CN1958789B - 一种真菌共培养发酵生产漆酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种真菌共培养发酵生产漆酶的方法，将栓菌AH28-2(Trametes sp.AH28-2)的菌悬液接种在发酵培养基中于22～37℃培养1～4天，然后加入木霉ZH1(Trichoderma sp.ZH1)的菌悬液继续培养5～10天，最后分离得到漆酶制剂，酶活达6,000U/L(愈创木酚法)。培养基为液体培养基，主要含一定量的碳源、氮源、钾与钠的磷酸盐、铜与铁的硫酸盐、腺嘌呤和维生素B等。本方法中不用芳香化合物和重金属离子诱导，安全、环保，酶活高且活力稳定。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种工业用酶制剂的制备方法，特别涉及工业用漆酶的制备方法，确切地说是一种真菌共培养发酵生产漆酶的方法。
二、背景技术
漆酶(Laccase，ECl.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶，能够催化多种酚类和非酚类化合物的氧化，同时伴随着氧还原成水。漆酶广泛存在于高等植物和高等真菌(特别是担子菌)中。漆酶作用底物广泛、催化效率高，在生物制浆和漂白、食品风味的改良、饲料营养的改善、纺织染料的降解和转化、纺织纤维的软化细化、新型药物开发、新型生物传感器的研制及新型能源开发等领域具有潜在重要应用价值[洪宇植，肖亚中，房伟等(2005)Trametes sp.AH28-2漆酶A的诱导合成及其基因5′-端调控区的克隆与分析.生物工程学报21：547-552；Xiao YZ，Hong YZ，Li JF et al(2006)Cloning of novel laccase isozyme genes from Trametes sp.AH28-2 andanalyses of their differential expression.Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-005-0188-2]，近年来成为国际酶工程学和环境科学交叉领域研究的热点之一。
目前，真菌漆酶大多采用人工合成培养基液态深层发酵进行制备，该过程需要添加芳香类化合物和/或重金属离子作为诱导物，增加了成本；并且，毒性诱导物的引入使得发酵液后处理难度大，易造成环境污染，难以进行大规模工业化生产。
微生物共培养是指将有益微生物加入培养基中，以促进另一种微生物菌株的生长或提高其代谢活性，该方法已在多个领域得以应用。利用基于微生物相互控制技术的共培养法发酵生产漆酶，与传统的生产方法相比具有两方面优点：(1)成本低廉：无需昂贵的诱导剂，发酵液后处理简单；(2)安全清洁：避免了毒性芳香物和重金属离子的使用。
国际上已初步开展了共培养法发酵生产漆酶的相关研究：1997年，德国学者Lang对此进行了最早的报道，他们用Pleurotus菌(侧耳属)等在土壤中培养，两个月内产生的酶活力低于7U/g(ABTS法)[Lang E，Eller G and Zadrazil F(1997)Lignocellulose decomposition andproduction of ligninolytic enzymes during interaction of white rot fungi with soil microorganisms.MicrobialEcology 34：1-10]；2001年丹麦学者Crowe报道荧光假单胞菌(Pseudomonas，fluorescens)能够诱导立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)产生少量漆酶[Crowe JD and Olsson S(2001)Induction oflaccase activity in Rhizoctonia solani by antagonistic Pseudomonas，fluorescens strains and a range of chemicaltreatments.Appl Environ Microbiol 67：2088-2094]；同年，法国学者Savoie研究了木霉(Trichoderma)对7株叶腐担子菌、7株木腐担子菌漆酶合成的影响，酶活力均有不同程度提高，其中香菇(Lentinula edodes)漆酶的活力由262.6提高到326.6μmol min-1 L-1(ABTS法)[Savoie JM，Mata G and Mamoun M(2001)Variability in brown line formation and extracellular laccase production duringinteraction between white-rot basidiomycetes and Trichoderma harzianum biotype Th2.Mycologia93：243-248]；2002年，俄国学者Koroleva等将漆酶产生菌Cerrena maxima和锰过氧化物酶产生菌Cerrena hirsutus共培养，漆酶活力有所增加[Koroleva OV，Gavrilova VP，Stepanova EV et al(2002)Production of lignin modifying enzymes by co-cultivated white-rot fungi Cerrena maxima andCoriolus hirsutus and characterization of laccase from Cerrena maxima.Enzyme Microb Tech 30：573-580]；2004年以色列学者Baldrian报道，木霉(Trichoderma sp.)与云芝(Trametes versicolor)共培养产生的酶活比空白提高了40倍，达44.2U/L[Baldrian P(2004)Increase of laccase activityduring interspecific interactions of white-rot fungi.FEMS Microbiol Ecology 50：245-253]；2005年墨西哥人Mata报道，以咖啡果肉为基质共培养平菇(Pleurotus spp)和木霉(Trichoderma spp)，酶活从150U/g上升到l80U/g[Mata G，Hernández D and Andreu L(2005)Changes in lignocellulolyticenzyme activites in six Pleurotus spp strains cultivated on coffee pulp in confrontation with Trichoderma spp.World J Microb Biot21：143-150]。
在国内，关于共培养影响漆酶表达量的报道仅有一篇，即平菇(Pleurotus sp.)与灵芝(Ganoderma sp.)混合培养进行固态发酵，酶活达到2,165U/g(ABTS法)，比单独培养的活力总和提高了近一倍[黄慧艳，张晓昱(2004)白腐菌混合培养在胞外漆酶分泌上的种属互惠性.中国食用菌23：31-33]。
这些研究说明，通过共培养微生物的相互控制技术可以提高漆酶的表达水平。然而，在这些研究中漆酶的产量均不高，难以达到工业化生产要求。另一方面，有关微生物共培养生产真菌漆酶的生产工艺未见有专利保护。
三、发明内容
本发明在共培养发酵中使用的两种真菌菌株系申请人自主选育的栓菌AH28-2(Trametes sp.AH28-2)和木霉ZH1(Trichoderma sp.ZH1)，其中前者为新型漆酶高产菌株，后者为微生物控制菌。以这两个菌株为材料进行漆酶的发酵生产。
本生产方法包括培养基配制、种液制备、灭菌、接种、共培养发酵和酶分离纯化，所述的共培养发酵就是先将栓菌AH28-2的菌悬液(种液)接种在培养基中于22～37℃培养1～4天，然后加入木霉ZH1的菌悬液(种液)于22～37℃继续培养5～10天，最后分离得到工业用漆酶制剂。若应用于食品、饮料或生物传感器领域，则漆酶蛋白需进一步纯化。
所述的培养基为液体培养基，每升含：10～30g碳源、1.0～4.0g氮源、0.5～1.5gKH2PO4、0.4～0.6g MgSO4·7H2O、0.05～0.15g Na2HPO4·5H2O、0.005～0.015g CaCl2、0.001～0.003gCuSO4·5H2O、0.0005～0.0015g FeSO4·7H2O、0.01～0.04g腺嘌呤、0.03～0.07g维生素B、pH4.0～8.0。
优选的培养基每升含：20g碳源、2.5g氮源、1.0g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.1gNa2HPO4·5H2O、0.01g CaCl2、0.002g CuSO4·5H2O、0.001g FeSO4·7H2O、0.0275g腺嘌呤、0.05g维生素B、pH4.5～6.5。
所述的碳源选自木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、海藻糖、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和甘油的一种或两种以上混合碳源，即每升培养基含总碳源量10～30g。优选木糖。
所述的氮源选自胰蛋白胨、蛋白胨、天门冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、KNO3、NH4O3中的一种或两种以上混合氮源，即每升培养基含总氮源量1.0～4.0g。优选胰蛋白胨。
所述的种液制备就是栓菌AH28-2和木霉ZH1各自接种在上述培养基中于28℃、100～200rpm培养1～3天，3000rpm匀浆约10s制成菌悬液。
本发明在漆酶生产过程中无需芳香化合物和重金属离子的诱导，发酵液后处理简单，因而生产工艺安全环保、成本低廉。本发明发酵获得的漆酶活力在6,000 U/L以上(愈创木酚法)，与先前用邻甲苯胺等芳香化合物高效诱导产生的酶活相当[Xiao YZ，TuXM，WangJ et al(2003)Purification，molecular characterization and reactivity with aromatic compounds of a laccasefrom a basidiomycete Trametes sp.strain AH28-2.Appl Microbiol Biotech 60：700-707]。与化学诱导法相比，本发明发酵生成的漆酶活力稳定。
申请人自主选育的栓菌AH28-2(Trametes sp.AH28-2)已于2005年11月22日送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNO：M205134；木霉ZH1(Trichoderma sp.ZH1)已于2006年1月16日送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNO：M206014。
四、具体实施方式
1、栓菌AH28-2和木霉ZH1菌悬液(种液)的制备
在土豆培养基(1L培养基：20％土豆汁、20g葡萄糖、3g KH2PO4、1.5g MgSO4·7H2O、0.4g维生素B，加1.5％琼脂制成固体培养基)斜面上4℃保存的栓菌AH28-2和木霉ZH1分别接种于已高温灭菌的种液培养基(1L培养基：15g葡萄糖、2.5g天冬酰胺、1.0g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.1g Na2HPO4·5H2O、0.01g CaCl2、0.002g CuSO4·5H2O、0.001gFeSO4·7H2O、0.0275g腺嘌呤和0.05g维生素B，自然pH)，28℃、100～200 rpm培养1～3天，3,000rpm匀浆约10s制成菌悬液。
2、共培养发酵培养基的制备
发酵产酶培养基(1L)：10～30g碳源、1.0～4.0g氮源、1.0g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.1g Na2HPO4·5H2O、0.01g CaCl2、0.002g CuSO4·5H2O、0.001g FeSO4·7H2O、0.0275g腺嘌呤和0.05g维生素B，pH4.0～8.0。
3、接种与发酵培养
将制备的栓菌AH28-2菌悬液按1～20％质量份数接种于已灭菌的发酵培养基中，100～200rpm、22～37℃培养1～4天，然后按0.1～10％质量份数加入木霉ZH1的菌悬液，继续培养5～10天至产酶高峰。
4、酶分离与纯化
发酵达到漆酶高峰期，发酵液经过滤分离菌体，即得到漆酶粗制剂。滤液可根据需要超滤浓缩或加水稀释(可用于纸浆漂白、工业染料脱色、废水处理、纤维软化、饲料加工等领域)。
粗酶制剂依次按下述步骤可获得纯酶，所有操作在4～10℃进行：①6,000rpm离心10min，上清液超滤浓缩10～50倍；②上清液在10mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(pH8.0)透析3～6小时，然后10,000rpm离心10min；③上清液上预先用透析液平衡的DEAE-Sepharose FF离子交换柱，并用0.3mol/L的硫酸铵进行线性洗脱，活性组分脱盐后用灭菌水(或去离子水)稀释，即可获得纯酶制剂(纯酶制剂除了可用于上述粗酶的应用领域外，还能用于食品和饮料工业、生物传感器等)。
5、具体操作例
(1)、从栓菌AH28-2和木霉ZH1的保藏斜面分别挑取1cm2的菌丝块，各自接种到装有100mL种液培养基的300mL三角瓶中，150rpm、28℃分别培养3天和1.5天，3,000rpm均浆10s制成菌悬液(临用现制)。
(2)、1L三角瓶中装350mL发酵培养基(1L：15g木糖、2.5g胰蛋白胨、1.0g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.1g Na2HPO4·5H2O、0.01g CaCl2、0.002g CuSO4·5H2O、0.001gFeSO4·7H2O、0.0275g腺嘌呤和0.05g维生素B，pH5.0～6.0)，高温灭菌后接种10mL栓菌AH28-2菌悬液，130rpm、28℃培养2.5天后，加入木霉ZH1菌悬液2.1mL，继续培养7天。
(3)、发酵液用八层纱布过滤去除菌体，滤液即是粗漆酶制剂，酶活在6,000U/L(愈创木酚法)以上。滤液经超滤浓缩冻干以便贮存，或加水稀释直接用于纸浆漂白、染料脱色、污水处理、纤维软化、饲料加工、酒精生产等。
(4)、若用于食品、饮料或生物传感器，则进一步纯化。按“4、酶分离与纯化”中所述的纯化步骤进行处理，得到纯漆酶制剂。
Claims (4)
1.一种真菌共培养发酵生产漆酶的方法，包括培养基配制、种液制备、灭菌、接种、共培养发酵和酶分离纯化，其特征在于：所述的共培养发酵就是先将栓菌AH28-2的菌悬液接种在经灭菌的培养基中于22～37℃培养1～4天，然后加入木霉ZH1的菌悬液于22～37℃继续培养5～10天，每升培养基含10～30g碳源、1.0～4.0g氮源、0.5～1.5g KH2PO4、0.4～0.6g MgSO4·7H2O、0.05～0.15g Na2HPO4·5H2O、0.005～0.015g CaCl2、0.001～0.003gCuSO4·5H2O、0.0005～0.0015g FeSO4·7H2O、0.01～0.04g腺嘌呤、0.03～0.07g维生素B、pH4.0～8.0；
所述的碳源选自木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、海藻糖、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和甘油的一种或两种以上混合碳源；
所述的氮源选自蛋白胨、天门冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、KNO3、NH4NO3中的一种或两种以上混合氮源。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的每升培养基含20g碳源、2.5g氮源、1.0g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.1g Na2HPO4·5H2O、0.01g CaCl2、0.002gCuSO4·5H2O、0.001g FeSO4·7H2O、0.0275g腺嘌呤、0.05g维生素B、pH4.5～7.5。
3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于：所述的碳源为木糖。
4.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于：所述的氮源为胰蛋白胨。
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