CN1969189B

CN1969189B - 非特异性反应被抑制的可溶性白介素-2受体免疫学测定方法和试剂

Info

Publication number: CN1969189B
Application number: CN2005800195973A
Authority: CN
Inventors: 守田和树; 鹈泽耕治; 铃木惠美子
Original assignee: Kyowa Medex Co Ltd
Current assignee: Minaris Medical Co Ltd
Priority date: 2004-06-14
Filing date: 2005-06-14
Publication date: 2012-03-21
Anticipated expiration: 2025-06-14
Also published as: KR20070026576A; TW200604527A; CN1969189A; EP1767942A1; EP1767942A4; JP2011197014A; JP4866724B2; WO2005121795A1; JP5559747B2; JPWO2005121795A1; KR101233837B1

Abstract

一种非特异性反应被抑制的待测对象的免疫学定量方法，其包括下列步骤：在含水介质中让与待测对象特异性结合的第一抗体经酶标记后形成的酶标抗体与样品反应，由此形成酶标抗体与待测对象的免疫复合体，所述酶标抗体基本上只含有一种或多种选自第一抗体与酶之间的结合比率为1:1、1:2、1:3和2:1的酶标抗体的酶标抗体，以及测定免疫复合体的酶活性。

Description

非特异性反应被抑制的可溶性白介素-2受体免疫学测定方法和试剂

技术领域

本发明涉及非特异性反应被抑制的待测对象的免疫学定量方法、在非特异性反应被抑制的待测对象的免疫学定量方法中使用的试剂和待测对象的免疫学定量方法中抑制非特异性反应的方法。

背景技术

在待测对象的免疫学定量方法中，已证实常常会发生非特异性反应。抗原抗体反应中，非特异性反应种类多样，而特别是由人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody，以下简称HAMA)产生的非特异性反应成为问题。在HAMA中，有HAMA I型和HAMA II型两种，HAMA I型是在未接触鼠蛋白的人血液中产生的，HAMA II型是动物饲养员等与鼠接触者，或接受过鼠抗体等鼠蛋白的人产生的。一般的，已知HAMA在采用鼠抗体的免疫学定量方法中，是产生问题的非特异因子，由HAMA而给测定***带进误差，因而无法取得正确的测定数据。因此，在处理采用免疫学测定方法定量待测对象所获得的待测对象的定量数据中的不合理数据时，为了避免错误判断，要求开发能得到正确定量数据的方法。

在免疫学定量方法中，抑制HAMA所引起的非特异性反应的方法，已知有效方法是采用与用于免疫测定的抗体相同的动物种中的免疫球蛋白，或聚合的免疫球蛋白等(参见专利文献1，专利文献2，非专利文献1，非专利文献2和非专利文献3)。

此外，在抗原抗体反应中的非特异性反应中，还有由于与用作标记的酶发生反应的抗体引起的非特异性反应，已报道有使测定***中同时存在钝化的该酶未抑制非特异性反应的方法(参见专利文献3)。

白介素-2(以下记作IL-2)是由133个氨基酸构成的细胞因子，主要由CD4⁺、CD8⁺的T细胞产生，也可由自然杀伤细胞(NK细胞)产生。IL-2有多种生理活性，主要参与免疫***的激活。例如作为推进细胞周期进程的因子对T细胞、B细胞、NK细胞、LAK(淋巴活化杀伤细胞)、巨噬细胞、嗜中性粒细胞等起作用。

已知IL-2的受体(以下记作IL-2R)由α链、β链和γ链构成，α链的一部分从细胞上游离而以可溶性的白介素-2受体(以下记作sIL-2R)存在于血液中。已报道因为sIL-2R由活化的T细胞和B细胞产生，所以伴随着生物体内免疫防御机制的活化、T细胞类和B细胞类活化，血液中的sIL-2R会增加。有报告指出，由于慢性关节炎、***性红斑狼疮(SLE)等自身免疫性疾病，或病毒性肝炎、获得性免疫缺陷综合症(AIDS)等病毒感染症患者中，血清中sIL-2R浓度会增高，从而成为体内活化淋巴球的指标之一。同时，还知道肿瘤细胞会产生sIL-2R，成人T细胞白血病(ATL)或非霍奇金淋巴瘤的病程与血清中sIL-2R浓度的变化有良好的相关性。已经有各种免疫***疾病或病症的这类相关性的报告，所以可望把它作为造血性疾病的血液标记。血清中sIL-2R浓度可以作为成人T细胞白血病的病况监测指标等，以及作为非霍奇金淋巴瘤治疗效果判断、症状缓解后跟踪和复发的早期发现的指标等，有效应用于临床。

关于sIL-2R测定方法，迄今已有采用两种抗sIL-2R抗体的免疫学测定方法(参见专利文献4)、测定sIL-2R的试剂，相应的酶免疫测定试剂开发并投放市场，例如“无细胞-IL-2R”(山之内制药株式会社制)等。

专利文献1：特开昭61-65162号公报

专利文献2：特开平1-254869号公报

专利文献3：特开平5-188055号公报

专利文献4：特开昭62-70761号公报

非专利文献1：临床化学(Clinical Chemistry)，1999，第45卷， 942-956页

非专利文献2：癌免疫学免疫治疗(Cancer Immunological Immunotherapy)1991年，第33卷，80-84页

非专利文献3：临床化学(Clinical Chemistry)，1990，第36卷，1093页

发明内容

本发明的目的是提供在抑制了非特异性反应的免疫学定量待测对象的方法、以及抑制了非特异性反应的免疫学定量待测对象的方法中所采用的试剂和在免疫学定量待测对象的方法中的一种抑制非特异性反应的方法。

本发明涉及以下(1)～(35)项。

(1)一种非特异性反应被抑制的待测对象的免疫学定量方法，其包括下列步骤：在含水介质中让与待测对象特异性结合的第一抗体经酶标记后形成的酶标抗体与样品反应，由此形成酶标抗体与待测对象的免疫复合体，所述酶标抗体基本上只含有一种或多种选自第一抗体与酶之间的结合比率为1∶1、1∶2、1∶3和2∶1的酶标抗体的酶标抗体；以及测定免疫复合体的酶活性。

(2)如(1)项所述的免疫学定量方法，还包含下列步骤：让一种抗体与样品反应，由此与待测对象形成免疫复合体，在所述抗体中，分离手段结合第二抗体，所述第二抗体特异性结合的抗原决定部位与结合第一抗体的待测对象物的抗原决定部位不同。

(3)如(1)或(2)项所述的免疫学定量方法，其中第一抗体和酶之间的结合比率分别为1∶1、1∶2和1∶3。

(4)如(1)或(2)所述的免疫学定量方法，第一抗体和酶之间的结合比率分别为1∶1和1∶2。

(5)如(1)～(4)中任一项所述的免疫学定量方法，第一抗体是除去了Fc部分的抗体。

(6)如(1)～(5)中任一项所述的免疫学定量方法，非特异性反应是由人抗鼠抗体引起的反应。

(7)如(1)～(6)中任一项所述的免疫学定量方法，在使酶标抗体与样品反应而与待测对象形成免疫复合体的步骤中，同时存在IgG聚合体和IgG或二者之一。

(8)如(1)～(5)中任一项所述的免疫学定量方法，非特异性反应是由与标记酶发生反应的抗体引起的反应。

(9)如(1)～(8)中任一项所述的免疫学定量方法，在使酶标抗体与样品反应而与待测对象形成免疫复合体的步骤中，同时存在钝化的该标记酶。

(10)如(1)～(9)中任一项所述的免疫学定量方法，酶是过氧化物酶。

(11)如(1)～(10)中任一项所述的免疫学定量方法，待测对象是可溶性白介素-2受体。

(12)一种在非特异性反应被抑制、待测对象的免疫学定量方法中使用的试剂，其包括与待测对象特异性结合的第一抗体经酶标记后形成的酶标抗体，所述酶标抗体基本上只含有一种或多种选自第一抗体与酶之间的结合比率为1∶1、1∶2、1∶3和2∶1的酶标抗体的酶标抗体。

(13)第(12)项所述的试剂，还含有一种抗体，其中分离手段结合第二抗体，所述第二抗体特异性结合的抗原决定部位与结合第一抗体的待测对象物的抗原决定部位不同。

(14)如(12)或(13)所述的试剂，其含有用于测定酶活性的试剂。

(15)如(12)～(14)中任一项所述的试剂，第一抗体和酶之间的结合比率分别为1∶1，1∶2和1∶3。

(16)如(12)～(14)中任一项所述的试剂，第一抗体和酶之间的结合比率分别为1∶1和1∶2。

(17)如(12)～(16)中任一项所述的试剂，第一抗体是除去了Fc部分的抗体。

(18)如(12)～(17)中任一项所述的试剂，非特异性反应是由人抗鼠抗体引起的反应。

(19)如(12)～(18)中任一项所述的试剂，其含有IgG聚合体和IgG或二者之一。

(20)如(12)～(17)中任一项所述的试剂，非特异性反应是由与标记酶发生反应的抗体引起的反应。

(21)如(12)～(20)中任一项所述的试剂，含有使标记抗体的酶钝化后得到的酶。

(22)如(12)～(21)中任一项所述的试剂，酶是过氧化物酶。

(23)如(12)～(22)中任一项所述的试剂，待测对象是可溶性白介素-2受体。

(24)如(12)～(23)中任一项所述的试剂，还含有选自含水介质、金属离子、盐类、糖类、表面活性剂、防腐剂、蛋白质、蛋白质稳定剂中的一种或多种物质。

(25)一种在待测对象的免疫学定量方法中用于抑制非特异性反应的方法，包括下列步骤：在含水介质中让与待测对象特异性结合的第一抗体经酶标记后形成的酶标抗体与样品反应，由此形成酶标抗体与待测对象的免疫复合体，所述酶标抗体基本上只含有一种或多种选自第一抗体与酶之间的结合比率为1∶1、1∶2、1∶3和2∶1的酶标抗体的酶标抗体。

(26)第(25)项所述所述的抑制方法，还包括下列步骤：让一种抗体与样品反应，由此与待测对象形成免疫复合体，在所述抗体中，分离手段结合第二抗体，所述第二抗体特异性结合的抗原决定部位与结合第一抗体的待测对象物的抗原决定部位不同。

(27)如(25)或(26)所述的抑制方法，第一抗体和酶之间的结合比率分别为1∶1，1∶2和1∶3。

(28)如(25)或(26)所述的抑制方法，第一抗体和酶之间的结合比率分别为1∶1和1∶2。

(29)如(25)～(26)所述的抑制方法，第一抗体是除去了Fc部分的抗体。

(30)如(25)～(29)中任一项所述的抑制方法，非特异性反应是由人抗鼠抗体引起的反应。

(31)如(25)～(30)中任一项所述的抑制方法，在使酶标抗体与样品反应从而与待测对象形成免疫复合体的步骤中，同时存在IgG聚合体和IgG或二者之一。

(32)如(25)～(29)中任一项所述的抑制方法，非特异性反应是由与标记酶反应的抗体引起的的反应。

(33)如(25)～(32)中任一项所述的抑制方法，在使酶标抗体与样品反应从而与待测对象形成免疫复合体的步骤中，同时存在钝化的该标记酶。

(34)如(25)～(33)中任一项所述的抑制方法，酶是过氧化物酶。

(35)如(25)～(34)中任一项所述的抑制方法，待测对象是可溶性白介素-2受体。

具体实施方式

1.非特异性反应

本发明中所述的非特异性反应，只要是在待测对象的免疫学测定方法中出现的非特异性反应即可，并无特别限定，例如有由HAMA引起的非特异性反应、由与标记酶反应的抗体引起的非特异性反应等。就HAMA而言，有HAMA I型和HAMA II型两种。作为与标记酶反应的抗体，可以列举例如与过氧化物酶反应的抗体、与碱性磷酸酶反应的抗体等。本发明中与标记酶反应的抗体是指与在本发明的免疫学测定方法中用于标记酶标抗体的酶反应的抗体，会引起非特异性反应。

2.样品

本发明所用的样品，可以列举全血、血浆、血清、脊髓液、唾液、羊水、尿、汗、胰液等，优选全血、血浆、血清等。

3.待测对象

本发明的待测对象只要是成为抗原的物质即可，并无特别限定，优选是至少有两个抗原决定簇的抗原。可以列举例如sIL-2R、已知作为心肌梗塞标志的肌红蛋白、肌酸激酶MB(CK-MB)、肌钙蛋白T等。

4.抗体

形成本发明中使用的酶标抗体的第一抗体，只要是能与待测对象特异性结合的抗体即可，并无特别限定，多克隆抗体、单克隆抗体均可使用，优选是单克隆抗体。同时，在本发明中，不仅可以使用抗体，还可以使用将抗体用木瓜蛋白酶处理得到的Fab、用胃蛋白酶处理得到的F(ab’)₂、用胃蛋白酶处理后又经还原处理的Fab’等除去了Fc部分的抗体片段。作为抗体片段，特别优选F(ab’)₂。

作为形成本发明中使用的固相抗体的第二抗体，只要是与待测对象特异性结合的抗体即可，并无特别限定，多克隆抗体、单克隆抗体也都可以使用，但优选单克隆抗体。第二抗体优选是特异性结合在待测对象上的与第一抗原结合的抗原决定部位不同的抗原决定部位的抗体。

本发明中使用的抗体，可以采用待测对象或相当于它的抗原决定部位的肽作为抗原用常规方法获得，也可以作为商品得到。

与sIL-2R特异性结合的抗体，有如杂交瘤AM92.3产生的单克隆抗体(PIERCE公司制)、单克隆抗体7G7/B6(PIERCE公司制，参见特开昭62-70761号公报)等，各自都可以作为第一抗体或第二抗体任意使用。

5.酶标记

本发明中，与第一抗体结合的酶，可以列举过氧化物酶(以下简称POD)、碱性磷酸酯酶、荧光酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等，优选过氧化物酶、碱性磷酸酯酶，特别优选过氧化物酶。可以使用任何来源的过氧化物酶，优选来源于西洋山嵛菜的。碱性磷酸酶可以是来自牛小肠的碱性磷酸酶等。

6.第一抗体与酶的结合

本发明中，酶标抗体是与作为标记与待测对象特异性结合的第一抗体的酶相结合的抗体，在这种结合中，结合方式可以是例如共价键结合，也可以是酶与抗体直接结合，还可以通过连接物间接结合。结合物的制备方法有例如戊二醛法、高碘酸法、马来酰亚胺法、吡啶二硫化物法等(例如可参见石川荣治著《酶免疫测定法》1987年，医学书院发行)，优选马来酰亚胺法。具体实例可举出将用硫醇亚胺(iminothiolane)等氢硫化后的抗体和用琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧酸酯(succinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate，SMCC)、N-6-(马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰胺)[N-6(maleimidocaproyloxy)succinimide，EMCS)等马来酰亚胺化的酶混合制备。

7.酶标抗体的抗体与酶之间的结合比率

本发明所使用的酶标抗体，是每分子抗体结合了少数标记酶分子的酶标抗体，具体而言，基本上是含有选自第一抗体和酶之间的结合比率分别是1∶1、1∶2和1∶3和2∶1的酶标抗体中的一种或多种酶标抗体，优选基本上含有选自第一抗体和酶之间的结合比率分别是1∶1、1∶2、1∶3的酶标抗体中的一种或多种酶标抗体，更优选基本上是含有选自第一抗体和酶之间的结合比率分别是1∶1、1∶2的酶标抗体中一种或多种酶标抗体。

酶标抗体，特别优选第一抗体和酶之间的结合比率为1∶1或1∶2的酶标抗体，当酶标抗体是混合物时，第一抗体和酶之间的结合比率是1∶1、1∶2的的酶标抗体占整个酶标抗体的分子数目的50％以上，更优选是占70％以上，特别优选是占90％以上。

使用上述戊二醛法、高碘酸法、马来酰亚胺法、吡啶二硫化物法等方法使酶与第一抗体结合时，可以通过采用诸如离子交换色谱法、凝胶过滤柱色谱法、疏水色谱法等方法，或将这些方法加以组合除去与多数的酶结合的第一抗体、未反应的酶和抗体来制备这样的酶标抗体。

8.固相抗体

本发明中所谓固相抗体，是采用分离方法结合了与待测对象特异性结合的第二抗体。所谓分离方法，可以列举固相物质本身或特异性结合固相物质的物质。该结合的结合方式，可以列举在采用固相物质时的非共价键结合，采用特异性结合固相物质的物质时是共价结合，既可是该物质与抗体直接结合，也可以通过连接物间接结合。作为与固相物质结合的物质和与该物质特异性结合的物质的组合，可以列举采用生物素和抗生物素蛋白的组合等。

固相，只要是可以固定化第二抗体，并能够应用于待测对象的免疫学测定方法中的固相即可，并无特别限定。例如微型滴定板等聚苯乙烯板、玻璃制或合成树脂制的颗粒(bead)、玻璃制或合成树脂制的小球(ball)、胶乳、磁性颗粒、硝基纤维素膜等各种膜、合成树脂制的试管等等。

9.IgG聚合物及IgG

本发明中的IgG聚合物，只要是由IgG聚合者即可，并无特定限定，例如MAK33-IgG1/IgG1Poly、MAK33-IgG(2b)/Fab(2a)Poly[均为罗氏诊断公司制]等。本发明中的IgG，只要是动物的IgG即可，并无特定限定，例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、山羊、绵羊、鸡、牛、马等动物的IgG，优选小鼠的IgG。由动物IgG提纯的产品亦可，动物的血清亦可。

10.含水介质

含水介质可以列举例如去离子水、蒸馏水和缓冲液等，优选缓冲液。用于配制缓冲液的缓冲剂，只要有缓冲能力即可，并无特别限定。可以列举pH 1～11的缓冲剂，例如乳酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、乙酸缓冲剂、琥珀酸缓冲剂、苯二甲酸缓冲剂、磷酸缓冲剂、三乙醇胺缓冲剂、二乙醇胺缓冲剂、赖氨酸缓冲剂、巴比妥酸盐缓冲剂、咪唑缓冲剂、苹果酸缓冲剂、草酸缓冲剂和甘氨酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、碳酸缓冲剂、古德缓冲剂(Good’s buffer)等。

古德缓冲液可以列举例如2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲剂、二-(2-羟乙基)-亚胺三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)缓冲剂、三羟乙基)氨基甲烷(Tris)缓冲剂、N-(2-乙酰氨基)-亚胺二乙酸((ADA)缓冲剂、，哌嗪-N，N’-二(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲剂、2-[N-(乙酰氨基)氨基]乙磺酸(ACES)缓冲剂、3-吗啉代2-羟丙磺酸(MOPSO)缓冲剂、2-[N，N-二(2-羟乙基)氨基]乙磺酸(BES)缓冲剂、3-吗啉代丙磺酸(MOPS)缓冲剂、2-[N-[三(羟甲基)甲基]氨基]乙磺酸)(TES)缓冲剂、N(2-羟乙基)-N’-(2-磺乙基)哌嗪(HEPES)缓冲剂、3-[N，N-二(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)缓冲剂、2-羟基-3-[N-三(羟甲基)甲基]氨基丙磺酸)TAPSO)缓冲剂、哌嗪-N，N’-二(2-羟基丙-3-磺酸)(POPSO)缓冲剂、N-(2-羟乙基)-N’-(2-羟基-3-磺丙基)哌嗪(HEPPSO)缓冲剂、N-(2-羟乙基)-N’-(3-磺丙基)哌嗪(EPPS)缓冲剂、三羟甲基甘氨酸[N-三(羟甲基)甲基甘氨酸]缓冲剂、蚕豆苷(N，N-二(2-羟乙基)甘氨酸)缓冲剂、3-[N-三(羟甲基)甲基]氨基丙磺酸(TAPS)缓冲剂、2-(N-环己胺)乙磺酸(CHES)缓冲剂、3-(N-环己胺)-2-羟基丙磺酸(CAPSO)缓冲剂、3-(N-环己胺)丙磺酸(CAPS)缓冲剂等。

缓冲液的浓度只要适合测定即可，并无特别限定，优选0.001～2.0mol/L，更优选0.005～1.0mol/L，特别优选0.01～0.1mol/L。

11金属离子

金属离子有诸如镁离子、锰离子、锌离子等。

12盐类

盐类有诸如氯化钠、氯化钾等。

13糖类

糖类有诸如甘露醇、山梨醇等。

14表面活性剂

表面活性剂有诸如非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、两性表面活性剂等，优选非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂有诸如吐温20(Tween 20)、润湿剂P-40(NP-40)等。

15防腐剂

防腐剂有诸如叠氮化钠、抗生素(链霉素、青霉素、庆大霉素等)、Bioace、Proclin300、Proxel GXL等。

16蛋白质

蛋白质有诸如牛血清白蛋白(BSA)、牛胎血清(FBS)、酪素、blockACETM(大日本制药公司制)等。

17蛋白质稳定剂

蛋白质稳定剂有诸如过氧化物酶稳定缓冲液(Peroxidase Stabilizing Buffer，DakoCytomation公司制)等。

18钝化的酶

本发明中钝化的酶，是和定量本发明的待测对象的免疫学方法中用来标记酶标抗体的酶相同的酶，即来自同一种生物的同种有活性的酶被钝化的后即可。例如免疫学定量方法中在采用POD标记抗体时，采用将该POD钝化后的酶，在采用碱性磷酸酶标记抗体时，采用将该碱性磷酸酶钝化后的酶。钝化的酶可以和载体或抗体结合的，但此时抗体必须是不和待测对象或该抗体发生反应的。所谓失活，是指一方面保持与引起非特异性反应的标记抗体发生反应的与抗体反应的特性，而完全或基本上丧失了参与本发明的免疫学定量方法的酶活性，可以通过加热处理、酸或碱变性处理、蛋白酶消化、冻融等方法，或组合这些方法处理。例如POD在100～125℃处理10～60分钟，即可得到钝化的POD。钝化的POD有钝化聚-POD(罗氏诊断公司制)。钝化的碱性磷酸酶有清道夫-ALP(东方酵母公司产品)等。

19.待测对象的免疫学定量方法

本发明的待测对象的免疫学定量方法，只要其包含选自基本上与待测对象特异性结合的从酶和第一抗体的结合比率分别1∶1，1∶2，1∶3和2∶1的酶标抗体中的一种或多种酶标抗体的酶标抗体，使其与样品反应与待测物质形成免疫复合体的步骤，以及测定免疫复合体的酶活性的步骤，并无特别限定。此外，所述方法还包含下列步骤：让一种抗体与样品反应，由此与待测对象形成免疫复合体，在所述抗体中，分离手段结合第二抗体，所述第二抗体特异性结合的抗原决定部位与结合第一抗体的待测对象物的抗原决定部位不同。

酶标抗体优选是从选自基本上第一抗体与酶结合比率分别以比例为1∶1，1∶2和1∶3的酶标抗体中一种或多种酶标抗体的酶标抗体，更优选是选自基本上第一抗体和酶之间的结合比率分别为1∶1和1∶2的酶标抗体中的一种或多种酶标抗体的酶标抗体。

标记抗体，特别优选第一抗体和酶之间的结合比率为1∶1或1∶2结合的酶标抗体，酶标抗体为混合物时，第一抗体和酶结合比率为1∶1或1∶2的酶标抗体在整个酶标抗体中所占比例优选为50％以上，更优选为70％以上，特别优选为90％以上。

具体的定量方法可列举例如夹心法、竞争法等，优选夹心法。夹心法可列举一步法、延迟一步法和二步法等。

更具体的待测对象的免疫学定量方法，可列举例如包含以下步骤的定量方法。

(1)使样品中的待测对象与固相抗体反应，形成免疫复合体的步骤(第一次反应)，

(2)使样品中的待测对象与酶标抗体反应，形成免疫复合体的步骤(第二次反应)，

(3)将不形成免疫复合体的酶标抗体与固相分离的步骤，

(4)测定固相中生成的免疫复合体中的酶标记的酶活性的步骤，

(5)根据预先用已知浓度的待测对象制作标准曲线，通过与第(4)步骤测定的酶活性作比较，定量待测对象的步骤。

上述步骤(1)和(2)之间，必要时还可以在第一次反应后增加一个洗涤固相的步骤。并且，步骤(1)和(2)也可以同时进行。

第一次反应优选在含水介质中进行。第一次反应的温度为例如0～50℃，优选为4℃～40℃。第一次反应的反应时间为例如5分钟～20小时。第一次反应后洗涤固相时所用的洗涤液，有诸如磷酸缓冲化的生理盐水(含有0.15mol/L氯化钠的10mmol/L磷酸缓冲液，pH7.2，以下简称PBS)，或含有表面活性剂的PBS等。表面活性剂有诸如吐温20等非离子型表面活性剂。

第二次反应优选在含水介质中进行。在第二次反应中使用形成酶标抗体的抗体(第一抗体)中的抗原决定簇优选不同于第一次反应中使用的抗体(第二抗体)中的抗原决定簇。第二次反应的反应温度为0～50℃，优选为4℃～40℃。第二次反应的反应时间为5分钟～20小时。第二次反应后洗涤固相所用的洗涤液，有诸如上述洗涤液等。

通过第二次反应在固相上生成的免疫复合体中的酶标记的活性测定方法，可以使酶的底物与该酶反应，通过测定产物来测定免疫复合体中的酶活性。酶的底物与该酶的反应，优选在含水介质中进行。

当酶是过氧化物酶时，可以用诸如吸光度法、荧光法、发光法等来测定免疫复合体中过氧化物酶的活性。用吸光度法测定过氧化物酶活性的方法，可以列举将过氧化物酶和它的底物过氧化氢及氧化生色团(chromogen)加以组合使之反应，用分光光度计等测定反应液的吸光度。氧化生色团有诸如无色型生色团、氧化偶合生色团等。

无色型生色团是在过氧化氢及过氧化物酶等过氧化活性物质存在存在条件下可以单独转变为色素的物质。具体而言，有0-苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、10-N-羧甲基胺基甲酰基-3，7-二(二甲氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-二(二甲氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-羧甲基氨基羰基-4，4’-二(二甲氨基)-二苯胺钠盐(DA-64)、4，4’-二(二甲氨基)二苯胺、二[3-二(4-氯苯基)甲基)-4-二甲氨基苯基]胺(BCMA)等。

氧化偶合生色团是在过氧化氢及过氧化物酶等过氧化活性物质存在条件下，两种化合物经氧化偶合而生成色素的物质。组合的两种化合物有如偶合剂和苯胺类化合物(Trinder试剂)相组合、偶合剂和酚类的组合等。偶合剂则有诸如4-氨基安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯并噻唑酮肼等。苯胺类化合物有诸如N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N，N-二甲基-3-甲基苯胺、N，N-二(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙烯二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙酰基乙烯二胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-4-氟-3，5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)等。酚类则有诸如苯酚、4-氯酚、3-甲苯酚、3-羟基-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)等。

测定过氧化氢时，过氧化活性物质的浓度只要适合测定即可，并无特别限定，在用过氧化物酶作为过氧化活性物质时，优选1～100kU/L。氧化生色团的浓度只要适合测定即可，并无特别限定，优选0.01～10g/L。

用荧光法测定过氧化物酶活性的方法，可以列举将过氧化物酶及其底物过氧化氢，以及荧光物质组合在一起使之进行反应，然后测定产生的荧光强度的方法等。该荧光物质有诸如4-羟基乙酸苯酯、3-(4-羟苯基)丙酸、香豆素等。

用发光法测定过氧化物酶活性的方法，可以列举将过氧化物酶及其底物过氧化氢，以及发光物质组合在一起使之进行反应，然后测定产生的发光强度的方法等。该发光物质有诸如鲁米诺等。

当酶是碱性磷酸酶时，可以用例如发光法等来测定复合体中的碱性磷酸酶的活性。用发光法来测定碱性磷酸酶的活性的方法，例如有使碱性磷酸酶和它的底物反应，用发光强度计等测定产生的发光物质的发光强度的方法等。碱性磷酸酶的底物，有诸如3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧杂环丁烷二钠盐(AMPPD)、2-氯-5-{4-甲氧基螺旋[1，2-二氧杂环丁烷-3，2′-(5’-氯)三环(3.3.1.1^3，7)癸烷]-4-基}苯基磷酸二钠盐(CDP-Star^TM)、3-{4-甲氧基螺旋[1，2-二氧杂环丁烷-3，2′-(5’-氯)三环(3.3.1.1^3，7)癸烷]-4-基}苯基磷酸}二钠盐(CSPD^TM)、[10-甲基-9-(10H)-亚吖啶基]苯氧甲基磷酸二钠盐(Lumigen^TMAPS-5)等。

当酶是荧光素酶时，可以用例如发光法等来测定复合体中的荧光素酶的活性。用发光法来测定荧光素酶的活性的方法，可列举例如使荧光素酶和它的底物反应，用发光强度计等测定产生的发光物质的发光强度的方法。荧光素酶的底物有诸如荧光素等。

当酶是β-D-半乳糖苷酶时，可以用例如吸光法度法(比色法)等来测定免疫复合体中的β-D-半乳糖苷酶的活性。吸光度法(比色法)测定 β-D-半乳糖苷酶的活性的方法，可以列举例如使β-D-半乳糖苷酶和它的底物反应，用分光光度计等测定反应液的吸光度的方法等。β-D-半乳糖苷酶的底物，可列举例如有2-氯-硝基苯-β-D-乳糖苷、2-硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)、5-溴代-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)等。

当酶是葡萄糖氧化酶时，可以用葡萄糖氧化酶作用于其底物葡萄糖，通过测定生成的过氧化氢来测定免疫复合体中的葡萄糖氧化酶的活性。过氧化氢的测定可以用例如上述测定过氧化物酶活性的方法进行。

本发明的免疫学定量方法中，都可以有上述缓冲剂、金属离子、盐类、糖类、表面活性剂、防腐剂、蛋白质、蛋白质稳定剂等同时存在于反应中。

20定量试剂

本发明的免疫学定量测定待测对象的方法中所用的试剂，包括基本上只含有选自与待测对象特异性结合的第一抗体和酶之间的结合比率分别为1∶1，1∶2，1∶3和2∶1的酶标抗体中的一种或多种酶标抗体的酶标抗体，任选还含有一种抗体，其中分离手段结合第二抗体，所述第二抗体特异性结合的抗原决定部位与结合第一抗体的待测对象物的抗原决定部位不同。

酶标抗体优选选自第一抗体和酶之间的结合比率分别为1∶1，1∶2和1∶3的酶标抗体中的一种或多种酶标抗体的酶标抗体，更优选是基本上选自第一抗体和酶之间的结合比率分别为1∶1和1∶2的酶标抗体中的一种或多种酶标抗体的酶标抗体。

标记抗体特别优选酶与第一抗体的结合比率为1∶1或1∶2的酶标抗体，当酶标抗体是混合物时，第一抗体和酶之间的结合比率为1∶1或1∶2酶标记抗体优选占整个酶标抗体分子数比例的50％以上，更优选是 70％以上，特别优选是90％以上。

本发明的测定试剂具体形态如下所述。

试剂1

含有固相抗体、酶标抗体及用于测定标记后酶活性的试剂的试剂。

试剂2

含有固相抗体、酶标抗体、IgG聚合体及用于测定标记后酶活性的试剂的试剂。

试剂3

含有固相抗体、酶标抗体、小鼠IgG及用于测定标记后酶活性的试剂的试剂。

试剂4

含有固相抗体、酶标抗体、IgG聚合体、小鼠IgG及用于测定标记后酶活性的试剂的试剂。

试剂5

含有固相抗体、酶标抗体、使标记抗体的酶钝化后得到的酶及用于测定标记后酶活性的试剂的试剂。

试剂6

含有固相抗体、酶标抗体、小鼠IgG、使标记抗体的酶钝化后得到的酶及用于测定标记后酶活性的试剂的试剂。

试剂7

含有固相抗体、酶标抗体、IgG聚合体、使标记抗体的酶钝化后得到的酶及用于测定标记后酶活性的试剂的试剂。

试剂8

含有固相抗体、酶标抗体、小鼠IgG、IgG聚合体、使标记抗体的酶钝化后得到的酶及用于测定标记后酶活性的试剂的试剂。

试剂9

含有固相抗体、酶标抗体、用于测定标记后酶活性的试剂和待测对象标准品的试剂。

试剂10

含有固相抗体、酶标抗体、IgG聚合体、用于测定标记后酶活性的试剂和待测对象标准品的试剂。

试剂11

含有固相抗体、酶标抗体、小鼠IgG、用于测定标记后酶活性的试剂和待测对象标准品的试剂。

试剂12

含有固相抗体、酶标抗体、IgG聚合体、小鼠IgG、测定标记用酶活性的试剂和待测对象标准品的试剂。

试剂13

含有固相抗体、酶标抗体、使标记抗体的酶钝化后得到的酶及用于测定标记后酶活性的试剂和待测对象标准品的试剂。

试剂14

含有固相抗体、酶标抗体、小鼠IgG、使标记抗体的酶钝化后得到的酶、用于测定标记后酶活性的试剂和待测对象标准品的试剂。

试剂15

含有固相抗体、酶标抗体、IgG聚合体、使标记抗体的酶钝化后得到的酶、用于测定标记后酶活性的试剂和待测对象标准品的试剂。

试剂16

含有固相抗体、酶标抗体、小鼠IgG、IgG聚合体、使标记抗体的酶钝化后得到的酶、用于测定标记后酶活性的试剂和待测对象标准品的试剂。

本发明的测定用试剂中，用于测定标记后酶活性的试剂，可列举例如含有该酶的底物的试剂。测定该酶活性的试剂中的酶，可列举例如前述的酶。该底物可举例为前述底物。

本发明的测定用试剂中的待测对象的标准品，可列举例如将待测对象调整到已知浓度的水溶液。

本发明的测定试剂可以用试剂盒的形态保存、运输，必要时也可以含有上述缓冲剂、金属离子、盐类、糖类、表面活性剂、防腐剂、蛋白质、蛋白质稳定剂等。

以下为本发明的实施例，但本发明并不只限定于这些实施例。同时，在本实施例中，使用下述制造厂商的试剂、酶、血清和器具。

杂交瘤AM92.3：PIERCE公司出品

杂交瘤7G7/B6：PIERCE公司出品

α-MEM(极限必需培养基α-培养基)：Invitrogen公司出品

96孔微型滴定板：Nalge Nunc International公司出品

BSA：InterGen公司出品

蔗糖：关东化学公司出品

吐温20：关东化学公司出品

庆大霉素：和光纯药工业公司出品

氯化钠：和光纯药工业公司出品

Bioace：组合化学工业公司出品

邻苯二胺(OPD)：Sigma-Aldrich公司出品

尿素过氧化氢盐：Sigma-Aldrich公司出品

Proclin：Sigma-Aldrich公司出品

POD：东洋纺织公司出品、罗氏诊断公司出品

硫酸：关东化学公司出品

胃蛋白酶：罗氏诊断公司出品

硫醇亚胺(Iminothiolane)：PIERCE公司出品

EMCS：PIERCE公司出品

FBS：海克隆公司公司出品

NP-40：Calbiochem公司出品

小鼠IgG：Scantibodies Laboratory公司出品

Proxel GXL：Avecia公司出品

POD稳定化缓冲液：DakoCytomation公司出品

MES：同仁化学研究所出品

MAK33-IgG1/IgG1Poly：罗氏诊断公司出品

MAK33-IgG(2b)/Fab(2a)Poly：罗氏诊断公司出品

正常人血清：Aries公司出品

HAMA血清I型：罗氏诊断公司出品

HAMA血清II型：罗氏诊断公司出品

无活性Poly-POD：罗氏诊断公司出品

参考例1 抗sIL-2R单克隆抗体的制备和纯化

用降植烷等分别处理产生抗sIL-2R单克隆抗体的杂交瘤AM92.3和杂交瘤7G7/B6，移植到小鼠腹腔，回收腹水。以常法的A蛋白柱r蛋白A琼脂糖快速流动(rProtein A Sepharose Fast Flow，AmershamBioscience公司出品)纯化来自腹水的单克隆抗体。由杂交瘤AM92.3得到单克隆抗体KTM-302抗体，从杂交瘤7G7/B6得到单克隆抗体KTM-303抗体。

参考例2 sIL-2R的制备

将冷冻保存的已知分泌表达sIL-2R的淋巴瘤细胞株U937(大日本制药公司出品)在37℃水浴中尽快解冻，转移到15mL无菌试管中，加入含有10％FBS、青霉素、链霉素的α-MEM 10mL，充分悬浮。将其在室温下离心分离(1200rpm)5分钟后，吸取上清液弃去。向残留物中加入10mL与上述相同的培养基，将混悬的细胞悬浊液全部转移到25cm²的T形烧瓶中，用二氧化碳培养箱(5％CO₂，37℃)培养2～3日。然后依次扩大培养至150cm²、225cm²的T形烧瓶中。在确认225cm²T形烧瓶中的细胞全部汇合后，将培养上清液收集到无菌容器中，4℃下离心分离(1200rpm)10分钟。离心分离得到的上清液转移到无菌容器中，充分搅拌15分钟后，经0.2μm滤器过滤处理后的制品作为sIL-2R标准品。

同时，根据文献[J.Immuno1.，135，3172-3177(1985)]，用10％IL-2刺激4日正常人IL-2的依赖T细胞的无细胞培养上清液(不稀释)中的sIL-2R的含量作为1000U/mL，进行标准品的评价。

参考例3 固定抗sIL-2R单克隆抗体的固相的制备

KTM-302抗体用PBS稀释到其终浓度为4μg/ml，将其加入固定化用的96孔微型滴定板上，每孔加入100μL。室温下静置一夜后，用封闭液(含有1％BSA，5％蔗糖、0.05％吐温20、0.01％庆大霉素硫酸盐的10mmol/L磷酸缓冲液，pH7.2)洗涤，加入200μL封闭液室温下静置一夜进行封闭。除去封闭液后，在真空干燥仪中干燥3日，制备成固定后的抗sIL-2R单克隆抗体的固相(板)制剂。

实施例1

(1)POD标记的抗sIL-2R单克隆F(ab’)₂抗体的制备

用0.01％胃蛋白酶消化参考例1中制备的KTM-303抗体后，经使用了G3000SW柱(东ソ一公司出品：Ф21.5mm X 60cm)的HPLC***(日立制作所出品)分离纯化F(ab’)₂。将得到4mg F(ab’)₂，用100 mmol/L硼酸缓冲液(pH8.0)透析。

将该抗sIL-2R单克隆F(ab’)₂抗体与POD(东洋纺织公司出品)，用下面的马来酰亚胺法使之结合。

即，用硫醇亚胺将该F(ab’)₂巯基化，用Sephadex G-25柱(Amersham Bioscience公司出品)除去未反应的硫醇亚胺。POD用马来酰亚胺化试剂EMCS加以马来酰化，用Sephadex G-25柱除去未反应的EMCS。将上述该F(ab’)₂巯基化的F(ab’)₂单克隆抗体与马来酰化的POD混合，30℃下反应30分钟，制备成POD标记的抗sIL-2R单克隆F(ab’)₂抗体。

(2)用凝胶过滤柱色谱分离POD标记的抗sIL-2R单克隆F(ab’) ₂抗体

F(ab’)₂抗体的分子量为约92kDa，POD的分子量为约44kDa。因此，可以计算出POD与该抗体之间的结合比率为1∶1的酶标抗体的分子量约为136kDa，结合比率为1∶2的约为180kDa，结合比率为1∶3的约为224kDa，结合比率为1∶4的约为268kDa，结合比率为1∶5的约为312kDa，结合比率为2∶1的约为228kDa，结合比率为2∶2的约为272kDa，结合比率为2∶3的约为316kDa，结合比率为3∶1的约为320kDa。

上述(1)所述方法制备的酶标抗体，以G3000SW柱(东ソ一公司出品：Ф21.5mm X 60cm)，用HPLC***(日立制作所出品)分级。以0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)为流动相，流速3mL/分钟，在室温下进行HPLC。各级分的回收以3mL/级分进行。另外，分子量标记，采用高分子量凝胶过滤法校正用的试剂盒(HMW Gel Filtration Calibration Kit，Amersham Bioscience公司出品)和低分子量凝胶过滤法校正用的试剂盒(LMW Gel Filtration Calibration Kit，Amersham Bioscience公司出品)。

测定各级分在280nm下的吸光度的结果见图1。如图1所示，证明各吸收峰分别为：级分1)级分33、级分2)级分40、级分3)级分43、级分4)级分48、级分5)级分52。

根据比照分子量标记，推定在上述各吸收峰显示的各级分的分子量，分别为1)250kDa以上、2)约170kDa、3)约140kDa、4)约100kDa、5)约40kDa。因此，可以推测，级分1)级分33中的酶标抗体是F(ab’)₂和POD聚合的标记抗体、级分2)级分40中的酶标抗体是在1分子F(ab’)₂结合了2分子POD的标记抗体、级分3)级分43中的酶标抗体是在1分子F(ab’)₂结合1分子POD的标记抗体、级分4)级分48含有未反应的F(ab’)₂、级分5)级分52含有未反应的POD。

(3)用SDS-PAGE鉴定各分部中的酶标抗体

由上述(2)所得到的级分32～52的各级分，制备电泳用的样品使分别来自各级分的蛋白量为2～3μg/条带。向此样品中加入1/4量的用于SDS-PAGE样品的缓冲液[含有8％SDS(和光纯药工业公司出品)、24％2-巯基乙醇(Nacalai公司出品)和40％甘油(关东化学公司出品)的lmol/LTris缓冲液，pH6.8]，95℃下加热5分钟。将热处理的样品以每条带20μL的量上样到SDS-PAGE凝胶上[PAGEL SPG-520L(Alto公司出品)]，以相当于每条凝胶20mA的电流进行电泳，用常规方法检测条带。分子量标记采用预染色的宽范围(Prestained Broad Range)，250kDa、150kDa、100kDa、75kDa、50kDa、37kDa、25kDa、16kDa、10kDa(Bio-Rad公司出品)。

根据SDS-PAGE所得条带的位置和分子量标记，鉴定结果是：级分32～35中的酶标抗体，是F(ab’)₂和POD的结合比率分别为1∶5、2∶3、3∶1等的高度聚合物，即是酶标抗体的混合物(观察到条带呈模糊状)；级分36中的酶标抗体，是F(ab’)₂和POD的结合比率分别为1∶4和2∶2的酶标抗体的混合物；级分37中的酶标抗体，是F(ab’)₂和POD之间的结合比率分别为1∶4、1∶3、2∶1和2∶2的酶标抗体的混合物。

同样，还鉴定出，级分38中的酶标抗体，是F(ab’)₂和POD之间的结合比率分别为1∶3和2∶1的酶标抗体的混合物；级分39中的酶标抗体，是F(ab’)₂和POD之间的结合比率分别为1∶2、1∶3和2∶1的酶标抗体的混合物；级分40～41中的酶标抗体，是F(ab’)₂和POD之间的结合比率是1∶2的酶标抗体；级分42中的酶标抗体，是F(ab’)₂和POD之间的结合比率分别为1∶2及1∶1的酶标抗体的混合物；级分43～46中的酶标抗体，是F(ab’)₂和POD之间的结合比率是1∶1的酶标抗体。

此外，还鉴定出，级分47中的蛋白质，是F(ab’)₂和POD之间的结合比率分别为1∶1的酶标抗体同未反应的F(ab’)₂的混合物；级分48～51中的蛋白质，是未反应的F(ab’)₂；级分52中的蛋白质，是未反应的POD。

(4)用各级分的酶标抗体制备定量sIL-2R的标准曲线

参考例3中制备的固相化板，在每孔中各添加50μL含有0U/mL、200U/mL、400U/mL、1600U/mL、3200U/mL、6400U/mL的sIL-2R标准溶液(含有150mmol/L氯化钠、4％BSA、1％蔗糖和0.01％Bioace的10mmol/L磷酸缓冲液，pH7.5)。用酶标抗体稀释液[150mmol/L氯化钠、10％FBS、0.2％NP-40、100μg/mL小鼠IgG、0.2％Proxel GXL、10％POD稳定化缓冲液及0.16μg/mL POD(罗氏诊断公司出品)的100mmol/L醋酸缓冲液，pH6.0]稀释上述(2)中各级分中的酶标抗体，制备成酶标抗体溶液(24～140ng/mL)，向每孔中各添加50μL，用水平旋转震荡器在室温下震荡(140～160rpm)90分钟。用洗涤液(含有150mmol/L氯化钠、0.05％吐温20的10mmol/L磷酸缓冲液，pH6.8)洗涤各孔后，在每孔中各加入100μL的OPD溶液(含有2mg/mL OPD、0.75g/L尿素过氧化氢盐、0.01％Proclin300的100mmol/L磷酸-柠檬酸缓冲液，pH4.4)，用主波长为490nm，副波长为660nm测定反应液的吸光度。根据抗原浓度与吸光度制作各级分酶标抗体的标准曲线。

(5)用POD标记的抗sIL-2R单克隆抗体测定样品中的sIL-2R

用HAMA血清I型(Lot.92069721)、HAMA血清II型(Lot.14482684)和正常人血清(Lot.101001-2)各50μL，各血清样品中的sIL-2R，用上述(2)中所述各级分的标记抗体，按上述(4)中所述方法测定。sIL-2R的测定值(U/mL)表示于表1中。

[表1]

第一表

含有抗体和酶的结合比率分别为1∶5、2∶3、3∶1等的高度聚合物的酶标抗体的级分32～35中，HAMA血清I型中的sIL-2R的测定值超过1000U/mL，特别是被认为高度聚合的级分32中则高达16000U/mL。同时，被鉴定出抗体和酶之间的结合比率为1∶4或2∶2的级分36也显示很高的测定值。

但是，经鉴定，只含有一种或多种选自抗体和酶之间结合比率分别为1∶3、2∶1、1∶2和1∶1的酶标抗体的酶标抗体的级分38～46中的酶标抗体的测定值则几乎都在500U/mL以下，这说明HAMA血清I型的非特异性反应受到了抑制。

特别是从含有1分子F(ab’)₂和2分子POD结合的酶标抗体的级分40，到含有1分子F(ab’)₂和1分子POD结合的酶标抗体的级分46附近，其测定值处于约为300U/mL的平衡状态。

根据这些结果，表明每分子抗体与少数标记酶分子结合的酶标抗体，优选是选自第一抗体和酶结合比率分别为1∶1，1∶2，1∶3和2∶1的酶标抗体中基本上只含有一种或多种酶标抗体的酶标抗体；更优选是选自第一抗体和酶结合比率分别为1∶1，1∶2和1∶3的酶标抗体中基本上只含有一种或多种酶标抗体的酶标抗体；特别优选是选自第一抗体和酶结合比率分别为1∶1或1∶2的酶标抗体中基本上只含有一种或多种酶标抗体的酶标抗体，使用这些抗体可以有效抑制在HAMA血清I型中表现很强烈的非特异性反应。

实例2 HAMA非特异性反应中小鼠IgG的效果

研究了加入小鼠IgG对抑制HAMA非特异性反应的效果。实例1中制备的级分40～46中的酶标抗体，用酶标抗体稀释液[含有150mmol/L氯化钠、10％FBS、0.2％NP-40、小鼠IgG、0.2％Proxel GXL、10％POD稳定化缓冲液及0.16μg/mL POD(罗氏诊断公司出品)的75mmol/L的MES缓冲液，(pH6.5)]稀释，小鼠IgG的浓度分别配制为0、20、40、60、80、100、200μg/mL。

使用HAMA血清I型(Lot.92069721)、HAMA血清II型(Lot.14482684)和正常人血清(Lot.101001-2)各50μL，各血清中的sIL-2R值，用和实例1(5)相同的方法测定。

结果表示在表2中。

[表2]

第二表

没有加入小鼠IgG时HAMA血清II型的测定值为9000U/mL以上，这是由于HAMA引起的非特异性反应造成的，通过加入20μg/mL小鼠IgG，就抑制了HAMA引起的非特异性反应，测定值降低为437U/mL。然而，进一步增加小鼠IgG，HAMA血清的测定值降低，加入80μg/mL以上，sIL-2R值就达到了平衡。在HAMA血清I型中，加入80μg/mL测定值虽然达到了平衡，但没有看到在HAMA血清II型中所表现的大的改变。另外，正常人血清的测定值是一定的，不随增加小鼠IgG的浓度改变，因此，证明加入小鼠IgG的浓度在200μg/mL以下对测定***没有影响。根据这些结果，得知加入小鼠IgG的浓度在80μg/mL以上即可充分抑制HAMA血清II型引起的非特异性反应。在HAMA血清I型中也证实有抑制作用。

实例3 在HAMA非特异性反应中高聚合化的小鼠IgG的效果和高聚合化的小鼠IgG的最适浓度的研究

探讨了加入高聚合化的小鼠IgG对HAMA引起的非特异性反应的抑制。将实例1中制备的级分40～46中的酶标抗体，用酶标抗体稀释液[含有150mmol/L氯化钠、10％FBS、0.2％NP-40、100μg/ml小鼠IgG、高聚合化小鼠IgG、0.2％Proxel GXL、10％POD稳定化缓冲液及0.16μg/mL POD(罗氏诊断公司出品)的75mmol/L的MES缓冲液，pH6.5]稀释。在用MAK33-IgG1/IgG1Poly作为高聚合化的小鼠IgG时，将其分别配制成浓度为0、75、100、125、150、175、200、300μg/mL的酶标抗体溶液。在用MAK33-IgG(2b)/Fab(2a)Poly时，将其分别配制成浓度为0、5、50、100μg/mL的酶标抗体溶液。

使用HAMA血清I型(Lot.90643629)、HAMA血清II型(Lot.92069831)和正常人血清(Lot.101001-2)各50μL，各血清中的sIL-2R，用实例1(5)相同的方法测定。

加入MAK33-IgG1/IgG1Poly的效果见表3。

[表3]

第三表

结果如表3所示，在未加入MAK33-IgG1/IgG1Poly的状态下 HAMA血清I型中的sIL-2R的测定值是435U/mL，随着加入MAK33-IgG1/IgG1Poly的浓度增加而测定值降低，加入浓度在125μg/mL以上时sIL-2R的测定值几乎达到稳定。

而MAK33-IgG1/IgG1Poly的浓度即使增加到300μg/mL正常人血清的测定值也不发生改变，证明加入300μg/mL以下的MAK33-IgG1/IgG1Poly，对测定值没有影响。

根据这些结果，说明在酶标抗体溶液中加入浓度在125μg/mL以上的MAK33-IgG1/IgG1Poly，能够充分抑制HAMA血清I型引起的非特异性反应。

加入MAK33-IgG(2b)/Fab(2a)Poly的效果如表4所示。

[表4]

第四表

结果如表4所示，用MAK33-IgG(2b)/Fab(2a)Poly取代MAK33-IgG1/IgG1Poly时，HAMA血清I型中的sIL-2R的测定值同样是低的。

因此，不仅加入IgG1，加入其它亚型的IgG聚合体，都可抑制HAMA血清I型引起的非特异性反应。

实施例4

HAMA血清检测样品中sIL-2R的测定(1)

将实例1中制备的级分40～46中的酶标抗体，用酶标抗体稀释液(含有150mmol/L氯化钠、10％FBS、0.2％NP-40、100μg/mL小鼠IgG、200μg/mL MAK33-IgG1/IgG1Poly、0.2％Proxel GXL、10％POD稳定化缓冲液及0.16μg/mL POD的75mmol/L的MES缓冲液，pH6.5)稀释，制备成酶标抗体溶液，用实施例1(5)相同的方法，测定HAMA血清I型(Lot.90643637)和HAMA血清II型(Lot.92069840)中的sIL-2R。以下将上述制备的酶标抗体溶液，以及用实施例1(4)中所述的方法配制的酶标抗体溶液以外的试剂(参考例3制备的固相滴定板、实施例1(4)中的标准物质溶液、洗涤液、OPD溶液及反应终止液)概括称为“实施例4的试剂”。以下记载了实施例4的试剂成分。

实施例4的试剂

抗sIL-2R抗体固定化滴定板：4μg/mL KTM-302抗体用100μL/孔固定化的8孔X 12条的96孔微型滴定板

标准物质溶液：分别含有0U/mL、200U/mL、400U/mL、1600U/mL、3200U/mL、6400U/mL的sIL-2R的标准物质溶液(含有150mmol/L氯化钠、4％BSA、1％蔗糖和0.01％Bioace的10mmol/L磷酸缓冲液，pH7.5)

酶标抗体溶液：含规定量(24～140ng/mL)的实施例1中级分40～46的经POD标记抗体的标记抗体稀释液(含有150mmol/L氯化钠、10％FBS、0.2％NP-40、100μg/mL小鼠IgG、200μg/mL MAK33-IgG1/IgG1Poly、0.2％Proxel GXL、10％POD稳定化缓冲液及0.16μg/mL POD的75mmol/L的MES缓冲液，pH6.5)

洗涤液：含有150mmol/L氯化钠、0.05％吐温20的10mmol/L磷酸缓冲液，pH6.8

OPD溶液：含有2mg/mL OPD、0.75g/L尿素过氧化氢盐、0.01％Proclin300的100mmol/L的磷酸-柠檬酸缓冲液，pH4.4

反应终止液：1mol/L的硫酸

还另行用イムライズIL-2R(DPC公司出品)测定了各血清中的sIL-2R。结果见表5。

[表5]

第5表

此结果表明，采用イムライズIL-2R的试剂盒测定，HAMA血清中的sIL-2R也低，能够充分抑制HAMA的非特异性反应。

实施例5

含有HAMA的检测样品中sIL-2R的测定(2)

测定在正常人血清中加入了不同量HAMA血清的检测样品中的sIL-2R，以便了解不同HAMA的浓度对测定值的影响。

首先，以用于制备检测样品的HAMA血清I型(Lot.90643656)、HAMA血清II型(Lot.92069858)和正常人血清(F41489B)作为样品，用实施例4的试剂测定各样品中的sIL-2R，同时，用于HAMA测定的夹心ELISA试剂盒ImmuSTRIP HAMA Fragment(Immunomedics公司出品)测定HAMA。各自的测定结果、以及在制备检测样品时使用了5倍浓缩的HAMA血清(以下简称5x HAMA血清)而得到的5x HAMA血清中的sIL-2R以及HAMA浓度的理论值，都表示在表6中。

[表6]

第6表

5x HAMA血清(血清I型或血清II型)与正常人血清分别以1∶1、1∶2和1∶4的比例混合作为样品，用实施例4的试剂和イムライズIL-2R测定各样品中的sIL-2R。另一方面，根据上述求得的5x HAMA血清及正常人血清的sIL-2R浓度与样品的血清混合比进行计算，求出各样品中的sIL-2R理论值，再通过测定值与理论值之比，求出对测定值的影响率(％)。同样根据sIL-2R理论值计算求得各样品中的HAMA的浓度。

5x HAMA与正常人血清的混合比为1∶a时的sIL-2R理论值

＝(5x HAMA血清之sIL-2R浓度(理论值)+正常人血清的sIL-2R浓度×a)/(1+a)

影响率(％)＝[(sIL-2R浓度的测定值/sIL-2R浓度的理论值)X100]]-100

第7表中表示采用实施例4的试剂、第8表中表示采用イムライズIL-2R抗体分别得到的各样品中HAMA的浓度、sIL-2R浓度的理论值和测定值，以及影响率。

[表7]

第7表用实施例4的试剂测定结果

[表8]

第8表用イムライズIL-2R抗体的测定

对于HAMA血清I型，用实施例4的试剂测定时，即使HAMA浓度增加到65.3μg/mL(为市售HAMA血清I型中所含HAMA的2.5倍)，对测定值的影响率也为10％以下，而用イムライズIL-2R测定时，对测定值的影响率为30～40％，说明受到HAMA的影响。对于HAMA血清II型，用实施例4的试剂测定时，即使HAMA浓度增加到31.1μg/mL(为市售HAMA血清II型中所含HAMA的2.5倍)，对测定值的影响率为5％以下，而用イムライズIL-2R测定时，对测定值的影响率为120～160％，说明受到HAMA很大的影响。根据这些结果，也表明用イムライズIL-2R时，对HAMA引起的非特异性反应的抑制不充分，而用实施例4的试剂对HAMA引起的非特异性反应则可以充分抑制。

实施例6

sIL-2R测定试剂盒

由以下各种试剂组成试剂盒。

1)抗sIL-2R抗体固定化板

将4μg/mL KTM-302抗体以100μL/孔制成固相化的8孔X12条的96孔微型滴定板

2)酶标抗体

成分：含有规定量(24～140ng/mL)的实施例1中的级分40～46的POD标记抗体的酶标抗体稀释液(含有150mmol/L氯化钠、10％FBS、0.2％NP-40、100μg/mL小鼠IgG、200μg/mL MAK33-IgG1/IgG1Poly、0.2％Proxel GXL、10％POD稳定化缓冲液及0.16μg/mL POD的75mmol/L的MES缓冲液，pH6.5)

体积：6mL/瓶

3)标准物质

相当于0U/mL、200U/mL、400U/mL、1600U/mL、3200U/mL、6400U/mL的sIL-2R的标准物质溶液[(含有150mmol/L氯化钠、4％BSA、1％蔗糖和0.01％Bioace的10mmol/L磷酸缓冲液，pH7.5)0.5mL/瓶的冷冻干燥制品。

4)检测样品稀释液

成分：含有150mmol/L氯化钠、4％BSA、1％蔗糖、0.2％Proxel GXL、20μg/mL小鼠IgG的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.45)0.5mL/瓶的冷冻干燥制品。

体积：6mL/瓶

5)发色底物

OPD片(Sigma-Aldrich公司出品)，10mg/片X 6

6)发色基底物溶解液

成分：含有0.75g/L尿素过氧化氢盐及0.1％Proclin300的100mmol/L磷酸-柠檬酸缓冲液(pH4.4)

体积：30mL/瓶

7)反应终止液

成分：1mol/L硫酸

体积：6mL/瓶

8)洗涤液

含有150mmol/L氯化钠和0.05％吐温20的10mmol/L磷酸缓冲液(pH6.8)

实施例7

对由于与POD反应的抗体而引起的非特异性反应的抑制

(1)显示由非HAMA引起的非特异性反应的检测样品

用检测样品稀释液(含有50mmol/L氯化钠、4％BSA、1％蔗糖、0.2％Proxel GXL和20μg/mL小鼠IgG的10mmol/L磷酸缓冲液，pH7.45)将人血清检测样品A稀释成1/1、1/4、1/8，用实施例4的试剂测定各自的sIL-2R浓度。在第9表中，表示了根据测定值及测定值与稀释率求出的检测样品原液的sIL-2R的计算值。检测样品原液的sIL-2R计算值由于稀释率不同而有差异，稀释的线性关系不好，说明产生了非特异性反应。

[表9]

第9表

为了确认检测样品的非特异性反应是否由于HAMA引起，用测定HAMA的试剂盒HAMA ELISA(罗氏诊断公司出品)测定了检测样品A中所含的HAMA的浓度。结果表示在表10中，在HAMA血清I型、HAMA血清II型中，检测到高浓度的HAMA，而检测样品A的HAMA值却在检测限5ng/mL以下，否定了存在HAMA。因此，考虑检测样品A的非特异性反应是由HAMA以外的原因引起的。

[表10]

第10表

样品	HAMA测定值(ng/mL)
		检测样品A	3.5
HAMA血清I型	3603
		HAMA血清II型	18033

(2)检测样品A非特异性反应的抑制

将检测样品A用检测样品稀释液稀释至1/2、1/4、1/6、1/11、1/21、1/31，用后述成分的、用由高碘酸法标记的POD标记抗体组成的sIL-2R测定试剂(以下简称sIL-2R测定试剂B)测定sIL-2R，根据测定值及稀释率求出的检测样品原液的sIL-2R的计算值。同时，sIL-2R测定试剂B除酶标抗体外和实施例4的试剂构成相同，该POD标记抗体，没有经凝胶过滤分离抗体。

sIL-2R测定试剂B

抗sIL-2R抗体固定化板：将4μg/mL KTM-302抗体以100μL/孔制成固相化的8孔X12条的96孔的微型滴定板

标准物质溶液：分别含有0U/mL、200U/mL、400U/mL、1600U/mL、3200U/mL、6400U/mL的sIL-2R的标准物质溶液[(含有150mmol/L氯化钠、4％BSA、1％蔗糖和0.01％Bioace的10mmol/L磷酸缓冲液，pH7.5)

酶标抗体溶液：含有规定量(24～140ng/mL)的由高碘酸法标记的POD标记抗体的标记抗体稀释液(含有150mmol/L氯化钠、10％FBS、0.2％NP-40、20μg/mL小鼠IgG、0.2％Proxel GXL、10％POD稳定化缓冲液及0.16μg/mL POD的10mmol/L的磷酸缓冲液，pH7.5)

洗涤液：含有150mmol/L氯化钠和0.05％吐温20的10mmol/L磷酸缓冲液，pH6.8

OPD溶液：含有2mg/L OPD、0.75g/L尿素过氧化氢盐、0.01％Proclin 300的100mmol/L磷酸-柠檬酸缓冲液，pH4.4

反应终止液：1mol/L硫酸

另一方面，将检测样品A用小鼠血清稀释至1/2、1/4、1/8，用实施例4的试剂测定sIL-2R进行非特异性反应吸收试验，结果计算出检测样品A中所含的sIL-2R的理论值为3624U/mL。根据上述和使用实施例4的试剂时各种稀释率时检测样品原液中sIL-2R的计算值，求出与理论值3624U/mL之比，和sIL-2R的测定值、检测样品原液中sIL-2R的计算值一起，表示于表11(用实施例4的试剂时)和表12(用sIL-2R测定试剂B时)中。

[表11]

第11表

[表12]

第12表

比较稀释率同样为1/4的检测样品的测定值时，表明用sIL-2R测定试剂B的测定值为用实施例4的试剂时的约4倍。同时，实施例4的试剂在稀释率为1/8时，几乎对非特异性反应没有影响，而sIL-2R测定试剂B，可以看到在稀释率为1/11时相对于理论值为125％，对非特异性反应几乎无作用，因此必须稀释为1/21～1/31的。有报告指出，用高碘酸法使酶和抗体结合，一般会形成聚合化的高度聚合的标记抗体(石川荣治著《酶免疫测定法》1987年，医学书院发行)。因此，在sIL-2R测定试剂B中使用的由高碘酸法标记的POD标记抗体，考虑包含着每分子抗体结合的POD分子数高达1∶4或1∶5，或以2∶2、2∶3及3∶1的比例结合的抗体。

根据以上结果，说明采用了实施例1的级分40～46的POD标记抗体、即抗体与POD结合比率分别为1∶1或1∶2的POD标记抗体的实施例4的试剂，可以有效抑制由HAMA以外的其它原因引起的非特异性反应。

(3)钝化的过氧化物酶对检测样品A的非特异性反应的影响

采用加入了200μg/mL MAK33-IgG Poly或400μg/mL无活性Poly-POD的实施例4的试剂，测定1/4稀释的检测样品A及对照血清II(在正常人血清中加入sIL-2R而成)的sIL-2R。也进行实施例4的试剂测定作为对照。结果见表13所示。同时，在对照血清II中含有的sIL-2R，用sIL-2R测定试剂B测定为2154U/mL，计算得出稀释为1/4的检测样品A的sIL-2R的理论值为906U/mL(3624U/mL X 1/4)。

[表13]

第13表

实施例4的试剂中即使加入了200μg/mL MAK33-IgG Poly或400μg/mL的无活性Poly-POD，并不改变对照血清II的测定值，所以可以认为对测定***没有影响。

稀释为1/4的检测样品A用实施例4的试剂测定sIL-2R的数值是2022U/mL，与理论值比照，可以发现非特异性反应，但在标记抗体稀释液中加入MAK33-IgG Poly或无活性Poly-POD，测定值降低到接近理论值，进一步抑制了非特异性反应。特别是加入了无活性Poly-POD，几乎完全抑制了非特异性反应，证明存在由与POD起反应的抗体引起的非特异性反应。实施例4的试剂可以抑制检测样品A的非特异性反应，即与POD起反应的抗体引起的非特异性反应，如果还同时存在无活性Poly-POD，则可以充分抑制抗POD抗体引起的非特异性反应。

在产业上应用之可能性

本发明提供了用于病症监控和疾病诊断等中样本中待测对象的免疫学定量方法及其定量试剂，以及免疫学定量方法中抑制非特异性反应的方法。

Claims

1.一种非特异性反应被抑制的可溶性白介素-2受体的免疫学定量方法，其包括下列步骤：

在含水介质中让与可溶性白介素-2受体特异性结合的第一抗体经酶标记后形成的酶标抗体与样品反应，由此形成酶标抗体与可溶性白介素-2受体的免疫复合体，所述酶标抗体为第一抗体和酶之间的结合比率是1∶1、1∶2的酶标抗体占整个酶标抗体的分子数目的50％以上的酶标抗体，以及

测定免疫复合体的酶活性。

2.如权利要求1所述的免疫学定量方法，还包含下列步骤：让一种抗体与样品反应，由此与可溶性白介素-2受体形成免疫复合体，在所述抗体中，分离手段结合第二抗体，所述第二抗体特异性结合的抗原决定部位与结合第一抗体的可溶性白介素-2受体的抗原决定部位不同。

3.如权利要求1或2所述的免疫学定量方法，其中第一抗体是除去了Fc部分的抗体。

4.如权利要求1或2所述的免疫学定量方法，其中非特异性反应是由人抗鼠抗体引起的反应。

5.如权利要求1或2所述的免疫学定量方法，其中在使酶标抗体与样品反应而与可溶性白介素-2受体形成免疫复合体的步骤中，同时存在IgG聚合体和IgG或二者之一。

6.如权利要求1或2所述的免疫学定量方法，其中非特异性反应是由与标记酶发生反应的抗体引起的反应。

7.如权利要求1或2所述的免疫学定量方法，其中在使酶标抗体与样品反应而与可溶性白介素-2受体形成免疫复合体的步骤中，同时存在钝化的该标记酶。

8.如权利要求1或2所述的免疫学定量方法，其中酶是过氧化物酶。

9.一种在非特异性反应被抑制、可溶性白介素-2受体的免疫学定量方法中使用的试剂，其包括与可溶性白介素-2受体特异性结合的第一抗体经酶标记后形成的酶标抗体，所述酶标抗体为第一抗体和酶之间的结合比率是1∶1、1∶2的酶标抗体占整个酶标抗体的分子数目的50％以上的酶标抗体。

10.如权利要求9所述的试剂，还含有一种抗体，其中分离手段结合第二抗体，所述第二抗体特异性结合的抗原决定部位与结合第一抗体的可溶性白介素-2受体的抗原决定部位不同。

11.如权利要求9或10所述的试剂，其还含有用于测定酶活性的试剂。

12.如权利要求9或10所述的试剂，其中第一抗体是除去了Fc部分的抗体。

13.如权利要求9或10所述的试剂，其中非特异性反应是由人抗鼠抗体引起的反应。

14.如权利要求9或10所述的试剂，其还含有IgG聚合体和IgG或二者之一。

15.如权利要求9或10所述的试剂，其中非特异性反应是由与标记酶发生反应的抗体引起的反应。

16.如权利要求9或10所述的试剂，其还含有使标记抗体的酶钝化后得到的酶。

17.如权利要求9或10所述的试剂，其中酶是过氧化物酶。

18.如权利要求9或10所述的试剂，还含有选自含水介质、金属离子、盐类、糖类、表面活性剂、防腐剂、蛋白质、蛋白质稳定剂中的一种或多种物质。

19.一种在可溶性白介素-2受体的免疫学定量方法中用于抑制非特异性反应的方法，包括下列步骤：

在含水介质中让与可溶性白介素-2受体特异性结合的第一抗体经酶标记后形成的酶标抗体与样品反应，由此形成酶标抗体与可溶性白介素-2受体的免疫复合体，所述酶标抗体为第一抗体和酶之间的结合比率是1∶1、1∶2的酶标抗体占整个酶标抗体的分子数目的50％以上的酶标抗体。

20.如权利要求19所述的抑制方法，还包括下列步骤：让一种抗体与样品反应，由此与可溶性白介素-2受体形成免疫复合体，在所述抗体中，分离手段结合第二抗体，所述第二抗体特异性结合的抗原决定部位与结合第一抗体的可溶性白介素-2受体的抗原决定部位不同。

21.如权利要求19或20所述的抑制方法，其中第一抗体是除去了Fc部分的抗体。

22.如权利要求19或20所述的抑制方法，其中非特异性反应是由人抗鼠抗体引起的反应。

23.如权利要求19或20所述的抑制方法，其中在使酶标抗体与样品反应从而与可溶性白介素-2受体形成免疫复合体的步骤中，同时存在IgG聚合体和IgG或二者之一。

24.如权利要求19或20所述的抑制方法，其中非特异性反应是由与标记酶反应的抗体引起的反应。

25.如权利要求19或20所述的抑制方法，其中在使酶标抗体与样品反应从而与可溶性白介素-2受体形成免疫复合体的步骤中，同时存在钝化的该标记酶。

26.如权利要求19或20所述的方法，其中酶是过氧化物酶。