CN1955171B - 一种制备丹参酚酸b的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从丹参中提取丹参酚酸B的制备方法，该方法为丹参水提液中加入抗氧剂，抗氧剂用量为提取液体积的0.001％-10％，采用过滤、离心或自然沉降法去除沉淀，滤液上非极性或弱极性大孔树脂，洗脱液酸化至pH＝1～4。

Description

一种制备丹参酚酸B的方法

技术领域

本发明涉及一种丹参酚酸B的制备方法。

背景技术

丹参Salviamiltiorrhiza是具有活血化瘀功效的传统中药，对心脑血管疾病具有显著疗效，自古以来就广泛应用于临床。药理研究表明水溶性的酚酸成分是丹参活血化瘀的有效成分，具有显著的抗脂质过氧化，清除自由基和抗血栓作用。

随着人口老龄化进程的加速以及生活方式的改变，心脑血管病已成为一个全球性的健康问题，冠心病、卒中的死亡率在世界范围分别居第1、3位。新型有效的防治心脑血管病药物的开发已刻不容缓。随着中药现代化进程的日益深入，具有显著抗脂质过氧化、清除自由基和抗血栓作用的丹参酚酸类成分越来越引起人们的注意。目前已有不少以丹参酚酸为主要药效成分的药物制剂，如丹参注射液、香丹注射液等。

研究表明，在丹参的干燥根中，酚酸B含量在5％左右，个别产地所产丹参中酚酸B的含量高达8％-10％。丹参酚酸B是丹参中主要的酚酸类成分，也是丹参具有活血化瘀功效的主要活性成分。但在目前的丹参药物制剂中，其酚酸类成分主要由丹参素和原儿茶醛组成，丹参酚酸B的含量很低。这是由于丹参酚酸B是二分子丹参素与一分子原紫草酸缩合而成的四聚咖啡酸类化合物，其化学结构中存在的酚羟基和羧基很不稳定，低浓度的丹参酚酸B水溶液在常温下经24小时后酚酸B即损失30％左右。现有的丹参提取过程中往往经过多次加热处理，使大部分丹参酚酸B降解为丹参素和寡聚咖啡酸的脱水、脱羧产物或进一步氧化成原儿茶醛、原儿茶酸。丹参素虽然也是丹参具有活血化瘀作用的有效成分之一，但在加热条件下同样易氧化分解。总而言之，丹参作为一种疗效显著的传统中药，在目前的制剂工艺中，其利用度是很低的。

现有的丹参注射液的的制备方法是：取丹参药材，加10倍量的注射用水煎煮2小时，过滤，保留第一次煎液；药渣再用8倍量的注射用水煎煮2小时，过滤，保留第二次煎液；药渣再加5倍量的注射用水煎煮1小时，过滤，保留第三次煎液；药渣再加5倍量的注射用水煎煮1小时，过滤，保留第四次煎液，去除药渣。然后合并四次煎煮液，蒸发浓缩至含丹参为2克/毫升的浓缩液。浓缩液中加入乙醇至含醇量为70％-80％，于0℃-5℃条件下放置12-36小时，过滤去除沉淀；滤液蒸馏浓缩至含丹参为3克/毫升的浓缩液，再加入乙醇至含醇量为80％-90％，于0℃-5℃条件下放置48-72小时，过滤去除沉淀；滤液蒸馏浓缩至含丹参为3克/毫升的浓缩液，再加入4倍量的注射用水，于0℃-5℃条件下放置12-36小时，过滤去除沉淀；滤液加热浓缩至含丹参为5克/毫升的浓缩液，再加入4倍量的注射用水，于0℃-5℃条件下放置48-72小时，过滤去除沉淀，滤液加热浓缩至含丹参为5克/毫升的浓缩液，加入活性碳，加热煮沸，制得丹参精制液。在这一工艺中，经过多次加热处理，丹参酚酸B损失90％以上，由丹参酚酸B降解产生的丹参素也损失巨大。

如何在提取工艺中保持丹参酚酸B的稳定性，最大限度地利用丹参中的有效成分，是药物研究工作者努力的方向。目前已有以丹参酚酸B提取对象的工艺和方法。如专利公开号为CN 1425659A的国家发明专利中公开了一种丹参酚酸B的制备方法。其工艺步骤为：1.水提取；2.用盐酸或硫酸酸化提取液；3.采用非极性或弱极性的大孔树脂或MCIGEL-CHP-20P、SephadexLH-20凝胶、C18键合相或C18键合相色谱柱填料通过柱层析法分离纯化丹参酚酸B；4.冷冻干燥。通过该方法可获得纯度在90％以上的丹参酚酸B制品。但我们在研究中发现，采用酸化处理丹参水提液时，丹参酚酸B的损失达20％，采用60％-85％乙醇沉淀处理时丹参酚酸B损失达30％以上；由于丹参酚酸B具有较大的极性，丹参水提、酸化后上非极性或弱极性的大孔树脂，直接以不同浓度醇(或其它有机溶剂)洗脱时层析柱的处理能力较低，按该专利说明书中所述大孔树脂处理丹参水提液中上柱样品(以原药材干重计算)与树脂量之比仅为1∶4(W∶W)，以丹参酚酸B计仅约5.5mg/ml大孔树脂；如果采用MCIGEL-CHP-20P、SephadexLH-20凝胶、C18键合相或C18键合相色谱柱填料，则生产成本将大幅度提高。

本发明提供了一种新的丹参酚酸B的制备方法，该方法在处理过程中尽可能地保持了丹参酚酸B的稳定性，并在保证产品质量的同时使单位体积大孔树脂对丹参酚酸B的处理能力提高了4倍以上，非常适于大规模的工业化生产。

发明内容

本发明提供了一种丹参酚酸B的制备方法。

本发明提供的制备方法为：丹参水提液上非极性或弱极性大孔树脂，其特征为，丹参水提液中加入抗氧剂，抗氧剂用量为提取液体积的0.001％-10％，洗脱液酸化至PH＝1～4。具体为：

1.水提丹参中的酚酸类成分时加入抗氧剂。

所用水可为常水、纯水、注射用水等，优选为纯水；水温应保持0-50℃，优选为室温。提取方法可以是浸渍、渗漉或超声萃取。上述浸渍法是取粉碎后可过三号筛的丹参加水一次性浸渍提取或多次浸渍提取。每次浸渍用5-20倍量水，浸渍时间为2-8小时。推荐方案为：第一次浸渍用20倍量水，浸渍时间为2小时，第二次浸渍用10倍量水，浸渍时间为4小时。合并两次提取液，过滤、离心或自然沉降初步去除提取液中的固体杂质。上述渗漉法是取粉碎后可过三号筛的丹参装于一有机玻璃制成的渗漉柱或桶中，边装边适当压实，渗漉柱或桶上端留出约1/5体积，加水至所有药材浸没，静止浸泡4小时。打开渗漉柱下端阀门，使渗漉液缓缓流出，每小时流出渗漉液约为丹参干重的一倍，同时不断注入水至渗漉柱上端。以HPLC跟踪检测渗漉液中丹参酚酸B的含量，确定用12-16倍量水渗漉可比较完全地提取出丹参酚酸B。上述超声法是取粉碎后可过三号筛的丹参，加水一次性提取或多次提取。每次提取用5-20倍量水，提取时间为0.5-2小时。推荐方案为：第一次用20倍量水，提取时间为0.5小时，第二次浸渍用10倍量水，浸渍时间为1.5小时。合并两次提取液，过滤、离心或自然沉降初步去除提取液中的固体杂质。

将上述水提液中加入抗氧剂，静置4-24小时，溶液变混浊并逐渐析出沉淀，采用过滤、离心或自然沉降法去除沉淀。抗氧剂可以是亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、抗坏血酸、焦亚硫酸钠。优选为亚硫酸氢钠和抗坏血酸。抗氧剂的用量为提取液体积的0.001％-10％，优选为0.005％-1％，再优选为0.005％-0.01％。加入抗氧剂的目的是延缓溶液中的溶解氧对丹参酚酸B的氧化作用。丹参酚酸B分子结构中的酚羟基和羧基很不稳定，尤其是在低浓度条件下极易氧化降解成丹参素和寡聚咖啡酸的脱水、脱羧产物或进一步氧化成原儿茶醛、原儿茶酸；并且水提液中含有大量的胶质成分，加入抗氧剂后，可产生盐析效果而去除这部分杂质。

本发明人设计了以下对比实验来考察抗氧剂对丹参水提液中丹参酚酸B的保护作用并比较了醇沉、酸化去除杂质的效果：

取上述丹参水提液5份，其中四份分别加入0.01％的亚硫酸氢钠、0.01％的抗坏血酸、以盐酸调至pH2、以95％乙醇调至醇浓度为75％，另外一份不做任何处理。5份溶液在用HPLC检测其中的丹参酚酸B含量后除菌、密封，室温下放置两天，观察溶液状态，HPLC检测溶液中的丹参酚酸B含量并与两天前比较。结果表明，处理过的丹参水提液均出现沉淀，目测沉淀的量基本相同，而加入抗氧剂的水提液中丹参酚酸B含量明显比其它三种溶液稳定。

   表一  不同方法处理丹参水提液后丹参酚酸B的变化

2.采用大孔树脂作层析介质，以酸性溶剂作洗脱用溶剂。

选用弱极性或非极性的大孔树脂，如AB-8、DM-130等，洗脱用溶剂均用酸调至酸性。由于丹参酚酸B具有较大的极性，采用非极性或弱极性的大孔树脂，层析介质与丹参酚酸B的结合较弱，单位体积树脂对丹参酚酸B的处理量较低。若强制增大上柱样品量，则用低浓度洗脱剂即可洗出丹参酚酸B，选择性不高，并且由于丹参酚酸B在洗脱流出液中分布较为分散，导致洗脱剂用量过大，增大了后续浓缩工序的工作量。本发明中的洗脱液均用酸调至酸性，增大了丹参酚酸B与树脂的结合能力，大大提高了单位体积树脂对丹参酚酸B的处理量，正常上柱样品量(以料液中丹参酚酸B量计算)达到25mg/ml大孔树脂。具体方法如下：

将上述加入抗氧剂静置4-24小时后的丹参水提物上清液加至大孔树脂柱上；上样量(以料液中丹参酚酸B量计算)10-40mg/ml大孔树脂，优选为20-30mg/ml大孔树脂。上样完成后，用酸水(用酸调pH＝1-4的纯水)冲洗柱子3-8个柱体积，至HPLC检测流出液中杂质峰接近基线为止；先用低浓度的有机溶剂水溶液(用酸调pH＝1-4)洗去大部分杂质，再换用中等浓度的有机溶剂水溶液洗脱得到高纯度的丹参酚酸B溶液，最后用高浓度的有机溶剂水溶液洗去层析柱上残留杂质并对大孔树脂进行再生处理。

所用有机溶剂为醇类、丙酮、乙腈等，优选为乙醇。

调节洗脱溶剂所用酸为盐酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸等，也可以是亚硫酸氢钠、抗坏血酸等具有酸功能的抗氧剂。优选为盐酸。

上述洗脱溶剂调至pH＝1-4，优选至pH＝2-3。

上述所用低浓度的有机溶剂水溶液，有机溶剂浓度为15％-45％，优选20％-25％，洗脱体积为3-15个柱体积，优选为5-10个柱体积。

上述所用中等浓度的有机溶剂水溶液，有机溶剂浓度为35％-85％，优选40％，洗脱体积为3-15个柱体积，优选为3-5个柱体积。

上述所用高浓度有机溶剂水溶液，有机溶剂浓度为85％-100％，优选95％，洗脱体积为3-5个柱体积，最后用纯水洗10-20个柱体积，至流出液中无有机溶剂的味道为止。

3.干燥：收集上述通过大孔树脂层析所得高纯度的丹参酚酸B溶液，在70℃、真空度-0.1Mpa的条件下减压脱醇浓缩至含药量5％左右，冷冻干燥，制品中丹参酚酸B含量在90％以上。通过HPLC跟踪检测各操作单元中丹参酚酸B的回收率，结果见表二。

        表二  不同操作单元中丹参酚酸B的回收率*

*取干燥丹参，粉碎过三号筛，加50倍量水超声提取30min，HPLC检测上清液中丹参酚酸B的含量。以此确定丹参中酚酸B的量，定为100％。

在本发明所涉及的丹参酚酸B制备方法中，水提丹参时采用常温或低温，避免了丹参酚酸B的降解；水提液加入抗氧剂，不但有利于保持酚酸B的稳定性，同时产生的盐析效果可有效去除胶质等杂质；洗脱过程采用酸性洗脱溶剂，增大了上柱丹参酚酸B与树脂的结合能力，不但显著提高了单位体积的大孔树脂对丹参酚酸B的处理能力，还提高了洗脱条件的选择空间。因此，本发明所涉及的丹参酚酸B制备方法不但可以得到高质量的丹参酚酸B制品，而且丹参酚酸B的收率和处理能力也大为提高，对降低生产成本，提高丹参的利用度，充分利用中药材资源具有重要意义，极其有利于工业化大生产。

附图说明

图1为实施例1制备的丹参酚酸B制品色谱图，各成分在色谱分析中保留时间、面积百分比等数值见表三。

          表三  实施例1制备的各成分保留时间、面积百分比

图2为丹参酚酸B对照品色谱图，各成分在色谱分析中保留时间、面积百分比等数值见表四。

         表四  对照品制备的各成分保留时间、面积百分比

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明，但并不意味着本发明仅限与此。

实施例1：丹参酚酸B的制备

水提取(浸渍法)：取丹参粉碎可过三号筛，称50Kg，按其重量的20倍量加纯水，室温浸泡4小时并适当搅拌，分离提取液，残渣按原丹参重量的10倍加水，室温浸泡6小时并适当搅拌，分离提取液。合并两次提取液，用过滤方法去除其中的固体杂质。

在上述提取液中加入抗氧剂亚硫酸氢钠，亚硫酸氢钠的用量为提取液体积的0.005％。静置6小时，溶液变混浊并逐渐出现沉淀，过滤去除沉淀，经HPLC测定，滤液中丹参酚酸B量为2.632Kg。

将上述滤液加至处理好的AB-8型大孔树脂柱，先用5个柱体积的酸水(用盐酸调pH＝2的纯水)洗柱，去除大部分未与大孔树脂结合的杂质，再用25％的乙醇水溶液洗5个柱体积，然后用40％乙醇洗脱5个柱体积，基本可将丹参酚酸B收集完全。最后用95％乙醇洗脱3个柱体积后用去离子水洗10-20个柱体积，再生柱子。

收集上述用40％乙醇洗脱时的流出液，在70℃、真空度-0.1Mpa的条件下减压脱醇浓缩至含药量5％左右，冷冻干燥，制得丹参酚酸B含量为95.45％的样品2.461Kg，丹参酚酸B回收率为89.25％。

实施例2：丹参酚酸B的制备

与实施例1基本相同，所不同的是，水提过程采用渗漉法。具体方法如下：

取粉碎后可过三号筛的丹参50Kg装于一有机玻璃制成的渗漉柱或桶中，边装边适当压实，渗漉柱或桶上端留出约1/5体积。加纯水至所有药材浸没，静止浸泡4小时。打开渗漉柱下端阀门，使渗漉液缓缓流出，每小时流出渗漉液约为丹参干重的一倍，同时不断注入水至渗漉柱上端。渗漉13倍水量后以HPLC检测渗漉液中丹参酚酸B的含量已降至很低，停止渗漉。合并渗漉液加入抗氧剂亚硫酸氢钠，亚硫酸氢钠的用量为提取液体积的0.01％。最终制得丹参酚酸B含量为93.38％的样品2.455Kg，丹参酚酸B回收率为87.10％。

实施例3：丹参酚酸B的制备

与实施例1基本相同，所不同的是，水提液中加入提取液体积0.005％的抗坏血酸代替亚硫酸氢钠。处理丹参药材50Kg，最终得到丹参酚酸B含量为94.12％的样品2.471Kg，丹参酚酸B回收率为88.40％。

实施例4：丹参酚酸B的制备

与实施例1基本相同，所不同的是，在大孔树脂层析分离纯化丹参酚酸B的单元操作中采用低浓度洗脱剂为20％的甲醇-水溶液洗5个柱体积，中浓度洗脱剂为40％的甲醇-水溶液洗4个柱体积。处理丹参药材50Kg，最终得到丹参酚酸B含量为94.38％的样品2.446Kg，丹参酚酸B回收率为87.74％。

实施例5：丹参酚酸B的制备

与实施例1基本相同，所不同的是，在大孔树脂层析分离纯化丹参酚酸B的单元操作中采用低浓度洗脱剂为20％的丙酮-水溶液洗5个柱体积，中浓度洗脱剂为40％的丙酮-水溶液洗3个柱体积。处理丹参药材50Kg，最终得到丹参酚酸B含量为92.38％的样品2.479Kg，丹参酚酸B回收率为87.04％。

实施例6：丹参酚酸B的制备

与实施例1基本相同，所不同的是，在大孔树脂层析分离纯化丹参酚酸B的单元操作中采用低浓度洗脱剂为15％的乙腈-水溶液洗5个柱体积，中浓度洗脱剂为40％的乙腈-水溶液洗3个柱体积。处理丹参药材50Kg，最终得到丹参酚酸B含量为93.46％的样品2.511Kg，丹参酚酸B回收率为89.20％。

Claims (1)

1.一种丹参酚酸B的制备方法，其特征为：丹参水提液加入抗氧剂亚硫酸氢钠或抗坏血酸，抗氧剂用量为提取液体积的0.005％-0.01％，静置4-6小时，溶液变浑浊并逐渐析出沉淀，采用过滤、离心或自然沉降法去除沉淀，将滤液加至处理好的AB-8或DM-130型大孔树脂柱，先用盐酸调PH＝2-3的纯水洗脱5个柱体积，再用25％的乙醇水溶液洗5个柱体积，然后用40％乙醇洗脱5个柱体积，收集流出液，冷冻干燥即得。