CN1940078A - 一种生物防腐剂苯乳酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种生物防腐剂苯乳酸的制备方法，涉及微生物发酵生物转化制备苯乳酸的一种方法，属于食品生物技术领域。本发明用乳酸菌作为菌种，以苯丙氨酸、苯丙酮酸或苯丙酮酸钠为转化底物，添加碳源、氮源及无机盐组成发酵培养基，发酵法生物转化制备苯乳酸。所用乳酸菌在MRS培养基中，25－40℃培养，生长良好，作为种子培养液，发酵培养基碳源为葡萄糖、麦芽糖、乳糖或蔗糖，氮源选用玉米浆、酵母膏、蛋白胨、大豆粕中的一种或几种混合使用，发酵后经检测，在发酵液中苯乳酸浓度达50－150mg/100ml。本发明所得产品安全可靠，具有很强的抑菌功能。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物防腐剂苯乳酸的制备方法，具体涉及微生物发酵生物转化制备苯乳酸的一种方法，属于食品生物技术领域。
背景技术
苯乳酸(phenyllactic acid)是近年来发现的一种新型天然防腐剂，1998首次证实苯乳酸对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)有很强的抑制作用。现已证明，苯乳酸能够抑制多种食源性致病菌如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、致病性大肠杆菌(Escherichia coli O157：H7)；特别是对引起食物腐败的真菌包括产生毒素的真菌有广谱的抑制作用，其抑菌活性强于常见的防腐剂。苯乳酸安全性高，是一种天然抑菌物质。它存在于天然蜂蜜中，对人和动物细胞无毒，是继乳酸菌产生的第一代抑菌物质如乳酸、醋酸，第二代抑菌物质如Nisin(乳链球菌素)等细菌素以外的第三代天然抑菌物质。目前Nisin和纳他霉素已用于食品工业，但存在诸如抑菌谱窄、理化性质差等问题，如Nisin只能抑制除乳酸菌以外的G+细菌，而对绝大部分G-细菌、酵母菌和霉菌没有作用；纳他霉素只对霉菌有抑制作用。与Nisin和纳他霉素相比，苯乳酸是一种新型天然防腐剂，有较广的抑菌谱，能抑制食源性致病菌、腐败菌，特别是它能抑制真菌的污染可延长食品的货架期；溶解性好、易于在各种食品体系中扩散；稳定性高、具有宽广的pH范围和热稳定性；这些优点使其在食品工业中的应用有广阔的前景。
目前苯乳酸的制备有化学催化合成以及生物转化方法。化学合成法有许多不利的因素，例如产生多种副产物和化学污染物，而形成的众多副产物又使分离、纯化步骤变得复杂。近年来研究人员都在寻找生物转化的方法来制备苯乳酸，由于乳酸菌是GRAS(公认为安全)的微生物，用安全菌株合成苯乳酸成为当前研究的热点。最近报道某些乳酸菌能够利用MRS培养基产生苯乳酸，但产量低、菌种个体差别非常大，最高产量为9.9mg/100ml。目前关于乳酸菌生产苯乳酸尚无相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物防腐剂苯乳酸的制备方法，具体内容涉及利用乳酸菌发酵生物转化制备苯乳酸的一种方法。本发明采用的乳酸菌能够将苯丙氨酸、苯丙酮酸或苯丙酮酸钠转化为苯乳酸，转化率高、副产物少，通过发酵转化取得了显著效果，为苯乳酸的生物转化提供了一个新途径。
本发明的技术方案：以乳酸菌(Lactobacillus plantarum，Lactobacilluspentose)作为菌种，以苯丙氨酸、苯丙酮酸或苯丙酮酸钠为转化底物，采用碳源、氮源以及无机盐组成发酵培养基，发酵法生物转化制备苯乳酸。
(1)菌种：采用乳酸菌
Lactobacillus plantarum AS1.550；Lactobacillus plantarum AS1.557；
Lactobacillus plantarum CICC6003；Lactobacillus plantarum CICC6014；
Lactobacillus pentose BCRC11053；Lactobacillus pentose BCRC15317。
用乳酸菌作为菌种生物转化时，选用Lactobacillus plantarum AS1.550或Lactobacillus pentose BCRC15317效果尤好。
(2)培养基，以g/100ml计：
保藏培养基：葡萄糖1.5，酵母膏1，碳酸钙1.5，琼脂1.5，pH 6.5-7.0。
种子培养基：葡萄糖1，蛋白胨1，酵母膏1，无水乙酸钠1，磷酸钾0.02，硫酸镁0.02，硫酸锰0.005，pH 6.5-7.0。
(3)制备工艺：
菌种保藏：所用菌种保藏在保藏培养基上，4℃保存，两周转接一次。
种子培养：从保藏培养基上转入种子培养基需活化2次，每次30℃培养12h。
发酵：底物苯丙氨酸、苯丙酮酸或苯丙酮酸钠在培养基中浓度为0.1％-0.4％(W/V)，种子培养液以1％-3％的接种量，接入添加不同碳源、氮源以及无机盐组成的发酵培养基中，250ml三角瓶装液量为200ml，碳源添加水平为发酵培养基的0.5％-3％(W/V)，氮源添加水平为发酵培养基的0.5％-3.5％(W/V)，发酵培养基组成以g/100ml计为：苯丙氨酸、苯丙酮酸或苯丙酮酸钠0.1-0.4，碳源0.5-3.0，氮源0.5-3.5，无水乙酸钠1，磷酸钾0.02，硫酸镁0.02，硫酸锰0.005，pH 6.2-6.8，25-40℃静置培养12-24h得到含苯乳酸的发酵液。所用碳源为葡萄糖、麦芽糖、乳糖或蔗糖，所用氮源为玉米浆、酵母膏、蛋白胨、大豆粕中的一种或几种混用。
优选的发酵培养基以g/100ml计：苯丙氨酸、苯丙酮酸或苯丙酮酸钠0.3，葡萄糖2，玉米浆1，酵母膏1，无水乙酸钠1，磷酸钾0.02，硫酸镁0.02，硫酸锰0.005，pH 6.2-6.4为较好。
检测苯乳酸的方法如下：
取发酵液离心，上清液经微孔滤膜过滤(0.22μm)，滤液上HPLC分析。HPLC条件：Agilent1100色谱柱：ZORBAX 300SB C18(5μm、4.6×250mm)，流动相为(A)0.05％三氟乙酸/水和(B)0.05％三氟乙酸/甲醇，不同时间段0、20、23、25、30分钟的洗脱液A/B体积比组成为10∶90、0∶100、0∶100、10∶90、10∶90进行梯度洗脱。检测器：紫外检测器，210nm，柱温：30℃，流速：1ml/min，进样量：10μl，苯乳酸标样浓度：0.5％。
所用菌种为Lactobacillus plantarum AS1.550；Lactobacillus plantarumAS1.557；Lactobacillus plantarum CICC6003；Lactobacillus plantarum CICC6014；Lactobacillus pentose BCRC11053；Lactobacillus pentose BCRC 15317，以上菌种均已公开，AS编号表示(China General Microbiological Cuture Collection Center.CGMCC.Institute of Micribiology，Chinese Academy of Science：中国微生物菌种委员会普通微生物中心)。CICC编号表示(China Center of Industrial Culture：中国工业微生物菌种保藏管理中心)。BCRC编号表示(Bioresource Collection andResearch Center：台湾生物资源保藏研究中心)。其后编号代表保藏编号，具体查看各菌种数据库网页。
本发明的有益效果：本发明提供了一种利用乳酸菌发酵生物转化制备苯乳酸的方法，表明通过发酵的方法，12h苯乳酸的产量可以达到50-150mg/100ml。采用所述乳酸菌能将苯丙氨酸、苯丙酮酸或苯丙酮酸钠转化为苯乳酸，转化率高、副产物少，通过发酵转化取得了显著效果，为苯乳酸的生物转化提供了一个新途径。
具体实施方式
通过实验，得到了影响发酵转化苯乳酸产率的主要因素：
实施例1不同菌种对苯乳酸产量的影响
在发酵培养基中添加0.3％的苯丙酮酸(分析纯)，按说明书上述的优选的培养基对初选的一些乳酸菌进行发酵实验，发酵12h后对发酵液进行检测，结果如表1所示，Lactobacillus plantarum AS1.550，Lactobacillus pentose BCRC15317的苯乳酸产率较高，不同菌种对苯乳酸的生成有较为显著的区别。
表1不同菌种对产苯乳酸的影响
| 菌种 | 苯乳酸(mg/100ml) |
| Lactobacillus plantarum AS1.550Lactobacillus plantarum AS1.557Lactobacillus plantarum CICC6003Lactobacillus plantarum CICC6014Lactobacillus pentose BCRC11053Lactobacillus pentose BCRC15317 | 147461053159136 |
实施例2发酵时间对产苯乳酸的影响
按说明书所述的发酵条件，添加0.3％的苯丙酮酸，通过对Lactobacillusplantarum AS1.550在不同发酵时间产苯乳酸的检测，发现发酵12h苯乳酸含量最高，随着发酵时间延长，苯乳酸含量稍有下降。所以确定发酵时间为12h，发酵时间对产苯乳酸的影响如表2所示。
表2发酵时间对产苯乳酸的影响
| 时间(h) | 6 | 12 | 24 | 48 |
| 苯乳酸(mg/100ml) | 110 | 147 | 144 | 134 |
实施例3不同底物苯丙氨酸、苯丙酮酸或苯丙酮酸钠对产苯乳酸的影响
按说明书所述的发酵条件，分别添加0.3％不同底物苯丙氨酸、苯丙酮酸或苯丙酮酸钠，通过对Lactobacillus plantarum AS1.550在发酵12h后产苯乳酸的检测，苯丙酮酸钠为底物时苯乳酸含量最高。不同底物苯丙氨酸、苯丙酮酸或苯丙酮酸钠对产苯乳酸的影响如表3所示。
表3不同底物苯丙氨酸、苯丙酮酸或苯丙酮酸钠对产苯乳酸的影响
| 苯丙氨酸 | 苯丙酮酸 | 苯丙酮酸钠 | |
| 苯乳酸(mg/100ml) | 50 | 147 | 150 |
Claims (3)
1.一种苯乳酸的制备方法，其特征是以乳酸菌(Lactobacillus plantarum，Lactobacillus pentose)作为菌种，以苯丙氨酸、苯丙酮酸或苯丙酮酸钠为转化底物，采用碳源、氮源及无机盐组成发酵培养基，发酵法生物转化制备苯乳酸；
(1)菌种：采用乳酸菌Lactobacillus plantarum AS1.550；Lactobacillusplantarum AS1.557；Lactobacillus plantarum CICC6003；Lactobacillus plantarumCICC6014；Lactobacillus pentose BCRC11053或Lactobacillus pentose BCRC15317；
(2)培养基，以g/100ml计：
保藏培养基：葡萄糖1.5，酵母膏1，碳酸钙1.5，琼脂1.5，pH 6.5-7.0；
种子培养基：葡萄糖1，蛋白胨1，酵母膏1，无水乙酸钠1，磷酸钾0.02，硫酸镁0.02，硫酸锰0.005，pH 6.5-7.0；
(3)制备工艺：
菌种保藏：所用菌种保藏在保藏培养基上，4℃保存，两周转接一次；
种子培养：从保藏培养基转入种子培养基需活化2次，每次30℃培养12h；
发酵：底物苯丙氨酸、苯丙酮酸或苯丙酮酸钠在培养基中的浓度为0.1％-0.4％(W/V)，种子培养液以1％-3％的接种量，接入添加不同碳源、氮源以及无机盐组成的发酵培养基中，250ml三角瓶装液量为200ml，碳源添加水平为发酵培养基的0.5％-3％(W/V)，氮源添加水平为发酵培养基的0.5％-3.5％(W/V)，发酵培养基组成以g/100ml计为：苯丙氨酸、苯丙酮酸或苯丙酮酸钠0.1-0.4，碳源0.5-3.0，氮源0.5-3.5，无水乙酸钠1，磷酸钾0.02，硫酸镁0.02，硫酸锰0.005，pH 6.2-6.8，25-40℃静置培养12-24h，得到含苯乳酸的发酵液，所用碳源为葡萄糖、麦芽糖、乳糖或蔗糖，所用氮源为玉米浆、酵母膏、蛋白胨、大豆粕中的一种或几种混用。
2.根据权利要求1所述的苯乳酸的制备方法，其特征是发酵培养基以g/100ml计：苯丙氨酸、苯丙酮酸或苯丙酮酸钠0.3，葡萄糖2，玉米浆1，酵母膏1，无水乙酸钠1，磷酸钾0.02，硫酸镁0.02，硫酸锰0.005，pH 6.2-6.4。
3.根据权利要求1所述的苯乳酸的制备方法，其特征是菌种选用Lactobacillus plantarum AS1.550或Lactobacillus pentose BCRC15317。
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