CN102583769A - 一种利用混和生物质发酵产酶处理染料废水的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用混和生物质发酵产酶处理染料废水的方法，该方法利用能产生木质素降解酶系的白腐菌为发酵产酶菌株，通过固体和液体培养方法，采用棉籽壳和/或水稻秸秆作为发酵底物，对木质素降解酶进行诱导，获得最佳木质素降解酶系，最后提取和分离制备粗酶液，并用于常用合成染料，如刚果红、苯酚红、溴酚蓝、结晶紫和孔雀绿等废水的脱色处理，从而获得染料污水最佳脱色效果，本发明方法简单，易操作，通过本发明方法诱导的酶系，酶解效率高，采用此酶系处理染料废水，能达到最佳脱色效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用混和生物质发酵产酶处理染料废水的方法，属于环境治理领域。
背景技术
刚果红、苯酚红、溴酚蓝、结晶紫和孔雀绿等合成染料是生物学实验室常用染料，广泛的应用于细胞特征结构染色、酶的生理生化特性研究以及细胞、个体毒理学研究等。它们化学性能稳定，具有极强的致畸、致癌、致突变的“三致”作用。染料污水如果不经处理，排放到中性环境中，能引起水体pH的变化，COD和TOC的增加，甚至导致生态危机的发生。染料吸收阳光，降低水体透射率，造成阳光不能投射到水底或投射到水底阳光强度极低，同时降低氧气在水中的溶解度，从而影响水生生物的光合作用。污水中金属离子等物质影响水生生物的生长发育。因此，对含以上合成染料的废水进行处理关乎环境安全和生态安全。
传统染料污水处理法主要是物理-化学法，包括薄膜过滤、凝结、吸附、电解、电-芬顿法、湿空气法、臭氧法等处理染料污水，这些方法的缺点是不能破坏染料结构、处理成本高、时间长、工艺复杂、效率低、染料专一性强，不利于含有多种染料污水的处理、高能量投入处理后产生大量污泥及其毒性副产物，还可能引起二次污染。由于传统处理工艺的缺陷，探寻高效、清洁环保的染料脱色技术是一项迫切的任务。
利用白腐菌产生的木质素降解酶系，对染料污水进行生物处理，是染料污水处理的一个趋势。这类丝状真菌产生的可分泌到胞外的、非底物专一性的木质素氧化酶系具有对多种有机物和染料氧化降解的能力，尤其是漆酶，该酶具有广泛的作用底物，可以氧化降解多种酚类化合物及其衍生物以及芳香胺，以分子氧作为最终电子受体而不是过氧化氢，在生物技术许多领域具有潜在应用价值。
麦秆、稻秆、稻壳、锯末、玉米芯、棉籽壳等农业废弃物是白腐真菌发酵产酶的天然诱导物，且由于它们在纤维素、半纤维素、木质素、果胶、色素、蛋白质和多酚类物质等组成上的不同，以它们作为发酵基质时，白腐菌产酶酶系组成上会有很大的差异。由于不同酶及其比例在染料处理中的作用不同，因此对染料废水的处理效率也会有差异。栓菌属是白腐菌的一个大的类群，其分泌木质素降解酶的种类、比例及其产量与菌株、培养基组分和培养条件有关。
目前Trametes versicolor，Trametes trogii，Phanerochaete chrysosporium等中的多个株系被用于木质素降解酶的产生和有色、有毒物质的解毒和脱色研究。但其发酵基质多为葡糖糖、蔗糖、淀粉等单一成分试剂，或者是利用单一的农业废弃物成分，如麦秆、稻秆、稻壳、锯末、玉米芯、棉籽壳等。因此，不能有效的发挥不同农业废弃物成分在诱导产酶上的优势，不利于优化木质素降解酶系的组成和提高其酶解效率。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用混和生物质发酵产酶处理染料废水的方法，该方法利用能产生木质素降解酶系白腐菌为发酵产酶菌株，采用棉籽壳、水稻秸杆或其任意比混合的基质，作为发酵底物，对木质素降解酶进行诱导，获得最佳木质素降解酶系，并提取和分离制备粗酶液，用于染料废水的脱色处理，从而获得染料污水最佳脱色效果。
本发明通过以下步骤实现：
（1）菌种种子的培养
将菌种接种到麦芽汁培养基（MEA）或马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基（PDA）上，30-37℃下培养6-10天后获得斜面种子，将斜面活化后的种子接种到麦芽汁培养基或PDA培养基上扩大培养，30-37℃下培养2-15天，即得固体发酵种子；
麦芽汁培养基（MEA）：麦芽提取物20g，葡萄糖10g，15g琼脂，1L蒸馏水，自然pH；
PDA培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15g，1L蒸馏水，自然pH或4.5；
（2）发酵产酶
将固体发酵种子接种到固体发酵基质中，接种量按每5g基质接种4片菌块（菌块直径1cm），35-55℃下培养7-21天；
（3）粗酶液的提取制备
在固体发酵基质发酵至7-21天时，取适量固体发酵基质用于粗酶液的提取，按每1克固体发酵基质添加3-50ml液体的比例，在固体发酵基质中添加无菌水或0.1M柠檬酸钠磷酸缓冲液，混匀后室温250rpm搅拌30min后，再10000rpm离心10min，取上清液即得粗酶液；
0.1M柠檬酸钠磷酸缓冲液的配制：取300ml无菌水，加入27.617g十二水合磷酸氢二钠，溶解完全，定容至385.5ml；取600ml无菌水，加入12.916g柠檬酸，定容至614.5ml；将上述溶液混匀，调节PH至4.0，定容至1000ml，即得0.1M柠檬酸钠磷酸缓冲液；
（4）染料废水的处理
将粗酶液与染料废水按1:1-80的比例混匀，在30℃-37℃，150rpm下处理24-48h，获得处理后废水，并检测废水中染料变化情况。
本发明中所述菌种为能产生木质素降解酶系（包括漆酶、木质素氧化酶和锰过氧化物酶等）的白腐菌。
本发明中所述能产生木质素降解酶系的白腐菌为毛栓菌（Trametes trogii）、粗毛栓菌（Trametes gallica）、黄孢原毛平革菌（Phanerochete chrysosporium）、云芝（Coriolus versicolor）等中任一种。
本发明中所述菌块直径为1cm。
本发明中所述产酶固体发酵基质的组分为质量百分比2%的麦芽提取物，13mM硫酸铜，质量百分比0.5-20%的棉籽壳和/或水稻秸秆（棉籽壳和水稻秸秆按任意比例混合使用），其余为水，最后混合基质121℃，30min灭菌后备用。
本发明方法相对于现有技术的优点和技术效果：
1、本发明方法简单，易操作，通过本发明方法诱导的酶系，酶解效率高。
2、本发明方法中利用棉籽壳或/和水稻秸杆作为发酵底物，对木质素降解酶进行诱导，可以获得最佳木质素降解酶系，采用此酶系处理染料废水，能达到最佳脱色效果。
附图说明
图1是本发明菌种培养7d，25%棉籽壳为发酵基质的粗酶液对溴酚蓝溶液脱色曲线示意图。
图2 是本发明菌种培养7d，25%棉籽壳为发酵基质的粗酶液对孔雀绿溶液脱色曲线示意图。
图3是本发明菌种Trametes trogii ATCC 200800不同基质配比漆酶活性分析曲线示意图，其中横坐标是培养天数，纵坐标是酶活性，0,25,50,75,100表示固体发酵基质中棉籽壳的百分含量。
图4是本发明中菌种Trametes trogii ATCC 200800在固体培养基中产木质素降解酶系的结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1：本利用混和生物质发酵产酶处理染料废水的方法，具体步骤如下：
（1）Trametes trogii ATCC 200800种子的培养
将毛栓菌的菌丝接种到麦芽汁培养基（MEA）上，30℃下培养8天后获得斜面种子，将斜面活化后种子接种到麦芽汁培养基上，30℃下培养6天，即得固体发酵种子；
（2）发酵产酶
将固体发酵种子接种到固体发酵基质中，接种量按每5g基质接种4片菌块（菌块直径1cm），35℃下培养7天；
产酶固体发酵基质的成分是质量百分比2%的麦芽提取物，13mM硫酸铜，质量百分比20%的棉籽壳和水稻秸秆混合物（棉籽壳和水稻杆的混合比例如表1），其余为水分，最后混合基质再121℃，灭菌30min后备用。
表1：固体发酵基质中棉籽壳和水稻杆的混合比例
| 棉籽壳（%） | 0 | 25 | 50 | 75 | 100 |
| 水稻秸秆（%） | 100 | 75 | 50 | 25 | 0 |
（3）粗酶液的提取制备
培养至第7天取2g固体发酵基质用于粗酶液的提取，按每1克固体发酵基质添加20ml 0.1M柠檬酸钠磷酸缓冲液，混匀后室温250rpm搅拌30min后，再10000rpm离心10min，取上清液即得粗酶液；
（4）染料废水的处理
脱色反应体系及反应条件：将粗酶液与染料废水（含溴酚蓝26.08mg/L）按质量比1:40的比例混匀，在30℃下，150rpm下处理不同时间，并分别于0，0.5，1，3，6，9，12，24h取样检测废水中染料变化情况。
结果表明：粗酶液对溴酚蓝的脱色效果最好，最终脱色率都达到80％以上，其中在固体发酵基质中添加25%棉籽壳发酵产酶并用于脱除溴酚蓝时，脱色效果最好，6h脱色率达到86%，最终脱色率达90%（图1）；棉籽壳含量为100%，75%，50%，0%的脱色效果次之。
实施例2：本利用混和生物质发酵产酶处理染料废水的方法，具体步骤如下：
（1）Trametes trogii ATCC 200800种子的培养
将毛栓菌的菌丝接种到麦芽提取物培养基（MEA）上，35℃下培养10天后获得斜面种子，将斜面种子接种到麦芽汁培养基上，35℃下培养4天，即得固体发酵种子；
（2）发酵产酶
将固体发酵种子接种到固体发酵基质中，接种量按每5g基质接种4片菌块（菌块直径1cm），35℃下培养21天；
产酶固体发酵基质的成分是质量百分比2%的麦芽提取物，13mM硫酸铜，质量百分比20%的棉籽壳和水稻秸秆混合物（棉籽壳和水稻杆的混合比例如表2），其余为水分，最后混合基质再121℃，灭菌30min后备用。
表2：固体发酵基质中棉籽壳和水稻杆的混合比例
| 棉籽壳（%） | 0 | 25 | 50 | 75 | 100 |
| 水稻秸秆（%） | 100 | 75 | 50 | 25 | 0 |
（3）粗酶液的提取制备
培养至第21天取2g固体发酵基质用于粗酶液的提取，按每1克固体发酵基质添加50ml 0.1M柠檬酸钠磷酸缓冲液，混匀后室温250rpm搅拌30min后，再10000rpm离心10min，取上清液即得粗酶液；
（4）染料废水的处理
脱色反应体系及反应条件：将粗酶液与染料废水（含孔雀绿8.028mg/L）按质量比1:1的比例混匀，在35℃下，150rpm下处理不同时间，并分别于0，0.5，1，3，6，9，12，24h取样检测废水中染料变化情况。实验结果显示：固体发酵基质中添加50%和25%的棉籽壳发酵产酶并用于脱除孔雀绿时，脱色效果最好，其中25%的棉籽壳发酵产酶12h可达到45%脱色率，最终脱色率为58%，而100和75脱色效果差（图2）。
实施例3：本利用混和生物质发酵产酶处理染料废水的方法，具体步骤如下：
（1）Trametes trogii ATCC 200800种子的培养
将毛栓菌的菌丝接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面上，37℃下培养6天后获得斜面种子，将斜面种子接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面上，37℃下培养2天，即得固体发酵种子；
（2）发酵产酶
将固体发酵种子接种到固体发酵基质中，接种量按每5g基质接种4片菌块（菌块直径1cm），37℃下培养15天；
产酶固体发酵基质的成分是质量百分比2%的麦芽提取物，13mM硫酸铜，质量百分比0.5%的棉籽壳和水稻秸秆混合物（质量比1：1混合），其余为水分，最后混合基质再121℃，灭菌30min后备用；
（3）粗酶液的提取制备
培养至第15天取2g固体发酵基质用于粗酶液的提取，按每1克固体发酵基质添加3ml无菌水，混匀后室温250rpm搅拌30min后，再10000rpm离心10min，取上清液即得粗酶液；
（4）染料废水的处理
将粗酶液与染料废水（含苯酚红15.13mg/L）按体积比1:80的比例混匀，在37℃下，150rpm下处理24h取样检测废水中染料变化情况，结果显示苯酚红的脱出率为37%。
实施例4：利用混和生物质发酵产酶处理染料废水的方法，具体步骤如下：
（1）粗毛栓菌（Trametes gallica）种子的培养
将粗毛栓菌的菌丝接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面上，32℃下培养7天后获得斜面种子，将斜面种子接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面上，30℃下培养15天，即得固体发酵种子；
（2）发酵产酶
将固体发酵种子接种到固体发酵基质中，接种量按每5g基质接种4片菌块（菌块直径1cm），55℃下培养7天；
产酶固体发酵基质的成分是质量百分比2%的麦芽提取物，13mM硫酸铜，质量百分比10%的棉籽壳和水稻秸秆混合物（质量比1:2混合），其余为水分，最后混合基质再121℃，灭菌30min后备用；
（3）粗酶液的提取制备
培养至第7天取2g固体发酵基质用于粗酶液的提取，按每1克固体发酵基质添加30ml无菌水，混匀后室温250rpm搅拌30min后，再10000rpm离心10min，取上清液即得粗酶液；
（4）染料废水的处理
将粗酶液与染料废水（含刚果红30.10mg/L）按体积比1:30的比例混匀，在35℃下，150rpm下处理48h取样检测废水中染料变化情况，结果显示刚果红的脱出率为41%。
实施例5：利用混和生物质发酵产酶处理染料废水的方法，具体步骤如下：
（1）云芝（Coriolus versicolor）种子的培养
将云芝菌的菌丝接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面上，35℃下培养9天后获得斜面种子，将斜面种子接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面上，35℃下培养12天，即得固体发酵种子；
（2）发酵产酶
将固体发酵种子接种到固体发酵基质中，接种量按每5g基质接种4片菌块（菌块直径1cm），50℃下培养8天；
产酶固体发酵基质的成分是质量百分比2%的麦芽提取物，13mM硫酸铜，质量百分比5%的棉籽壳和水稻秸秆混合物（质量比2:3混合），其余为水分，最后混合基质再121℃，灭菌30min后备用；
（3）粗酶液的提取制备
培养至第8天取2g固体发酵基质用于粗酶液的提取，按每1克固体发酵基质添加10ml无菌水，混匀后室温250rpm搅拌30min后，再10000rpm离心10min，取上清液即得粗酶液；
（4）染料废水的处理
将粗酶液与染料废水（含刚果红30.10mg/L）按体积比1:50的比例混匀，在35℃下，150rpm下处理40h取样检测废水中染料变化情况，结果显示刚果红的脱出率为45%。
实施例6：粗酶液中漆酶活性的测定
菌种培养发酵（发酵35天）产酶和粗酶液的制备方法同实施例1，酶活性测定方法：用pH4.0的100mM柠檬酸钠缓冲液配制2mM的2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐（ABTS）溶液，取上述ABTS溶液1.1ml，加入0.4ml 经40倍稀释的粗酶液，混合均匀，开始计时，记下在前3min内OD420 变化情况，每个样品做三个重复；阴性对照加入等体积经105℃、15min失活处理的粗酶液。酶活定义：一个单位酶活（1U）每min内氧化1μmol ABTS所需要的酶量。按下式计算漆酶活性: U(U／g)=N× Δ OD420 × 106／36000×3 ，其中N为稀释倍数，ΔOD420 为3min内反应液在420nm处吸光度的吸光度增加值，420nm处ABTS摩尔消光系数: ε420=36000/mol × cm-1。
由图3可知，不同配比的基质，对漆酶的诱导作用不同，在发酵到第7天时，漆酶活性都达到最大，其中棉籽壳含量为25%酶活性最高，0%的次之，35天漆酶活性普遍升高，可能是营养物质消耗殆尽，真菌菌体裂解，释放除体内的漆酶，活性增加，不含棉籽壳的固体发酵基质中的漆酶活性与其它差别较大，可能是水稻秸秆吸收性很强，易于保湿所致。
实施例7：毛栓菌（Trametes trogii）固体培养基中得产木质素降解酶系分析
锰过氧化物酶酶活验证：验证培养基为麦芽提取物20g，琼脂15g，MnCL2 0.5mM，定容至1L；将毛栓菌接种于培养基中37℃下培养3d观察平板颜色变化并拍照。
漆酶酶活验证：验证培养基为麦芽提取物20g，琼脂15g，ABTS 250mg，定容至1L；将毛栓菌接种于培养基中37℃培养3d观察平板颜色变化并拍照。
结果如图4所示，发现添加氯化锰平板颜色变为棕褐色，显示该菌能显著产生锰过氧化物酶。添加ABTS平板颜色变为黄褐色，显示该菌能产生漆酶，根据文献报道称锰过氧化物酶和漆酶，是合成染料脱色中的关键酶，因此说明该菌具有合成染料脱色的能力。
Claims (5)
1.一种利用混和生物质发酵产酶处理染料废水的方法，其特征在于按如下步骤进行：
（1）菌种种子的培养
将菌种接种到麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，30-37℃下培养6-10天后获得斜面种子，将斜面活化后的种子接种到麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基上扩大培养，30-37℃下培养2-15天，即得固体发酵种子；
（2）发酵产酶
将固体发酵种子接种到固体发酵基质中，接种量按每5g基质接种4片菌块，35-55℃下培养7-21天；
（3）粗酶液的提取制备
在固体发酵基质发酵至7-21天时，取适量固体发酵基质用于粗酶液的提取，按每1克固体发酵基质添加3-50ml液体的比例，在固体发酵基质中添加无菌水或0.1M柠檬酸钠磷酸缓冲液，混匀后室温250rpm搅拌30min后，再10000rpm离心10min，取上清液即得粗酶液；
（4）染料废水的处理
将粗酶液与染料废水按体积比1:1-80的比例混匀，在30℃-37℃，150rpm下处理24-48h，获得处理后废水。
2.根据权利要求1所述的利用混和生物质发酵产酶处理染料废水的方法，其特征在于：菌种为能产生木质素降解酶系的白腐菌。
3.根据权利要求2所述的利用混和生物质发酵产酶处理染料废水的方法，其特征在于：能产生木质素降解酶系的白腐菌为毛栓菌、粗毛栓菌、黄孢原毛平革菌、云芝中任一种。
4.根据权利要求1所述的利用混和生物质发酵产酶处理染料废水的方法，其特征在于：菌块直径1cm。
5.根据权利要求1所述的利用混和生物质发酵产酶处理染料废水的方法，其特征在于：产酶固体发酵基质的组分为质量百分比2%的麦芽提取物，13mM硫酸铜，质量百分比0.5-20%的棉籽壳和/或水稻秸秆，其余为水，最后混合基质121℃，灭菌30min后备用。
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