KR100189699B1 - Hbv 항원단백질을 발현하는 키메라 폴리오바이러스백신벡터를 이용한 면역화 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리오바이러스의 전체 cDNA 유전자 중에서 VP2 및 VP3 코딩부위가 제거된 위치에 2A 올리고펩타이드 코딩 유전자 및 HBV의 표면항원 단백질 유전자를 가지며, HBV의 표면항원 단백질을 발현하는 키메라 폴리오-HBV 백신벡터 및 그를 이용한 포유동물의 면역화 방법을 제공한다.
본 발명의 백신벡터는 폴리오바이러스 백신의 많은 장점을 보존하고 있는 폴리오-HBV 키메라 바이러스를 생산하며, 이때 HBV의 표면항원 단백질이 지속적으로 발현됨을 확인하였다. 또한, 전기 폴리오-HBV 키메라 바이러스를 포유동물에 투여하면, HBV 표면항원 단백질에 특이적인 체액성 또는 세포성 면역이 유도되어, HBV의 감염으로 부터 동물을 면역화시킬 수 있다.

Description

HBV 항원단백질을 발현하는 키메라 폴리오바이러스 백신벡터를 이용한 면역화 방법
본 발명은 HBV 항원단백질을 발현하는 키메라 폴리오바이러스(chimeric poliovirus) 백신벡터를 이용한 면역화 방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 폴리오바이러스의 전체 cDNA 유전자 중에서 VP2 및 VP3 코딩부위가 제거된 위치에 2A 올리고펩타이드 코딩 유전자 및 HBV의 항원단백질 유전자를 가지며, HBV의 항원단백질을 발현하는 키메라 폴리오-HBV 백신벡터 및 그를 이용하여 포유동물을 면역화시키는 방법에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스(HBV)에 감염된 성인 환자의 약 5 내지 10%, 영아의 경우는 80%가 만성감염으로 진전한다고 알려져 있다. 현재, 전세계적으로 3억의 HBV 보균자가 추정되고 있고, 감염병에 의한 사망원인 중 말라리아 다음으로 사망율이 높다. HBV에 감염되면, 전신쇠약감, 피로감, 식욕감퇴 등의 초기증상이 나타나고, 담마진, 관절통, 관절염 등을 거쳐 간염, 간암으로 발전한다.
현재 우리나라의 간염환자는 범 국민적 백신접종의 결과로 최근 몇 년 사이 8 내지 12%에서 4 내지 5%로 줄어들었다고는 하나, 완전 퇴치는 아직 요원한 실정이다. 또한, 구미각국에서의 HBV 보균율도 0.1% 내지 1%로 비교적 낮으나, 아직까지 완전퇴치에 이르지 못하고 있다.
따라서, 천연두 바이러스에 이어 세계 두번째로 그의 박멸이 예측되고 있는 약독화 폴리오바이러스를 HBV 항원들의 운반체(carrier)로 개발할 수 있다면, 폴리오바이러스가 가진 여러가지 장점 중, 경구투여에 의해 국부적인 세포내 저장성(local cellular resistance)과 혈액내에 순환성 항체(circulating antibody)가 유도되는 점 및 예방접종을 받은 사람과의 접촉으로 면역반응이 이전될 수 있어 바이러스의 박멸이 가능한 점을 HBV 감염의 예방 및 치료에 충분히 이용할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 자가 가수분해 펩타이드(autoproteolytic peptide)인 2A 올리고펩타이드의 유전자 및 클로닝부위를 폴리오바이러스 유전자 VP2 및 VP3가 결실된 위치에 도입시켜 기본벡터를 제조하고(참조: 동일자 출원하는 '2A 올리고펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 키메라 폴리오바이러스 백신벡터') 여기에 HBV의 표면항원 단백질 유전자를 삽입하여 제조한 키메라 폴리오-HBV 백신벡터가 HBV 항원단백질을 발현하여 포유동물 내에서 그에 대한 항체를 생성함을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 HBV의 표면항원 단백질을 발현하는 키메라 폴리오-HBV 백신벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 키메라 폴리오-HBV 백신벡터를 이용하여 HBV의 감염으로 부터 포유동물을 면역화시키는 방법을 제공하는 것이다.
제 1도는 재조합 벡터 pPS의 유전자 위치를 개략적으로 나타낸 그림이다.
제 2도는 폴리오-HBV 키메라 바이러스의 계대배양에 따라 HBV 표면 항원단백질의 발현을 ELISA로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
제 3도는 폴리오-HBV 키메라 바이러스를 Balb/C 마우스에 접종하여 HBV 표면 항원단백질에 대한 항체생성을 ELISA로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명자들은 폴리오바이러스 유전자 중 VP2 및 VP3 코딩부위의 제거 위치에 2A 올리고펩타이드 코딩 유전자 및 HBV의 표면항원 유전자인 S유전자를 클로닝하여, 키메라 폴리오-HBV 벡터 pPS를 제조하였다.
한편, 폴리오바이러스의 P1 유전자를 포함하는 pGRE-EBV-P1으로 Vero세포를 형질 전환시키고, 하이그로마이신(hygromycin)으로의 선별과정 및 덱사메타손(dexa-
methasone)으로의 발현 유도과정을 거쳐, 폴리오바이러스의 P1 산물을 생성하는 Vero/P1 세포주를 최종 선별하였다.
그런 다음, 폴리오-HBV 키메라 바이러스를 제조하기 위하여, 상기 재조합 벡터 pPS로 부터 RNA를 제조하고, 그를 Vero/P1 세포주에 감염시켰다(참조: '2A 올리고펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 키메라 폴리오바이러스 백신벡터').
이렇게 제조된 폴리오-HBV 키메라 바이러스는 폴리오바이러스 백신의 많은 장점을 보존하고 있으며, HBV의 표면항원 단백질을 지속적으로 발현함을 확인하였다. 또한, 전기 재조합 폴리오바이러스를 마우스에 면역시킨 결과, HBV표면항원 단백질에 특이적인 항체를 생성함을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 폴리오-HBV 키메라 바이러스를 포유동물에 투여하면, 체액성 또는 세포성 면역이 유도되어 HBV의 감염으로 부터 동물을 면역화시킬 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 키메라 폴리오-HBV 벡터 및 그로 부터 재조합 바이러스의 제조
폴리오바이러스의 전체 cDNA 유전자 중에서 P1 산물인 VP2 및 VP3 코딩부위를 제거하고, 외부 유전자의 서브클로닝을 위한 클로닝부위 및 FMOV 2A 올리고펩타이드 코딩 유전자를 삽입하여 기본벡터 pP2A(KFCC-10904)를 제조하였다. 이어, 기본벡터 pP2A를 제한효소 Smal으로 절단하고, HBV 전체 유전자를 포함하고 있는 pHBV156((주)녹십자, 대한민국)으로 부터 PCR하여 얻은 HBV S 항원유전자를 클로닝하여, pPS의 재조합 벡터를 제조하였다. 재조합 벡터 pPS의 유전자 위치지를 개략적으로 제 1도에 나타내었다.
재조합-벡터 pPS는 대장균(Escherichia coli) Top1OF'에 도입되어 1996년 6월 21일 국제기탁기관인 사단법인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터(KFCC)에 기탁번호 KFCC-1O905로 기탁되었다.
한편, 폴리오바이러스의 P1 산물을 생성하는 패키징 세포주를 제조하기 위하여, 폴리오바이러스의 P1 유전자를 포함하는 pGRE-EBV-P1으로 Vero 세포(ATCC CRL 6318)를 형질전환시킨 다음, 하이그로마이신(hygromycin)으로의 선별과정을 거쳐, pGRE-EBV-P1 벡터를 포함하는 Vero/P1 세포주를 최종 선별하였다. 이어, 덱사메타손(dexamethasone)으로 폴리오바이러스 P1 산물의 발현을 유도하여, Vero/P1 세포주에서 전기 P1 산물이 성공적으로 발현됨을 확인하였다.
재조합 폴리오바이러스를 제조하기 위하여, 재조합 벡터 pPS를 선형화시키고 그로 부터 RNA를 전사시킨 다음, Vero/P1 세포주에 감염시켜 폴리오-HBV 키메라 바이러스를 제조하였다. CPE(cytopathic effect) 및 HBV 유전자 분석을 통하여 안정한 재조합 바이러스를 확인하였다.
이상의 모든 일련의 과정은 동일자 특허출원하는 '2A 올리고펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 키메라 폴리오바이러스 백신벡터'에 따라 수행하였다.
실시예 2 : HBV 표면 단백질의 발현 확인
HBV 표면 단백질의 발현은 제네디아 에취비에스에이지 엘리자 3.0키트((주)녹십자, 대한민국)를 사용하여 ELISA 분석으로 확인하였다. 즉, 폴리오-HBV 키메라 바이러스로 감염된 Vero/P1 세포의 배양액을 100㎕ 취하고, 농축접합체액 25㎕와 혼합하여, 37℃에서 1시간 30분간 방치하였다. 이어, 1× PBS로 5회 세척하고 기질 완충용액 100㎕를 첨가하여 상온에서 1시간 방치한 다음, 반응을 종결시켰다. ELISA 판독기로 45Onm에서의 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 제 2도에 나타내었다. 이때, 대조군은 재조합 벡터 pPS 대신에 기본벡터 pP2A를 감염시킨 세포주로 하였는데, O.D값은 0.01이었다.
제 2도에서 보듯이, 폴리오-HBV 키메라 바이러스는 15계대까지 지속적으로 HBV의 표면 단백질을 발현함을 알 수 있었다. 도면에 나타나 있지 않지만 30여 계대 후에도 계속 HBV의 표면 단백질이 발현되는 것으로 확인되었다.
실시예 3 : 폴리오-HBV 키메라 바이러스의 면역성 확인
Vero/P1 세포를 10% FBS 함유 DMEM 배지(Gibco-BRL, USA)에서 5% CO2, 37℃의 조건으로 T-플라스크 또는 페트리디쉬에 고착시켜 배양하였다. T-플라스크에 1.5×107의 세포농도가 될 때까지 세포를 배양하고 배지를 제거한 다음, 폴리오-HBV 키메라 바이러스를 10MOI의 농도로 접종하였다. 1시간 동안 5% CO2, 37℃에서 방치하고 바이러스를 제거하여,10% FBS 및 항생물질을 함유한 새로운 DMEM 배지 1.5㎖로 교환하여 12시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 폴리오-HBV 키메라 바이러스로 감염된 Vero/P1 세포를 60시간 동안 5% CO2, 37℃에서 배양하고, 동결-융해(freezing-thawing)를 반복하여 5,000 × g에서 원심분리하고 상층액을 취한 다음, 다시 50,000 x g에서 원심분리하여 침전물을 수득하고, 이를 TE 완충용액에 현탁시켰다.
상기에서 현탁된 바이러스는 6주령의 Balb/c 마우스에 마리당 1 × 106pfu의 농도로 근육접종하였다. 이 때, 재조합 바이러스와 CFA(complete Freund's adjuvant), IFA(incomplete Freund's adjuvant)를 각각 50:50(v/v)의 비율로 혼합하여 2주간격으로 3회 접종하였다. 각각의 면역시 안구(eye)에서 채취한 혈액으로 실시예 2-2에서와 같이 ELISA 분석하여, HBV 표면 항원단백질에 대한 항체 생성을 알아보았다(참조: 제 3도). 제 3도에서, PBS는 PBS(phosphate buffered saline)를 접종한 경우, CFA는 재조합 바이러스 및 CFA를 접종한 경우, IFA는 재조합 바이러스 및 IFA를 접종한 경우, W/O는 재조합 바이러스를 애쥬번트없이 접종한 경우를 각각 나타낸다.
제 3도에서 보듯이, CFA 또는 IFA과 혼합접종된 폴리오-HBV 키메라 바이러스는 HBV 표면 항원단백질에 대한 항체를 생성함을 알 수 있었다. 따라서, 키메라 폴리오-HBV 벡터는 소아마비 뿐만 아니라 B형 간염을 예방 및 치료하는 백신으로 사용될 수 있음을 확인하였다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 폴리오바이러스의 전체 cDNA 유전자 중에서 VP2 및 VP3 코딩부위가 제거된 위치에 2A 올리고펩타이드 코딩 유전자 및 HBV의 표면항원 단백질 유전자를 가지며, HBV의 표면항원 단백질을 발현하는 키메라 폴리오-HBV 백신벡터 및 그를 이용한 포유동물의 면역화 방법을 제공한다. 본 발명의 백신벡터는 폴리오바이러스 백신의 많은 장점을 보존하고 있는 폴리오-HBV 키메라 바이러스를 생산하며, 이때 HBV의 표면항원 단백질이 지속적으로 발현됨을 확인하였다. 또한, 전기 폴리오-HBV 키메라 바이러스를 포유동물에 투여하면, HBV 표면항원 단백질에 특이적인 체액성 또는 세포성 면역이 유도되어, HBV의 감염으로 부터 동물을 면역화시킬 수 있다.

Claims (2)

  1. 폴리오바이러스의 전체 cDNA 유전자 중에서 VP2 및 VP3 코딩부위가 제거된 위치에, 2A 올리고펩타이드 코딩 유전자 및 226개 아미노산으로 구성된 HBV 표면항원 단백질의 유전자를 가지며, HBV의 항원단백질을 발현하는 키메라 폴리오-HBV 백신벡터 pPS(KFCC-10905).
  2. 제1항의 키메라 폴리오-HBV 백신벡터 pPS(KFCC-10905)의 RNA를 세포주에 감염시켜 증식시킨 폴리오-HBV 키메라 바이러스를, 인간을 제외한 포유동물에 감염시켜 체액성 또는 세포성 면역을 유도하는 단계를 포함하는, HBV의 감염으로부터 인간을 제의한 포유동물을 면역화시키는 방법.
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