CN101918549B - 改良的人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了与供体小鼠抗-人α9整联蛋白抗体相比具有提高的活性和/或性质的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，即含有由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列组成的轻链可变区的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，含有由SEQID NO：13所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列组成的轻链可变区的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，含有由SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ IDNO：9所示的氨基酸序列组成的轻链可变区的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，和使用所述抗体预防或治疗在发病机理中涉及人α9整联蛋白的多种疾病的方法。

Description

改良的人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体
技术领域
本发明涉及改良的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体。更具体地，涉及改良的人源化的Y9A2抗体，其具有结合人α9整联蛋白从而抑制α9整联蛋白依赖性的细胞粘附的活性，和与小鼠抗-人α9整联蛋白抗体Y9A2相比提高的活性和/或性质。预期所述人源化抗体是用于诊断、预防或治疗自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎)、免疫性疾病(例如***反应和移植物排斥)和在它们的发病机理中涉及α9整联蛋白的其它各种疾病的药物。 
背景技术
整联蛋白(一种细胞表面糖蛋白)是一种主要起与胞外基质(胶原，层粘连蛋白等)和免疫球蛋白家族成员(ICAM-1，VCAM-1等)的细胞粘附的受体作用的粘附分子，并介导来自胞外基质的信号转导。由此，细胞接收来自胞外基质的信号，诱发分化、增殖、细胞死亡等。整联蛋白是由2个亚基α链和β链组成的异源二聚体；不同的α链和β链存在多种组合，存在24个整联蛋白超家族成员。无论缺少哪个亚基，整联蛋白敲除的小鼠是致命的或患病的，这暗示单个整联蛋白是维持生命所必需的。因此，认为整联蛋白(它将关于环境条件的信息传递给细胞，以刺激它们的响应)在生物学现象的所有情形中起作用，并介导广范围的病理状况。 
这样，整联蛋白是生物体存活所不可缺少的，且被认为甚至在患病状态中起作用；已经报道了一些病例，其中它们的抑制有助于改善病理状况。例如，已经批准血小板特异性的整联蛋白αIIbβ3的抑制剂作为PCTA再狭窄的治疗药物，称作阿昔单抗(商品名：ReoPro；Eli Lilly)。已经批准那他珠单抗(商品名：Antegren；ELAN公司)(一种α4β1(VLA4)抑制剂)作为多发性硬化的治疗药物。αvβ3抑制剂Vitaxin(MEDIMMUNE公司)正处于临床研究它的新血管形成抑制作用、破骨细胞激活抑制作用等的开发中。 
整联蛋白α9β1在巨噬细胞、NKT细胞、树突细胞和中性粒细胞中 表达，据报道在这些炎症细胞的浸润和粘附、骨吸收等中起重要作用。最近，已经报道，整联蛋白α9β1参与破骨细胞形成，且已经暗示它参与骨破坏(非专利文件1)。其已知的配体包括截短的骨桥蛋白(N-末端OPN)，VCAM-1，结合腕蛋白-C等。临床上，已经在类风湿性关节炎患者的滑液组织中观察到显著升高水平的整联蛋白α9β1(非专利文件2)。 
因此，如果开发出特异性地结合α9整联蛋白并起抑制α9整联蛋白依赖性的细胞粘附的作用的单克隆抗体，将可以用于诊断、预防或治疗在它们的发病机理中涉及α9整联蛋白的各种疾病。 
已经报道的表现出对人α9整联蛋白的功能抑制作用的抗体是小鼠单克隆抗体Y9A2(非专利文件3)，和1K11、24I11、21C5和25B6(专利文件1)和28S1(专利文件2)。体外实验结果已经证实，这些抗体能抑制人α9整联蛋白依赖性的细胞粘附。其中，由于Y9A2抑制对骨桥蛋白和结合腕蛋白-C的细胞粘附，认为它是最有前途的针对α9整联蛋白的抗体药物的候选物。 
但是，应当指出，Y9A2是通过用抗原免疫小鼠制备的小鼠衍生的抗体，因此，从安全性(抗原性的诱导)和有效性(缩短的半衰期)方面看，将其直接施用给人在实践中是不可行的。因此，需要进行改良，将所述抗体转化成具有人抗体的氨基酸序列的分子，同时维持Y9A2的活性，即人源化。 
目前，作为人源化抗体的一种生产方法，以Winter等人设计的包括嫁接互补性决定区(在下文中有时称作CDR)氨基酸的方法(非专利文件4)为基础的方法是最常见的。这里还众所周知，从作为CDR氨基酸供体的外来抗体不仅嫁接CDR还将参与CDR的结构维持或与抗原的结合的非-CDR氨基酸即框架区(在下文中有时称作FR)同时嫁接到作为CDR受体的人抗体，对于再现供体抗体的固有活性而言是重要的(非专利文件4和5)。 
但是，基于CDR嫁接的人源化抗体的生产包括几个问题。首先，最普遍的问题是，甚至适当选择再现供体抗体的活性所必需的FR氨基酸，也不能消除获得具有对抗原的亲和力和超过供体抗体的生物活性的人源化抗体的困难。 
近年来，大量嵌合抗体、人源化抗体和人抗体已经作为单克隆药物投放市场。它们中的任一种的有效剂量都非常高，是几mg/kg体重。因 此，抗体药物不可避免地是昂贵的，这又增加了患者的经济负担和医疗成本。决定抗体药物的有效剂量的主要因素包括抗体对抗原的亲和力和体内存在的抗原的量。从这些方面看，更具体地，提高抗体对抗原的亲和力，会导致剂量的减少，且是非常有用的改进，也导致患者的经济负担和医疗成本的减少。 
为了实现提高的抗体对抗原的亲和力，经常采用包括将氨基酸置换引入抗体的可变区中的方法。但是，当抗体和抗原不同时，CDR氨基酸的序列和立体结构以及参与抗原-抗体相互作用的氨基酸的位置也变化。因此，在实践中难以确定与CDR一起嫁接的FR氨基酸的位置适用于任意抗体。 
另一个问题是，尽管在基于CDR嫁接的人源化抗体的制备中通常将供体小鼠抗体的完整CDR氨基酸嫁接给模板人抗体，对于结合抗原而言至关重要的源自小鼠抗体的CDR氨基酸序列有时会显示出针对人的抗原性，经常造成抗-独特型抗体的产生。 
也就是说，就人源化抗体的生产而言，为了赋予比供体抗体更高的活性，同时避免在人中产生抗原性和降低的抗体稳定性，适当受体抗体的选择和要置换的CDR氨基酸和FR氨基酸的选择是必不可少的。这需要大量的创造力和试验和错误。 
专利文件1：WO 2006/075784 
专利文件2：WO 2008/007804 
非专利文件1：Journal of Bone and Mineral Research，2006，21：1657-1665 
非专利文件2：The Journal of Clinical Investigation，2005，115：1060-1067 
非专利文件3：Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，1996，15：664-672 
非专利文件4：Science，239，1534-1536(1988) 
非专利文件5：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，10029-10033(1989) 
发明内容
本发明解决的问题 
本发明的一个目的是，解决上述与人源化抗体有关的各个问题，并提供人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其具有与供体小鼠抗-人α9整联 蛋白抗体(Y9A2)相比提高的活性和/或性质。 
解决问题的方式 
因此，本发明包含下面(1)-(15)的发明，作为医学上或工业上有用的物质和方法。 
(1)人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其包含选自下述的重链可变区和轻链可变区： 
(a)由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列组成的轻链可变区， 
(b)由SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列组成的轻链可变区，和 
(c)由SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。 
(2)上面(1)中所述的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其中所述抗体的重链恒定区是人Igγ1。 
(3)上面(1)中所述的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其中所述抗体的轻链恒定区是人Igκ。 
(4)上面(1)中所述的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其中所述抗体的重链恒定区是人Igγ1，且所述抗体的轻链恒定区是人Igκ。 
(5)上面(1)中所述的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其中所述重链由SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列组成，且所述轻链由SEQ IDNO：25所示的氨基酸序列组成。 
(6)上面(1)中所述的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其中所述重链由SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列组成，且所述轻链由SEQ IDNO：25所示的氨基酸序列组成。 
(7)上面(1)中所述的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其中所述重链由SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列组成，且所述轻链由SEQ IDNO：27所示的氨基酸序列组成。 
(8)一种多核苷酸，其包含编码上面(1)中所述的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体的重链可变区的序列。 
(9)一种多核苷酸，其包含编码上面(1)中所述的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体的轻链可变区的序列。 
(10)一种表达载体，其包含在上面(8)中所述的多核苷酸和/或在上面(9)中所述的多核苷酸。 
(11)一种宿主细胞，其掺入在上面(10)中所述的表达载体。 
(12)一种生产人源化的抗-人α9整联蛋白抗体的方法，其包含下述步骤：培养在上面(11)中所述的宿主细胞，以表达人源化的抗-人α9整联蛋白抗体。 
(13)一种类风湿性关节炎的治疗药物，其包含在上面(1)-(7)任一项中所述的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体。 
(14)一种预防或治疗类风湿性关节炎的方法，其包含下述步骤：施用治疗有效量的在上面(1)-(7)任一项中所述的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体。 
(15)在上面(1)-(7)任一项中所述的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体用于生产药物的用途，所述药物用于预防或治疗类风湿性关节炎。 
发明效果 
根据本发明，提供了人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其具有与供体小鼠抗-人α9整联蛋白抗体相比提高的活性和/或性质。通过阻断人α9整联蛋白和其多种配体之间的相互作用，本发明的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体具有强抗炎作用和强骨破坏抑制作用，可以用于预防或治疗在发病机理中涉及人α9整联蛋白的多种疾病。此外，本发明的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体会提供临床应用的优良改善，例如剂量减少，给药间隔延长，给药方法(例如皮下注射)的改善等，极大促进治疗效果和患者顺应性的提高。 
附图简述 
图1显示了小鼠Y9A2抗体的VH区的氨基酸序列。 
图2显示了小鼠Y9A2抗体的VL区的氨基酸序列。 
图3显示了用于生产编码RY9A2VHv5的基因的寡DNA的组成，它是人源化的Y9A2抗体的VH的一个实例。 
图4显示了用于生产编码RY9A2VLv01的基因的寡DNA的组成，它是人源化的Y9A2抗体的VL的一个实例。 
图5显示了嵌合的Y9A2抗体和RY9A2v501抗体的细胞ELISA的结果。 
图6显示了嵌合的Y9A2抗体和RY9A2v801抗体的细胞ELISA的结果。 
实现本发明的最佳方式 
下面详细描述本发明。 
发明人已经证实了生产小鼠抗-人α9整联蛋白抗体Y9A2的人源化抗体的显著的创造力和考虑，并成功生产3类人源化的抗-人α9整联蛋白抗体(在下文中也称作人源化的Y9A2抗体或RY9A2)，其与Y9A2相比具有显著提高的活性和/或性质。 
更具体地，发明人首先将小鼠抗-人α9整联蛋白抗体Y9A2(在下文中也称作小鼠Y9A2抗体)的重链可变区(在下文中也称作VH)和轻链可变区(在下文中也称作VL)的CDR氨基酸序列和几个FR氨基酸嫁接进模板人抗体，以制备2类人源化的抗-人α9整联蛋白抗体RY9A2v501和RY9A2v801，它们各自具有与小鼠Y9A2抗体相当的活性。根据Kabat等人的分类(Sequences of Proteins of Immunological Interest 4th ed.，PublicHealth Service，NIH，Washington DC，1987)，确定CDR。RY9A2v501和RY9A2v801的VH的氨基酸序列分别是SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7。在这里，RY9A2v801的VH是RY9A2v501的VH，其中来自从小鼠Y9A2抗体衍生的FR氨基酸残基的4个氨基酸残基被置换为对应的模板人抗体氨基酸。2种人源化抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，为两种抗体所共有。 
接着，为了生产与起始小鼠Y9A2抗体相比具有对人α9整联蛋白更高的亲和力的人源化抗体，同时避免产生人源化抗体的抗原性和降低的抗体保藏稳定性的风险，发明人考虑置换上述两类人源化抗体的VH和VL的CDR中的氨基酸序列。结果，证实了下面3类人源化的抗-人α9整联蛋白抗体具有与起始小鼠Y9A2抗体相比显著提高的活性和/或性质。 
1)人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其包含由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。 
2)人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其包含由SEQ ID NO：13所示 的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。 
3)人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其包含由SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。 
在本文公开的其重链可变区和轻链可变区的序列信息的基础上，使用本领域普遍已知的方法，本领域技术人员可以容易地制备本发明的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体。具体地，制备具有编码本发明的人源化抗体的重链可变区氨基酸的碱基序列的重链可变区基因节段和具有编码本发明的人源化抗体的轻链可变区氨基酸的碱基序列的轻链可变区基因节段。然后，将可变区基因连接至适当类别的人抗体中的恒定区基因，以制备人源化抗体基因。接着，将该人源化抗体基因连接至适当表达载体，并引入培养的细胞。最后，培养该培养的细胞，由此可以从培养上清液得到人源化抗体。 
可以合成每一个上述的编码本发明的人源化抗体的重链和轻链可变区氨基酸的可变区基因节段，例如，基于重链和轻链可变区的碱基序列，或在重链和轻链可变区的氨基酸序列的基础上设计的碱基序列，和通过本领域已知的基因合成方法。本领域普通技术人员已知的多种方法，例如在WO90/07861等中所述的抗体基因合成方法，可以用作这样的基因合成方法。另外，一旦获得本发明的抗体的可变区基因节段，通过在基因节段的特定位点引入突变，也可以获得本发明的其它抗体。本领域技术人员显而易见的多种方法，例如定向诱变(Current Protocols inMolecular Biology edit.Ausubel等人(1987)Publish.John Wiley & SonsSection 8.1-8.5)，可以用作这样的突变引入方法。 
接着，连接上述的可变区基因节段和人抗体的恒定区基因，以制备人源化抗体基因。尽管可以选择任意的恒定区子类(例如γ1，γ2，γ和γ4作为重链，λ和κ链恒定区作为轻链)作为使用的人抗体的恒定区，优选地使用人Igγ1作为重链恒定区，使用人Igκ作为轻链恒定区。 
制备该人源化抗体基因以后，使用本领域普遍已知的多种方法，或参照在WO2007/139164或WO2003/027151中所述的制备人源化的抗-人骨桥蛋白抗体的方法，可以将人源化抗体基因引入表达载体、将表达载体引入培养的细胞、培养所述培养的细胞、纯化抗体等。 
可以使用在国际专利公开官方公报WO94/20632中所述的表达载体，例如AG-γ1和AG-κ，作为要连接至这样得到的人源化抗体基因上的表达载体，但是表达载体没有限制，只要它能表达人源化抗体基因即可。优选地使用已经具有人Ig恒定区基因例如AG-γ1或AG-κ的表达载体，因为只要简单地在其中***人源化抗体可变区基因，它就会变成具有人源化抗体基因的表达载体。在表达载体中，可以使用先导序列来促进抗体的胞外分泌和表达。可以使用从Y9A2衍生的先导序列或从其它抗体(例如在WO2007/139164中所述的人源化的抗-骨桥蛋白抗体)衍生的先导序列作为这样的先导序列。 
通过例如使用FreeStyle 293表达***(Invitrogen)、磷酸钙方法等，将上述的表达载体引入培养的细胞。 
可以使用培养的细胞，例如293细胞、CHO-DG44细胞，作为要引入表达载体的培养的细胞的实例，它们可以通过常规方法来培养。 
上述的培养以后，通过多种类型的柱色谱，例如，使用蛋白A柱的色谱，可以纯化在培养上清液中积累的抗体。 
可以使用ELISA、FACS等，作为测量得到的人源化抗体与人α9整联蛋白的结合活性的方法。当使用ELISA时，例如，将表达α9整联蛋白的细胞(例如SW480细胞)固定化在ELISA平板上，加入人源化抗体来造成反应，加入第二抗体例如用辣根过氧化物酶(HRP)等酶标记的人IgG抗体来造成反应。洗涤细胞，加入显色底物(例如TMB，当HRP标记时)，测量吸光度。 
作为评价得到的人源化抗体是否具有针对人α9整联蛋白的功能抑制活性的方法，可以通过人α9整联蛋白分子依赖性的对人骨桥蛋白分子的细胞粘附的抑制实验(在J.Biol.Chem.，274：36328-36334，1999中描述)来证实。也就是说，将作为α9配体之一的N-末端OPN(骨桥蛋白被凝血酶切割后的N末端片段；在下文中有时称作nOPN)的RAA变体(将RGD序列改变成RAA，以抑制与其它整联蛋白的反应；在下文中有时称作nOPN-RAA)固定化在平板上，进行封闭。加入不同的人源化抗体后，加入α9表达细胞，在37℃温育1小时。固定细胞，用结晶紫和甲醇染色，并洗涤。用Triton X-100提取粘附的细胞中的染料，在波长595nm测量吸光度。 
此外，可以提及以在Molecular Biology of the Cell，12：3214-3225， 2001中所述的细胞迁移抑制实验为基础的方法，作为详细评价得到的人源化抗体是否具有针对人α9整联蛋白的功能抑制活性的方法。也就是说，将nOPN-RAA固定化在转移孔(transwell)的上层，置于平板上，然后向下层加入含有10％FCS的F15培养基。将α9表达细胞和人源化抗体同时加入上层，在37℃温育16小时。此后，通过例如QCM趋化性细胞迁移24-孔测定试剂盒(Millipore)，定量迁移进转移孔下层的细胞。 
可以如下容易地获得本发明的3类人源化的抗-人α9整联蛋白抗体：使用本领域普遍已知的方法，合成编码SEQ ID NO：11、13或15所示的VH氨基酸序列的DNA和编码SEQ ID NO：17或9所示的VL氨基酸序列的DNA，将它们连接至适当类别的人抗体恒定区基因，就重链而言优选人Igγ1恒定区基因，就轻链而言优选人Igκ恒定区基因，以构建人源化抗体基因，使用本领域普遍已知的多种方法或在WO02/081522或WO03/027151等中所述的方法，将所述人源化抗体基因引入表达载体，将该表达载体引入培养的细胞，培养所述培养的细胞，并从得到的培养物纯化抗体。优选地，编码SEQ ID NO：11、13或15所示的VH氨基酸序列的DNA分别含有SEQ ID NO：12、14和16所示的碱基序列。优选地，编码SEQ ID NO：17和9所示的VL氨基酸序列的DNA分别含有SEQ ID NO：18和10所示的碱基序列。 
通过连接SEQ ID NO：11所示的重链可变区和人Igγ1恒定区得到的优选的本发明的人源化抗体重链，是由SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列组成的重链。通过连接SEQ ID NO：17所示的轻链可变区和人Igκ恒定区得到的优选的本发明的人源化抗体轻链，是由SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列组成的轻链。优选地，编码由SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列组成的人源化抗体重链的DNA含有SEQ ID NO：20所示的碱基序列。优选地，编码由SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列组成的人源化抗体轻链的DNA含有SEQ ID NO：26所示的碱基序列。可以提及在下面所述的实施例中所示的RY9A2v12(M34L)012抗体，作为本发明的人源化的抗-α9整联蛋白抗体，其含有由SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列组成的轻链。 
通过连接SEQ ID NO：13所示的重链可变区和人Igγ1恒定区得到的优选的本发明的人源化抗体重链，是由SEQ ID NO：21所示的氨基酸序 列组成的重链。通过连接SEQ ID NO：17所示的轻链可变区和人Igκ恒定区得到的优选的本发明的人源化抗体轻链，是由SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列组成的轻链。优选地，编码由SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列组成的人源化抗体重链的DNA含有SEQ ID NO：22所示的碱基序列。优选地，编码由SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列组成的人源化抗体轻链的DNA含有SEQ ID NO：26所示的碱基序列。可以提及在下面所述的实施例中所示的RY9A2v11(M34L)012抗体，作为本发明的人源化的抗-α9整联蛋白抗体，其含有由SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列组成的轻链。 
通过连接SEQ ID NO：15所示的重链可变区和人Igγ1恒定区得到的优选的本发明的人源化抗体重链，是由SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列组成的重链。通过连接SEQ ID NO：9所示的轻链可变区和人Igκ恒定区得到的优选的本发明的人源化抗体轻链，是由SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列组成的轻链。优选地，编码由SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列组成的人源化抗体重链的DNA含有SEQ ID NO：24所示的碱基序列。优选地，编码由SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列组成的人源化抗体轻链的DNA含有SEQ ID NO：28所示的碱基序列。可以提及在下面所述的实施例中所示的RY9A2v05(IAW)01抗体，作为本发明的人源化的抗-α9整联蛋白抗体，其含有由SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列组成的轻链。 
这样得到的本发明的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，在根据需要进一步纯化后，可以根据常规方法制备成药物制剂，并用于治疗自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎等)、免疫性疾病(例如***反应、移植排斥等)和其中在发病机理中涉及α9整联蛋白的疾病(例如骨质疏松症、慢性阻塞性肺病、癌症等)。 
本发明的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体可以优选地用作类风湿性关节炎的治疗剂。作为这些治疗剂的剂型的实例，可以制备肠胃外制剂，例如注射或滴注，优选通过静脉内给药、皮下给药等来施用。在制备药物制剂中，可以在药学可接受的范围内使用与这些剂型相匹配的载体和添加剂。 
在上述制剂制备中加入的本发明的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体的量，随患者症状严重性和年龄、使用的制剂的剂型或抗体的结合效价 等而变化；例如，可以使用约0.1mg/kg至100mg/kg。 
本发明也提供了编码本发明的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体或其重链和/或轻链可变区的多核苷酸，和含有它们的表达载体。本发明的表达载体没有限制，只要它能在原核细胞和/或真核细胞的不同宿主细胞中表达编码本发明的人源化抗体或其重链或轻链可变区的基因并生成这些多肽即可。例如，可以提及质粒载体、病毒载体(例如腺病毒，逆转录病毒)等。 
本发明的表达载体可以包含编码本发明的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体或其重链和/或轻链可变区的基因和与在功能上连接至该基因的启动子。作为用于在细菌中表达编码本发明的人源化抗体或其重链和/或轻链可变区的基因的启动子，当宿主是埃希氏杆菌属的细菌时，可以提及例如，Trp启动子，1ac启动子，recA启动子，λPL启动子，1pp启动子，tac启动子等。作为用于在酵母中表达编码人源化抗体或其重链和/或轻链可变区的基因的启动子，可以提及例如，PH05启动子，PGK启动子，GAP启动子，和ADH启动子；当宿主是芽胞杆菌属的细菌时，可以提及SL01启动子，SP02启动子，penP启动子等。当宿主是真核细胞例如哺乳动物细胞时，可以提及β肌动蛋白启动子，CAG启动子(Niwa H.等人，Gene，108，193-200，1991)，SV40-衍生的启动子，逆转录病毒启动子，热休克启动子等。 
当使用细菌、尤其大肠杆菌作为宿主细胞时，本发明的表达载体可以另外包含起始密码子、终止密码子、终止子区和可复制单元。当使用酵母、动物细胞或昆虫细胞作为宿主时，本发明的表达载体可以包含起始密码子和终止密码子。在该情况下，可以含有增强子序列、在编码本发明的人源化抗体或其重链和/或轻链可变区的基因的5’侧和3’侧的非编码区、剪接点、多腺苷酸化位点或可复制单元等。另外，也可以含有根据目的常规使用的选择标记(例如四环素抗性基因，氨苄西林抗性基因，卡那霉素抗性基因，新霉素抗性基因，二氢叶酸还原酶基因)。 
本发明也提供了掺入编码本发明的人源化抗体或其重链和/或轻链可变区的基因的转化体。通过例如用本发明的表达载体转化宿主细胞，可以制备这样的转化体。用于制备转化体的宿主细胞没有限制，只要它匹配前述表达载体且可转化即可；可以提及不同的细胞例如天然细胞或常用于本发明的技术领域中的人工建立的细胞系(例如细菌(埃希氏杆 菌属的细菌，芽胞杆菌属的细菌)、酵母(酵母属，毕赤酵母属等)、动物细胞或昆虫细胞(例如Sf9)等)作为实例。通过本身已知的方法，可以进行转化。 
本发明也提供了本发明的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体的生产方法，其包含，在宿主细胞中表达编码本发明的人源化抗体或重链和/或轻链可变区的基因，即使用这样的转化体。优选地，用于该方法中的宿主细胞掺入本发明的表达载体，所述表达载体可以分开地或同时地含有编码人源化的抗-人α9整联蛋白抗体的重链和轻链可变区的多核苷酸。 
在本发明的生产人源化的抗-人α9整联蛋白抗体中，可以在营养培养基中培养转化体。营养培养基优选地含有转化体生长所需的碳源和无机氮源或有机氮源。作为碳源的实例，可以提及葡萄糖、葡聚糖、可溶淀粉、蔗糖等；作为无机氮源或有机氮源的实例，可以提及铵盐、硝酸盐、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉膏、豆饼、马铃薯提取物等。如果需要，可以含有其它营养物(例如无机盐(例如氯化钙，磷酸二氢钠，氯化镁)、维生素、抗生素(例如四环素，新霉素，氨苄西林，卡那霉素等)等)。 
通过本身已知的方法，可以进行转化体的培养。选择适当的培养条件，例如，温度、培养基的pH和培养时间。例如，当宿主是动物细胞时，可以使用MEM培养基(Science，Vol.122，p.501，1952)、DMEM培养基(Virology，Vol.8，p.396，1959)、RPMI1640培养基(J.Am.Med.Assoc.，Vol.199，p.519，1967)、含有约5-20％胎牛血清等的199培养基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，Vol.73，p.1，1950)作为培养基。培养基的pH优选是约6-8，通常在约30-40℃培养约15至72小时，可以根据需要给培养物充气或搅拌。当宿主是昆虫细胞时，可以提及例如，包含胎牛血清的Grace氏培养基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.82，p.8404，1985)等，其pH优选是约5-8。通常在约20-40℃培养约15至100小时，可以根据需要给培养物充气或搅拌。当宿主是细菌、放线菌、酵母或丝状真菌时，例如，包含上述营养源的液体培养基是适当的。具有pH5-8的培养基是优选的。当宿主是大肠杆菌时，可以提及LB培养基、M9培养基(Miller等人，Exp.Mol.Genet，Cold Spring Harbor Laboratory，p.431，1972)等作为优选的培养基。在该情况下，通常在14-43℃培养约3至24小时，同时根据需要给培养物充气或搅拌。当宿主是芽胞杆 菌属的细菌时，通常在30-40℃培养约16至96小时，同时根据需要给培养物充气或搅拌。当宿主是酵母时，可以提及Burkholder氏基本培养基(Bostian，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.77，p.4505，1980)作为培养基的实例，pH理想地是5-8。通常在约20-35℃培养约14至144小时，根据需要给培养物充气或搅拌。 
可以从如上所述的培养的转化体回收、优选分离和纯化本发明的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体。作为分离和纯化方法的实例，可以提及基于溶解度差异的方法，例如盐析和溶剂沉淀；基于分子量差异的方法，例如透析、超滤、凝胶过滤和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；基于电荷差异的方法，例如离子交换色谱和羟基磷灰石色谱；基于特异性亲和力的方法，例如亲和色谱；基于疏水性差异的方法，例如反相高效液相色谱；基于等电点差异的方法，例如等电点聚焦电泳等。 
下面参考实施例详细解释本发明，这些实施例不应理解为限制性的。 
实施例
关于使用可商业得到的试剂盒或试剂的部分，除非另有说明，根据所附的说明进行实验。 
《实施例1：小鼠Y9A2抗体可变区序列的确定和嵌合Y9A2抗体的生产》 
确定小鼠Y9A2抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因，将VH基因连接至人Igγ1基因，将VL基因连接至人Igκ基因，产生小鼠-人嵌合抗体(在下文中也称作嵌合Y9A2抗体)。操作如下所述。 
首先，使用TRIzol试剂(Invitrogen)，从生产小鼠Y9A2抗体的杂交瘤提取RNA，所述杂交瘤由位于圣弗兰西斯科的加利福尼亚大学(UCSF)提供。使用RNA作为模板，使用随机引物和SuperScript III反转录酶(二者都来自Invitrogen)，合成cDNA。然后，使用该cDNA作为模板，和先导区的引物和参照Kabat等人的V区和J区序列分类(Sequencesof Proteins of Immunological Interest 4th ed.，Public Health Service，NIH，Washington DC，1987)设计的J区的引物，用Ex耐热性DNA聚合酶(TAKARA BIO INC.)扩增VH基因节段。上述先导区的引物和这里使用的J区的引物分别添加了HindIII识别序列和BamHI识别序列。关于VL，使用符合先导序列的引物和符合J区的引物，以与VH相同的方式得到 VL基因节段。 
用HindIII和BamHI(二者都来自TAKARA BIO INC.)消化这样得到的VH和VL基因节段，并分别连接至AG-γ1和AG-κ(WO94/20632)，它们是表达载体。AG-γ1具有β肌动蛋白启动子、人免疫球蛋白恒定区γ1链基因和作为选择标记的新霉素抗性基因(neo)，通过在位于γ1基因上游的HindIII识别序列和BamHI识别序列之间***小鼠Y9A2抗体VH基因，变成表达嵌合Y9A2抗体的重链的质粒。AG-κ具有β肌动蛋白启动子、人免疫球蛋白恒定区κ链基因和作为选择标记的二氢叶酸还原酶(dhfr)基因，通过在位于κ基因上游的HindIII识别序列和BamHI识别序列之间***小鼠Y9A2抗体VL基因，简单地变成表达嵌合Y9A2抗体的轻链的质粒。 
根据常规方法，将这些表达质粒引入大肠杆菌，产生转化的克隆，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)，从其制备质粒DNA。使用得到的质粒DNA作为模板，GenomeLab DTCS-Quick Start试剂盒和CEQ2000自动测序仪(二者都来自BECKMAN COULTER)，合成克隆的VH和VL碱基序列。VH和VL的碱基序列分别如SEQ ID NO：2和SEQID NO：4所示。基于得到的序列确定的VH和VL的氨基酸序列分别如图1和图2所示。另外，它们分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示。 
大量培养上述的大肠杆菌克隆，使用EndoFree Plasmid Maxi试剂盒(QIAGEN)，纯化嵌合Y9A2抗体的重链表达质粒和轻链表达质粒。混合它们，使用FreeStyle 293表达***(Invitrogen)引入细胞，由此短暂表达嵌合Y9A2抗体。使用山羊-衍生的抗-人IgG Fc抗体(CAPPEL)和蛋白A-HRP (ZYMED)，通过夹心ELISA，测量在得到的培养上清液中含有的嵌合Y9A2抗体的浓度。在该情况下，制备可商业得到的人IgG1抗体(Biogenesis)的系列稀释物，用作标准样品。然后，使用蛋白A柱(GEHealthcare)，亲和纯化上述的培养上清液中的嵌合Y9A2抗体，得到纯化的嵌合Y9A2抗体。计算纯化的嵌合Y9A2抗体的浓度，其中当在波长280nm的吸光度是1.4时，浓度是1mg/mL。 
《实施例2：嵌合Y9A2抗体的细胞粘附抑制实验》 
为了对比纯化的嵌合Y9A2抗体(通过在前述部分所述的方法制备) 与小鼠Y9A2抗体(CHEMICON INTERNATIONAL)的活性，进行J.Biol.Che m.，274：36328-36334，1999所述的细胞粘附抑制实验。更具体地，首先固定化和封闭变体(nOPN-RAA)，其中用凝血酶切割骨桥蛋白产生的N末端片段(nOPN)含有的RGD序列被置换为RAA，加入小鼠Y9A2抗体或纯化的嵌合Y9A2抗体。接着，加入表达人α9整联蛋白分子的SW480细胞(在下文中有时称作SW480/hα9细胞)，在37℃温育混合物1小时。此后，固定细胞，用结晶紫和甲醇染色，并洗涤。用Triton X-100提取粘附的细胞中的染料，在波长595nm测量吸光度。 
如表1所示，结果发现，小鼠Y9A2抗体的IC50和纯化的嵌合Y9A2抗体的IC50几乎相同，它们具有抑制SW480/hα9细胞与nOPN-RAA粘附的活性。将IC50定义为，抑制不加入抗-α9整联蛋白抗体时产生的细胞粘附水平的50％所需的抗-α9整联蛋白抗体的浓度。 
表1小鼠Y9A2抗体和嵌合Y9A2抗体的细胞粘附抑制实验的结果 
    小鼠Y9A2抗体   嵌合Y9A2抗体
  IC50(μg/mL)   0.039   0.038
《实施例3：人源化的Y9A2抗体基因的生产》 
从含有与小鼠Y9A2抗体的VH、VL中的框架区(FR)氨基酸序列具有高度同源性的氨基酸序列的人抗体种系中，选择要与小鼠Y9A2抗体的VH和VL中的互补性决定区(CDR)氨基酸嫁接的模板人抗体。更具体地，选择的模板人VH是DP-88和JH6的组合，选择的模板人VL是DPK-1和Jκ4的组合。 
将上述的模板人抗体VH和VL的FR与来自小鼠Y9A2抗体的VH和VL的必需氨基酸序列嫁接，产生人源化抗体。更具体地，就VH而言，首先将前述模板人抗体VH的CDR氨基酸序列和FR氨基酸的几个位点置换为小鼠Y9A2抗体的VH中的对应氨基酸序列。设计了2类人源化的Y9A2抗体(即，RY9A2VHv5和RY9A2VHv8)的VH的氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7)，进一步地，设计了编码该氨基酸序列的DNA的碱基序列(分别是SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8)。在RY9A2VHv8中，源自RY9A2VHv5中的小鼠Y9A2抗体的4个FR氨基酸残基被置换为模板人抗体的残基。 
就VL而言，将前述模板人抗体VL的CDR氨基酸序列置换为小鼠Y9A2抗体的VL中的CDR氨基酸序列。设计了RY9A2VLv01的氨基酸序列，它是人源化的Y9A2抗体的VL(SEQ ID NO：9)，进一步地，设计了编码该氨基酸序列的DNA的碱基序列(SEQ ID NO：10)。 
为了生产编码上述的RY9A2VHv5、RY9A2VHv8和RY9A2VLv01的DNA片段，使用寡DNA作为原料，通过PCR进行全合成。更具体地，如下合成RY9A2VHv5：把它分成6类寡DNAs(如SEQ ID NO：29-34所述)，以覆盖VH的全长，分别如图3所示，并使用它们，通过下述操作进行PCR。也就是说，混合等当量6类寡DNAs。使用该混合物作为模板和Pyrobest DNA聚合酶(TAKARA BIO)，重复下述步骤15个循环：96℃，30秒，50℃，30秒和72℃，3分钟。然后，使用该PCR产物(1μL)作为模板、具有图3中的粗体所示的序列的寡DNA(如SEQ IDNO：35和36所示)作为引物和Pyrobest DNA聚合酶，重复下述步骤25个循环：96℃，20秒和72℃，2分钟，以扩增全长VH。通常也以相同的方式生产RY9A2VHv8。 
为了生产RY9A2VLv01，使用图4所示的6个寡DNAs(如SEQ IDNO：37-42所示)，以与上面相同的方式，进行15个PCR循环，使用扩增产物作为模板、具有图4中的粗体所示的序列的寡DNA(如SEQ IDNO：43和44所示)作为引物，以与上面相同的方式，进行25个PCR循环，由此扩增全长VL。 
在上述的VH和VL中，使用与在WO2007/139164中描述的人源化的抗-骨桥蛋白单克隆抗体相同的序列，作为抗体的先导序列。另外，在得到的DNA片段的两端，添加用于克隆的HindIII识别序列和BamHI识别序列。 
用限制性内切酶HindIII和BamHI消化这样得到的VH和VL的DNA片段，分别连接前述表达载体AG-γ1和AG-κ，根据克隆的常规方法，引入大肠杆菌。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)，从得到的大肠杆菌克隆制备质粒DNA。使用得到的质粒DNA作为模板，使用GenomeLab DTCS-Quick Start试剂盒和CEQ2000自动测序仪(二者都来自BECKMAN COULTER)，分析克隆的VH和VL的碱基序列，由此得到具有设计的碱基序列的克隆。培养这些克隆，使用EndoFree PlasmidMaxi试剂盒(QIAGEN)，纯化重链和轻链的表达质粒。 
混合纯化的重链表达质粒和轻链表达质粒，将混合物引入细胞，以使用FreeStyle 293表达***短暂表达抗体。在该情况下，由***RY9A2VHv5的重链表达质粒和***RY9A2VLv01的轻链表达质粒的组合表达的人源化的Y9A2抗体称作RY9A2v501抗体，由***RY9A2VHv8的重链表达质粒和***RY9A2VLv01的轻链表达质粒的组合表达的人源化的Y9A2抗体称作RY9A2v801抗体。 
通过与前述嵌合Y9A2抗体相同的方法，测量在培养上清液中积累的每种人源化的Y9A2抗体的浓度，并从培养上清液获取纯化的抗体。 
《实施例4：人源化的Y9A2抗体与人α9整联蛋白的结合活性的证实》 
根据细胞ELISA方法，将通过前述方法表达的RY9A2v501抗体和RY9A2v801抗体与嵌合的Y9A2抗体(在下文中有时称作cY9A2抗体)对比结合人α9整联蛋白分子的活性。更具体地，将表达人α9整联蛋白分子的SW480细胞固定化在ELISA平板上，与上述的cY9A2抗体或RY9A2v501抗体或RY9A2v801抗体反应，并与作为第二抗体的HRP-标记的山羊抗-人IgG(Fc)抗体(American Qualex)反应。加入TMB来实现显色，加入稀硫酸来淬灭反应，测量在波长450nm的吸光度。结果如图5和图6所示，已经证实RY9A2v501抗体和RY9A2v801抗体具有与cY9A2抗体相当的结合人α9整联蛋白分子的活性。 
《实施例5：人源化的Y9A2抗体的细胞粘附抑制实验》 
以与实施例2相同的方式，对上述纯化的RY9A2v501抗体、纯化的RY9A2v801抗体和小鼠Y9A2抗体进行细胞粘附抑制实验。 
结果如表2所示。将IC50(μg/mL)定义为，抑制不加入抗-α9整联蛋白抗体时产生的细胞粘附水平的50％所需的抗-α9整联蛋白抗体的浓度。小鼠Y9A2抗体的IC50值的平均值是0.070μg/mL。表2显示了当小鼠Y9A2的IC50值是1时人源化抗体的比活。表2显示了2批实验的平均值。如表2所示，已经证实，上述两类人源化抗体具有与小鼠Y9A2抗体相当的细胞粘附抑制活性。 
表2小鼠Y9A2抗体/RY9A2v501抗体和RY9A2v801抗体的细胞粘附抑制实验的结果 
  抗体   比活
  Y9A2   1.0
  RY9A2v501   0.77
  RY9A2v801   0.82
《实施例6：改良的人源化的Y9A2抗体的生产》 
如上所述，由于可以获得两类具有与起始小鼠Y9A2抗体相同水平的细胞粘附抑制活性的人源化的Y9A2抗体(RY9A2v501抗体和RY9A2v801抗体)，发明人现在尝试基于这些人源化抗体通过引入突变进一步改良人源化的Y9A2抗体。 
作为发明人的突出创造力和考虑的结果，他们已经成功地生产下述3类抗体，作为具有显著超过小鼠Y9A2抗体的活性的人源化的Y9A2抗体：RY9A2v12(M34L)012抗体，RY9A2v11(M34L)012抗体和RY9A2v5(IAW)01抗体。 
1.RY9A2v12(M34L)012抗体 
RY9A2v12(M34L)012抗体的重链可变区(VH)具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，轻链可变区(VL)具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。RY9A2v12(M34L)012抗体的VH和VL的碱基序列分别如SEQ IDNO：12和18所示。RY9A2v12(M34L)012抗体的VH是上述的RY9A2VHv8(SEQ ID NO：7)，其中CDR1中的蛋氨酸残基(VH氨基酸序列的第34个氨基酸残基)被置换为亮氨酸，以及CDR2中的赖氨酸残基和天冬氨酸残基(VH氨基酸序列的第65个和第66个氨基酸残基)分别被置换为谷氨酰胺和甘氨酸。RY9A2v12(M34L)012抗体的VL是上述的RY9A2VLv01(SEQ ID NO：9)，其中CDR1中的赖氨酸残基(VL氨基酸序列的第24个氨基酸残基)被置换为精氨酸。 
2.RY9A2v11(M34L)012抗体 
RY9A2v11(M34L)012抗体的VH具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，VL具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。RY9A2v11(M34L)012抗体的VH和VL的碱基序列分别如SEQ ID NO：14和18所示。RY9A2v11(M34L)012抗体的VH是上述的RY9A2VHv5(SEQ ID NO： 5)，其中CDR1中的蛋氨酸残基(VH氨基酸序列的第34个氨基酸残基)被置换为亮氨酸，以及CDR2中的赖氨酸残基和天冬氨酸残基(VH氨基酸序列的第65个和第66个氨基酸残基)分别被置换为谷氨酰胺和甘氨酸。RY9A2v11(M34L)012抗体的VL是上述的RY9A2VLv01(SEQ IDNO：9)，其中CDR1中的赖氨酸残基(VL氨基酸序列的第24个氨基酸残基)被置换为精氨酸。 
3.RY9A2v5(IAW)01抗体 
RY9A2v5(IAW)01抗体的VH具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，VL具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。RY9A2v5(IAW)01的VH和VL的碱基序列分别如SEQ ID NO：16和10所示。RY9A2v5(IAW)01抗体的VH是上述的RY9A2VHv5(SEQ ID NO：5)，其中CDR1中的蛋氨酸残基(VH氨基酸序列的第34个氨基酸残基)被置换为异亮氨酸，以及CDR3中的天冬氨酸残基和苯丙氨酸残基(VH氨基酸序列的第104个和第105个氨基酸残基)分别被置换为丙氨酸和色氨酸。RY9A2v5(IAW)01抗体的VL与上述的RY9A2VLv01(SEQ ID NO：9)相同。 
以与上面相同的方式，将上述3类改良的人源化的Y9A2抗体的VH和VL的DNA片段连接至表达载体AG-γ1和AG-κ，产生表达质粒。使用FreeStyle 293表达***，表达质粒，使用如上所述的蛋白A柱，从培养上清液得到各种纯化的抗体。 
《实施例7：改良的人源化的Y9A2抗体与人α9整联蛋白的结合活性的证实》 
以与实施例4相同的方式，通过细胞ELISA，证实如上所述生产的3类人源化的Y9A2抗体和cY9A2抗体结合人α9整联蛋白的活性。结果，证实所有改良的人源化的Y9A2抗体具有结合人α9整联蛋白的活性，如嵌合Y9A2抗体。 
《实施例8：改良的人源化的Y9A2抗体对人nOPN的细胞粘附抑制实验》 
为了将3类改良的人源化的Y9A2抗体的活性与小鼠Y9A2抗体相对比，以与实施例2相同的方式进行细胞粘附抑制实验。 
结果如表3所示。将IC50(μg/mL)定义为，抑制不加入抗-α9整联蛋白抗体时产生的细胞粘附水平的50％所需的抗-α9整联蛋白抗体的浓度。小鼠Y9A2抗体的IC50值的平均值是0.039μg/mL。表3显示了当小鼠Y9A2的IC50值是1时人源化的Y9A2抗体的比活。表3显示了2或3批实验的平均值。已经发现，3类改良的人源化的Y9A2抗体表现出与小鼠Y9A2抗体相比提高了不小于4倍的细胞粘附抑制活性。 
表3改良的人源化的Y9A2抗体的细胞粘附抑制实验的结果 
  抗体   比活
  Y9A2   1.0
  RY9A2v5(IAW)01   0.29
  RY9A2v11(M34L)012   0.23
  RY9A2v12(M34L)012   0.23
《实施例9：改良的人源化的Y9A2抗体对人VCAM-1和人结合腕蛋白C的细胞粘附抑制实验》 
使用不同于前述细胞粘附抑制实验所用的nOPN-RAA的配体，检查了3类改良的人源化的Y9A2抗体。更具体地，以相同的方式，检查了对人VCAM-1/Ig(R&D)和人结合腕蛋白C-RAA变体(其中人结合腕蛋白C的RGD序列被置换为RAA)的细胞粘附抑制作用。 
表4显示了2批实验的平均值。小鼠Y9A2抗体对人VCAM-1和人结合腕蛋白C-RAA的细胞粘附抑制活性IC50值的平均值分别是0.077μg/mL和0.041μg/mL。表4显示了当小鼠Y9A2的IC50值是1时人源化的Y9A2抗体的比活。已经发现，3类改良的人源化的Y9A2抗体表现出至少与小鼠Y9A2抗体相当的抑制活性，尽管根据使用的配体会有变化。 
[表4]改良的人源化的Y9A2抗体对VCAM-1和结合腕蛋白C的细胞粘附抑制实验的结果 
  抗体   人VCAM-1比活   人结合腕蛋白C-RAA比活
  Y9A2   1.0   1.0
  RY9A2v5(IAW)01   1.0   0.44
  RY9A2v11(M34L)012   0.44   0.35
  RY9A2v12(M34L)012   0.95   0.26
《实施例10：改良的人源化的Y9A2抗体的细胞迁移抑制实验》 
检查了3类改良的人源化的Y9A2抗体对SW480/hα9细胞抗nOPN-RAA的迁移活性的抑制作用。该实验基于在Molecular Biology ofthe cell，12：3214-3225，2001中所述的细胞迁移抑制实验，作出一些改变。更精确地，将nOPN-RAA固定化在转移孔(Millipore)的上层，置于平板上，然后将含有10％FCS的F15培养基加入下层。将小鼠Y9A2抗体或人源化的Y9A2抗体与SW480/hα9细胞一起加入上层，在37℃温育混合物16小时。此后，使用QCM趋化性细胞迁移24-孔测定试剂盒(Millipore)，定量迁移进转移孔下层中的细胞。将通过加入过量(100μg/mL)的小鼠Y9A2抗体抑制的迁移活性定义为α9依赖性的迁移活性(100％抑制)，每种抗体的抑制率如表5所示。 
仅在加入50μg/mL的小鼠Y9A2抗体时，发现了显著的迁移抑制作用；但是，发明人生产的改良的人源化的Y9A2抗体在5μg/mL的浓度表现出显著的抑制作用，该浓度是小鼠Y9A2抗体浓度的1/10。相对于无抗体的孔，通过t检验进行显著性差异实验。 
*：P＜0.05，**：P＜0.01。 
[表5]改良的人源化的Y9A2抗体的细胞迁移抑制实验的结果 
  抗体   抗体浓度(μg/mL)   抑制率(％)
  Y9A2   5  20  50   28  24  99*
  RY9A2v5(IAW)01   5   109**
  RY9A2v11(M34L)012   5   84*
  RY9A2v12(M34L)012   5   86*
显著的细胞迁移抑制作用与临床有效浓度直接关联，临床有效浓度变成1/10会在临床实践中导致延长的给药间隔(例如2周给药一次变成几个月一次，等)，维持在约5μg/mL的血浓度允许开发皮下注射制剂。由于现在全世界允许皮下注射制剂的自我注射，会显著提高在慢性疾病中的便利性，特别就患者和医疗机构而言。因此，本发明对生物活性的提高不仅极大地促进了其治疗有效性，而且提高了患者顺应性。 
《实施例11：改良的人源化的Y9A2抗体的热稳定实验》 
在70℃温育3类改良的人源化的Y9A2抗体和小鼠Y9A2抗体2小时或10小时，使用在实施例8中所述的细胞粘附抑制实验，评价热稳定性。 
4个实验的平均值如表6所示。没有热处理的细胞粘附抑制活性作为100％，显示了热处理后每种抗体的活性残余率。尽管小鼠Y9A2抗体在2小时时表现出活性的降低，3类改良的人源化的Y9A2抗体甚至在温育10小时后保留85％或更高的活性。因此，改良的人源化的Y9A2抗体对加热非常稳定的性质，导致在临床开发制剂中，开发允许在室温保藏的非常方便的制剂。 
[表6]改良的人源化的Y9A2抗体的热稳定实验的结果 
  抗体  2小时的活性残余率 (％)   10小时的活性残余率  (％)
  Y9A2  27   33
  RY9A2v5(IAW)01  89   86
  RY9A2v11(M34L)012  92   87
  RY9A2v12(M34L)012  91   89
工业实用性 
通过阻断人α9整联蛋白和其多种配体之间的相互作用，本发明的改良的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体具有与供体小鼠抗-人α9整联蛋白抗体相比提高的活性和/或性质、和强抗炎作用和强骨破坏抑制作用，可用于预防或治疗在发病机理中涉及人α9整联蛋白的多种疾病。 
本申请是基于在日本提交的专利申请号2008-004975(提交日期：2008年1月11日)和2008-282496(提交日期：2008年10月31日)，它们的内容在这里全部并入。 
序列表
<110>Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
Astellas Pharma Inc.
<120>改良的人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体
<130>091325
<150>JP 2008-004975
<151>2008-01-11
<150>JP 2008-282496
<151>2008-10-31
<160>44
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>120
<212>PRT
<213>小鼠
<400>1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Asn Pro Gly Ala
1         5           10           15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Thr Tyr
       20           25           30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
    35           40           45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
  50            55            60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65           70          75           80
Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
         85          90            95
Ala Ile Tyr Gly Asp Tyr Gly Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
        100          105           110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
    115          120
<210>2
<211>360
<212>DNA
<213>小鼠
<400>2
caggtccagc ttcagcagtc tggggctgaa ctggcaaatc ctggggcctc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacattaact acctactgga tgcactgggt aaaacagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gctctggtta tactgaatac 180
aatcagaagt tcaaggacaa ggccacgttg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactga ccagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aatctatggt 300
gactatgggg atttctactt tgactactgg ggccagggca ccactctcac agtctcctca 360
<210>3
<211>108
<212>PRT
<213>小鼠
<400>3
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1          5           10           15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asn Thr Asp
      20          25            30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
     35          40           45
Tyr Phe Ala Ser Asn His Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
  50            55          60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala
65           70          75           80
Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Phe Cys Arg Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Phe
         85           90           95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
      100           105
<210>4
<211>324
<212>DNA
<213>小鼠
<400>4
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gggaccaagc tggaaataaa acgg                                        324
<210>5
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的VH链
<400>5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1         5           10           15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Thr Tyr
       20           25           30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
    35           40           45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
  50            55            60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65          70            75           80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
         85           90           95
Ala Ile Tyr Gly Asp Tyr Gly Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
        100          105           110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
    115           120
<210>6
<211>360
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的VH基因
<400>6
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gactatgggg atttctactt tgactactgg gggcaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
<210>7
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的VH链
<400>7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1         5          10            15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Thr Tyr
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Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
    35           40           45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
  50            55            60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65          70            75           80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
         85           90           95
Ala Ile Tyr Gly Asp Tyr Gly Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
        100          105          110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
    115           120
<210>8
<211>360
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的VH基因
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<210>9
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的VL链
<400>9
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asn Thr Asp
      20            25           30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
     35          40            45
Tyr Phe Ala Ser Asn His Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
  50           55           60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65           70           75          80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Phe
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<210>10
<211>324
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的VL基因
<400>10
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<210>11
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的VH链
<400>11
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<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的VH基因
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<400>13
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<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的VH基因
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<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的VH链
<400>15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1         5           10           15
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<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的VH基因
<400>16
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc cgtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggata caccctcacc acctactgga ttcactgggt gaaacagaga 120
cctggacaag ggcttgagtg gattggatac attaatccta gctctggtta tactgaatac 180
aatcagaagt tcaaggacag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gatttatggt 300
gactatgggg cttggtactt tgactactgg gggcaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
<210>17
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的VL链
<400>17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1          5          10            15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Thr Asp
      20            25           30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
    35            40           45
Tyr Phe Ala Ser Asn His Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
  50            55          60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65           70           75          80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Phe
         85            90           95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
      100           105
<210>18
<211>324
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的VL基因
<400>18
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca gggccagtca gagtgtgaat actgatgttg cttggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctacttt gcatccaatc actacactgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatattg caacatatta ctgtcggcag gattacagct ctccgttcac gttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa acgt                                        324
<210>19
<211>450
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的H链
<400>19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1         5           10           15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Thr Tyr
       20           25           30
Trp Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
    35           40           45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
  50            55            60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65          70            75           80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
         85          90            95
Ala Ile Tyr Gly Asp Tyr Gly Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
        100          105           110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
     115          120           125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
  130           135           140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145          150          155           160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
         165           170          175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
       180           185          190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
    195            200          205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
  210           215          220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225          230           235           240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
         245          250           255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
       260          265          270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
    275          280           285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
  290           295          300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305          310           315          320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
         325          330           335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
       340            345           350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
    355           360          365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
  370           375          380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385          390           395          400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
        405           410           415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
       420          425          430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
    435           440          445
Gly Lys
  450
<210>20
<211>1350
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的H基因
<400>20
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc cgtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccctcacc acctactggt tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatac attaatccta gctctggtta tactgaatac 180
aatcagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gatttatggt 300
gactatgggg atttctactt tgactactgg gggcaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
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tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
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<210>21
<211>450
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的H链
<400>21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1         5           10           15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Thr Tyr
       20           25           30
Trp Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
    35           40           45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
  50            55            60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65          70             75          80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
         85          90            95
Ala Ile Tyr Gly Asp Tyr Gly Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
        100          105          110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
    115           120           125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
  130           135          140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145          150          155           160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
         165           170          175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
      180           185           190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
    195            200          205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
  210           215          220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225          230           235           240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
         245          250           255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
       260          265          270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
    275          280           285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
  290           295          300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305          310           315          320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
         325          330           335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
      340             345          350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
    355           360          365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
  370          375          380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385          390           395          400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
         405           410         415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
       420          425          430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
    435           440          445
Gly Lys
  450
<210>22
<211>1350
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的H基因
<400>22
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc cgtgaagatg  60
tcctgcaagg cttctggata caccctcacc acctactggt tgcactgggt gaaacagaga  120
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ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc  600
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gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg  840
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<210>23
<211>450
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的H链
<400>23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1         5           10           15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Thr Tyr
       20           25           30
Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
     35           40            45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
  50            55            60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65          70            75           80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90            95
Ala Ile Tyr Gly Asp Tyr Gly Ala Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
        100          105           110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
    115           120           125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
  130           135           140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145          150          155           160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
         165           170          175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
      180           185           190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
     195          200           205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
  210           215          220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225          230           235           240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
         245          250           255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
       260          265          270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
    275          280           285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
  290          295           300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305          310           315          320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
         325          330           335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
       340            345          350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
    355           360          365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
  370          375          380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385          390           395          400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
         405           410         415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
       420          425          430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
    435           440          445
Gly Lys
  450
<210>24
<211>1350
<212>DNA
<13>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的H基因
<400>24
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc cgtgaagatg  60
tcctgcaagg cttctggata caccctcacc acctactgga ttcactgggt gaaacagaga  120
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gactatgggg cttggtactt tgactactgg gggcaaggga ccacggtcac cgtctcctca  360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg  420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg  480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca  540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc  600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc  660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga  720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct  780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtca gttcaactgg   840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac  900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag  960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc  1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag  1080
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc  1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg  1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg  1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg  1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa                                   1350
<210>25
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的L链
<400>25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1         5           10            15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Thr Asp
      20            25           30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
    35           40            45
Tyr Phe Ala Ser Asn His Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
  50            55          60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65           70           75          80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Phe
          85           90           95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
      100           105           110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
    115            120          125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
  130           135          140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145          150           155          160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
         165           170          175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
       180          185           190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
     195          200           205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
  210
<210>26
<211>642
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的L基因
<400>26
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca gggccagtca gagtgtgaat actgatgttg cttggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctacttt gcatccaatc actacactgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatattg caacatatta ctgtcggcag gattacagct ctccgttcac gttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa acgtactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt                    642
<210>27
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的L链
<400>27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1          5          10            15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asn Thr Asp
      20            25           30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
     35           40           45
Tyr Phe Ala Ser Asn His Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
  50            55          60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65           70           75          80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Phe
         85            90          95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
      100           105           110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
    115            120           125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
  130           135          140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145          150           155          160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
         165           170          175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
       180          185           190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
    195           200           205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
  210
<210>28
<211>642
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人源化的抗-人α9-整联蛋白抗体的L基因
<400>28
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc  60
atcacttgca aggccagtca gagtgtgaat actgatgttg cttggtatca gcagaaacca  120
gggaaagccc ctaagctcct gatctacttt gcatccaatc actacactgg ggtcccatca  180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct  240
gaagatattg caacatatta ctgtcggcag gattacagct ctccgttcac gttcggcgga  300
gggaccaagg tggagatcaa acgtactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca  360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat  420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag  480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg  540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc  600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt                     642
<210>29
<211>92
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>图3所示的寡DNA
<400>29
cagcaagctt gccgccacca tggaatggag ctggatcttt ctcttcctcc tgtcagtaac    60
tgcaggtgtc caatcccagg tgcagctggt gc                                  92
<210>30
<211>96
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>图3所示的寡DNA
<400>30
aggcttctgg atacaccctc accacctact ggatgcactg ggtgaaacag agacctggac    60
aagggcttga gtggattgga tacattaatc ctagct                              96
<210>31
<211>93
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>图3所示的寡DNA
<400>31
ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc ctgagatctg aggacacggc    60
cgtgtattac tgtgcgattt atggtgacta tgg                                 93
<210>32
<211>93
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>图3所示的寡DNA
<400>32
tcgcggatcc actcacctga ggagacggtg accgtggtcc cttgccccca gtagtcaaag 60
tagaaatccc catagtcacc ataaatcgca cag                              93
<210>33
<211>95
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>图3所示的寡DNA
<400>33
ggtgagggtg tatccagaag ccttgcagga catcttcacg gaggacccag gcttcttcac 60
ctcagcccca gactgcacca gctgcacctg ggatt                            95
<210>34
<211>97
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>图3所示的寡DNA
<400>34
gctgtgctcg tggatttgtc cgcggtaatc gtgactctgt ccttgaactt ctgattgtat 60
tcagtataac cagagctagg attaatgtat ccaatcc                          97
<210>35
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>图3所示的寡DNA
<400>35
cagcaagctt gccgccacca tggaatggag ctggatcttt    40
<210>36
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>图3所示的寡DNA
<400>36
tcgcggatcc actcacctga ggagacggtg accgtggtcc    40
<210>37
<211>93
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>图4所示的寡DNA
<400>37
cagcaagctt gccgccacca tgaagttgcc tgttaggctg ttggtgctga tgttctggat 60
tcctgcttcc agcagtgaca tccagatgac cca                              93
<210>38
<211>95
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>图4所示的寡DNA
<400>38
tattcacact ctgactggcc ttgcaagtga tggtgactct gtctcctaca gatgcagaca 60
gggaggatgg agactgggtc atctggatgt cactg                            95
<210>39
<211>92
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>图4所示的寡DNA
<400>39
aggccagtca gagtgtgaat actgatgttg cttggtatca gcagaaacca gggaaagccc 60
ctaagctcct gatctacttt gcatccaatc ac                               92
<210>40
<211>91
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>图4所示的寡DNA
<400>40
tgctgatggt gaaagtaaaa tctgtcccag atccacttcc actgaacctt gatgggaccc 60
cagtgtagtg attggatgca aagtagatca g                                91
<210>41
<11>88
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>图4所示的寡DNA
<400>41
cagattttac tttcaccatc agcagcctgc agcctgaaga tattgcaaca tattactgtc  60
ggcaggatta cagctctccg ttcacgtt                                     88
<210>42
<211>92
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>图4所示的寡DNA
<400>42
tcgcggatcc aactgaggaa gcaaagttta aattctactc acgtttgatc tccaccttgg    60
tccctccgcc gaacgtgaac ggagagctgt aa                                  92
<210>43
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>图4所示的寡DNA
<400>43
cagcaagctt gccgccacca tgaagttgcc tgttaggctg    40
<210>44
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>图4所示的寡DNA
<400>44
tcgcggatcc aactgaggaa gcaaagttta aattctactc    40

Claims (12)

1.人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其包含选自下述的重链可变区和轻链可变区：
(a)由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列组成的轻链可变区
(b)由SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列组成的轻链可变区，或
(c)由SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
2.根据权利要求1的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其中所述抗体的重链恒定区是人Igγ1。
3.根据权利要求1的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其中所述抗体的轻链恒定区是人Igκ。
4.根据权利要求1的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其中所述抗体的重链恒定区是人Igγ1，且所述抗体的轻链恒定区是人Igκ。
5.根据权利要求1的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其中所述重链由SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列组成，且所述轻链由SEQID NO：25所示的氨基酸序列组成。
6.根据权利要求1的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其中所述重链由SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列组成，且所述轻链由SEQID NO：25所示的氨基酸序列组成。
7.根据权利要求1的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体，其中所述重链由SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列组成，且所述轻链由SEQID NO：27所示的氨基酸序列组成。
8.一种多核苷酸，其由编码根据权利要求1的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体的重链可变区的序列组成。
9.一种多核苷酸，其由编码根据权利要求1的人源化的抗-人α9整联蛋白抗体的轻链可变区的序列组成。
10.一种表达载体，其包含根据权利要求8的多核苷酸和/或根据权利要求9的多核苷酸。
11.一种宿主细胞，其掺入根据权利要求10的表达载体。
12.一种生产人源化的抗-人α9整联蛋白抗体的方法，其包含下述步骤：培养根据权利要求11的宿主细胞，以表达人源化的抗-人α9整联蛋白抗体。
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