SEQ ID NO：67)、血管肽-2(SEQ ID NO：97)、血管肽-3(SEQ ID NO：107)、血管肽-4a(SEQ IDNO：108)、血管肽-4b(SEQ ID NO：109)、血管肽-5(SEQ ID NO：110)、血管肽-6(SEQ ID NO：111)或血管肽-7(SEQ ID NO：112)的序列。肽载体或结合体可以有效地转运进入特定细胞类型(例如，肝、肺、肾、脾和肌肉中的任何一种、两种、三种、四种或五种)或可以有效穿过哺乳动物BBB(例如，血管肽-1、-2、-3、-4a、-4b、-5和-6)。在另一实施方式中，这种肽载体或结合体能够进入特定细胞类型(例如，肝、肺、肾、脾和肌肉中的任何一种、两种、三种、四种或五种)但是不能有效穿过BBB(例如，包括血管肽-7的结合体)。这种肽载体可以具有任何长度，例如，至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、35、50、75、100、200或500个氨基酸或处于这些数值之间的任何范围。在某些实施方式中，这种肽载体长度为10～50个氨基酸。这种多肽可以通过重组遗传技术或化学合成而生产。
表1：示例性肽载体
Figure BDA0000075330340000041
Figure BDA0000075330340000051
Figure BDA0000075330340000061
多肽No.5、67、76和91分别包含SEQ ID NO：5、67、76和91的序列，且在C-端酰胺化。
多肽No.107、109和110分别包含SEQ ID NO：97、109和110的序列，且在N-端乙酰化。
在以上任何方面中，肽载体可以包含具有以下通式的氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19
其中X1-X19(例如，X1-X6、X8、X9、X11-X14和X16-X19)各自独立地是任何氨基酸(例如，天然存在的氨基酸如Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val)或是不存在，且X1，X10和X15中的至少一个(例如，2或3个)是精氨酸。在一些实施方式中，X7是Ser或Cys；或X10和X15各自独立地是Arg或Lys。在一些实施方式中，X1至X19的残基(包括X1和X19)基本上同一于SEQ ID NO：1-105和107-116任何一个的任意氨基酸序列(例如，血管肽-1、血管肽-2、血管肽-3、血管肽-4a、血管肽-4b、血管肽-5、血管肽-6和血管肽-7)。在一些实施方式中，氨基酸X1-X19中至少一个(例如，2、3、4或5)是Arg。在一些实施方式中，这种多肽在该多肽的N-端、该多肽的C-端或两端具有一个或多个另外的半胱氨酸残基。
在任意上述方面的某些实施方式中，这种肽载体或瘦素、瘦素类似物或OB受体激动剂被修饰(改性)(例如，如本文中所述)。这种肽载体或多肽治疗剂可进行酰胺化、乙酰化或酰胺化和乙酰化。这种修饰可以是在该多肽的氨基或羧基端上。这种肽载体或多肽治疗剂也可包含或作为本文中描述的任意多肽的肽模拟物(例如，本文中描述的那些)。这种肽载体或多肽治疗剂可以是多聚体形式，例如，二聚体形式(例如，通过经由半胱氨酸残基的二硫化物结合而形成)。
在某些实施方式中，所述肽载体或瘦素、瘦素类似物、或OB受体激动剂包含具有至少一个氨基酸替换(替代，substitution)(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个替换)、***或缺失的本文中所述的氨基酸序列。所述多肽可以包含例如1～12、1～10、1～5、或1～3个氨基酸替换，如1至10(如至9、8、7、6、5、4、3、2)个氨基酸替换。所述氨基酸替换可以是保守性或非保守性替换。如所述肽载体可以在对应于任何SEQID NO：1、血管肽-1、血管肽-2、血管肽-3、血管肽-4a、血管肽-4b、血管肽-5、血管肽-6和血管肽-7的氨基酸序列的位置1、10和15的1个、2个或3个位置上具有精氨酸。在某些实施方式中，瘦素、瘦素类似物、或激动剂可以在任何位置具有半胱氨酸或赖氨酸替换或添加(如在N-端或C-端位置的赖氨酸替换)。
在以上任何方面中，所述化合物可以具体排除包括任何SEQ ID NO：1-105和107-116(如血管肽-1、血管肽-2、血管肽-3、血管肽-4a、血管肽-4b、血管肽-5、血管肽-6和血管肽-7)的多肽或由其构成的多肽。在一些实施方式中，本发明的所述多肽和结合物排除SEQ ID NO：102、103、104和105的多肽。
在以上任何方面中，所述连接子(X)可以是本领域已知的或本文中所述的任何连接子。在具体实施方式中，所述连接子是共价键(如肽键)、化学连接剂(如本文中描述的那些)、氨基酸或肽(如2、3、4、5、8、10或更多个氨基酸)。在某些实施方式中，所述连接子具有下式：
Figure BDA0000075330340000081
其中，n是2～15的整数(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15)；要么Y是A上的硫醇(thiol)而Z是B上的伯胺基(primaryamine)、要么Y是B上的硫醇而Z是A上的伯胺基(primary amino)。
在某些实施方式中，所述化合物是包含肽载体(例如，血管肽-2)和多肽治疗剂(例如，人瘦素)的融合蛋白。
在以上任何实施方式中，B可以是瘦素(116-130)、瘦素(22-56)、瘦素(57-92)、瘦素(93-105)、LY396623、美曲普汀(metreleptin)、小鼠瘦素类似物、聚乙二醇化瘦素和甲硫氨酰基人瘦素(蛋氨酰基人瘦素，methionyl human leptin)。抵抗素包括人、小鼠和大鼠抵抗素。瘦素可以是成熟序列(例如，人序列的氨基酸22-167，例如，图16中所示)或全长蛋白(例如，图16中所示)。本发明中所用的多肽可以是任何这些肽或可以基本上同一于任何这些多肽。
“肽载体”是指能够被转运进入特定细胞类型(如肝、肺、肾、脾或肌肉)或穿过BBB的化合物或分子如多肽或多肽模拟物。在某些实施方式中，载体可以结合至癌细胞或脑内皮细胞上存在的受体而由此通过胞转作用(transcytosis)而被转运进入癌细胞或穿过BBB。载体可以是因此可获得高水平跨内皮转运而不会影响该细胞或BBB完整性的分子。这种载体可以是多肽或肽模拟物且可以是天然存在的或通过化学合成或重组遗传技术生产。
“治疗”主体中疾病、紊乱或病症是指通过向该主体给予治疗剂而缓解该疾病、紊乱或病症的至少一种症状。
“预防性治疗”主体中的疾病、紊乱或病症是指在疾病症状发作之前通过向该主体给予治疗剂而降低疾病、紊乱或病症的发生频率或降低疾病、紊乱或病症的严重程度。
在一种实施例中，因为代谢紊乱而受治疗的主体是已经由从业医师诊断为患有这种病症的主体。诊断可以通过任何合适的方式，如本文中描述的那些进行实施。正在预防性治疗糖尿病或肥胖症发展的主体可能已经接受或未接受这种诊断。本领域技术人员将会理解到，本发明的主体可能已经经受标准测试或可能无需检测已证实为具有高风险，因为存在一种或多种风险因素，如家族病史、肥胖症、特殊种族(例如非裔美国人和西班牙裔美国人)、妊娠期糖尿病或生产的孩子体重超过9磅、高血压、患有易感肥胖症或糖尿病的病理学病症、高血液水平甘油三酯、高血液水平胆固醇、存在分子标记(例如存在自身抗体)和年龄(超过45岁)。当个体体重超过其身高所需的最大体重20％(女性为25％)或更高时就认为其肥胖。体重超重多于100磅的成年，被认为是病态肥胖。肥胖症也定义为身体质量指数(BMI)超过30kg/m2。
“代谢紊乱”是指任何由主体中的代谢改变所致的病理学病症。这种紊乱包括由葡萄糖动态平衡改变而导致的那些病症，如高血糖症。根据本发明，葡萄糖水平改变典型地是葡萄糖水平相对于健康个体内的这种水平而升高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或甚至100％。代谢紊乱包括肥胖症和糖尿病(如I型糖尿病、II型糖尿病、MODY、和妊娠期糖尿病)、饱腹感(satiety)和老龄化内分泌不足(endocrine deficiencies of aging)。
“降低葡萄糖水平”是指相对于未治疗的对照而降低葡萄糖水平至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％。理想地，葡萄糖水平降低至正常血糖水平，即，150～60mg/dL、140～70mg/dL、130～70mg/dL、125～80mg/dL、而优选120～80mg/dL。这种葡萄糖水平的降低可以通过提高任何一种与血液葡萄糖的清除相关的生物活性(如提高胰岛素生产、分泌或作用)而获得。
“主体”是指人或非人动物(如哺乳动物)。
“相当剂量”是指相比于未结合的多肽治疗剂，实现本发明化合物中相同摩尔量的多肽治疗剂(例如，瘦素)所需的本发明化合物的量。
“有效转运穿过BBB”的多肽是指能够至少与血管肽-6一样有效地穿过BBB(即，在2007年5月29日提交的美国专利申请No.11/807,597中描述的原位脑灌注分析中，超过38.5％的血管肽-1(250nM)，其结合于本文中作为参考)的多肽。因此，“未有效转运穿过BBB”的多肽则是以较低水平转运到大脑中(如转运效率低于血管肽-6)。
“有效转运进入特定细胞类型”的多肽或化合物是指能够在那种细胞类型中累积(例如，要么是由于进入细胞的转运提高、从细胞的流出减少、要么由于它们的组合)至超过对照物质(或者在结合物的情况下相比于未结合试剂)至少10％(如25％、50％、100％、200％、500％、1,000％、5,000％、或10,000％)程度的多肽或化合物。这种活性详细描述于国际申请公开No.WO 2007/009229中，其结合于本文中作为参考。
本发明的其它特点和优点由以下详细描述、附图和权利要求将会显而易见。
附图说明
图1A和1B是显示瘦素-AN2(C11)结合物在纯化之前(图1A)和之后(1B)的色谱图。
图2是显示瘦素-AN2(C11)结合物纯化结果的色谱图。
图3是显示采用原位脑灌注分析的C3、C6和C11瘦素-AN2结合物被摄入大脑、毛细血管和实质(parenchyma)的图示。
图4A和4B是显示在瘦小鼠和饮食诱导肥胖(DIO)小鼠(图4A)中瘦素116-130和瘦素-AN2(C11)结合物的原位脑灌注、以及在瘦小鼠和DIO小鼠(图4B)中瘦素血浆水平的图示。
图5A和5B是显示接受对照注射(盐水)、瘦素116-130或瘦素-AN2(C11)结合物的小鼠4小时(图5A)或15小时(图5B)之后的食物摄取的图示。
图6是显示在接受对照、瘦素116-130或瘦素-AN2(C11)结合物的小鼠6天时间体重增加的图示。
图7是显示经六天时间的每日IP注射接受对照、瘦素116-130或瘦素-AN2(C11)结合物的ob/ob小鼠10天时间体重增加的图示。
图8是显示GST标记的(tagged)血管肽构建体的示意图。
图9是显示用于产生血管肽-2-瘦素116-130融合蛋白的PCR策略的示意图。
图10是显示在GSH-琼脂糖柱上的GST-血管肽2纯化的色谱图
图11A-11C显示重组血管肽-2肽的蛋白印迹(Western blot)(图11A)、液相色谱实验的UV谱(图11B)和质谱(图11C)。
图12是显示原位脑灌注分析中血管肽-2的合成和重组形式的摄取的图示。
图13是显示原位脑灌注分析中GST、GST-血管肽-2、GST-瘦素116-130和GST-血管肽-2-瘦素116-130被摄入实质的图示。
图14是显示His-标记的小鼠瘦素和His-标记的血管肽-2-小鼠瘦素融合蛋白的示意图。
图15是显示His-标记的小鼠瘦素和人瘦素序列纯化的凝胶图像。
图16是人瘦素前体的序列。该序列的氨基酸22-167形成成熟的瘦素肽。
图17A和图17B是His-标记的瘦素(小鼠)和His-标记的血管肽-2-瘦素结合物的示例性纯化方案。
图18是显示成功小规模(small-scale)表达瘦素和血管肽-2-瘦素结合物的凝胶照片。
图19是显示由His-标记的结合物的凝血酶裂解而获得的两种产品的示意图和凝胶图片。
图20是显示瘦素和血管肽-2-瘦素融合蛋白被摄入DIO小鼠实质中的图示。
图21是显示重组瘦素对ob/ob小鼠体重的影响的图示。
图22是显示接受对照、瘦素、His-标记的小鼠瘦素或His-标记的血管肽-2-瘦素结合物的DIO小鼠体重变化的图示。
具体实施方式
我们已经开发出具有增强的穿过血脑屏障(BBB)或进入特定细胞类型(例如，肝、肺、肾、脾和肌肉)的能力的多肽治疗性结合物，如肽载体结合至示例性多肽治疗剂瘦素的结合物所例示的。这些示例性多肽治疗剂能够起到OB-R受体激动剂的作用。本发明的结合物由此包括治疗性多肽和增强转运穿过BBB的肽载体。
令人惊讶的是，我们已经证明本发明的化合物，相比于瘦素的未结合形式，在降低体重方面更为有效。因此，相比于未结合多肽，较高的功效能够导致较小的剂量、较低频率的给予、较为有效的治疗或较低的副作用。可替换地，在较高剂量下可以获得提高的功效。
瘦素和瘦素类似物
瘦素是脂肪素(脂肪因子，adipokine)，由此在本发明中使用的蛋白或肽可包括脂肪素或其类似物。脂肪素包括脂联素(adiponectin)、瘦素和抵抗素。脂联素包括人、小鼠和大鼠脂联素。瘦素包括瘦素(116-130)、瘦素(22-56)、瘦素(57-92)、瘦素(93-105)、LY396623、美曲普汀、小鼠瘦素类似物、聚乙二醇化瘦素和甲硫氨酰基人瘦素。抵抗素包括人、小鼠和大鼠抵抗素。瘦素可以是裂解序列(例如，人序列的氨基酸22-167，例如，图15中所示)或全长蛋白(例如，图15中所示)。本发明中所用的多肽可以是任何这些肽或蛋白或可以基本上同一于任何这些肽或蛋白。
瘦素类似物可以是OB受体激动剂。在某些实施方式中，OB受体激动剂是在下丘脑中发现的主要受体OB-Rb形式的激动剂或是在血脑屏障处发现的并参与瘦素转运的OB-R的激动剂。
多肽治疗剂的修饰形式
本文中描述的任何瘦素、瘦素类似物或OB受体激动剂可以进行修饰(例如，如本文中描述的或本领域内已知的)。正如在美国专利No.6,924,264中描述的，多肽能够结合至聚合物而增大其分子量。示例性的聚合物包括聚乙二醇聚合物、聚氨基酸、白蛋白、明胶、琥珀酰-明胶、(羟丙基)-甲基丙烯酰胺、脂肪酸、多糖、脂质氨基酸和葡聚糖。
在一种情况下，多肽通过加入白蛋白(例如，人白蛋白)或其类似物或片段或免疫球蛋白的Fc部分而进行修饰。这种方法描述于，例如，美国专利No.7,271,149中。
在一个实施例中，多肽通过加入亲脂性取代基而进行修饰，如PCT公开WO 98/08871中描述的。亲脂性取代基可以包括部分或完全氢化的环戊并菲(cyclopentanophenathrene)骨架、直链或支链烷基；直链或支链脂肪酸的酰基(例如，包括CH3(CH2)nCO-或HOOC(CH2)mCO-的基团，其中n或m为4～38)；直链或支链烷烃α，ω-二羧酸的酰基；CH3(CH2)p((CH2)q，COOH)CHNH-CO(CH2)2CO-，其中p和q是整数且p+q为8～33；CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-，其中r为10～24；CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CO-，其中s为8～24；COOH(CH2)tCO-，其中t为8～24；-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)uCH3，其中u为8～18；-NHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)wCH3，其中w为10～16；-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)xCH3，其中x为10～16；或-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NHCO(CH2)yCH3，其中y为1～22。
在其他实施方式中，多肽治疗剂通过加入化学反应性基团如马来酰亚胺基团进行修饰，如美国专利No.6,593,295中描述的。这些基团可与血液组分上的可利用的反应性官能团发生反应而形成共价键并可延长经修饰的促胰岛素肽的体内治疗有效半衰期。为了与蛋白上官能团形成共价键，可使用作为化学反应性基团的各种活性羧基(例如，酯)，其中羟基部分是在修饰(改性)多肽所需的水平下生理上可接受的。具体的试剂包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基-磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、马来酰亚胺-苯甲酰基-琥珀酰亚胺(MBS)、γ-马来酰亚胺基-丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、马来酰亚胺基丙酸(MPA)、马来酰亚胺基己酸(MHA)和马来酰亚胺基十一酸(MUA)。
伯胺是NHS酯的主要靶。在蛋白和赖氨酸的ε-胺的N-端上存在的可接近的α-胺基与NHS酯发生反应。酰胺键在NHS酯结合反应与释放N-羟基琥珀酰亚胺的伯胺反应时形成。这些含反应性基团的琥珀酰亚胺在本文中称之为琥珀酰亚胺基。在本发明的某些实施方式中，蛋白上的官能团将是硫醇基而化学反应活性基团将是含马来酰亚胺基的基团如γ-马来酰亚胺-丁酰胺(GMBA或MPA)。这种含马来酰亚胺的基团在本文中称之为马来酰亚胺基。
马来酰亚胺基在反应混合物pH为6.5-7.4时对肽上的巯基最具选择性。在pH为7.0时，马来酰亚胺基与巯基(例如，蛋白如血清白蛋白或IgG上的硫醇基)的反应速率比与胺基的反应速率快1000倍。因此，马来酰亚胺基团和巯基之间形成稳定的硫醚连接，其在生理条件下不会被裂解。
肽载体
本发明的所述化合物的特征在于本文中所述的任何多肽，例如，表1中所述的任何肽(如血管肽-1或血管肽-2)、或其片段或类似物。在某些实施方式中，这种多肽与本文中所述的多肽具有至少35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或甚至100％的同一性。这种多肽相对于本文中所述的一个序列可以具有一个或多个(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个)替换。以下将更为详细地描述其它修饰。
本发明的特征还在于这些多肽的片段(如功能性片段)。在某些实施方式中，这些片段能够有效转运或累积于特定细胞类型(如肝、眼、肺、肾或脾)中或有效转运穿过BBB。这些多肽的截短体可以是来自多肽的N-端、多肽的C-端或其组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个氨基酸。其它片段包括其中多肽的居间部分被缺失的序列。
另外的多肽可以通过使用本文中描述的一种分析或方法进行识别。例如，候选多肽可以通过传统的肽合成生产，与紫杉醇结合而向实验室动物给予。生物活性多肽结合物可以例如基于注射肿瘤细胞并用结合物治疗的动物相对于没有用结合物治疗(如用未结合试剂治疗)的对照的存活率的提高而识别。例如，生物活性多肽可以按照原位脑灌注分析基于其在实质中的位置而识别。
在其它组织中确定累积的分析也可以实施。标记的多肽结合物可向动物给予，并可测定不同器官中的累积。例如，结合于可检测标记(如近IR荧光光谱标记，如Cy5.5)的多肽容许体内活体观察。这种多肽可向动物给予，并可检测器官中多肽的存在，由此容许确定在所需器官中多肽累积的速率和量。在其他实施方式中，这种多肽可用放射活性同位素(如125I)标记。这种多肽随后给予动物。在一定时间之后，动物被处死并提取器官。随后采用本领域内任何已知方式测定每一器官中的放射同位素的量。通过比较特定器官中标记的候选多肽的量相对于标记的对照多肽的量，能够确定候选多肽进入和累积于特定组织中的能力。合适的阴性对照包括已知不能有效转运进入特定细胞类型的任何肽或多肽(例如，与不能穿过BBB的血管肽相关的肽，或任何其它肽)。
另外的序列描述于美国专利No.5,807,980(如本文中的SEQ ID NO：102)、5,780,265(如SEQ ID NO：103)、5,118,668(如SEQ ID NO：105)。编码抑肽酶(aprotinin)类似物的示例性核苷酸序列atgagaccag atttctgcctcgagccgccg tacactgggc cctgcaaagc tcgtatcatc cgttacttct acaatgcaaa ggcaggcctgtgtcagacct tcgtatacgg cggctgcaga gctaagcgta acaacttcaa atccgcggaa gactgcatgcgtacttgcgg tggtgcttag；SEQ ID NO：6；Genbank登录号X04666)。抑肽酶类似物的其它实例可以采用国际专利申请No.PCT/CA2004/000011中公开的合成抑肽酶序列(或其部分)通过实施蛋白BLAST(基因库：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)而发现。示例性抑肽酶类似物也可按照登录号CAA37967(GI：58005)和1405218C(GI：3604747)而找到。
修饰多肽
本发明中所用的肽载体和多肽治疗剂可以具有修饰的氨基酸序列。在某些实施方式中，这种修饰并不会显著损坏所需的生物活性(如穿过BBB的能力或GLP-1激动剂活性)。这种修饰可以降低(如至少5％、10％、20％、25％、35％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、或95％)，可以无效于，或可以提高(如至少5％、10％、25％、50％、100％、200％、500％、或1000％)原始多肽的生物活性。这种修饰肽载体或多肽治疗剂可以具有或可以优化多肽的特性，如体内稳定性、生物利用度、毒性、免疫活性、免疫特性(immunological identity)和结合性能。
修饰包括通过天然加工，例如翻译后加工，或通过本领域内已知的化学修饰技术的那些修饰。修饰可以发生于多肽中的任何位置，包括多肽骨架、氨基酸侧链和氨基-或羧基-端。相同类型的修饰在给定多肽中的几个位置处以相同或不同的程度存在，而多肽可以包含不只一种类型的修饰。多肽可以因为遍在蛋白化(泛素化，ubiquitination)而支化，且它们可以是环状的，支化或未支化。环状的、支化的以及支化环状的多肽可以源自翻译后的天然加工或可以通过合成获得。其它修饰包括聚乙二醇化、乙酰化、酰基化、乙酰氨基甲基(acetomidomethyl，Acm)基团的添加、ADP-核糖基化、烷基化、酰胺化、生物素化、甲氨酰化、羧乙基化、酯化、共价连接至核黄素(fiavin)、共价连接至血红素部分、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、药物的共价连接、标记(荧光或放射活性)的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键的形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸酯(焦谷氨酸盐，pyroglutamate)的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚的形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解处理、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化(selenoylation)、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸添加至蛋白，如精氨酰化和遍在蛋白化。
修饰的多肽也可包括多肽序列中的氨基酸***、缺失或替换，要么保守要么非保守(如D-氨基酸、脱氨基酸)(例如，其中这种变化基本上不会改变多肽的生物活性)。具体而言，将一个或多个半胱氨酸残基添加至本发明任何多肽的氨基端或羧基端，能够有利于这些多肽(例如通过二硫键)结合。例如，血管肽-1(SEQ ID NO：67)、血管肽-2(SEQ ID NO：97)或血管肽-7(SEQ ID NO：112)能够经过修饰而在氨基端包含单个半胱氨酸残基(分别是SEQ ID NO：71、113和115)或在羧基端包含单个半胱氨酸残基(分别是SEQ ID NO：72、114和116)。氨基酸替换可以是保守的(即，其中残基被同一简并类型(通用类型，general type)或类别中的另一个氨基酸替代)或非-保守的(即，其中残基被另一种类型的氨基酸替代)。另外，非-天然存在的氨基酸能够替换天然存在的氨基酸(即，非-天然存在的保守氨基酸替换或非-天然存在的非-保守氨基酸替换)。
合成的多肽可包括非DNA天然编码的氨基酸的替换(如非天然存在的或非天然氨基酸)。非天然存在的氨基酸的实例包括D-氨基酸、具有连接至半胱氨酸的硫原子的乙酰基氨基甲基的氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、其中n为2-6的式NH2(CH2)nCOOH的ω氨基酸、中性非极性氨基酸如肌氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸和正亮氨酸。苯基甘氨酸可以替换Trp、Tyr、或Phe；瓜氨酸和蛋氨酸亚砜是中性非极性的，半胱氨酸是酸性的，而鸟氨酸是碱性的。脯氨酸可以用羟基脯氨酸替换而保持赋予其性质的构象。
类似物可以通过替换突变(替换诱变，substitutional mutagenesis)产生并保持原始多肽的生物活性。被识别为“保守替换”的替换实例如表2中所示。如果这种替换导致非所需的变化，则引入其它类型的替换(在表3中命名为“示例性替换”，或正如本文中参照氨基酸分类所进一步描述的)，并筛选产物。
功能或免疫学特性(identity)的实质性修饰通过选择替换而实现，这些替换在其对维持(a)在替换区域的多肽骨架的结构、如作为片状或螺旋构象，(b)靶位点的分子电荷或疏水性，或(c)侧链的体积的效果方面显著不同。天然存在残基基于常见的侧链性质而进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、蛋氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)；
(2)中性亲水性：半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)；
(3)酸性/带负电：天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)；
(4)碱性：天门冬酰胺酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)；
(5)影响链取向的残基：甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)；
(6)芳族：色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)；
(7)极性：Ser、Thr、Asn、Gln
(8)碱性带正电：Arg、Lys、His；和
(9)带电：Asp、Glu、Arg、Lys、His。
其它氨基酸替换列于表3中。
表2：氨基酸替换
  原始残基   示例性替换   保守替换
  Ala(A)   Val，Leu，Ile   Val
  Arg(R)   Lys，Gln，Asn   Lys
  Asn(N)   Gln，His，Lys，Arg   Gln
  Asp(D)   Glu   Glu
  Cys(C)   Ser   Ser
  Gln(Q)   Asn   Asn
  Glu(E)   Asp   Asp
  Gly(G)   Pro   Pro
  His(H)   Asn，Gln，Lys，Arg   Arg
  Ile(I)   Leu，Val，Met，Ala，Phe，正亮氨酸   Leu
  Leu(L)   正亮氨酸，Ile，Val，Met，Ala，Phe   Ile
  Lys(K)   Arg，Gln，Asn   Arg
  Met(M)   Leu，Phe，Ile   Leu
  Phe(F)   Leu，Val，Ile，Ala   Leu
  Pro(P)   Gly   Gly
  Ser(S)   Thr   Thr
  Thr(T)   Ser   Ser
  Trp(W)   Tyr   Tyr
  Tyr(Y)   Trp，Phe，Thr，Ser   Phe
  Val(V)   Ile，Leu，Met，Phe，Ala，正亮氨酸   Leu
多肽衍生物和肽模拟物
除了由天然存在的氨基酸构成的多肽之外，肽模拟物或多肽类似物也被本发明涵盖并能够构成本发明化合物中所用的肽载体或多肽治疗剂。多肽类似物通常用于制药工业，作为具有类似于那些模板多肽的性质的非肽药物。非肽化合物称之为“模拟肽”或肽模拟物(Fauchere et al.，Infect.Immun.54：283-287，1986和Evans et al.，J.Med.Chem.30：1229-1239，1987)。结构上与治疗用肽或多肽相关的模拟肽可以用于产生相当的或增强的治疗或预防效果。一般而言，肽模拟物结构上类似于范例多肽(即，具有生物或药物活性的多肽)如天然存在的受体结合多肽，但是具有一个或多个通过本领域内众所周知的方法可选地被连接基(linkages)如-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-CH2SO-、-CH(OH)CH2-、-COCH2-等取代的肽连接基(Spatola，Peptide BackboneModifications，Vega Data，1：267，1983；Spatola et al.，Life Sci.38：1243-1249，1986；Hudson et al.，Int.J.Pept.Res.14：177-185，1979；和Weinstein，1983，Chemistry and Biochemistry，of Amino Acids，Peptides and Proteins，Weinstein eds，Marcel Dekker，New York)。这种模拟多肽可具有优于天然存在多肽的显著优点，包括生产更经济、化学稳定性更高、药物学性质增强(如半衰期、吸收、效力、功效)、抗原性降低等。
尽管本文中所描述的肽载体可以有效地穿过BBB或靶向特定细胞类型(如本文中描述的那些)，但由于存在蛋白酶可使其效率降低。同样，本发明中所用的多肽治疗剂的效率可类似地降低。血清蛋白酶具有特异性底物要求，包括用于裂解的L-氨基酸和肽键。而且，外肽酶(代表血清中蛋白酶活性的最突出组分)，通常作用于多肽的第一个肽键上并需要游离的N-端(Powell et al.，Pharm.Res.10：1268-1273，1993)。鉴于此，常常有利的是采用修饰形式的多肽。修饰多肽保持原始L氨基酸多肽的结构特性，但有利的是其不易于被蛋白酶和/或外肽酶裂解。
用相同类型的D-氨基酸(如对映体；D-赖氨酸替代L-赖氨酸)对一致性序列(共有序列，consensus sequence)中的一个或多个氨基酸的***性替换，可以用于产生更稳定的多肽。因此，如本文中描述的多肽衍生物或肽模拟物可以都是L-多肽、都是D-多肽或混合的D、L-多肽。N-端或C-端的D-氨基酸的存在，提高了多肽的体内稳定性，因为肽酶不能利用D-氨基酸作为底物(Powell et al.，Pharm.Res.10：1268-1273，1993)。反(逆，reverse)-D多肽是含D-氨基酸的多肽，相对于含L-氨基酸的多肽排列为反序列(reverse sequence)中。因此，L-氨基酸多肽的C-端残基变成了D-氨基酸多肽的N-端，等等。反-D-多肽保留了相同的三级构象而因此保持了作为L-氨基酸多肽的相同活性，但是对于体外和体内酶降解则更稳定，而由此比原始多肽具有更高的疗效(Brady and Dodson，Nature368：692-693，1994and Jameson et al.，Nature 368：744-746，1994)。除了反-D-多肽之外，包含一致性序列或基本同一的一致性序列变体的限制性多肽(受限多肽constrained polypeptides)，可以通过本领域内众所周知的方法产生(Rizo et al.，Ann.Rev.Biochem.61：387-418，1992)。例如，限制性多肽可以通过加入能够形成二硫桥的半胱氨酸残基而由此形成环状多肽而产生。环状多肽不具有游离的N-或C-端。因此，它们并不易于通过外肽酶发生蛋白水解，但是它们当然易受内肽酶作用，这种酶不会在多肽末端上进行裂解。具有N-端或C-端D-氨基酸的多肽和环状多肽的氨基酸序列，除了分别存在N-端或C-端D-氨基酸残基、或其环状结构外，通常同一于它们所对应的多肽的序列。
含有分子内二硫键的环状衍生物可以通过传统的固相合成法制备，同时在选择用于环化的位置如氨基和羧基端引入合适的S-保护半胱氨酸或高半胱氨酸残基(Sah et al.，J.Pharm.Pharmacol.48：197，1996)。在完成链组装之后，环化能够通过以下方式进行：(1)通过对相应的两个游离SH-官能的后续载体上氧化(on-support oxidation)选择性地除去S-保护基团，而形成S-S键，接着从载体上常规地去除产物并进行合适的纯化步骤，或(2)随着侧链完全脱保护而从载体上去除多肽，接着在高度稀释的水溶液中对游离的SH-官能进行氧化。
含有分子内酰胺键的环状衍生物可以通过传统的固相合成法制备，同时在选择用于环化的位置引入合适的氨基和羧基侧链保护的氨基酸衍生物。含分子内-S-烷基键的环状衍生物可通过传统的固相化学法制备，同时在选择用于环化的位置引入具有合适的氨基-保护侧链的氨基酸残基、和合适的S-保护的半胱氨酸或高半胱氨酸残基。
另一种赋予对肽酶(其作用于多肽的N-端或C-端残基)的抗性的有效方法是在多肽末端上添加化学基团，使得修饰的多肽不再是肽酶的底物。一种这样的化学修饰是在任意一端或两端对多肽进行糖基化。某些化学修饰，特别是N-端糖基化，已经证实提高了多肽在人血清中的稳定性(Powell et al.，Pharm.Res.10：1268-1273，1993)。其它增强血清稳定性的化学修饰包括但不限于，添加N-端烷基(其由1～20个碳的低级烷基构成，如乙酰基)，和/或添加C-端酰胺或取代的酰胺基团。具体而言，本发明包括包括由具有N端乙酰基和/或C-端酰胺基的多肽构成的修饰多肽。
本发明也包括其它类型的多肽衍生物，其包含通常不作为多肽部分的其它化学部分，条件是衍生物要保持这种多肽的所需功能活性。这种衍生物的实例包括(1)氨基端或另一游离氨基的N-酰基衍生物，其中酰基可以是烷酰基(如乙酰基、己酰基、辛酰基)和芳酰基(如苯甲酰基)或封端基团如F-moc(芴甲基-O-CO-)；(2)羧基端或另一游离羧基或羟基的酯；(3)通过与氨或与合适的胺反应而产生的羧基端或另一游离羧基的酰胺；(4)磷酸化衍生物。
由向本文中所描述的多肽添加其它氨基酸残基而获得的较长多肽序列也涵盖于本发明中。这种较长的多肽序列能够预期具有与以上所述多肽相同的生物活性和特异性(专化性，specificity)(如细胞趋性，cell tropism)。尽管具有大量其它氨基酸的多肽并不排除在外，但应该认识到，一些大的多肽可能呈现出遮蔽有效序列的构象，由此妨碍与靶结合(例如，OB受体家族的成员)。这些衍生物可用作竞争性拮抗剂。因此，尽管本发明涵盖了本文中所述具有延伸(范围)的多肽或多肽衍生物，然而期望的是该延伸(范围)不破坏多肽或其衍生物的细胞靶向活性。
其它包含于本发明中的衍生物是直接或通过间隔子(如通过丙氨酸残基的短链段或通过蛋白水解(如通过组织蛋白酶，参见美国专利No.5,126,249和欧洲专利No.495049)的推定位置)彼此共价连接的如本文中所述的两个相同的或两个不同的多肽构成的双多肽(双重多肽，dualpolypeptides)。本文中描述的多肽的多聚体由相同或不同的多肽或其衍生物形成的分子聚合物构成。
本发明也涵盖多肽衍生物，该多肽衍生物是嵌合或融合蛋白，包含本文中所述的多肽、或其片段，在其氨基或羧基末端或两端连接至不同蛋白质的氨基酸序列。这种嵌合或融合蛋白可以通过重组表达编码蛋白的核酸而进行生产。例如，嵌合或融合蛋白可以包含与一个所述多肽共享的至少6个氨基酸，其理想地产生具有相当或更高功能活性的嵌合或融合蛋白。
鉴定肽模拟物的分析
如上所述，用来复制本文所述多肽的骨架几何和药效团表现(pharmacophore display)的非肽化合物(肽模拟物)，经常具有更大的代谢稳定性、更高的效力、更长的作用持久性和更好的生物利用度。
肽模拟物化合物能够采用本领域内已知的组合文库方法中的多种途径中的任何一种获得，包括生物文库、空间可寻址并行固相或液相文库、需要去卷积的合成文库法、“一珠一化合物”文库法和采用亲和色谱选择的合成文库法。生物学文库法局限于肽文库，而其它四种方法则适用于肽、非肽低聚物、或小分子化合物文库(Lam，Anticancer Drug Des.12：145，1997)。合成分子文库的方法实例能够在本领域内找到，例如：De Witt etal.{Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909，1993)；Erb et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422，1994)；Zuckermann et al.(J.Med.Chem.37：2678，1994)；Cho et al.(Science 261：1303，1993)；Carell et al.(Angew.Chem，Iht.Ed.Engl.33：2059，1994 and ibid 2061)；以及Gallop et al.(Med.Chem.37：1233，1994)。化合物文库可以呈现(呈递)在溶液中(如Houghten，Biotechniques 13：412-421，1992)或呈现在珠上(Lam，Nature 354：82-84，1991)、碎片(chips)上(Fodor，Nature 364：555-556，1993)、细菌或孢子上(美国专利No.5,223,409)、质粒上(Cull et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-1869，1992)或噬菌体上(Scott and Smith，Science249：386-390，1990)、或荧光素酶以及通过测定合适底物转化成产物而检测的酶标记上。
一旦本文中所述的多肽被识别，就能够分离并通过任何多种标准方法进行纯化，包括但不限于，差异溶解度(如沉淀法)、离心法、色谱法(如亲合性、离子交换和体积排阻)、或通过任何用于纯化肽、肽模拟物或蛋白的其它标准技术。所识别的感兴趣多肽的功能性质可以采用任何本领域内已知的功能性分析法进行评价。理想地，采用评价胞内信号传递的下游受体功能的分析法(如细胞增殖)。
例如，本发明的肽模拟物化合物可以采用以下三阶段方法获得：(1)扫描本文中所述多肽以识别靶向本文中所述特定细胞类型所必需的二级结构的区域；(2)采用构象上受限制的二肽替代物来精修骨架几何结构并提供对应于这些替代物的有机平台；和(3)采用最佳有机平台来表现设计用于模拟所需天然多肽活性的候选物文库中的有机药效团。更详细地，三阶段法如下所述。在阶段1中，扫描主要的候选多肽并消减其结构以识别其活性必要的条件。合成一系列原始多肽的多肽类似物。在阶段2中，采用构象上受限制的二肽替代物来探究最佳多肽类似物。吲哚里西啶-2-酮(indolizidin-2-one)、吲哚里西啶-9-酮和喹啉里西啶酮(quinolizidinone)氨基酸(分别为I2aa、I9aa和Qaa)用作研究最佳肽候选物的骨架几何结构的平台。这些和相关的平台(综述于文献Halab et al，Biopolymers 55：101-122，2000和Hanessian et al.，Tetrahedron 53：12789-12854，1997中)可以在多肽的特定区域引入而在不同方向上定向药效团。这些类似物的生物学评价识别出模拟活性所必需的几何条件的改善的前导多肽(lead polypeptides)。在阶段3中，最具活性的前导多肽的平台用于表现产生天然肽活性的药效团的有机替代物。药效团和支架结合为并行合成形式。多肽的衍生化和上述阶段可通过采用本领域内已知方法的其它方式完成。
由文中所述的多肽、多肽衍生物、肽模拟物或其它小分子确定的结构功能关系可用于精修和制备具有类似或更好性能的类似分子结构。因此，本发明的化合物也包括共享本文中所述多肽的结构、极性、电荷特性和侧链性质的分子。
总之，基于本文的公开内容，本领域的技术人员能够开发出适用于识别将药剂靶向特定细胞类型(如本文中描述的那些)的化合物的肽和肽模拟物筛选分析法。本发明的分析法可以开发用于低通量、高通量或超高通量筛选形式。本发明的分析法包括适用于自动化的分析法。
连接子
多肽治疗剂(例如，瘦素)可以直接结合至载体肽(例如，通过共价键，如肽键)或可以通过连接子结合。这种连接子包括化学连接剂(如可裂解的连接子)和肽。
在一些实施方式中，连接子是化学连接剂。多肽治疗剂和载体肽可以通过巯基、氨基(胺)和/或碳水化合物或任何合适的反应性基团结合。同双官能性(homobifunctional)和杂双官能***联连接子(结合剂)可从多种商业来源获得。可用于交联的区域可在本发明的多肽上找到。交联连接子可以包含柔性臂(flexible arm)，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个碳原子。示例性的交联连接子包括BS3([双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯]；BS3是靶向可接近的伯胺的同双官能N-羟基琥珀酰亚胺酯)、NHS/EDC(N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-′(二甲基氨基丙基)碳二亚胺；NHS/EDC容许伯胺基团结合羧基)、磺基-EMCS([N-e-马来酰亚胺基己酸]酰肼；磺基-EMCS是对巯基和氨基具有反应性的杂双官能反应基(马来酰亚胺和NHS-酯))、酰肼(大多数蛋白包含暴露的碳水化合物而酰肼是适用于将羧基连接至伯胺的有用试剂)和SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯；SATA对胺具有反应性并加入保护的巯基)。
为了形成共价键，可采用各种活性羧基(例如酯)作为化学反应性基团，其中羟基部分在修饰肽所需的水平下为生理上可接受的。具体试剂包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基-磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、马来酰亚胺-苯甲酰基-琥珀酰亚胺(MBS)、γ-马来酰亚胺基-丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、马来酰亚胺基丙酸(MPA)、马来酰亚胺基己酸(MHA)和马来酰亚胺基十一酸(MUA)。
伯胺是NHS酯的主要靶。存在于蛋白N-端的可接近的α-胺基和赖氨酸的ε-胺与NHS酯发生反应。酰胺键在NHS酯结合反应与释放N-羟基琥珀酰亚胺的伯胺反应时形成。这些含反应基的琥珀酰亚胺在本文中称之为琥珀酰亚胺基。在本发明的某些实施方式中，在蛋白上的官能团是硫醇团而化学反应性基团是含马来酰亚胺基的基团如γ-马来酰亚胺-丁酰胺(GMBA或MPA)。这种含马来酰亚胺基的基团在本文中称之为马来酰亚胺基。
马来酰亚胺基当反应混合物pH为6.5-7.4时对于肽上的巯基最具选择性。在pH为7.0时，马来酰亚胺基与巯基(例如，蛋白质如血清白蛋白或IgG上的硫醇)的反应速率比与胺反应快1000倍。因此，马来酰亚胺基和巯基之间的稳定硫醚连接能够形成。
在其他实施方式中，连接子包含至少一个氨基酸(如至少2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、40、或50个氨基酸的肽)。在某些实施方式中，连接子是单个氨基酸(例如，任何天然存在的氨基酸，如Cys)。在其他实施方式中，使用富含甘氨酸的肽，如具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n的肽，其中n为1、2、3、4、5或6，其描述于美国专利No.7,271,149中。在其他实施方式中，使用富含丝氨酸的肽连接子，其描述于美国专利No.5,525,491中。富含丝氨酸的肽连接子包括式[X-X-X-X-Gly]y的那些，其中多达2个x是Thr，而其余X是Ser，且y为1～5(例如，Ser-Ser-Ser-Ser-Gly，其中y大于1)。在一些情况下，连接子是单个氨基酸(如任何氨基酸，如Gly或Cys)。
合适连接子的实例有琥珀酸、Lys、Glu和Asp，或二肽如Gly-Lys。当连接子是琥珀酸时，其一个羧基可以与氨基酸残基的氨基形成酰胺键，而其另一羧基可以例如与肽或取代基的氨基形成酰胺键。当这种连接子是Lys、Glu或Asp时，其羧基可以与氨基酸残基的氨基形成酰胺键，其氨基可以例如与取代基的羧基形成酰胺键。当Lys用作连接子时，另一连接子可以***Lys的ε-氨基和取代基之间。在一个具体实施方式中，另一连接子是琥珀酸，例如其与Lys的ε-氨基和取代基中存在的氨基形成酰胺键。在一个实施方式中，另一连接子是Glu或Asp(例如其与Lys的ε-氨基形成酰胺键并与取代基中存在的羧基形成另一酰胺键)，即，这种取代基是Nε-酰基化赖氨酸残基。
代谢紊乱治疗
在某些实施方式中，本发明的结合物用于治疗代谢紊乱。这类紊乱包括糖尿病(I型或II型)、肥胖症、高血糖症、血脂异常症、高甘油三酯血症、X综合症、胰岛素抗性、IGT、糖尿病性血脂异常症、高血脂症、心血管疾病和高血压。瘦素减少食物摄取而由此能够用于降低体重并治疗其中减少食物摄取或体重降低有益的疾病。
神经疾病治疗
因为本文中描述的多肽能够将药剂转运穿过BBB，本发明的化合物也适用于治疗神经疾病如神经变性疾病或其它中枢神经***(CNS)、外周神经***或自主神经***(例如，其中神经元丧失或退化)的病症。多种神经变性疾病的特征为运动失调(即，肌肉运动不协调)和/或记忆丧失。神经变性疾病包括亚历山大病(Alexander disease)、阿尔珀病(Alperdisease)、阿茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS；即，卢伽里格病(LouGehrig’s disease))、共济失调毛细血管扩张、巴廷疾病(Batten disease)(施-伏-斯-巴廷病(Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten disease))、牛海绵状脑病(BSE)、海绵状脑白质营养不良(Canavan disease)、科凯恩综合征(Cockayne syndrome)、皮质基底节变性(corticobasal degeneraion)、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、亨廷顿氏病、HIV相关性痴呆、肯尼迪氏病(Kennedy’s disease)、克拉伯氏病(Krabbédisease)、路易体痴呆、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease)(脊髓小脑共济失调3型(spinocerebellar ataxia type 3))、多发性硬化、多***萎缩、嗜睡症、神经疏螺旋体病(neuroborreliosis)、帕金森氏病、佩-梅氏病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、匹克氏病(Pick’s disease)、原发性侧索硬化症、朊病毒病、雷福孙氏病(Refsum’s disease)、希尔德氏病(Schilder’s disease)(即，肾上腺脑白质失养症(adrenoleukodystrophy))、精神***症、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩、斯蒂尔-理查德森病(Steele-Richardson)、奥尔谢夫斯基病(Olszewski disease)和脊髓痨。
其他适应症
本发明的结合物也可用于治疗在其它器官或组织中发现的疾病。例如，血管肽-7(SEQ ID NO：112)有效地被转运进入肝、肺、肾、脾和肌肉细胞，容许与这些组织相关的疾病的优先治疗(例如，肝细胞癌和肺癌)。本发明的化合物也可以用于治疗遗传性紊乱，如唐氏综合症(即，三体21)，其中特定基因转录的下调可能是有利的。
给予和剂量
本发明的特征还在于含有治疗有效量的本发明化合物的药物组合物。这种组合物能够配制用于各种药物递送***。一种或多种生理可接受的赋形剂或载体也可包含在用于合适剂型的组合物中。用于本发明中的合适剂型可见于Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，PA，17th ed.，1985。对于药物递送方法的简单综述，参见，例如，Langer(Science 249：1527-1533，1990)。
药物组合物旨在用于非肠道、鼻内、外用(topical)、口服或局部(local)给予，如通过透皮途径，用于预防和/或治疗性治疗。这种药物组合物可通过非肠道(例如，经过静脉内、肌肉内或皮下注射)或通过口服消化或通过在受到血管或癌症影响的区域局部涂用或关节内注射而给予。其它给予途径包括脉管内、动脉内、瘤内、腹膜内、腔室内、硬膜内、以及鼻、眼、巩膜内、眼窝内、直肠、外用或雾化吸入给予。缓释给予也特别地包含在本发明中，例如借助于储药池注射(depot injections)或易蚀移植物或组分。因此本发明提供用于非肠道给予的组合物，其包含上述溶解于或悬浮于可接受载体，优选水性载体，如水、缓冲水、盐水、PBS等中的药剂。组合物可以包含近似生理条件所需的药用辅助物质，如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、洗涤剂等。本发明也提供了用于口服递送的组合物，其可以包含用于配制片剂、胶囊等的惰性成分，如粘合剂或填料。而且，本发明提供了用于局部给予的组合物，其可以包含用于配制霜剂、油膏等的惰性成分，如溶剂或乳化剂。
这些组合物可以通过传统的灭菌技术灭菌，或可以进行无菌过滤。所得的水性溶液可以就此包装待用，或冻干，冻干的制剂与无菌水性载体在给予之前合并。制剂的pH值典型地为3～11，更优选5～9或6～8，而最优选7～8，如7～7.5。固体形式的所得组合物可以包装于多个单剂量单元中，每个包含固定量的上述一种药剂或多种药剂，如包装在片剂或胶囊的密封包装中。固体形式的组合物也能以灵活的量包装于容器中，如包装于设计用于外用霜剂或油膏的挤压管中。
含有有效量的组合物可以给予用于预防性或治疗性治疗。在预防应用中，可向临床上确定对于代谢紊乱或神经学疾病具有倾向性或易感性提高的主体给予组合物。本发明的组合物可按照足以延缓、降低或优选防止临床疾病发作的量向患者(如人)给予。在治疗应用中，向已经患有疾病(诸如本文所述那些的代谢紊乱，或神经疾病)的主体(如人)以足以治愈或至少部分抑制病症症状及其综合症的量给予组合物。足以实现这个目的的量定义为“治疗有效量”，即，足以基本上改善一些与疾病或医学病症相关的症状的化合物的量。例如，在代谢紊乱(本文中描述的那些)的治疗中，降低、预防、延缓、抑制或遏制这种疾病或病症的任何症状的药剂或化合物是治疗上有效的。治疗有效量的药剂或化合物并不需要治愈疾病或病症，但是将会提供对疾病或病症的治疗使得这种疾病或病症的发作得以延缓、阻滞或防止，或使这种疾病或病症的症状被改善，或使这种疾病或病症的期限被改变或者例如在个体中变得不太严重或恢复加速。
瘦素可以以0.001-3mg/kg的剂量给予(例如，0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、或3mg/kg)。本发明的化合物可以按照瘦素指定的相当剂量给予，可以按照较高的相当剂量(如10％、25％、50％、100％、200％、500％、1000％更高剂量)给予，或能够按照较低的相当剂量(如90％、75％、50％、40％、30％、20％、15％、12％、10％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、或0.1％的相当剂量)给予。这种用途的有效量可取决于疾病或病症的严重程度和患者的体重和一般状态。初始给予和增强给予的合适方案典型地为初始给予然后是以一或多小时、天、星期或月间隔后续给予重复剂量。本发明组合物中存在的药剂的总有效量可以单剂量，作为丸剂或通过在相对较短的时期内输注而给予哺乳动物，或可采用分级治疗方案(fractional treatment protocol)进行给予，其中多剂量在更加延长的时期内(如每4-6、8-12、14-16或18-24小时一次，或每2-4天、1-2星期一次，每月一次的剂量)给予。可替换地，足以维持血液中治疗有效浓度的连续静脉输注被考虑在内。
在本发明组合物中存在的和在用于哺乳动物(如人)的本发明方法中使用的一种或多种药剂的治疗有效量可通过普通的技术人员考虑主体的年龄、体重和病症的个体差异而确定。由于本发明的某些化合物表现出增强的穿过BBB的能力，因而本发明的化合物的量可低于(如低于或等于约90％、75％、50％、40％、30％、20％、15％、12％、10％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、或0.1％)未结合瘦素、瘦素类似物或OB受体激动剂治疗效果所需的相当剂量。本发明的药剂以有效量向主体(如哺乳动物，如人)给予，有效量是在受治疗主体中产生所需疗效(如血糖降低、增重减小、减重增加和食物摄取减少)的量。治疗有效量也可由本领域的技术人员经验性确定。
患者也可接受范围在相比于瘦素的每剂量为约80μg至240mg相当剂量，1次或多次/星期(如2、3、4、5、6、或7或更多次/星期)、1mg至24mg相当剂量/天。
单次或多次给予包含有效量的本发明组合物可通过治疗医师所选的剂量水平和方式实施。剂量和给予方案可基于患者疾病或病症的严重程度进行确定和调节，这可以根据临床医师常用的或本文中所描述的方法在整个疗程中进行监控。
本发明的化合物可以结合传统治疗方法或疗法使用或独立于传统治疗方法或疗法使用。
当本发明的化合物结合采用其它药剂的疗法给予时，它们可以按序或同时向个体给予。可替换地，根据本发明的药物组合物可由本发明化合物连同本文中描述的药用赋形剂、本领域内已知的另一种治疗或预防药剂的组合构成。
实施例1
瘦素结合物的合成
以下步骤用于产生瘦素-(C11)-AN2结合物。
Figure BDA0000075330340000281
将MUA-AN2(264.6mg，91.5μmol，1.2当量，82％肽含量)溶解于H2O/ACN(9/1)(14mL)中，通过加入0.1N NaOH溶液(1.5mL)将pH从3.9调节至5.00。将该溶液加入到瘦素116-130-NH2(156.5mg，76.2μmol，1当量，76％肽含量)在PBS 4X(pH 6.61，7mL)中的溶液中。采用以下描述的分析方法监控反应。结果如图1A和1B所示(色谱图1和2)。
随着反应进行完全而观察到浑浊的悬浮液。在室温下1h之后，反应(3.62mM)完成并将混合物立即通过FPLC色谱(AKTAexplorer，参见色谱3，表1)进行纯化。纯化在GE Healthcare AKTA explorer柱(GEHealthcare)30RPC树脂(聚苯乙烯/二乙烯基苯)上进行，95mL，样品载入：450mg在反应缓冲液(21mL)中，10％ACN在H2O中，0.05％TFA(60mL)，DMSO.HCl(pH 2.87，6mL)，溶液A：H2O，0.05％TFA，溶液B：ACN，0.05％TFA，流速：5-17mL/min，梯度：10-30％B。
纯化结果如图2所示(色谱3)。用于纯化化合物的梯度如下表中所示。
Figure BDA0000075330340000291
在蒸发乙腈和冻干之后，获得白色固体(250mg，79％，纯度＞98％)。通过ESI-TOFMS(Bruker Daltonics)检测质量。为了避免一些剩余瘦素(116-130)-NH2会发生二聚(≤5％，半胱氨酸肽Mw＝3119.44)的可能性，立即实施纯化并使用1.2当量过量的马来酰亚胺基-(C11)-AN2。
为了监控反应，采用以下分析方法。使用具有Waters Acquity UPLCBEH苯基柱(1.7μm，2.1×50mm)的WatersAcquity UPLC***。在229nm下进行检测。溶液A为H2O、0.1％FA，而溶液B为乙腈(ACN)、0.1％甲酸(FA)。下表中示出流速和梯度。
  时间(min)   流速(ml/min)   ％A   ％B   曲线(Curve)
  0.5   90   10
  0.4   0.5   90   10   6
  0.7   0.5   70   30   6
  2.2   0.5   30   70   6
  2.4   0.5   10   90   6
  2.7   0.5   10   90   6
  2.8   0.5   90   10   6
  2.81   0.5   90   10   6
由质谱(ESI-TOF-MS；Bruker Daltonics)(得到)：计算值4125.53；实验值4125.06，m/z 1376.01(+3)，1032.26(+4)，826.02(+5)，688.52(+6)。
这种结合物在氮气气氛下储存于低于-20℃的暗室中。
采用这种步骤生产的瘦素结合物由于其11个碳连接子而称之为瘦素-AN2(C11)。其它长度的碳连接子结合物，包括瘦素-AN2(C3)和瘦素AN2(C6)，也采用类似步骤生产。
实施例2
原位脑灌注瘦素116-130血管肽-2结合物
为了确定哪些瘦素结合物最有效地穿过血脑屏障，我们在原位脑灌注分析中测试了每一种结合物。该分析方法或类似分析法描述于，例如美国专利公开No.20060189515中，其是基于Dagenais et al.，2000，J.Cereb.Blood Flow Metab.20(2)：381-386中描述的方法。BBB转运常数按照之前Smith(1996，Pharm.Biotechnol.8：285-307)的描述而确定。由这些实验可知，瘦素-AN2(C11)相比于具有C3或C6连接子的结合物表现出最高程度的转运穿过BBB而由此选择其用于进一步的实验(图3)。
采用原位灌输分析法在瘦小鼠和饮食诱导肥胖(DIO)小鼠(例如，可获自Jackson实验室)中比较瘦素的转运和瘦素-AN2(C11)结合物的转运。由这些结果可知，在DIO小鼠中瘦素转运穿过BBB相比于瘦小鼠而降低。相比之下，在瘦小鼠和DIO小鼠中，瘦素-AN2(C11)结合物显著更加有效地穿过大脑，而在结合物转运方面在瘦小鼠和DIO小鼠之间没有观察到统计学显著性差异(图4A)。在3个星期高脂肪(60％)饮食之后观察到血浆瘦素水平提高，表明该小鼠为瘦素抗性(图4B)。
实施例3
瘦素结合物对食物摄取和体重增加的影响
对小鼠通过静脉推注而注射瘦素-AN2(C11)(1mg瘦素116-130当量/小鼠)、瘦素116-130(1mg/小鼠)或对照(盐水)(n＝5/组)。在4h(图5A)和15h(图5B)监控该小鼠的食物摄取。在两种情况下，相比于对照小鼠或接受瘦素116-130的小鼠，结合物表现出显著更大的食物摄取减少。
我们也对比了接受结合物(2.5mg/小鼠；1mg瘦素116-130mg当量/小鼠)、瘦素116-130(1mg/小鼠)和对照的DIO小鼠在6天时间内的体重变化。每只小鼠每日接受腹膜内注射治疗。接受瘦素或对照的小鼠在6天内表现出类似的体重增加量，而接受结合物的小鼠相比于对照小鼠和接受瘦素116-130的小鼠则表现为体重增加显著降低(图6)。
我们进一步对比了接受结合物(2.5mg/小鼠；1mg瘦素116-130mg当量/小鼠)、瘦素116-130(1mg/小鼠)和对照的瘦素缺乏型ob/ob小鼠在6天时间内的体重变化。每只小鼠(n＝5/组)每日接受腹膜内注射治疗。接受结合物的小鼠相比于接受瘦素116-130的小鼠和对照小鼠(图7)在给予期间表现为较低的体重增加。
实施例4
重组血管肽-2和血管肽-2瘦素融合蛋白的开发
我们还开发出血管肽-2融合蛋白。作为初始步骤，创建cDNA(ACCTTT TTC TAT GGC GGC AGC CGT GGC AAA CGC AAC AAT TTC AAGACC GAG GAG TAT；SEQ ID NO：117)。将该序列***到用于细菌表达的pGEX载体***中，并检验***的序列(图8)。采用重叠延伸PCR策略形成GST-An2-瘦素116-130构建体(图9)。
在细菌表达***中使重组的血管肽-2表达并采用GSH-琼脂糖柱纯化。示出了由该步骤(获得)的色谱图(图10)。通过蛋白印迹法采用血管肽-2抗体(图11A)、通过液相色谱(图11B)、以及通过质谱(图11C)来分析纯化的血管肽-2。
采用重组血管肽-2进行原位脑灌注分析。将结果与合成的血管肽-2(图12)进行比较。采用这两种形式的血管肽-2观察到类似的摄取水平。在GST、GST-血管肽-2、GST-瘦素116-130和GST-血管肽-2-瘦素116-130之间，比较实质的摄入(图13)。这些结果表明含有血管肽-2序列的融合蛋白被有效地摄入到实质中，而缺乏血管肽-2序列的蛋白的摄取则显著更加低效。
含全长瘦素序列的His-标记的血管肽-2/小鼠瘦素融合蛋白已经产生(图14)。这种融合蛋白表达于细菌表达***中(图15)。对于融合蛋白的示例性纯化方案示于图17A和17B中。小规模纯化的结果如图18所示。
凝血酶裂解步骤导致两种产物的生成，表明血管肽-2序列包含低亲合性凝血酶裂解位点的可能性，如图19中所示。由于瘦素-血管肽-2具有溶液中凝聚的倾向，因此测试降低凝聚并提高收率的纯化条件。
实施例5
瘦素融合蛋白的脑摄取和活性
我们随后采用原位脑灌注分析检测了血管肽-2-瘦素融合蛋白相对于瘦素被摄入DIO小鼠脑实质中的能力(图20)。由该实验，我们观察到融合蛋白相比于瘦素表现出摄取增加。
作为对照，我们采用每日0.1mg/小鼠或0.25mg/小鼠测试了重组瘦素降低ob/ob小鼠体重的能力。如图21中所示，瘦素的确以剂量依赖性方式降低了这些小鼠的体重。
DIO小鼠也采用对照或采用50μg his-标记的融合蛋白、瘦素或his-标记的瘦素进行治疗。如所示，小鼠在第3天和第4天接受两种治疗。基于这些结果，在接受融合蛋白的小鼠中观察到最大体重损失(图22)。
其它实施方式
本说明书中提及的所有专利、专利申请和出版物(包括分别于2008年12月5日和2009年5月15日提交的美国临时专利申请No.61/200,947和61/178,837)结合于本文中作为参考，这等同于每一独立专利、专利申请或出版物具体地且分别地被指出结合于本文中作为参考。

Claims (27)

1.一种具有以下通式的化合物
A-X-B
其中，
A是肽载体，包含至少70％同一于选自由SEQ ID NO：1-105和107-114构成的组中的序列的氨基酸序列、或其片段；
X是连接子；以及
B是瘦素、瘦素类似物或OB受体激动剂。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，A是多肽，具有至少70％同一于选自由血管肽-1(SEQ ID NO：67)、血管肽-2(SEQ ID NO：97)、cys-血管肽-2(SEQ ID NO：113)和血管肽-2-cys(SEQ ID NO：114)构成的组中的序列的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中，所述序列同一性为至少90％。
4.根据权利要求3所述的化合物，其中，所述多肽包含选自由血管肽-1(SEQ ID NO：67)、血管肽-2(SEQ ID NO：97)、cys-血管肽-2(SEQ IDNO：113)和血管肽-2-cys(SEQ ID NO：114)构成的组中的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中，所述多肽由选自由血管肽-1(SEQ ID NO：67)、血管肽-2(SEQ ID NO：97)、cys-血管肽-2(SEQ IDNO：113)和血管肽-2-cys(SEQ ID NO：114)构成的组中的氨基酸序列构成。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中，A包括血管肽-1(SEQ IDNO：67)、血管肽-2(SEQ ID NO：97)、cys-血管肽-2(SEQ ID NO：113)或血管肽-2-cys(SEQ ID NO：114)。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中，B包括全长人瘦素、成熟人瘦素(图16中的所述全长人瘦素的氨基酸22-167)、或瘦素116-130。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的化合物，其中，X具有以下通式：
Figure FDA0000075330330000021
其中，n是2至15的整数；并且要么Y是A上的硫醇而Z是B上的伯胺，要么Y是B上的硫醇而Z是A上的伯胺。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中，n为3、6或11。
10.一种具有以下结构的化合物：
Figure FDA0000075330330000022
11.根据权利要求10所述的化合物，其中，所述瘦素或瘦素类似物是全长人瘦素、成熟人瘦素(所述全长人瘦素的氨基酸22-167)、或瘦素116-130。
12.根据权利要求1所述的化合物，其中，X是肽键。
13.根据权利要求1-9所述的化合物，其中，X是至少一个氨基酸；且A和B各自通过肽键共价结合至X。
14.一种核酸分子，编码根据权利要求12或13所述的化合物。
15.一种载体，包含根据权利要求14所述的核酸分子，其中，所述核酸可操作地连接至启动子。
16.一种制备根据权利要求12或13所述的化合物的方法，所述方法包括在细胞中表达由根据权利要求15所述的载体所编码的多肽，以及纯化所述多肽。
17.一种制备根据权利要求12或13所述的化合物的方法，所述方法包括在固相载体上合成所述化合物。
18.一种治疗患有代谢紊乱的主体的方法，所述方法包括以足以治疗所述紊乱的量给予根据权利要求1-13中任一项所述的化合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述足够的量为低于未结合于所述肽载体时所述瘦素、瘦素类似物或OB受体激动剂的相当剂量所需的量的50％。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述的量为低于15％。
21.根据权利要求18所述的方法，其中，所述代谢紊乱是糖尿病、肥胖症、肥胖症所致的糖尿病、高血糖症、血脂异常症、高甘油三酯血症、X综合症、胰岛素抗性、葡萄糖耐量降低(IGT)、糖尿病性血脂异常症、高血脂症、心血管疾病、或高血压。
22.根据权利要求18所述的方法，其中，所述紊乱是糖尿病。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述紊乱是II型糖尿病。
24.根据权利要求18所述的方法，其中，所述紊乱是肥胖症。
25.一种减少主体食物摄取或降低主体体重的方法，所述方法包括以足以减少食物摄取或降低体重的量向主体给予根据权利要求1-13中任一项所述的化合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述主体为体重超重或肥胖。
27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述主体为食欲过盛。
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