CN1980956B - 抗乙型肝炎病毒s-表面抗原的人源化抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明的人源化抗体表现出对小鼠单克隆抗体相似的抗原结合亲和力和显著的低免疫原性。因此，本发明的人源化抗体能够有效用来治疗慢性乙型肝炎和预防接受肝脏移植患者的HBV感染以及从感染有HBV的母亲向婴儿的垂直传播。

Description

抗乙型肝炎病毒S-表面抗原的人源化抗体
技术领域
本发明涉及抗乙型肝炎病毒(以下作“HBV”)S-表面抗原的人源化抗体、其制备方法、以及用来治疗HBV相关疾病的包含该人源化抗体的药物组合物。
背景技术
众所周知，作为丹氏颗粒的HBV是一种直径约为42nm的球形颗粒，由外包膜和核衣壳组成。包裹核衣壳的外包膜含有大量乙型肝炎表面抗原，含有大约180个乙型肝炎核心蛋白亚基的核衣壳包括多种基因，它们编码HBV蛋白、聚合酶等(Summers et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.72：4579，1975；Pierre Tiollais et al.，Science213：406-411，1981)。
HBV表面抗原的基因编码区包含三个阅读框内的起始位点，所有这些位点有共同的S-结构域末端的终止密码子。因此，HBV表面抗原可以分为三组：(i)仅包含S-结构域的小乙型肝炎病毒表面抗原(以下作“S-表面抗原”)；(ii)包含S-结构域和由55个氨基酸组成的前-S2的中乙型肝炎病毒表面抗原(以下作“M-表面抗原”)；以及(iii)包含S-结构域、前-S2和前-S1的大乙型肝炎病毒表面抗原(以下作“L-表面抗原”)。S-表面抗原占约总共表达的表面蛋白的80％或更多。
干扰素α和拉米夫定已经广泛用于治疗慢性肝炎(C.L.Lai和P.C.Wu，H.K.M.J.3：289-296，1997)。尽管干扰素表现出抗体内病毒的免疫反应，但是它毒性高。另一方面，作为核酸衍生物的拉米夫定通过抑制DNA聚合酶从而表现出抗病毒的活性。口服给药的拉米夫定制剂表现出高疗效，但长时间服用时，存在诱导耐受拉米夫定的突变体的高风险(Daryl T.Y.Lau et al，Hepatology 32：828-834，2000))))。此外，从人血清当中分离的抗-HBV的多克隆抗体已经用来预防由于肝脏移植以及垂直传播造成的HBV感染。然而，该抗体在如下方面也存在问题，即它的抗原特异性低，并且必须从人血中分离。
最近已经发展了一种使用抗HBV表面抗原的小鼠单克隆抗体的方法，以便解决上述问题，但是长时间使用，会产生抗小鼠单克隆抗体的人抗体(Dimaggio J.J.，et al.，Cancer Chemother.Biol.Response Modif.11：177-203，1990)。
为了克服小鼠单克隆抗体令人不满的性质，通过将除抗原结合位点以外的框架区替换为人抗体的区域，已发展了一种人源化抗体。目前用来制备该人源化抗体的方法包括如下步骤：选择编码人抗体的基因，该基因表现出和小鼠抗体的序列相似性最接近，通过CDR移植方法仅仅用人抗体的相应区域替换小鼠抗体的互补性决定区(CDR)。人源化抗体有降低体内免疫反应的优势(Riechmann et al.，Nature 332：323，1988；Nakatani et al.，Protein Engineering 7：435，1994)。但仅把CDR移植到人抗体上时，也经常削弱了其选择性和反应性(Carter P.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285-4289，1992)。
本发明人已努力克服了传统人源化抗体的该类问题，并且发展了一种抗HBV的S-表面抗原的新型人源化抗体，它保持了抗HBV S-表面抗原的小鼠单克隆抗体的抗体特异性，却使对小鼠单克隆抗体的免疫反应得以最小化。
发明内容
于是，本发明的一个目的是提供抗HBV的S-表面抗原的人源化抗体及其制备方法。
本发明的另一个目的是提供用于治疗HBV相关疾病的含有以人源化抗体作为有效成分的药物组合物。
根据本发明的一方面，提供了抗HBV的S-表面抗原的人源化抗体，该抗体包含：
a)在互补性决定区(CDR)具有SEQ ID NO：38至40的氨基酸序列的重链可变区；
b)在CDR具有SEQ ID NO：41至43的氨基酸序列的轻链可变区；
c)与人抗体重链恒定区相一致的重链恒定区；以及
d)与人抗体轻链恒定区相一致的轻链恒定区。
附图描述
从以下对本发明的描述并结合附图，使得本发明上述以及其他目的和特征显而易见，附图分别如下：
图1：抗HBV的S-表面抗原的小鼠单克隆抗体A9-11-5、人源化抗体HFW141以及人抗体亚型2(Hh2)的重链氨基酸序列；
图2：抗HBV的S-表面抗原的小鼠单克隆抗体A9-11-5、人源化抗体LFW22-31和LFW22-312以及人抗体亚型7(hV7)的轻链氨基酸序列；
图3：构建人源化抗体重链表达载体pHAB-HFW141 HF的程序；
图4：构建人源化抗体轻链表达载体pHAB-LFW22-31 LF和pHAB-LFW22-312LF的程序；
图5：由SDS-PAGE分析所确定的人源化抗体YH1110-13和YHB1110-15的表达模式；以及
泳道1：小鼠抗体，泳道2：YHB-1110-13
泳道3：YHB-1110-15
图6：人源化抗体YH1110-13和YHB1110-15抗HBV S-表面抗原的抗原结合亲和力。
具体实施方式
本发明公开了这样的人源化抗体，其重链可变区或轻链可变区的抗原结合位点、互补性决定区(CDR)来自小鼠单克隆抗体，抗体分子的框架区来自人抗体。优选地，该人源化抗体表现从7×107M-1到1×108M-1的抗原结合亲和力(Ka)。
本发明的人源化抗体可从小鼠单克隆抗体A9-11-5(登记号：KCTC 18020P和KCTC 18021P)根据CDR移植术制备，其中，小鼠单克隆抗体A9-11-5的重链可变区包含SEQ ID NOs：38至40的三个CDR区，轻链可变区包含SEQ ID NOs：41至43的三个CDR区。
首先，小鼠单克隆抗体A9-11-5的轻链和重链可变区的氨基酸序列与GeneBank数据库中人序列比较，并且选择出来的是人重链可变区亚型2(Hh2)，根据Kabat定义其与小鼠单克隆抗体A9-11-5重链具有最大序列相似性，以及人轻链可变区亚型7(7hV)或人Ig lambda生殖系V基因的V3，通过GeneBank Ig blast其与小鼠抗体A9-11-5轻链最相似(Kawasaki K.，et al.，Genome Res.，7：250-261，1997)。
可以使用如此选择的人基因作为模板扩增编码人源化抗体重链和轻链的基因。在此过程中，可以基于公知的遗传研究和抗体结构分析对每条编码人源化抗体重链和轻链的核苷酸序列进行修饰。此外，如果小鼠单克隆抗体的某些核苷酸序列编码的氨基酸残基影响抗原结合亲和力或者对于抗体结构有重要作用，那么它们将被保留下来而不替换序列(Kabat E.A.，et al.，D.H.H.S.91：3242，1991；Chothia C5 et al.，Nature342：877-883，1989；Gary M.，et al.，Protein Engineering 7：805-814，1994；LindaHarris and Bajorath，J.，Protein Science 4：306-310，1995)。
通过用人抗体的重链亚型2(Hh2)替换特异性识别HBV S-表面抗原的小鼠单克隆抗体A9-11-5的重链可变区中除抗原结合位点以外的框架区，可以制备编码人源化抗体重链可变区的基因。这种编码人源化抗体重链可变区的基因可以按如下步骤制备：以编码小鼠单克隆抗体A9-11-5重链的基因作为模板设计将小鼠单克隆抗体进行人源化的引物；用相应的引物进行PCR(聚合酶链式反应)；和用限制性内切酶和DNA连接酶将如此扩增的PCR产物彼此连接起来。按此制备的编码人源化抗体重链可变区的基因称为HFW141(SEQ ID NO：32)，它编码具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽(见图1)。
为了制备包括编码人源化重链可变区的基因在内的编码人源化抗体全长重链的基因，将基因HFW141***PCR载体中来制备表达载体pCR-HFW141。此时，优选在人源化抗体重链的前导序列之前***Kozak序列(Kozak，M.Nuc.Acids Res.15：8125-8148，1987)，并且将重链前导序列中有些密码子替换为显示在动物细胞中高频率使用的其他密码子，这将提高人源化抗体重链可变区(SEQ ID NO：1)的表达效率。从表达载体pCR-HFW141分离编码人源化抗体重链可变区的基因片段，然后将其***含有编码人抗体重链恒定区基因的表达载体pHAB-HC(登记号：KCTC10229BP；Korean Patent Laid-Open NO：2004-12266)中，从而获得人源化抗体重链的表达载体。按此制备的表达载体称为pHAB-HFW141 HF(登记号：KCTC10533BP)。编码人源化抗体全长重链的基因可以从重链表达载体pHAB-HFW141 HF分离，并将其称为HFW141 HF。
根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条款，用人源化重链表达载体pHAB-HFW141HF转化的大肠杆菌(E.coli)TOPl0F′转化子于2003年10月29日保藏于Korean Collection for Type Cultures(KCTC)(地址：KoreaResearch Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，Republic of Korea)，登记号为KCTC 10533BP。
通过用人抗体的轻链亚型7(hV7)或轻链lambda生殖系V3替换特异性识别HBV S-表面抗原的小鼠单克隆抗体A9-11-5的轻链可变区中除抗原结合位点以外的框架区，可以制备编码人源化抗体轻链可变区的基因。这种编码人源化抗体轻链可变区的基因可以按如下步骤制备：以编码小鼠单克隆抗体A9-11-5轻链的基因作为模板设计将小鼠单克隆抗体进行人源化的引物；用相应的引物进行PCR；以及用限制性内切酶和DNA连接酶将如此扩增的PCR产物彼此连接起来。每条按此制备的编码人源化抗体轻链可变区的基因分别称为LFW22-31(SEQ ID NO：33)和LFW22-312(SEQ ID NO：34)，它编码具有SEQ ID No：36和37的核苷酸序列的多肽(见图2)。
为了制备包括编码人源化轻链可变区的基因在内的编码人源化抗体全长轻链的基因，将基因LFW22-31或LFW22-312***PCR载体中来制备表达载体pCR-LFW22-31或pCR-LFW22-312。此时，优选在人源化抗体轻链的前导序列之前***Kozak序列(Kozak，M.Nuc.Acids Res.15：8125-8148，1987)，并且将轻链前导序列中有些密码子替换为显示在动物细胞中高频率使用的其他密码子，这将提高人源化抗体轻链可变区(SEQ ID NO：13)的表达效率。从表达载体pCR-LFW22-31或pCR-LFW22-312分离编码人源化抗体轻链可变区的基因片段，然后将其***含有编码人抗体轻链恒定区基因的表达载体pHAB-LC(登记号：KCTC 10231BP；KoreanPatent Laid-Open NO：2004-12267)中，从而获得人源化抗体轻链的表达载体。每个按此构建的表达载体称为pHAB-LFW22-31 LF(登记号：KCTC 10532BP)和pHAB-LFW22-312 LF(登记号：KCTC 10553BP)。编码全长人源化轻链的基因可以自轻链表达载体pHAB-LFW22-31 LF和pHAB-LFW22-312 LF分离，并分别称为LFW22-31 LF和LFW22-312 LF。
根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条款，用人源化轻链表达载体pHAB-LFW22-31 LF和pHAB-LFW22-312 LF转化的大肠杆菌TOPl0F′转化子分别于2003年10月29日和2003年11月25日保藏于Korean Collection forType Cultures(KCTC)(地址：Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，Republic ofKorea)，登记号分别为KCTC 10532BP和10553BP。
可通过使用合适的转化溶液如GenePORTER用人源化重链表达载体pHAB-HFW141 HF和人源化轻链表达载体pHAB-LFW22-31 LF转化CHO细胞系，从而获得产生特异性识别HBV S-表面抗原的人源化抗体的转化子，该转化子已被称为CHO-YHB1110-13。此外，根据上述同样方法，可用人源化重链表达载体pHAB-HFW141 HF和人源化轻链表达载体pHAB-LFW22-312 LF制备另一个转化子，其已被称为CHO-YHB1110-15。
为了从转化子细胞系中纯化本发明的人源化抗体，可以在合适的培养基中培养转化子CHO-YHB1110-13或CHO-YHB1110-15，可以将培养上清液使用Protein-A(Amersham Bioscience，Sweden)或羊抗人免疫球蛋白G(Zymed Laboratories Inc.，USA)进行柱层析。按此纯化的人源化抗体分别称为YHB1110-13和YHB1110-15。
特异性识别HBV S-表面抗原的人源化抗体YHB1110-13和YHB1110-15表现出从6×107到5×108M-1范围的抗原结合亲和力，这证明本发明的人源化抗体保持了和先前报道的小鼠单克隆抗体相似的抗原结合活性，但却表现出显著降低的免疫原性，因此，可以有效用于治疗HBV相关疾病，而不会面临不利的副作用。
为此，本发明的人源化抗体可用作治疗HBV相关疾病的药物组合物的有效成分。药物组合物可以配制成口服或非口服剂型，用于立即或长时释放。该组合物可以含有药物制剂中常用的无活性成分，如稀释剂、填充剂、崩解剂、增甜剂、润滑剂以及矫味剂。优选将药物组合物配制成静脉给药，经快速浓注或持续滴注，或者配制成可以从植入胶囊中释放。静脉给药的典型制剂用生理盐水作为稀释剂。
配制抗体用于治疗性施用被认为是公知技术。
患者群体的剂量取决于所用的特定抗体、体重、年龄、性别、健康状态、饮食、给药时间和组合物的制剂、给药途径以及待治疗的疾病。典型剂量是0.01mg/kg/天至1,000mg/kg/天。更典型地，剂量是0.1mg/kg/天至10mg/kg/天。
本发明的组合物也可包括印刷品，其描述可作为治疗剂施用抗体的临床适应症、用药量以及用法、和/或本发明抗体向患者给药的禁忌症。
以下实施例旨在进一步说明本发明，而不应受限于此范围。
实施例1：编码人源化抗体重链可变区基因的构建
用编码抗HBV S-表面抗原的小鼠单克隆抗体A9-11-5(Accession NOs：KCTC18020P和KCTC 18021P)重链可变区的基因作为模板以及SEQ ID NO：1和12的引物对进行PCR，来扩增携带有前导序列的编码人源化抗体重链可变区的基因A。扩增的PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，并用QIAgel提取试剂盒(Qiagen，USA)将其从凝胶中回收。
按此纯化的基因A用SEQ ID NO：1和3或SEQ ID NO：2和12的引物对进行PCR。每个扩增的PCR产物用StuI(BioLabs Inc.，USA)在37℃下消化2小时，之后用T4DNA连接酶(BioLabs Inc，USA)在室温下处理1小时，制备编码重链可变区的基因B。
用基因B作为模板以及SEQ ID NO：4和12或SEQ ID NO：1和5的引物对进行PCR。每个扩增的PCR产物用PstI(BioLabs Inc.，USA)在37℃下消化2小时，之后用T4 DNA连接酶(BioLabs Inc，USA)在室温下处理1小时，制备编码重链可变区的基因C。
按上述同样方式，用SEQ ID NO：6和12或SEQ ID NO：1和7的引物对基因C进行PCR，按此扩增的PCR产物用SalI(BioLabs Inc.，USA)处理，获得编码重链可变区的基因D。用SEQ ID NO：8和12或SEQ ID NO：1和9的引物对基因D进行PCR，按此扩增的PCR产物用DraI(BioLabs Inc.，USA)处理，获得编码重链可变区的基因E。用基因E作为模板以及SEQ ID NO：10和12或SEQ ID NO：1和11的引物对进行PCR。每个PCR产物用XbaI(BioLabs Inc.，USA)在37℃下消化2小时，之后用T4DNA连接酶(BioLabs Inc，USA)在室温下处理1小时，获得编码重链可变区的基因A9V7FW42HV。
用基因A9V7FW42HV作为模板以及SEQ ID NO：23和25或SEQ ID NO：1和24的引物对根据表1所述条件进行PCR。两个PCR产物按等摩尔比混合，用SEQ IDNO：1和25的引物对对混合物进行搭桥PCR。PCR热循环重复30次，每个循环由如下步骤组成：95℃持续2分钟，58℃持续2分钟以及72℃持续2分钟。将按此扩增的编码人源化抗体重链可变区的最终基因称为HFW141。
引物的核苷酸序列以及每次PCR反应所用的反应条件如表1所示。
在95℃下起始变性5分钟后，在下表1所示条件重复30个循环进行每次PCR反应，最后在72℃下延伸10分钟。
<表1>
Figure G200580011182120061019D000091
实施例2：人源化抗体全长重链基因及其表达载体的构建
为了提高编码人源化抗体重链可变区基因的表达效率，将引物设计成把Kozak序列(Kozak，M.Nuc.Acids Res.15：8125-8148，1987)***到人源化抗体重链前导序列之前，并将编码重链前导序列第四个氨基酸亮氨酸的密码子TTA替换为动物细胞中偏好使用的CTG。经过修饰的人源化抗体重链前导序列如表2所示。
<表2>
引物   序列
小鼠重链前导序列   CGAC ATG GCT GTC TTA TTC CTG CTC CTC TGC CTGM   A  V  L  F   L  L  L   C   L
人源化重链前导序列(SEQ ID NO：1) CACC ATG GCT GTC CTG TTC CTG CTC CTC TGC CTGM  A   V   L  F  L   L  L   C  L
将实施例1制备的编码人源化抗体重链可变区的基因HFW141克隆到PCR载体中，获得表达载体pCR-HFW141。
此外，为了构建编码人源化全长重链的基因，使用含有编码人抗体重链恒定区基因的表达载体pHAB-HC(KCTC 10229BP，Korean Patent Laid-Open NO：2004-12266)。首先，为了将编码人源化抗体重链可变区的基因HFW141***表达载体pHAB-HC中，用HindIII/ApaI(BioLabs，Inc.，USA)在37℃下将表达载体pCR-HFW141处理两小时，在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，溴化乙锭(EtBr)染色，获得约450bp的该基因片段。
按上述同样方式，用HindIII/ApaI处理表达载体pHAB-HC获得约6.5kb的载体片段。此后，每个基因片段用QIAgel提取试剂盒(Qiagen，USA)从凝胶中回收，将其用T4 DNA连接酶(BioLabs Inc，USA)在16℃下处理过夜，并转化入大肠杆菌TOPl0F′中，从而获得转化子。在添加有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上将转化子培养过夜，从培养基中分离质粒。用HindIII/ApaI处理分离的质粒并在琼脂糖凝胶上进行电泳，从而获得约1.4kb人源化抗体的全长重链。
按此制备的人源化抗体全长重链称为HFW141 HF。此外，***有人源化抗体全长重链HFW141 HF的人源化抗体重链表达载体称为pHAB-HFW141 HF(图3)，将其转化入大肠杆菌TOPl0F′，获得转化子，该转化子于2003年10月29日保藏到Korean Collection for Type Cultures(KCTC)(地址：Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，Republic of Korea)，登记号为KCTC 10533BP。
实施例3：编码人源化抗体轻链可变区基因的构建
用编码特异性识别HBV S-表面抗原的小鼠单克隆抗体A9-11-5轻链可变区的基因作为模板以及SEQ ID NO：13和22的引物对进行PCR，来扩增含有前导序列的编码人源化抗体轻链可变区的基因A’。基因A’在琼脂糖凝胶上进行电泳，EtBr染色，用QIAgel提取试剂盒(Qiagen，USA)将其从凝胶中回收。
纯化的基因A’用SEQ ID NO：14和22的引物对或SEQ ID NO：13和15的引物对进行PCR。扩增的PCR产物用KpnI(BioLabs Inc.，USA)在37℃下消化2小时，并用T4 DNA连接酶(BioLabs Inc，USA)在室温下处理1小时，获得编码轻链可变区的基因B’。
用基因B’作为模板以及SEQ ID NO：16和22的引物对或SEQ ID NO：13和17的引物对进行PCR。扩增的PCR产物用MscI(BioLabs Inc.，USA)在37℃下消化2小时，并用T4 DNA连接酶(BioLabs Inc，USA)在室温下处理1小时，获得编码轻链可变区的基因C’。
按上述同样方式，用SEQ ID NO：18和22的引物对或SEQ ID NO：13和19的引物对基因C’进行PCR，按此扩增的PCR产物用ApaLI(BioLabs Inc.，USA)消化，以便获得编码轻链可变区的基因D’。此外，用基因D’作为引物以及SEQ ID NO：20和22的引物对或SEQ ID NO：13和21的引物对进行PCR之后，按此扩增的PCR产物用SmaI(BioLabs Inc.，USA)消化，并用T4 DNA连接酶(BioLabs Inc，USA)在室温下处理1小时，获得编码轻链可变区的基因A9V7LV。
用基因A9V7LV作为模板以及SEQ ID NO：26和22或SEQ ID NO：13和27的引物对根据表3所述条件进行PCR。两种PCR产物按等摩尔比混合，用SEQ ID NO：13和22的引物对对混合物进行搭桥PCR。PCR热循环重复30次，每个循环由如下步骤组成：95℃持续2分钟，58℃持续2分钟以及72℃持续2分钟。将按此扩增的编码人源化抗体轻链可变区的基因称为LFW22。
按上述同样方式，用基因LFW22作为模板以及SEQ ID NO：28和22或SEQ IDNO：13和29的引物对根据表3所述条件进行PCR。两种PCR产物按等摩尔比混合，用SEQ ID NO：13和22的引物对对混合物进行搭桥PCR。PCR热循环重复30次，每个循环由如下步骤组成：95℃持续2分钟，58℃持续2分钟以及72℃持续2分钟。将按此扩增的编码人源化抗体轻链可变区的最终基因称为LFW22-31。
按上述同样方式，用基因LFW22-31作为模板以及SEQ ID NO：30和22或SEQID NO：13和31的引物对根据表3所述条件进行PCR。两种PCR产物按等摩尔比混合，用SEQ ID NO：13和22的引物对对混合物进行搭桥PCR。PCR热循环重复30次，每个循环由如下步骤组成：95℃持续2分钟，58℃持续2分钟以及72℃持续2分钟。将按此扩增的编码人源化抗体轻链可变区的最终基因称为LFW22-312。
引物的核苷酸序列以及上述PCR反应所用反应条件如表3所述。
95℃下起始变性5分钟后，在表3所示的30个循环条件下进行每次PCR反应，最后在72℃下延伸10分钟。
<表3>
实施例4：人源化抗体全长轻链基因及其表达载体的构建
为了增强编码人源化抗体轻链可变区基因的表达，将引物设计成把Kozak序列***到人源化抗体轻链前导序列之前(Kozak，M.Nuc.Acids Res.15：8125-8148，1987)，并将编码轻链前导序列的基因的核苷酸序列中第八个氨基酸苯丙氨酸替换为动物细胞中偏好使用的亮氨酸。此外，将编码第六个亮氨酸的CTT替换为CTG，将编码第七个异亮氨酸的ATA替换为ATC。经过修饰的人源化抗体轻链前导序列如表4所示。
<表4>
  引物   序列
  小鼠轻链前导序列   TTC ATG GCC TGG ATT TCA CTT ATA TTC TCTCTC CTGM  A  W  I  S  L I  F  S L  L
  人源化轻链前导序列(SEQ ID NO：13)   CACC ATG GCC TGG ATT TCA CTG ATC CTC TCTCTC CTGM   A  W  I  S  L I L  S  L L
将实施例3制备的编码人源化抗体轻链可变区的基因LFW22-31***PCR载体中，获得表达载体pCR-LFW22-31。
此外，为了制备人源化抗体的全长轻链，使用含有编码人抗体轻链恒定区基因的表达载体pHAB-LC(KCTC 10231BP，Korean Patent Laid-Open NO：2004-12267)。
首先，为了将编码人源化抗体轻链可变区的基因LFW22-31***表达载体pHAB-LC中，用HindIII/AvrII在37℃下将表达载体pCR-LFW22-31处理两小时，在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，EtBr染色，获得约400bp的基因片段。
按上述同样方式，用HindIII/AvrII处理表达载体pHAB-LC获得约6.5kb的载体片段。每个基因片段用QIAgel提取试剂盒(Qiagen，USA)从凝胶中回收，并用T4 DNA连接酶(BioLabs Inc，USA)在16℃下处理过夜，之后转化到大肠杆菌TOPl0F′中获得转化子。在添加有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上将转化子培养过夜，从培养溶液中分离质粒。用HindIII/NotI(BioLabs，Inc.，USA)处理分离的质粒，在琼脂糖凝胶上进行电泳，从而获得约0.7kb人源化抗体的全长轻链。
按此制备的编码人源化抗体的全长轻链的基因称为LFW22-31 LF。此外，含有基因LFW22-31 LF的人源化抗体轻链表达载体称为pHAB LFW22-31 LF(图4)，将其转化入大肠杆菌TOPl0F′获得转化子，该转化子于2003年10月29日保藏于Korean Collection for Type Cultures(KCTC)(地址：Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，Republic of Korea)，登记号为KCTC 10532BP。
根据上述相同方法，用基因LFW22-312制备人源化抗体的另一个全长轻链，称为LFW22-312 LF。此外，含有基因LFW22-312 LF的人源化抗体轻链表达载体称为pHAB LFW22-312 LF(图4)，将其转化入大肠杆菌TOPl0F′获得转化子，该转化子于2003年11月25日保藏于Korean Collection for Type Cultures(KCTC)(地址：Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，Republic ofKorea)，登记号为KCTC 10553BP。
实施例5：人源化抗体转化入CHO细胞系
为了测量人源化抗体在动物细胞中活性，将实施例2制备的重链表达载体pHAB-HFW141 HF以及实施例4制备的轻链表达载体pHAB-LFW22-31 LF转化到CHO细胞(ATCC CRL-9096，USA)中。
首先，在增湿CO2培养箱中，在添加有1.5g/l碳酸氢钠(Sigma，USA)和10％热灭活FBS(Gibco BRL，USA)的DMEM/F12培养基(JRH Inc.，USA)中37℃下培养CHO细胞2到3天。将培养溶液在1,200rpm下室温(25℃)离心5分钟，收获细胞沉淀。用0.4％台盼蓝(Gibco BRL，USA)给细胞染色，用血细胞计数器计数。将细胞按照约6×106个细胞的量转移到T-225培养瓶(或T-75培养瓶)中进行传代培养。
传代培养的CHO细胞继续增殖，直到它们大约覆盖了培养瓶表面的60到90％。10μg待转化基因和40μl GenePORTER转化溶液(GTS，USA)与5ml DMEM/F12(无血清)培养基相混合。混合物置于室温10到45分钟后，从中移除培养基，增殖细胞在增湿CO2培养箱中37℃下培养3到5天来获得转化子，将其称为CHO-YHB1110-13。
根据上述相同方法，将实施例2制备的重链表达载体pHAB-HFW141 HF以及实施例4制备的轻链表达载体pHAB-LFW22-312 LF转化到CHO细胞中，获得另一个转化子，将其称为CHO-YHB1110-15。
实施例6：人源化抗体的纯化
将实施例5获得的转化子CHO-YHB 1110-13细胞按照2×106个细胞的量接种到含有DMEM/F12培养基的T-75培养瓶中，其中DMEM/F12培养基中添加有10％胎牛血清，37℃下孵育5小时。离心培养溶液分离出上清，过滤上清获得无细胞的培养溶液。
为了从培养溶液中纯化人源化抗体，使用偶联有Protein-A以及羊抗人免疫球蛋白G(Zymed Laboratories Inc.，USA)的sepharose 4B柱(Pharmacia)。培养上清上样到偶联有Protein-A的sepharose 4B柱层析中，让人源化抗体和Protein-A结合，将甘氨酸缓冲液(pH 2.5)引入柱中，洗脱人源化抗体。然后，按照1∶10的体积比与1M Tris-Cl(pH 8.0)相混合来中和洗脱液。被中和的洗脱液上样到偶联有羊抗人IgG的sepharose 4B柱层析中来特异性捕获人源化抗体蛋白。
根据上述用Protein-A柱层析相同的方法对人源化抗体进一步纯化，并称为YHB1110-13。
根据上述相同方法，通过培养实施例5制备的转化子CHO-YHB1110-15，并从培养上清中纯化抗体，获得纯化的人源化抗体YHB1110-15。
用SDS-PAGE分析纯化的人源化抗体的结果为，观察到了大小约50kDa和约25kDa的带，分别被鉴定为人源化抗体重链和轻链(图5)。
实施例7：测量抗HBV S-表面抗原的人源化抗体的抗原结合亲和力
用夹心ELISA对实施例6纯化的人源化抗体进行定量，用S-表面抗原(International Enzyme Inc.，USA)adr型分析其抗原结合活性。为了定量抗体，100ng羊抗人免疫球蛋白G.A.M(Zymed Laboratories Inc.，USA)分配到微量培养板(Dynatech Laboratories Inc.，USA)每个孔中，孔板置于4℃下过夜，用此免疫球蛋白包被。此时，小鼠单克隆抗体A9-11-5用作对照。
为了测量抗HBV S-表面抗原的人源化抗体的抗原结合亲和力，浓度从10-11到10-6M不等的抗原溶液(各100μl)分别和5ng小鼠单克隆抗体A9-11-5、人源化抗体YHB1110-13以及人源化抗体YHB1110-15相混合，37℃下反应1小时。每份反应物加入到包被有0.5μg抗原的孔板中，孔板置于37℃下约2小时。偶联辣根过氧化物酶的羊抗人多克隆抗体(BioRad，USA)按照1∶1000的比例稀释，将100μl稀释的抗体溶液加入到每个孔中。孔板置于37℃下约1小时。反应完成后，用辣根过氧化物酶底物试剂盒(BioRad，USA)测量各孔吸光度。
根据测量的吸光度计算与抗原结合的抗体以及未结合抗体的浓度，从而确定人源化抗体的抗原结合亲和力(Friguet，et al.，J.Immunol.Meth.77：305-319，1985)。结果如表5所示。
<表5>
  抗原   小鼠抗体mA9-11-5   人源化抗体YHB1110-13   人源化抗体YHB1110-15
  抗原结合亲和力(Ka)   1×108M-1   1×108M-1   7×107M-1
由表5可见，人源化抗体YHB1110-13和YHB1110-15的抗原结合亲和力与小鼠单克隆抗体A9-11-5的相似(图6)。
尽管已经结合上述具体实施方案描述了本发明，但必须意识到本领域技术人员可以对发明进行各种修饰和改变，这些同样落在权利要求限定的发明范围内。
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Claims (10)

1.抗乙型肝炎病毒(HBV)S-表面抗原的人源化抗体，其包含：
a)其氨基酸序列为SEQ ID NO：35的重链可变区；
b)其氨基酸序列为SEQ ID NO：36或37的轻链可变区；
c)与以登记号KCTC10533BP保藏的大肠杆菌中的重链恒定区相一致的重链恒定区；以及
d)与以登记号KCTC 10532BP或KCTC 10553BP保藏的大肠杆菌中的轻链恒定区相一致的轻链恒定区。
2.权利要求1的人源化抗体，其中重链可变区由其核苷酸序列为SEQ ID NO：32的多核苷酸所编码。
3.权利要求1的人源化抗体，其中轻链可变区由其核苷酸序列为SEQ ID NO：33或34的多核苷酸所编码。
4.乙型肝炎病毒S-表面抗原特异性人源化抗体的重链可变区的表达载体，其包含编码SEQ ID NO：35的重链可变区的多核苷酸。
5.权利要求4的表达载体，其是pHAB-HFW141HF，其中所述载体可以分离自保藏号为KCTC10533BP的大肠杆菌。
6.乙型肝炎病毒S-表面抗原特异性人源化抗体的轻链可变区的表达载体，其包含编码SEQ ID NO：36或37的轻链可变区的多核苷酸。
7.权利要求6的表达载体，其是pHAB-LFW22-31LF或pHAB-LFW22-312LF，其中所述载体分别可以分离自以登记号KCTC 10532BP或KCTC 10553BP保藏的大肠杆菌。
8.用权利要求4或权利要求6的表达载体转化的大肠杆菌细胞。
9.权利要求8的大肠杆菌细胞，其是登记号为KCTC10533BP的TOP10F’/pHAB-HFW141HF、登记号为KCTC  10532BP的TOP10F’/pHAB-LFW22-31LF、或登记号为KCTC 10553BP的TOP10F’/pHAB-LFW22-312LF。
10.包含权利要求1到3中任一项的人源化抗体的用于治疗乙型肝炎病毒相关疾病的药物组合物。
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