CN106399195A - 一种干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一株干酪乳杆菌及其在微生物转化合成苯乳酸中的应用，该干酪乳杆菌株命名为（Lactobacillus casei）HRS67，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No. M 2016216。以本发明提供的菌株为出发菌株，经发酵培养可以合成苯乳酸，发酵液中浓度可达20 mg/L；以本发明提供菌株的菌体为全细胞催化剂，对含苯丙酮酸的底物溶液进行微生物转化，得到含苯乳酸的转化液，其中苯乳酸浓度可达11.2 g/L。本发明提供的菌株分离自泡菜食品，是典型的益生菌，以其为发酵微生物或全细胞微生物催化剂，不仅具有很好的生物安全性，还具有发酵和转化条件温和、转化液中产物浓度高、放大容易等优点，具有很好的工业应用前景。

Description

一种干酪乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种干酪乳杆菌微生物菌株及其在发酵和转化合成苯乳酸中的应用。
背景技术
苯乳酸是近几年研究的一种具有广谱抑菌特性的食品和药品防腐剂，也是合成聚苯乳酸高分子材料的重要单体，还可以用于合成抗血小板凝聚和心肌梗塞药物，因此，苯乳酸在化工、材料、医药和食品等许多领域都具有重要应用前景。
传统的化学合成法制备苯乳酸具有原料来源较方便、成本较低、规模化生产容易实现等优点，但还存在一些难以克服的局限性，如使用高毒溶剂、较严重的环境污染及产物中溶剂残留问题等。利用微生物发酵或微生物转化合成苯乳酸，具有条件温和、环境友好和合成路径较简便等优点，成为近几年苯乳酸制备方面的重要发展方向。
但是，微生物发酵合或转化合成苯乳酸时，存在一些关键难题，例如菌株的安全性、转化产率不高、产物浓度很低。因此，需要探索生物安全性好、转化率高和产物浓度高的苯乳酸发酵合成或转化合成新菌株及转化合成新方法。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明目的是提供一株干酪乳杆菌株，并提供其在苯乳酸合成中的应用。该菌株既有很好的生物安全性，又有很好的发酵合成和转化合成苯乳酸的能力。
为实现上述目的，所采取如下的技术方案：
（1）一种干酪乳杆菌株，其特征在于，所述菌株命名为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）HRS67，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No. M 2016216。保藏时间：2016年4月21日；保藏地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院，邮编430072。
进一步，所述的干酪乳杆菌株（Lactobacillus casei）HRS67菌株为革兰氏阳性杆菌, 0.8微米×1.5~2.0微米；成链生长，不生芽孢；不运动；兼性厌氧；过氧化氢酶阴性；化能异养。
更进一步，所述的干酪乳杆菌株（Lactobacillus casei）HRS67菌株16S rDNA序列如SEQ ID NO ：1所示。
（2）一种干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）HRS67在发酵合成苯乳酸中的应用。
进一步，该应用以所述的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）HRS67菌株为出发菌株，在液体培养基中进行发酵，得到含有苯乳酸的发酵液。
进一步，所述的液体培养基组成为：所述的液体培养基组成为：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，柠檬酸氢二胺2 g，无水乙酸钠5 g，硫酸锰0.25 g，硫酸镁0.58 g，磷酸氢二钾2 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，吐温80 1 g，去离子水1 L，pH值自然。
进一步，所述的发酵条件为：温度25~35℃，发酵时间24~72h，静置发酵。
更进一步，所述的含有苯乳酸的发酵液中，苯乳酸终浓度为5.3~20 mg/L。
（3）一种干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）HRS67在微生物转化制备苯乳酸中的应用。
进一步，该用于以所述的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）HRS67菌株发酵所得的菌体为全细胞生物催化剂，对含苯丙酮酸的底物溶液进行微生物转化，得到含苯乳酸的转化液。
进一步，所述的含苯丙酮酸的底物溶液用苯丙酮酸、葡萄糖及磷酸盐缓冲液配制而成。
进一步，所述的含苯丙酮酸的底物溶液的组成为：葡萄糖14 g，苯丙酮酸15 g，100mM pH 8的磷酸盐缓冲液1 L。
进一步，所述的微生物转化条件为：干酪乳杆菌株（Lactobacillus casei）HRS67菌株菌体浓度100 g/L，转化温度为35℃，转化时间为4 h。
更进一步，所述的含苯乳酸的转化液中，苯乳酸的终浓度可达11.2 g/L，转化率74%。
通过采用上述技术，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明提供的菌株分离自泡菜食品，是典型的益生菌，其发酵合成苯乳酸具有很好的生物安全性。
（2）以本发明提供的菌株为全细胞微生物催化剂，转化合成苯乳酸时，具有转化条件温和、转化迅速、转化液中产物浓度高、放大容易等优点，转化液中苯乳酸的浓度可达11.2 g/L，具有很好的工业应用前景。
具体实施方式
为了更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
本发明从传统泡菜中进行菌株分离筛选。取一定量泡菜汁液，于无菌水中进行稀释，在含有碳酸钙的固体培养基（组成：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，柠檬酸氢二胺2 g，无水乙酸钠5g，硫酸锰0.25 g，硫酸镁0.58 g，磷酸氢二钾2 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，吐温80 1 g，琼脂20 g，碳酸钙30 g，去离子水1 L，pH值自然）上进行初筛，温度30℃，静置培养24~72 h。
选取过氧化氢阴性的单一菌落，接种于液体培养基（组成：葡萄糖20 g，蛋白胨10g，柠檬酸氢二胺2 g，无水乙酸钠5 g，硫酸锰0.25 g，硫酸镁0.58 g，磷酸氢二钾2 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，吐温80 1 g，去离子水1 L，pH值自然），30℃静置培养24 h；复筛多次，得到一株乳杆菌株HRS67。
经检测，菌株HRS67的生理生化特征为：革兰氏阳性杆菌，0.8微米×1.5~2.0微米；成链生长，不生芽孢；不运动；兼性厌氧；过氧化氢酶阴性；化能异养。
菌株HRS67的16S rDNA序列如SEQ ID NO ：1所示。
结合菌株生理生化特征及16S rDNA序列，与GreenGenes16S rRNA 基因数据库进行比对，将菌株GBS3鉴定为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），命名为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）HRS67，已于2016年4月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No. M 2016216。
实施例2
以本发明所述的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）HRS67菌株为出发菌株，于1 L液体培养基（组成：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，柠檬酸氢二胺2 g，无水乙酸钠5 g，硫酸锰0.25g，硫酸镁0.58 g，磷酸氢二钾2 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，吐温80 1 g，去离子水1 L，pH值自然）中进行静置发酵，温度控制在25~35℃，发酵24小时，得到含有乳酸和苯乳酸的发酵液；用高效液相色谱进行检测分析，所得发酵液中苯乳酸终浓度为5.3 mg/L。
实施例3
以本发明所述的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）HRS67菌株为出发菌株，于1 L液体培养基（组成：同实施例2）中进行静置发酵，温度控制在25~35℃，发酵72小时，得到含乳酸和苯乳酸的发酵液；用高效液相色谱进行检测分析，所得发酵液中苯乳酸浓度20 mg/L。
实施例4
以本发明所述的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）HRS67菌株为出发菌株，于1.5 L液体培养基（组成：同实施例2）中进行静置发酵，温度控制在25~35℃，发酵72小时，取其中离心所得的3.1 g菌体，作为全细胞催化剂，取10 mL含0.14 g葡萄糖和0.15 g苯丙酮酸的溶液（100 mM pH 8磷酸盐缓冲液）为底物，转化4小时，温度35℃，得到转化液；用高效液相色谱进行检测分析，所得转化液中苯乳酸浓度为11.2 g/L，摩尔转化率74%。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工业大学
<120> 一种干酪乳杆菌及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 950
<212> DNA
<213> 菌株HRS67
<400> 1
gcggcggctg ctataatgca gtcgaacgag ttctcgttga tgatcggtgc ttgcaccgag 60
attcaacatg gaacgagtgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cccttaagtg 120
ggggataaca tttggaaaca gatgctaata ccgcatagat ccaagaaccg catggttctt 180
ggctgaaaga tggcgtaagc tatcgctttt ggatggaccc gcggcgtatt agctagttgg 240
tgaggtaatg gctcaccaag gcgatgatac gtagccgaac tgagaggttg atcggccaca 300
ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat 360
ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggctttcggg tcgtaaaact 420
ctgttgttgg agaagaatgg tcggcagagt aactgttgtc ggcgtgacgg tatccaacca 480
gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc 540
cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttttta agtctgatgt gaaagccctc 600
ggcttaaccg aggaagcgca tcggaaactg ggaaacttga gtgcagaaga ggacagtgga 660
actccatgtg tagcggtgaa atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc 720
tgtctggtct gtaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag gattagatac 780
cctggtagtc catgccgtaa acgatgaatg ctaggtgttg gagggtttcc gcccttcagt 840
gccgcagcta acgcattaag cattccgcct ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa 900
aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 950

Claims (7)

1.一种干酪乳杆菌株（Lactobacillus casei）HRS67，保藏编号为：CCTCC No. M2016216。
2.如权利要求1所述的一种干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）HRS67在发酵合成苯乳酸中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于以所述的干酪乳杆菌株（Lactobacillus casei）HRS67菌株为出发菌株，在液体培养基中进行发酵，得到含有苯乳酸的发酵液。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的液体培养基组成：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，柠檬酸氢二胺2 g，无水乙酸钠5 g，硫酸锰0.25 g，硫酸镁0.58 g，磷酸氢二钾2 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，吐温80 1 g，去离子水1 L，pH值自然，所述的发酵的条件为：温度25~35℃，发酵时间24~72h，静置发酵。
5.如权利要求1所述的一种干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）HRS67在微生物转化合成苯乳酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于以所述的干酪乳杆菌株（Lactobacillus casei）HRS67菌株为出发菌株发酵所述的菌体为全细胞生物催化剂，以苯丙酮酸为前体，进行微生物转化，得到含苯乳酸的转化液。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的微生物转化条件为：葡萄糖14 g/L，苯丙酮酸15 g/L，溶剂为100 mM pH 8的磷酸盐缓冲液，干酪乳杆菌株（Lactobacillus casei）HRS67菌株菌体浓度100 g/L，转化温度35℃，转化时间4 h，搅拌速度80 rpm。
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