CN101166823A - 组合性白介素-2突变蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新型人白介素－2(IL－2)突变蛋白或其变体、其核酸分子和变体。也公开了制备这些突变蛋白的方法和刺激动物免疫***的方法。此外，本发明提供含有本发明核酸分子的重组表达载体和已导入了该表达载体的宿主细胞。包括含有治疗有效量的本发明人IL－2突变蛋白和药学上可接受运载体的药物组合物。与天然的IL－2或ProleukinIL－2相比，该IL－2突变蛋制品毒性较低，同时保持或提高了NK细胞介导的作用，可用于制备治疗癌症和剌激免疫***的药物组合物。

Description

组合性白介素-2突变蛋白
发明领域
本发明涉及具有提高的治疗效果的人白介素-2(IL-2)突变蛋白。也提供制备用于治疗癌症和刺激哺乳动物免疫***的新分子和药物制剂的方法。
发明背景
白介素-2(IL-2)是自然杀伤细节(NK)和T-细胞增殖和功能的强激活剂(Morgan等，Sience 193：1007-11，1976)已证明这种自然产生的细胞因子单独或与淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)或肿瘤渗出淋巴细胞(TIL)联合时具有对抗各种恶性疾病的抗肿瘤活性(见例如，Rosenberg等，N.Engl.J.Med.316：889-97，1987；Rosenberg，Ann.Surg.208：121-35，1988；Topalian等，J.Clin.Oncol.6：839-53，1988；Rosenberg等，N.Engl.J.Med.319：1676-80，1988；Weber等，J.Clin.Oncol.10：33-40，1992)。然而为了对肿瘤生长获得正面治疗结果而采用的高剂量IL-2常常引起严重的副作用，包括发热、寒战、低血压和毛细血管渗漏(血管渗漏综合征或VLS)及神经学变化(见例如，Duggan等，J.Immunotherapy 12：115-22，1992；Gisselbrecht等，Blood 83：2081-85，1994；Sznol和Parkinson，Blood 83：2020-22，1994)。
虽然IL-2诱导毒性和VSL的精确机理尚不清楚，但积累的资料提示IL-2诱导的杀伤(NK)细胞触发了剂量限制的毒性(DLT)，结果过度产生了促炎症细胞因子，包括IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-β和IL-6。这些细胞因子激活了单核细胞/巨噬细胞和诱导了一氧化氮的产生，导致随后的内皮细胞损伤(Dubinett等，Cell Immunol157：170-80，1994；Samlowski等，J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.18：166-78，1995)。这些发现导致其他人根据假说：T细胞选择性表达了高亲和力的IL-2受体(IL-2R)而开发了对T细胞而非NK细胞有优先选择性的IL-2突变蛋白(见例如，BAY50-4798，成熟的人IL-2的N88R IL-2突变蛋白，公开于国际专利WO 99/60128和Shanafelt等，Nat.Biotechnol.18：1197-202，2000)。
多种NK效应器功能，如自然杀伤(NK)、LAK、和抗体依赖(ADCC)的溶细胞杀伤、及细胞因子的产生和增殖有赖于激活不同的NK胞内信号传导通路特异性中间产物。重要的是，有证据表明对IL-2-IL-2R相互作用的选择性调节可影响下游NK-和T-细胞介导的多种效应器功能，如增殖、细胞因子产生和溶细胞杀伤(Sauve等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：4636-40，1991；Heaon等，Cancer Res.53：2597-2602，1993；Eckenberg等，J.Exp.Med.191：529-40，2000)。
IL-2(含有重组的人IL-2突变蛋白阿地白介素；Chiron Corporation，Emeryville，California)已经FDA批准用于治疗转移性黑色素瘤和肾癌。并正研究用于其它临床病症，包括非何杰金淋巴瘤、HIV和乳腺癌。然而，由于IL-2的相关毒副作用，需要毒性减低IL-2突变蛋白以使该白介素具有更好的治疗应用。具有提高的耐受性和/或增强的IL-2介导的NK细胞或T细胞效应器功能的IL-2突变蛋白将会有更广泛的用途，特别适合于癌症治疗和调节免疫应答反应。
发明概述
本发明是关于预计毒性降低和功能提高的白介素-2(IL-2)突变蛋白。提供编码人IL-2突变蛋白的核酸分子和分离的含有这些突变的多肽。与脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2突变蛋白相比，这种突变蛋白诱导NK细胞产生较低水平的促炎症细胞因子，同时保持或增强了NK细胞的增殖，保持了NK细胞介导的NK、LAK和ADCC溶细胞功能。也阐述了这些改进的人IL-2突变蛋白治疗癌症和调节免疫应答反应的临床用途。
在一方面，本发明提供的分离的核酸分子含有编码人IL-2突变蛋白的核苷酸序列。在某些实施方式中，该核酸分子编码含有选自SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72的氨基酸序列的人IL-2突变蛋白。
在某些实施方式中，本发明包括的IL-2突变蛋白的分离的核酸分子含有选自SEQID NO：9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69和71所示核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明包括的分离的核酸分子含有编码人IL-2突变蛋白的核苷酸序列，其中该突变蛋白的氨基酸序列包含选自SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72的序列的残基2-133。
在某些实施方式中，本发明的分离的核酸分子包含含有选自SEQ ID NO：9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69和71的序列的核苷酸4-399的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本文所述还可包含取代，其中SEQ ID NO：9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69和71的核苷酸373-375被编码丙氨酸的三联密码子取代。
在某些实施方式中，本文所述核酸分子还可包含取代，其中SEQ ID NO：9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69和71的核苷酸373-375被编码半胱氨酸的三联子取代。
在某些实施方式中，本文所述的的核酸分子经修饰而优化了表达。这些核酸包含的核苷酸序列中，编码该突变蛋白的一个或多个密码子已经过优化而在感兴趣宿主细胞中表达。含有优化密码子的示范性核酸包括但不限于：含有选自SEQ ID NO：73的序列，SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74的核苷酸4-399和SEQ ID NO：74的核苷酸4-399。
本发明还包括用于在所选宿主细胞中表达的载体，所述载体含有本发明的一种或多种核酸。在这类表达载体中，所述核酸操作性连接有与在所选宿主细胞中表达相容的调控元件。许多表达调控元件是本领域技术人员已知的，包括但不限于以下：转录启动子、转录增强子元件、转录终止信号、聚腺苷酸序列、优化起动翻译的序列、翻译终止序列。示范性的转录启动子包括但不限于衍生自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿病毒40的启动子。
在另一方面，本发明提供的细胞含有本发明的载体，其中的核酸序列(如编码人IL-2突变蛋白)操作性连接于在所选细胞中表达相容的调控元件。在一实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。示范性的哺乳动物细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞。可用于实施本发明的其它细胞、细胞类型、组织类型等包括但不限于获自以下的细胞：昆虫(如粉蚊夜娥(Trichoplusia ni)(Tn5)和Sf9)、细菌、酵母菌、植物、抗原提呈细胞(如巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、B-细胞、T-细胞、干细胞和它们的祖细胞)、原代细胞、永生细胞、肿瘤衍生细胞。
在另一方面，本发明供本发明的含有用于重组产生人IL-2突变蛋白的表达载体的组合物和宿主细胞。这种组合物可含有红学上可接受的运载体。
在还有一方面，本发明提供含人IL-2突变蛋白的分离的多肽。在某些实施方式中，本发明包括分离的含有选自SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72氨基酸序列的多肽。
在某些实施方式中，本发明包括分离的含有选自SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72氨基酸序列的氨基酸残基2-133的多肽。
在某些实施方式中，上述多肽还含有取代。其中在SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72的125位丙氨酸残基取代了丝氨酸残基。
在某些实施方式中，上述多肽还含有取代，其中在SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72的125位半胱氨酸残基取代了丝氨酸残基。
在某些实施方式中，本发明包括的的分离的多肽含有人IL-2突变蛋白，该突变蛋白含有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列，在SEQ ID NO：4的125位丝氨酸取代了半胱氨酸，SEQ ID NO：4中至少有二处其它的氨基酸取代，与类似量的脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S相比，此突变蛋白：1)保持了或增强了自然杀伤(NK)细胞的增殖，和2)导致NK细胞产生的促炎症细胞因子水平降低。示范性的组合取代包括但不限于：19D40D、19D81K、36D42R、36D61R、36D65L、40D36D、40D61R、40D65Y、40D72N、40D80K、40G36D、40G65G、80K36D、80K65Y、81K36D、81K42E、81K61R、81K65Y、81K72N、81K88D、81K91D、81K107H、81L107H、91N95G、107H36D、107H24E、107H65Y、107R36D、107R72N、40D81K107H、40G81K107H和91N94Y95G。在实施方式中，该突变蛋白还包含SEQ ID NO：4位置1的丙氨酸缺失。
可用NK-92生物试验检测自然杀伤(NK)细胞增殖的提高和NK细胞产生促炎症细胞因子水平的降低。可在相等试验条件下比较上述多肽对NK细胞增殖和NK细胞产生促炎症细胞因子的作用与类似量的脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2的作用。在某些实施方式中，可在相等的试验条件下，用NK-92生物试验来证明，与类似量的脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的相比，上述多肽诱导的促炎症细胞因子TNF-α水平降低。
在某些实施方式中，在相等试验条件下，用NK3.3细胞毒性生物试验来证明，与类似量的脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的相比，上述多肽保持了或增强了人NK细胞介导的自然杀伤细胞毒性、淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞毒性、或ADCC介导的细胞毒性。
在某些实施方式中，在相等试验条件下，该突变蛋白诱导的NK细胞增殖比类似量的脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的高150％。
在某些实施方式中，该突变蛋白诱导的NK细胞增殖比脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的高170％。
在某些实施方式中，该突变蛋白诱导的NK细胞增殖为脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的约200-250％
在某些实施方式中，在相等试验条件下，该突变蛋白诱导的NK细胞增殖高于类似量的脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2所诱导的至少10％。
在某些实施方式中，该突变蛋白诱导的NK细胞增殖高于脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2所诱导的至少15％。
在某些实施方式中，在相等试验条件下，该突变蛋白诱导产生的促炎症细胞因子低于类似量脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2所诱导的100％。
在某些实施方式中，该突变蛋白诱导产生的促炎症细胞因子低于脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2所诱导的70％。
在某些实施方式中，本发明包括的分离的多肽含有人IL-2突变蛋白，其中该突变蛋白含有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列，SEQ ID NO：4的125位半胱氨酸取代了丝氨酸，SEQ ID NO：4中至少有二处其它的氨基酸取代，在相等试验条件下，该突变蛋制品IL-2诱导的NK细胞与IL-2诱导的TNF-α产生之比率，比类似量的脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2突变蛋白观察到的至少高1.5倍。可用NK-92生物试验测定0.1nM突变蛋白的NK细胞增殖和1.0nM突变蛋白的TNF-α产量。在某些实施方式中，上述比率比脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的至少高2.5倍。在某些实施方式中，此比率比脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的至少高3.0倍。
在某些实施方式中，本发明包括的分离的多肽含有人IL-2突变体的氨基酸序列，其中该突变蛋白含有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列，SEQ ID NO：4的125位丝氨酸取代了半胱氨酸，和至少有二处其它的氨基酸取代，SEQ ID NO：4中其它取代的残基位置选自：19、36、40、42、61、65、72、80、81、88、91、95和107位。示范性的组合取代包括但不限于：19D40D、19D81K、36D42R、36D61R、36D65L、40D36D、40D61R、40D65Y、40D72N、40D80K、40G36D、40G65Y、80K36D、80K65Y、81K36D、81K42E、81K61R、81K65Y、81K72N、81K88D、81K91D、81K107H、81L107H、91N95G、107H36D、107H42E、107H65Y、107R36D、107R72N、40D81K107H、40G81K107H和91N94Y95G。在某些实施方式中，该多肽在SEQ ID NO：4中还含有1位丙氨酸缺失。
在另一方面，本发明提供产生人白介素-2(IL-2)突变蛋白的方法，该方法包括：用含有上述核酸分子的表达载体转化宿主细胞；在能表达该核酸分子成为多肽的条件下细胞培养基中培养所述宿主细胞；和分离该多肽。在某些实施方式中，在相似的试验条件下，与类似量的选自脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2的参比品IL-2突变蛋白相比，该人白介素-2(IL-2)突变蛋白能保持或增强NK细胞的增殖，还能诱导NK细胞产生较低水平的促进炎症细胞因子，其中用NK-92生物试验来测定NK细胞的增殖和产生的促炎症细胞因子。
在另一方面，本发明提供含有治疗有效量的一种或多种上述多肽的组合物，该组合物含人IL-2突变蛋白。此组合物还可含有药学上可接受的运载体。
在另一方面，本发明提供刺激哺乳动物免疫***的方法，该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的人IL-2突变蛋白，在相等试验条件下，与类似量的选自脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2的参比品IL-2突变蛋白相比，所述突变蛋白诱导NK细胞产生低水平的促炎症细胞因子和保持或增强了NK细胞的增殖，其中采用NK-92生物试验测定所述NK细胞的增殖和所述产生的促炎症细胞因子。在某些实施方式中，所述哺乳动物是人。
在某些实施方式中，用于刺激免疫***的人IL-2突变蛋白含有选自SEQ IDNO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72的氨基酸序列。
在某些实施方式中，用于刺激免疫***的人IL-2突变蛋白含有的氨基酸序列选自SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72氨基酸序列的残基2-133。
在某些实施方式中，用于刺激免疫***的人IL-2突变蛋白还含有取代，其中在SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72的125位丙氨酸残基取代了丝氨酸残基。
在某些实施方式中，用于刺激免疫***的人IL-2突变蛋白还含有，其中在SEQ IDNO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72的125位半胱氨酸残基取代了丝氨酸残基。
在另一方面，本发明提供治疗哺乳动物癌症的方法，该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的人IL-2突变蛋白，在相等试验条件下，与类似量的选自脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2的参比品IL-2突变蛋白相比，该突变蛋白诱导NK细胞产生较低水平的促炎症细胞因子和保持或增强了NK细胞增殖，其中采用NK-92生物试验来测定所述NK细胞的增殖和所述产生的促炎症细胞因子。在某些实施方式中，所述哺乳动物是人。
在某些实施方式中，用于治疗癌症的人IL-2突变蛋白含有选自SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72的氨基酸序列。
在某些实施方式中，用于治疗癌症的人IL-2突变蛋白含有SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72的2-133残基氨基酸序列。
在某些实施方式中，用于治疗癌症的人IL-2突变蛋白还含有取代，其中在SEQ IDNO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72的125位丙氨酸残基取代了丝氨酸残基。
在某些实施方式中，用于治疗癌症的人IL-2突变蛋白还含有取代，其中在SEQ IDNO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72的125位半胱氨酸残基取代了丝氨酸残基。
在另一方面，本发明提供在给予IL-2作为治疗方案的病人中降低白介素-2(IL-2)诱导的毒性症状的方法。该治疗方法包括给予作为IL-2突变蛋白的IL-2。
在某些实施方式中，用于治疗的IL-2突变蛋白含有选自SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72的氨基酸序列。
在某些实施方式中，用于治疗的IL-2突变蛋白含有选自SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72氨基酸序列的2-133残基。
在某些实施方式中，用于治疗的IL-2突变蛋白还含有取代，其中在SEQ IDNO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72的125位丙氨酸残基取代了丝氨酸残基。
在某些实施方式中，用于治疗的IL-2突变蛋白还含有取代，其中在SEQ IDNO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72的125位半胱氨酸残基取代了丝氨酸残基。
附图简述
图1概括了用IL-2突变蛋白刺激分离自正常人供体的人PBMC的联合增殖/促炎症细胞因子产生试验。
图2显示了人PBMC中40D72N IL-2突变蛋白介导的增殖和TNF-α的产生。
图3显示了人PBMC中40D61R IL-2突变蛋白介导的增殖和TNF-α的产生。
图4显示IL-2激活的分离自正常人供体的人PBMC保持了人NK-介导的LAK和ADCC活性。
发明详述
本发明涉及新的人白介素-2(IL-2)突变蛋白，由于其毒性降低和/或NK或T细胞效应器功能提高而具有改进的治疗效果。上述人IL-2突变蛋白及其生物活性变体与脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2的参比品IL-2突变蛋白相比，诱导产生的促炎症细胞因子降低同时保持了或增强了自然杀伤(NK)细胞的增殖。“促炎症细胞因子”指能刺激免疫***的细胞因子。这种细胞因子包括但不限于：IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-β和IL-6。
术语“突变蛋白”指由于氨基酸缺失、取代或二者而含有与天然产生的蛋白质氨基酸序列不同的突变的氨基酸序列的蛋白质。本发明的人IL-2突变蛋白与成熟的人IL-2不同在于，在成熟的人IL-2序列125位处丝氨酸残基取代了半胱氨酸残基(即C125S)，和还含有至少二处氨基酸取代，并且相对于成熟的人IL-2序列还含有一处或多处氨基酸缺失，如成熟的人IL-2蛋白1位N-末端的丙氨酸(Ala)缺失。在另一实施方式中，本发明的人IL-2突变蛋白保持了成熟的人IL-2序列125位处的半胱氨酸残基，但至少有其它二处氨基酸取代，并且相对于成熟的人IL-2序列还含有一处或多处氨基酸缺失，如成熟的人IL-2蛋白1位N-末端丙氨酸(Ala)缺失。这些人IL-2突变蛋白可以是糖基化的或非糖基化的，取决于产生它们的宿主表达***。上述具体的取代导致产生的突变蛋白保持了所需活性，即用上述NK-92细胞试验，与脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，其诱导产生的促炎症细胞因子降低同时保持了或增强了NK细胞的增殖。鉴定人IL-2序列中导致产生毒性降低和/或NK细胞增殖增强的IL-2变体的位置和这些位置的相关取代，在本领域的技术之内，通过改变人IL-2序列内的其它残基可获得本文所述的也保持了这些所需活性的人IL-2突变蛋白变体本文所述的这些人IL-2突变蛋白变体也属于本发明，还包括以下。
人IL-2先翻译成SEQ ID NO：2所示的前体多肽，其由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码。该前体多肽包含SEQ ID NO：2的残基1-20为信号序列。术语“成熟的人IL-2”指SEQ ID NO：4所示氨基酸序列，其由SEQ ID NO：3所示核苷酸序列编码。术语“C125S人IL-2突变蛋白”或“C125S人IL-2”指成熟的人IL-2突变蛋白，其保持了成熟的人IL-2的1位N-末端丙氨酸残基和成熟的人IL-2序列125位为丝氨酸取代了半胱氨酸。C125S人IL-2突变蛋白具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列，其由SEQ ID NO：5所示核苷酸序列编码。术语“脱丙氨酰-1C125S人IL-2”和“脱丙氨酰-1丝氨酸-125人IL-2”指成熟的人IL-2突变蛋白，为在成熟的人IL-2序列125位为丝氨酸取代了半胱氨酸和在缺失成熟的人IL-2序列1位(即SEQ ID NO：4的1位)的N-末端丝氨酸。脱丙氨酰-1C125S人IL-2具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，其由SEQ ID NO：7所示核苷酸序列编码。大肠杆菌重组产生的的脱丙氨酰-1C125S人IL-2突变蛋白称为“阿地白介素”，可从市场上购买到的制剂商品名为
Figure A20058000707200181
IL-2(Chiron Coporation，Emeryville，California)。对于本发明的目的，脱丙氨酰-1C125S人IL-2和C125S人IL-2突变体，是作为测定本发明的人IL-2突变蛋白所显示理想活性的人IL-2突变体参比品。因此在类似的试验条件下，测定相对于同等量脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2突变蛋白诱导NK细胞产生的促炎症细胞因子量，本发明合适的人IL-2突变蛋白的所需活性降低了IL-2诱导NK细胞产生的促炎症细胞因子，特别是产生的TNF-α。与此相似，在类似的试验条件下，测定相对于同等量脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2突变蛋白诱导NK细胞增殖的量，本发明合适的人IL-2突变蛋白的所需活性保持或提高了IL-2诱导的NK细胞增殖。
提供的编码人IL-2突变蛋白的分离核酸及其生物活性变体含有脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2(SEQ ID NO：8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列和至少二处其它氨基酸取代，当与二种参比IL-2突变蛋白相比时，它能诱导NK细胞产生较低水平的促炎症细胞因子同时保持或增强NK细胞增殖。也提供分离的本发明核酸分子编码的多肽。
本发明的人IL-2突变蛋白包含SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72所示的突变蛋白，也称为“双数SEQ ID NO：10-72序列”。本发明也提供编码这些突变蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO：9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69和71分别所示的编码序列。这些编码序列本文也称为“单数SEQ ID NO：9-71序列”这些上述氨基酸序列的突变蛋白包含C125S人IL-2氨基酸序列和至少二处其它取代，这些其它取代在下表1中用组合取代表示。“组合取代”指发生在人IL-2突变蛋白序列中的一组二处或多处残基取代。因此例如，称为“19D40D”的组合取代指本发明的人IL-2突变蛋白含有二处取代，一处在对应于成熟的人IL-2的19位天冬氨酸残基(即D)取代了亮氨酸残基(见SEQ ID NO：4)，一处在对应于成熟的人IL-2的40位天冬氨酸残基(即D)取代了亮氨酸残基(见SEQ IDNO：4)。类似地，称为“40D81K107H”的组合取代指本发明的人IL-2突变蛋白含有以下三处取代：对应于成熟的人IL-2的40位天冬氨酸残基(即D)取代了亮氨酸残基，对应于成熟的人IL-2的81位赖氨酸残基(即K)取代了精氨酸残基，和对应于成熟的人IL-2的107位组氨酸残基(即H)取代了酪氨酸残基。在其它实施方式中，本发明的人IL-2突变蛋白具有这些氨基酸序列缺失的1位原始丙氨酸残基，因此包括脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2氨基酸序列和至少二处其它的取代，这些其它取代在下表1中用组合取代表示。这些突变蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72所示序列的残基2-133。本发明也提供编码这些突变蛋白的核苷酸序列，例如编码SEQ ID NO：9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69或71所示序列的核苷酸4-399的序列。
也提供本文所述本发明的人IL-2突变蛋白的生物学活性变体，包括其具有所需人IL-2突变蛋白功能的片段和截短形式。例如，可用本领域熟知的和本文上述的重组DNA技术，通过去除全长人IL-2突变蛋白氨基酸序列中的氨基酸残基而产生上述人IL-2突变蛋白的片段或截短形式。本发明人IL-2突变蛋白的合适变体具有类似于该新型人IL-2突变蛋白本身所显示的生物学活性，即用本文所述生物试验与参比的IL-2分子，即脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2相比时，它们具有该新型人IL-2突变蛋白的低毒性(即低的或降低的促炎症细胞因子产生)以及能保持或增强NK细胞增殖。认为本文鉴定的某给定的新型人IL-2突变蛋白与本发明新型人IL-2突变蛋白观察到的相比，可具有绝对不同的特定生物学活性，只要当与参比的人IL-2突变蛋白相比时，它保持了所需的毒性减低等生物学活性，即诱导NK细胞产生低水平的促炎症细胞因子，和/或增强NK细胞增殖。
表1本发明的人IL-2突变蛋白例子，其含有C125S人IL-2(SEQ ID NO：6)或脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列，和至少二处其它取代，此种取代选自以下所述的组合取代。其残基位置相对于SEQ ID NO：4所示成熟的人IL-2序列的位置。这些残基的位置也对应于SEQ ID NO：6所示C125S人IL-2序列中的位置。各残基位置后为取代了该位置天然残基的氨基酸单字母缩写。
  19D40D19D81K36D42R36D61R36D65L40D36D40D61R40D65Y40D72N40D80K40G36D40G65Y80K36D80K65Y81K36D81K42E   81K61R81K65Y81K72N81K88D81K91D81K107H81L197H91N95G107H36D107H42E107H65Y107R36D107R72N40D81K107H40G81K107H91N94Y95G
本发明的组合物还包含用于重组产生本发明人IL-2突变蛋白或其生物活性变体的载体和宿主细胞。此外，也提供含有治疗有效量的本文所述人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体及药学上可接受运载体的药物组合物。
本发明包括与参比品IL-2突变蛋白相比，能诱导NK细胞产生较低水平促炎症产物和保持或增强NK细胞增殖的人IL-2突变蛋白的生产方法。这些方法包括用含有编码本发明新型人IL-2突变蛋白或编码其生物学活性变体的核酸分子的表达载体转化宿主细胞，在允许所编码多肽表达的条件下在培养基中培养该宿主细胞，和分离多肽产物。
也提供刺激动物免疫***或治疗哺乳动物癌症的方法，该方法包括给予动物治疗有效量的本发明人IL-2突变蛋白可其生物学活性变体，其中用本文以下所述的生物试验测定，与脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，该IL-2突变蛋白或其变体诱导的NK细胞产生较低水平促炎症细胞因子和能保持或增强NK细胞增殖。
本发明也提供降低给予IL-2作为治疗方案的病人中白介素2(IL-2)所导致的毒性症状的方法。该方法包括给予本发明的IL-2突变蛋白，即用本文以下所述的生物试验测定，与脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，诱导NK细胞产生较低水平促炎症细胞因子和能保持或增强NK细胞增殖的IL-2突变蛋白。
术语“核酸分子”本文包括DNA分子(如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(如mRNA)，和用核苷酸同类物产生的DNA或RNA同类物。核酸分子可以是单链或双链，但优选双链DNA。明包括分离的或基本上纯化的核酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”核酸分子或蛋白质或其生物学活性部分应基本上没有该核酸分子或蛋白质天然存在的环境中通常与其相伴或相互作用的组分。因此，分离的或纯化的核酸分子或蛋白质，当用重组方法产生时基本上没有其它细胞物质或培养基成分，或当用化学合成法产生时基本上没有化学前体物或其它化学物质。分离的核酸宜不含产生该核酸生物体基因组DNA中天然侧接该核酸的序列(即位于该核酸5’和3’末端的序列)(优选蛋白质编码序列)。例如，在各种实施方式中，分离的核酸分子可含有产生此核酸的细胞基因组DNA中天然侧接此核酸的少于约5kb，4kb，3kb，2kb，1kb，0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。基本上无细胞物质的蛋白质包括污染蛋白低于约30％、20％、10％、5％或1％(干重)的蛋白制品。当本发明的蛋白质或其生物学活性变体通过重组产生时，其中培养基的化学前体成分或非蛋白质感兴趣化学成分宜低于约30％、20％、10％、5％或1％(干重)。
新型人IL-2突变蛋白的生物学活性
与脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2相比，或与C125S人IL-2相比，本发明的新型人IL-2突变蛋白具有提高的治疗指数。前二种突变蛋白在本文中称为“参比IL-2突变蛋白”，因为在用类似的蛋白浓度和相等试验条件来给本发明的突变蛋白分类所进行的给定比较中，本发明的新型突变蛋白在生物学性能上比得上这二种先前已特征鉴定过的人IL-2突变蛋白的生物学性能。本发明突变蛋白治疗指数的提高反映在与这二种参比IL-2突变蛋白之一的毒性及NK和/或T细胞效应器功能相比时，其毒性改善(即该突变蛋白诱导NK细胞产生较低水平的促炎症细胞因子)及NK和/或T细胞效应器功能提高而毒性不提高，或这些突变蛋白的毒性改善及NK和/或T细胞效应器功能均提高。
利用以下三种功能终点来选择治疗指数提高的突变蛋白：(1)与脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或相比，能诱导NK细胞产生较低水平促炎症细胞因子；(2)与脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，能保持或增强IL-2诱导的NK和T细胞增殖但不提高NK细胞产生的促炎症细胞因子；和(3)与脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，能保持或改善(即增强)NK-介导的溶细胞杀伤。NK-介导的溶细胞杀伤包括：NK介导的、淋巴因子活化杀伤(LAK)-介导的、和抗体依赖的细胞毒性(ADCC)-介导的溶细胞杀伤。
上述新型人IL-2突变蛋白显示的最大治疗指数改进属于预计临床疗效改善的三种功能类型。应注意所有这些突变蛋白显示都能保持或增强T细胞的增殖和NK介导的溶细胞活性。该突变蛋白的第一类功能特征在于，与参比IL-2突变蛋白，即脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，优选的突变蛋白能使IL-2诱导的NK细胞降低促炎症细胞因子的产生，同时保持IL-2诱导的NK细胞增殖。该突变蛋白的第二类功能是增强IL-2诱导的NK细胞增殖比二参比IL-2突变蛋白诱导的更强，但无二参比IL-2突变蛋白所诱导的促炎症细胞因子产生的不良作用。该突变蛋白的第三类功能包括该突变蛋白的“双功能”，即与这二种参比IL-2突变蛋白诱导的活性水平相比，能使IL-2诱导的NK细胞促炎症细胞因子产生降低，同时增强IL-2诱导的NK细胞增殖。
测定新鲜分离NK细胞的IL-2诱导的NK细胞增殖和促炎症细胞因子产生的试验是本领域熟知的。见例如，Perussia，Methods 9：370，1996和Baume等，Eur.J.Immunol.22：1-6，1996。据先前报导NK-92细胞系具有NK细胞的表型和功能特性，包括存在IL-2时的增殖(Gong等，Leukemia 8：652，1994)然而在存在IL-2时极少或不产生TNF-α(Nagashima等，Blood 91：3850，1998)。已开发的筛选人NK和T细胞功能活性的IL-2生物试验在本文以下实施例章节中描述。虽然可采用检测NK细胞增殖和促炎症细胞因子产生、及T细胞效应吕功能的试验，但优选用本文所述的IL-2生物试验来筛选感兴趣的IL-2突变蛋白以确定它们是否保持了本文所述突变蛋白的所需特征。特别感兴趣的是它们能否降低NK细胞诱导TNF-α产生。因此，在一实施方式中，IL-2诱导的NK细胞增殖和TNF-α因子产生可用本文以下描述的人NK-92细胞系(ATCC CRL-2407，CMCC ID#11925)IL-2生物试验来测定。对于NK-92细胞系的描述见Gong等，Leukemia 8(4)：652-658，1994。为了本发明的目的，此试验称为“NK-92生物试验”。
“降低”或“减少”促炎症细胞因子产生指与参比的IL-2突变蛋白，即脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2突变蛋白相比，本发明的人IL-2突变蛋白诱导NK细胞产生炎症细胞因子的水平降低，特别是NK细胞产生的TNF-α降低。虽然在可比试验条件下，本发明的人IL-2突变蛋白可使NK细胞产生最低水平的TNF-α比类似量的脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的至少低20％，但本发明突变蛋白诱导NK细胞产生TNF-α的最高水平取决于该突变蛋白所属的功能类型。
因此，例如在某些实施方式中，通常应选择能最大增强NK细胞增殖的诱导而对IL-2诱导NK细胞产生TNF-α无不良作用(即突变蛋白的第二类功能)的突变蛋白。在这些实施方式中，当用人NK-92细胞系(ATCC CRL-2407，CMCC ID#11925)(即用上述NK-92生物试验)和0.1nM或100pM(即0.1nM)浓度的各人IL-2突变蛋白测定产生的TNF-α时，本发明的人IL-2突变蛋白诱使NK细胞产生TNF-α的水平与参比IL-2突变蛋白诱导的相类似(即±10％)，或优选低于参比IL-2突变蛋白诱导的90％。在本发明其它实施方式中，在可比的试验条件下，当用人NK-92细胞系(即用上述NK-92生物试验)和0.1nM浓度的各人IL-2突变蛋白测定产生的TNF-α时，本发明的人IL-2突变蛋白诱使NK细胞产生的TNF-α水平低于类似量脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2所诱导的TNF-α量的90％、优选于85％，甚至更优选低于80％。在某些实施方式中，当用人NK-92细胞系(即用上述NK-92生物试验)和0.1nM浓度的各人IL-2突变蛋白测定产生的TNF-α时，本发明的人IL-2突变蛋白诱导产生的TNF-α比脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的至少低20％至60％。与参比IL-2突变蛋白相比，能保持或增强IL-2诱导的NK细胞增殖的这种突变蛋白属于第一类功能的IL-2突变蛋白。
“保持”指在可比试验条件下，本发明的人IL-2突变蛋白诱导的生物学活性水平为类似量的脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2所见活性水平的至少70％、优选至少75％、更优选至少80％，最优选至少85％和高至100％(等价)。因此，当所需活性是诱导NK细胞增殖时，当在可比试验条件下用同样的生物试验(即上述NK-92生物试验和类似量的这些IL-2突变蛋白)测定NK细胞增殖时，本发明的IL-2突变蛋白诱导的NK细胞增殖水平为类似量的脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的增殖活性的至少70％、优选至少75％、更优选至少80％，最优选至少85％、90％、95％更高包括100％(±5％)。
“增强”或“提高”或“改进”指在可比试验条件下，人IL-2突变蛋白诱导的所需生物学活性水平比类似量的脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2所观察到的更高。因此，当所需的生物学活性是诱导NK细胞增殖和采用同样的NK细胞增殖试验(如上述NK-92生物试验)时，本发明合适的IL-2突变蛋白诱导的NK细胞增殖水平，为类似量的脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的NK细胞增殖活性的至少105％、110％、115％，更优选至少120％，甚至更优选至少125％，最优选至少130％、140％或150％。
测定NK细胞增殖的试验是本领域熟知的(见例如，Baume等，Eur.J.Immuno.22：1-6，1992；Gong等，Leukemia 8(4)：652-658，1994和上述NK-92生物试验)。优选采用NK-92细胞来检测IL-2诱导产生的促炎症细胞因子，特别是TNF-α的产生和NK细胞的增殖(即上述NK-92生物试验)。NK细胞增殖试验所用人IL-2突变蛋白的合适浓度包括约0.005nM(5pM)-1.0nM(1000pM)，包括0.005nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1.0nM和0.005nM-1.0nM之间的其它数值。在本文下述的优选实施方式中，采用NK-92细胞和约0.1nM-1.0nM浓度的人IL-2突变蛋白进行NK细胞增殖试验。
由于本发明的人IL-2突变蛋白能降低对促炎症细胞因子产生的诱导，和保持或增强IL-2诱导的NK细胞增殖，它们的IL-2诱导的NK细胞增殖：IL-2诱导NK细胞促炎症细胞因子产生的比率，优于脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的，每种突变蛋白的这些活性测定采用同等的蛋白浓度和生物试验条件。当所测定的促炎症细胞因子是TNF-α时，在类似的生物试验条件和蛋白浓度下，合适的本发明人IL-2突变蛋白在0.1nM突变蛋白时IL-2诱导的NK细胞增殖：在1.0nM突变蛋白时IL-2诱导NK细胞产生TNF-α的比率，至少是用脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2所获得的1.5倍，更优选是用参比IL-2突变蛋白的至少1.75倍、2.0倍、2.25倍、甚至更优选至少2.75倍、3.0倍、3.25倍。在某些实施方式中，在类似的生物试验条件和蛋白浓度下，本发明的人IL-2突变蛋白在0.1nM突变蛋白时IL-2诱导的NK细胞增殖：在1.0nM突变蛋白时IL-2诱导NK细胞产生TNF-α的比率，至少是用脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2所获得的3.5倍，3.75倍、4.0倍、4.5倍、或甚至5.0倍。
在类似的生物试验条件和蛋白浓度下，相对于用脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2所见，发明的突变蛋白也能提高(即增加)NK细胞的存活。NK细胞的存活可用本领域已知的试验，包括本文所述试验来测定。例如，在存在感兴趣IL-2突变蛋白时NK细胞的存活可通过检测IL-2突变蛋白能否阻断糖皮质类固醇的程序性细胞死亡和诱导NK细胞表达BCL-2来测定(见例如Armant等，Immunology85：331，1995)。
本发明提供监测IL-2对NK细胞存活影响的试验。在一实施方式中，通过用pAKT ELISA检测突变蛋白在NK3.3细胞(CMCC ID#12022，见Kornbluth，J.Immunol.129(6)：2831-37，1982)中能否诱导细胞存活信号传导级联反应，来测定感兴趣的人IL-2突变蛋白存在时NK细胞的存活。以此方式，利用感兴趣的人IL-2突变蛋白上调NK细胞的AKT磷酸化作为NK细胞存活的指标。
本发明方法中采用的IL-2突变蛋白将激活和/或扩增自然杀伤(NK)细胞而介导淋巴因子活化杀伤(LAK)活性和抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。静止(未活化的)NK细胞可介导对某些称为“NK-细胞敏感性靶标”的靶细胞(如人红白血病K562细胞系)的自发性或天然细胞毒性。被IL-2激活后NK细胞获得了LAK活性。例如，可检测IL-2激活的NK细胞能否杀伤各种肿瘤细胞和其它“LAK-敏感/NK-不敏感”靶细胞，如Daudi B-细胞淋巴瘤系(其通常能抵抗静止(即未激活的)NK细胞的溶解作用)，来测定这种LAK活性。类似地，在存在最适浓度的有关肿瘤细胞特异性抗体时，可通过检测IL-2活化细胞能否溶解“LAK敏感NK-不敏感的”靶细胞，如DAUDI B-细胞淋巴系，或静止(即未活化的)NK细胞不易溶解的其它靶细胞来测定ADCC活性。产生和测定NK/LAK细胞和ADCC的细胞毒活性的方法是本领域已知的。见例如《新编免疫学实验方法：人类免疫研究》(Current Protocols in Immunology：Immunologic Studies in Humans)，增刊17，7.7，7.18和7.27单元(John Wiley & Son，Inc.1996)。在一实施方式中，采用表型和功能特征为外周血NK细胞的NK3.3的细胞系检测本发明IL-2突变蛋白的ADCC活性。对于本发明的目的，此试验称为“NK3.3细胞毒性生物试验”。
在类似的生物试验条件和蛋白浓度下，与脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2所见相比，本发明的人IL-2突变蛋白也能保持或增强IL-2诱导的T细胞增殖。细胞增殖试验是本领域熟知的。在一实施方式中，利用人T细胞系Kit225(CMCCID#11234；Hori等，Blood 70(4)：1069-72，1987)来检测本文上述试验的T细胞增殖。
如上所述，本文鉴定的候选先导人IL-2突变蛋白(即具有最为改进的治疗指数的那些新型突变蛋白)属于三种功能类型。第一种功能类型包括在类似的生物试验条件和蛋白浓度1.0nM测定所有突变蛋白时，诱导NK细胞产生的TNF-α水平较低、约为脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的60％或更低，并且与脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2相比保持或增强了NK细胞增殖的那些突变蛋白。这些突变蛋白可进一步分成二亚类：(1)当在类似的生物试验条件和约1.0nM蛋白浓度检测这些突变蛋白时，与参比的人IL-2突变蛋白相比，能增强(即大于100％)IL-2诱导的NK细胞增殖，但在约0.1nM或更低浓度时与参比的人IL-2突变蛋白观察到的相比，降低(即低于100％)NK细胞增殖活性的人IL-2突变蛋白；和(2)在类似的条件和蛋白浓度约1.0-0.05(即约50pM)下检测这些突变蛋白时，与参比的人IL-2突变蛋白或观察到的相比，能提高(即大于100％)或保持(即至少约70-100％)IL-2诱导NK细胞增殖的那些人IL-2突变蛋白。在一实施方式中，IL-2诱导的NK细胞增殖和TNF-α产生用NK-92细胞(即用NK-92细胞生物试验)检测，其中NK细胞增殖用商品化购得的MTT染料还原试剂盒(CellTiter
Figure A20058000707200261
非放射性细胞增殖试验试剂盒，购自Promega Corp Madison，Wisconsin)检测，根据比色读数计算出刺激指数；用商品化购得的TNF-αELISA试剂盒(BioSource CytoscreenTM人TNF-αELISA试剂盒；Camarillo，California)定量TNF-α。属于第一种功能类型的亚类(1)的人IL-2突变蛋白，包括含有脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2(SEQ ID NO：8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO：6)氨基酸序列和相对于成熟的人IL-2序列(即相对于SEQID NO：4)残基位置(即19、36、40、61、65、81或91)含有选自19D40D、36D61R、36D65L、40D61R、40D65Y、40G65Y、81K91D至少一种组合取代的那些突变蛋白。见以下实施例2和表3。属于第一种功能类型的亚类(2)的人IL-2突变蛋白，包括含有脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2(SEQ ID NO：8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO：6)氨基酸序列和相对于成熟的人IL-2序列(即相对于SEQ ID NO：4)残基位置(即40、42、65、72、80、81、88或107)含有选自40D72、80K65Y、81K88D、81K42E、81K72N、107H65Y、107R72N至少一种组合取代的那些突变蛋白。见以下实施例2和表4。
第二种功能类型的人IL-2突变蛋白包括能强烈增强NK细胞增殖但对IL-2诱导NK细胞产生TNF-α无不良作用的那些突变蛋白。属于此功能类型的突变蛋白要符合三个选择标准：(1)在选自0.005nM(即5pM)、0.02nM(即20pM)、0.05nM(即50pM)、0.1nM(即或100pM)或1.0nM(即1000pM)IL-2的人IL-2突变蛋白的一种或多种浓度时诱导NK细胞增殖的水平大于脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2所诱导的约200％；(2)当检测选自0.005nM(即5pM)、0.02nM(即20pM)、0.05nM(即50pM)、0.1nM(即或100pM)或1.0nM(即1000pM)至少二种浓度的的人IL-2突变蛋白时，IL-2诱导NK细胞增殖的水平大于脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2所诱导的约150％；(3)当检测1.0nM(即1000pM)或0.1nM(即100pM)浓度突变蛋白产生的TNF-α时，IL-2诱导NK细胞产生TNF-α的水平与参比IL-2突变蛋白诱导的相似，优选低于90％。在一实施方式中，IL-2诱导NK细胞产生TNF-α和IL-2诱导NK细胞增殖采用NK-92细胞(即用上述NK-92细胞生物试验)检测，其中IL-2诱导产生的TNF-α用ELISAS检测，IL-2诱导的NK细胞增殖用上述MTT试验检测。属于该第二种功能类型的人IL-2突变蛋白包括含有脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2(SEQ ID NO：8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO：6)氨基酸序列和相对于成熟的人IL-2序列(即相对于SEQ ID NO：4)残基位置(即19、36、40或81)含有选自19D81K、40G36D和81K36D至少一种组合取代的那些突变蛋白。见以下实施例3和表5。
第三种功能类型的人IL-2突变蛋白包括具有双功能的那些突变蛋白，与参比的IL-2突变蛋白相比，它们能诱导NK细胞增殖增强和降低NK细胞产生TNF-α。属于该第三种功能类型的突变蛋制品应符合以下标准：(1)当用选自0.005nM(即5pM)、0.02nM(即20pM)、0.05nM(即50pM)、0.1nM(即或00pM)或1.0nM(即1000pM)浓度的任何一种突变蛋白检测时，诱导的NK细胞增殖水平是脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的至少约150％；(2)当用约1.0nM浓度突变蛋白检测时，诱导NK细胞产生TNF-α的水平低于脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的约75％。在一实施方式中，IL-2诱导NK细胞产生TNF-α和IL-2诱导NK细胞增殖采用NK-92细胞(即用上述NK-92细胞生物试验)检测，其中IL-2诱导产生的TNF-α用ELISAS检测，IL-2诱导的NK细胞增殖用上述MTT试验检测。属于该第三种功能类型的人IL-2突变蛋白包括含有脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2(SEQ IDNO：8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO：6)氨基酸序列和相对于成熟的人IL-2序列(即相对于SEQ ID NO：4)残基位置(即36、40、42、61、80、81、91、94、95或107)含有选自36D42R、36D80K、40D80K、81K61R、91N95G、107H36D、107R36D和91N94Y95G至少一种组合取代的那些突变蛋白。见以下实施例4和表6。
本发明还提供符合其它选择标准，相对于脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2而言具有改进的治疗指数的人IL-2突变蛋白。因此例如，在另一实施方式中，本发明提供的人IL-2突变蛋白在0.1nM突变蛋白时IL-2诱导的NK细胞增殖与0.1nM突变蛋白IL-2诱导NK细胞产生TNF-α的比率，高于脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的至少1.25倍、1.5倍、1.75倍，优选至少高2.0倍、2.5倍3.0倍，更优选高3.5倍、3.75倍、4.0倍4.5倍和高达5.0倍。符合这些标准的突变蛋白包括表1所示的所有突变蛋白，例外的是含有19D40D组合取代的人IL-2突变蛋白。此指数提高预示增强NK细胞效应器功能和降低毒性的有益临床作用有所改进。
新型人IL-2突变蛋白的生物学活性变体
本发明也提供上述新型人IL-2突变蛋白的生物学性能比参比IL-2分子性能提高的变体，即用本文所述生物试验，当与参比的IL-2分子，即脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，其能诱导NK细胞降低或减少促炎症细胞因子产生，和能保持可增强NK细胞增殖的生物学活性变体。如前所述，认为与本发明的新型人IL-2突变蛋白观察到的相比，本文鉴定的某给定的新型人IL-2突变蛋白可具有绝对不同的特定生物活性，只要当用上述生物试验与参比的IL-2分子，即脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，其相对于参比IL-2分子而具有所需特性，即诱导促炎症细胞因子的毒性降低，和/或能增强NK细胞的增殖。
“变体”指基本上相似的序列。上述新型人IL-2突变蛋白可以是天然产生的(如IL-2基因座的等位基因变体)或重组产生的(如突变蛋白)核酸或氨基酸序列。多肽变体可以是上述新型人IL-2突变蛋白的片段，或它们与该新型人IL-2突变蛋白不同处在于具有一处或多处其它的氨基酸取代或缺失或氨基酸***，只要变体多肽保留了上述新型人IL-2突变蛋白中存在的感兴趣特定氨基酸取代。因此，合适的多肽变体包括对应于成熟的人IL-2序列(即SEQ ID NO：4)125位含有C125S取代的那些多肽，它们为本文鉴定的一种组合取代，具有本发明新型人IL-2突变蛋白的改进治疗指数(即以上表1所示组合取代)和一处或多处其它的氨基酸取代或缺失或氨基酸***。因此例如，如表1所示，当新型人IL-2突变蛋白含有脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2(SEQID NO：8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列和表1所示的一种组合取代，这些新型人IL-2突变蛋白的合适生物学活性变体也含有C125S取代及表1所示的组合取代，但与各种新型人IL-2突变蛋白不同之处在于有一处或多处其它的取代、***或缺失，只要当与参比的IL-2分子(即C125S人IL-2或脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2)相比，该变体多肽相对于参比IL-2分子(即参比的IL-2突变蛋白C125S人IL-2或脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2)而具有毒性降低、促炎症细胞因子产生减少、和/或NK细胞增殖增强的所需特性。当如下文所述测定序列相同性百分比时，这种变体的氨基酸序列与各新型人IL-2突变蛋白，例如SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72所示的新型人IL-2突变蛋白的氨基酸序列至少有70％相同，通常至少75％、80％、85％、90％相同，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。
在其它实施方式中，当如下文所述测定序列相同性百分比时，该生物学活性变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72的残基2-133所示氨基酸序列至少有70％相同，通常至少75％、80％、85％、90％相同，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。
在本发明的某些实施方式中，本发明的人IL-2突变蛋白生物活性变体含有用其它天然氨基酸如丙氨酸的C125S取代，这不影响所需的人IL-2突变蛋白的功能特性。因此例如，这种变体在SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72的125位丙氨酸残基取代了丝氨酸残基。在另一实施方式中，本发明的人IL-2突变蛋白生物活性变体含有SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72的残基2-133，和这些序列的125位丙氨酸残基取代了丝氨酸残基。
发明的其它实施方式中，本发明的人IL-2突变蛋白生物活性变体含有SEQ IDNO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72的氨基酸序列，和这些序列的125位半胱氨酸残基取代了丝氨酸残基。在其它实施方式中，本发明的人IL-2突变蛋白生物活性变体含有SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72所的残基2-133，和这些序列的125位半胱氨酸残基取代了丝氨酸残基。
核酸“变体”指编码本发明的新型人IL-2突变蛋白的多聚核苷酸，但由于基因密码子的简并性其核苷酸序列不同于上述新型突变蛋白的序列。天然氨基酸的密码子是本领域熟知的，包括特定宿主生物用于表达重组蛋白最常用的那些密码子。编码上述IL-2突变蛋白的核苷酸序列本文附属序列表中所示的那些序列，及由于基因密码子简并性而不同于上述序列的核苷酸序列。
因此例如，当本发明的IL-2突变蛋白含有天冬氨酸(即D)取代时，例如在C125S或脱丙酰胺基-1、C125S突变蛋白中含有19D40D、19D81K、36D42R、36D61R、36D65L、40D36D、40D61R、40D65Y、40D72N、40D80K、49D36D、80K36D、81K36D、81K88D、81K91D、107H35D、107R36D或40D81K107H组合取代，编码取代的天冬氨酸残基的核苷酸序列可选自天冬氨酸的二种通用三联密码子，即GAC和GAT。当该组合取代包含二种相似残基的取代，如该突变蛋白含有19D40D或40D36D组合取代时，该取代的残基可由相同的通用密码子编码(即由GAC或GAT编码二取代)，或可由另一通用密码子编码(即一处取代由GAC编码，另一处取代由GAT编码)。类似地，当本发明的IL-2突变蛋白含有甘氨酸(即G)取代，如在C125S或脱丙酰胺基-1、C125S突变蛋白中含有40G36D、40G65Y、91N95G、40G81K107H或91N94Y95G组合取代时，编码取代的甘氨酸残基的核苷酸序列可选自甘氨酸的4个通用三联密码子，即GGT、GGC、GGA和GGG。
当本发明的IL-2突变蛋白含有赖氨酸(即K)取代时，例如在C125S或脱丙酰胺基-1、C125S突变蛋白中含有19D81K、40D80、8036D、8065、81K36D、81K42E、81K61R、81K65Y、81K72N、81K88D、81K9ID、81K107H、40D81K107H或40D81K107H组合取代，编码取代的赖氨酸残基的核苷酸序列可选自赖氨酸的二种通用三联密码子，即AAA和AAG。类似地，本发明的IL-2突变蛋白含有亮氨酸(即L)取代时，例如在C125S或脱丙酰胺基-1、C125S突变蛋白中含有36D65L或81K107H组合取代，编码取代的亮氨酸残基的核苷酸序列可选自亮氨酸的六种通用三联密码子，即TTA、TTG、CTT、CTC、CTA和CTG。
当本发明的IL-2突变蛋白含有天冬酰胺(即N)取代时，例如在C125S或脱丙酰胺基-1、C125S突变蛋白中含有40D72N、81K72N、91N95G、107R72N或91N94Y95G组合取代，编码取代的天冬酰胺残基的核苷酸序列可选自天冬酰胺的二种通用三联密码子，即GAT和GAG。类似地，当本发明的IL-2突变蛋白含有组氨酸(即H)取代时，例如在C125S或脱丙酰胺基-1、C125S突变蛋白中含有81K107H、81L107H、107H36D、107H42E、107H65Y、40D81K107H或40G81K107H组合取代，编码取代的组氨酸残基的核苷酸序列可选自组氨酸的二种通用三联密码子，即CTA和CAC。
当本发明的IL-2突变蛋白含有精氨酸(即R)取代时，例如在C125S或脱丙酰胺基-1、C125S突变蛋白中含有36D42R、36D61R、40D61R、81K61R、107R36D或107R72N组合取代，编码取代的精氨酸残基的核苷酸序列可选自精氨酸的六种通用三联密码子，即CGT、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG。类似地，当本发明的IL-2突变蛋白含有酪氨酸(即Y)取代时，例如在C125S或脱丙酰胺基-1、C125S突变蛋白中含有40D65Y、40G65Y、80K65Y、81K65R、107H65Y或91N94Y95G组合取代，编码取代的酪氨酸残基的核苷酸序列可选自酪氨酸的二种通用三联密码子，即TAT和TAC。当本发明的IL-2突变蛋白含有谷氨酸(即E)取代时，例如在C125S或脱丙酰胺基-1、C125S突变蛋白中含有81哄骗2或107H42组合取代，编码取代的谷氨酸残基的核苷酸序列可选自谷氨酸的二种通用三联密码子，即GAA和GAG。
虽然上述核酸变体名单已描述了可用来编码本文所鉴定的特定残基取代的通用密码子，但应认为本发明包括编码本文所述人IL-2突变蛋白的由于基因密码子简并性而致的所有核酸变体。
天然的人IL-2的天然等位基因变体可用熟知的分子生物学技术鉴定，如聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术，可用作加入突变的指南将其加入到本文所人IL-2突变蛋白而不影响这些新型人IL-2突变蛋白所需的治疗指数。变体核苷酸序列也包括衍生自合成的核苷酸的突变蛋白，例如，如下所述，通过定点诱变产生的编码上述新型人IL-2的突变蛋白。通常当如下文所述测定序列相同性百分比时，本发明的核苷酸序列变体与它们各自的新型人IL-2突变蛋白的核苷酸序列，例如SEQ ID NO：9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、57、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、79或71所示编码序列的核苷酸4-399有至少70％，通常有至少75％、80％、85％、90％序列相同，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列相同。
术语“基因”和“重组基因”本文用于指含有编码本发明IL-2突变蛋白开放读框的核酸分子。短语“等位基因变体”指位于IL-2基因座的核苷酸序列或指该核苷酸序列编码的多肽。这种天然等位基因变体通常可导致IL-2基因的核苷酸序列发生1-5％变异。IL-2序列中的任何和所有的核苷酸变体和所产生的氨基酸多态性是天然等位基因变异所至，不会改变本发明新型人IL-2突变蛋白的功能活性，包括按本发明突京戏产生的序列，所有这些产生的序列均属于本发明的范围。
例如，可在编码新型IL-2突变蛋白的克隆DNA序列中制造突变来上述新型人IL-2突变蛋白的氨基酸序列变体，只要这些突变不改变表1鉴定的组合取代。诱变和改变核苷酸序列的方法是本领域熟知的，见例如，Walker和Gaasta编，(1983)《分子生物学技术》Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，NewYork)；Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-92；Kunkel等，(1987)MethodsEnzymol.154：267-82；Sambrook等(1989)《分子克隆：实验手册》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NewYork)、美国专利4,873,192和本文引用的参考文献。关于不影响IL-2突变蛋白的所需生物学活性(即降低NK细胞产生促炎症细胞因子、预计减少毒性和保持或增强NK细胞增殖)的适当氨基酸取代指南可在Dayhoff等，《多肽序列和结构图集》Atlas ofPolypeptide Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，DC)的模型中找到。
当设计上述人IL-2突变蛋白的生物学活性变体时，优先保守性取代，如一个氨基酸用另一个具有相似性能的氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基取代。该领域定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括含碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。见例如，Bowie等，Science 247：1306，1990。保守性取代的例子包括但不限于：
Figure A20058000707200321
Figure A20058000707200322
Figure A20058000707200323
Figure A20058000707200324
和
Figure A20058000707200325
这种取代宜不含保守的半胱氨酸残基，如氨基末端毗连的半胱氨酸残基。
关于人IL-2蛋白中可通过取代、缺失或***本文鉴定的所需取代而改变的区域是本领域知道的。见例如，Bazan，Science 257：410-12，1992；McKay，Science 257：412；Theze等，Immunol.Today 17：481-86，1996；Buchli和Ciardelli，Biochem.Biophys307：411-15，1993；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85：7709-13，1988；Kunkel等，J.Immunol.150：5731，1993；Eckenberg等，Cytokine 9：488-98，1997。
在构建本发明新型人IL-2突变蛋白变体时，将修饰编码该变体的核苷酸序列使变体多休可持续拥有所需活性。显然，在编码变体多肽DNA中进行的任何突变必须不将该序列置于读框外、优选不产生可能导致二级mRNA结构的互补区。多肽变体可有少至1-15个氨基酸的不同，如6-10个少至5个，少至4、3、2个，甚至1个氨基酸残基不同。核苷酸序列变体可有少至1-30个核苷酸不同，如6-25个，少至5个，少至4、3、2个，甚至1个核苷酸不同。
本发明的人IL-2突变蛋白的生物学活性变体包括这些突变蛋白的片段。“片段”指编码核苷酸序列的一部分或氨基酸序列的一部分。关于编码序列，人IL-2突变蛋白核苷酸序列的片段可编码保留了新型人IL-2突变蛋白所需生物学活性的突变蛋白片段。上述新型人IL-2突变蛋白的片段可以长15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130个氨基酸功多达该新型人IL-2多肽的全长。编码核苷酸序列的片段可以至少是45、60、75、90、105、120、135、150、165、180、195、210、225、240、255、270、285、300、315、330、345、360、375、390个核苷酸，和多达编码该新型人IL-2突变蛋白的整个核苷酸序列。
可进一步修饰上述人IL-2突变蛋白及其生物学活性变体，只要它们相对于C125S人IL-2突变蛋白或脱丙酰胺基-1C125S人IL-2突变蛋白具有所需特性，即毒性降低和/或增强NK细胞增殖。其它修饰包括但不限于：磷酸化、非天然氨基酸同类物的取代等。可导致其体内表达延长，因此提高了IL-2突变蛋白药物制剂的效力的IL-2突变蛋白修饰包括蛋白分子的糖基化或PEG化。天然是非糖基化的蛋白质的糖基化常通过在分子中***N-连接的糖基位点来进行。可用这种方法来蛋白质如IL-2突变蛋白的半寿期。此外，可用此方法不掩盖免疫原性表位，提高蛋白质的稳定性、减少凝聚和提高表达和纯度产量。
一旦获得上述人IL-2突变蛋白的变体，预计该人IL-2突变蛋白序列中的缺失、***和取代不会对具体的人IL-2突变蛋白的特性产生根本改变。然而当预先这样做难以预计取代、缺失或***的确切影响时，本领域技术人员知道可用常规筛选试验来评价这种作用。即用本领域技术人员已知的标准细胞增殖试验，包括上述试验来评价IL-2诱导的NK细胞或T细胞增殖活性。可用细胞因子特异性ELISA，例如上述TNF-α特异性ELISA，来检测IL-2诱导的促炎症细胞因子产生。NK细胞存活信号可用pAKT ELISA检测(见例如，以下描述的试验)。NK细胞介导的溶细胞活性(即细胞毒性)可用本领域已知的试验检测(例如，本文所述的NK-介导的、LAK介导的、或ADCC介导的溶细胞活性)。
可将上述人IL-2突变蛋白及其生物学活性变体构建成含有IL-2融合或偶联蛋白，其含中所含的IL-2突变蛋白(或上述生物学活性变体)融合于第二蛋白或共价偶联于聚脯氨酸或水溶性聚合物以减少给药次数或进一步提高对IL-2的耐受性。例如，可用本领域已知方法将人IL-2突变蛋白(或其上述生物学活性变体)融合于人白蛋白或白蛋白片段(见例如WO 01/79258)。或者，可采用本领域已知方法，将人IL-2突变蛋白(或其上述及其生物学活性变体)共价偶联于聚脯氨酸或聚乙二醇均聚物和聚氧乙烯化多聚醇，其中所述均聚物一端可用烷基和聚醇不取代或取代。(见例如美国专利4,766,106；5,206,344和4,894,226)。
“序列相同性”指当排列核苷酸序列或氨基酸序列的特定连续区段，和将其与参比序列的核苷酸序列或氨基酸序列作比较时，在变体序列和参比序列中找到的相同核苷酸或氨基酸残基。序列排列对比和测定序列间相同性的方法是本本领域熟知的。见例如，Ausubel等编著，(1995)《新编分子生物学实验指南》(Current Protocol inMolecular Biology)，第9章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff，1978，见《多肽序列和结构图集5》：增刊3(National BiomedicalResearch Foundation，Washington，D.C)。对于二核苷酸序列的最佳排列对比，该变体核苷酸序列的连续区段与参比核苷酸序列相比，可以加入核苷酸或缺失核苷酸。同样，为了最佳排列对比二氨基酸序列，该变体氨基酸序列的毗连区段与参比氨基酸序列相比，可以加入氨基酸残基或缺失氨基酸残基。用于与参比核苷酸序列或参比氨基酸序列作比较的毗连区段应含至少20个毗连核苷酸或氨基酸残基，可以是30、40、50、100个或更多的核苷酸或氨基酸残基。为提高序列相同性可在该变体核苷酸序列或氨基酸序列中包括空格，这可通过设置空格罚分来纠正。序列排列对比的方法是本领域熟知的。
可用数学算法来进行二序列之间相同性百分比的测定。对于本发明的目的，采用Smith-Waterman的同源检索算法测定氨基酸序列的序列相同性百分比，采用仿射6空格检索，空格罚分12，空格延伸罚分2，BLOSUM矩阵62。Smith-Waterman的同源检索算法在Smith-Waterman(1981)Adv.Appl.Math 2：482-89中讲解。或者，用Smith-Waterman的同源检索算法，采用空格罚分25，空格延伸罚分5，测定核苷酸序列的同源性百分比。因此，可用例如Time Logic的DeCyoher Hardware Accelerator进行序列相同性的测定。
进一步认识到当考虑氨基酸相同性百分比时，某些氨基酸可能因保守性氨基酸取代(不会影响多核苷酸功能特性)而不同。此时，可考虑保守性取代的氨基酸类似性来校正序列相同性百分比。这种校正方法是本领域熟知的。见例如，Meyers等，ComputerApplic.Biol. Sci.4：11-17，1988。
重组表达载体和宿主细胞
通常，本发明的人IL-2突变蛋白用载体，优选表达载体表达。载体可在宿主细胞中用于自身复制或可通过导入宿主细胞而整合入宿主细胞基因组中(如非游离体哺乳动物载体)。表达载体能指导与其操作性相连的编码序列表达。通常重组DNA技术中用的表达载体为质粒(载体)形式。然而，本发明包括其它类型的表达载体，如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
本发明的表达构建物或载体含本发明人IL-2突变蛋白的核酸分子，其形式适合于在宿主细胞中表达该核酸分子。感兴趣的编码序列可通过下述重组DNA技术，如Taniguchi等，Nature 302：305-310，1983和Devos，Nucleic Acids Research 11：4307-4323或采用Wang等，Science 224：1431-33，1984所述的突变改变的IL-2来制备。认识到单数SEQ ID NOS：9-71所示编码序列开始于成熟的人IL-2序列SEQ ID NO：4第一个残基的密码子(即1位丙氨酸的密码子)，而非甲硫氨酸密码子，其通常是信使RNA中的翻译起始密码子ATG。这些公开的核苷酸序列也缺乏单数SEQ ID NOS：9-71的399位核苷酸之后的翻译终止密码子。当采用这些序列或含单数SEQ ID NOS：9-71的4-399位核苷酸序列来表达本发明人IL-2突变蛋白时，应知道含这些人IL-2突变蛋白编码序列的表达构建物还应在上游和含人IL-2突变蛋白编码序列的正确读框内包含翻译起始密码子，如ATG密码子。翻译起始密码子可利用翻译起始密码子，如ATG，在人IL-2突变蛋白编码序列起始密码子的上游位置提供，ATG可能已存在于包含人IL-2突变蛋白编码序列的序列中，或可由外源，如用于表达的质粒提供，只要翻译起始密码子在含人IL-2突变蛋白编码序列起始密码子的正确读框中位于人IL-2突变蛋白编码序列中起始密码子第一个之前。类似地，上这人IL-2突变蛋白编码序列之后为一个或多个翻译终止密码子，如TGA，使人IL-2突变蛋白产物末端为SEQ ID NOS：10-72所示序列的最后一个氨基酸。
重组表达载体所含的根据宿主细胞选择的一个或多个调节序列操作性连接于被表达的核酸序列。“操作性相连”指感兴趣的核苷酸序列(即编码本发明人IL-2突变蛋白的序列)连接于所述调节序列，其方式能使该核苷酸序列表达(如在体外转录/翻译***中或当该载体被导入宿主细胞中时在宿主细胞中)。“调控序列”包括启动子、增强子和其它表达控制元件(如聚腺苷酸信号)。见例如，Goeddel(1990)，《基因表达技术：酶学方法》（Gene Expression Technology：Methods in Enzymology)185(AcademicPress，San Diego，California)。调控序列包括能在许多类型宿主细胞中指导核苷酸序列组成性表达和只在某种宿主细胞中指导核苷酸序列表达的那些序列(如组织特异性调控序列)。本领域技术人员知道表达载体的设计取决于许多因素，如所选择的待转化宿主细胞、蛋白质表达的所需水平等。可将本发明的表达构建物导入宿主细胞中来产生上述人IL-2突变蛋白，或产生其生物学活性变体。
本发明的表达构建物或载体设计用于在原核或真核宿主细胞中表达人IL-2突变蛋白或其变体。最常用含组成型或可诱导性启动子的载体在原核大肠杆菌细胞中表达蛋白质。在大肠杆菌中最大程度表达重组蛋白质的方法或参见例如，Gottesman(1990)，《基因表达技术：酶学方法》185(Academic Press，San Diego，CA)119-128页和Wada等，Nucleic Acid Res 20：2111-18，1992。培养、收集、破裂或从细腻提取人IL-2突变蛋白或其变体的方法基本描述可见，例如美国专利4,604,377；4,738,927；4,656,132；4,569,790；4,748,234；4,530,7874,572,798：4,748,234和4,931,543。
重组人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体也可在真核细胞，如酵母菌或人细胞中制备。合适的真核宿主细胞包括昆虫细胞(例子为可利用杆状病毒载体在培养的昆虫细胞，如sf9细胞，包括pAc系列(Smith等，Mol.Cell.Biol.3：2156-65，1983)和pVL系列(Lucklow和Summers，Virology 170：31-39，1989)中表达蛋白质)；酵母细胞(酿酒酵母菌中表达载体的例子包括pYepSecl(Baldari等，EMBO J.6：229-234，1987)，pMFa(Kurjan和Herskowitz，Cell 30：933-43，1982)，pJRY88(Schultz，Gene 54：113-123，1987)，pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)，和pPicZ(Invitrogen Corporation，San Diego，CA))；或哺乳动物细胞(哺乳动物表达载体包括pCDM8(Seed，Nature 329：840，1987)和pMT2PC(Kaufman等，ENBO J.6：187-195，1987))。合适的哺乳动物细胞包括中国仑鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞。哺乳动物细胞中，常通过病毒调控元件提供表达载体的控制功能。例如，常用的启动子得自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和仙台病毒40。真核和原核细胞的其它合适表达***可参见Sambrook等(1989)，《分子克隆：实验手册》(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)的16和17章，见Goeddel(1990)，《基因表达技术：酶学功法》185(AcademicPress，San Diego，California)。
可优化在感兴趣宿主细胞中表达本发明的人IL-2突变蛋白编码序列。对某给定细胞宿主，可参考在该宿主细胞中表达的已知基因经计算调节该序列中的G-C含量至平均水平。可优化个别密码子，例如已进行残基取代，如C125S取代、C125A取代、和/或表1所示其它组合取代的密码子。或者，可优化人IL-2突变蛋白编码序列中的其它密码子以提高宿主细胞表达，如已为在特定宿主细胞中表达优化了该密码子序列中的1％、5％、10％、25％、50％、75％或高达100％密码子。见例如，SEQ IDNO：73和74公开的人IL-2突变蛋白序列。其中为在大肠杆菌中表达，已分别优化了36D61R和107R36D组合取代的密码子。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应理解此术语不仅指具体的对象细胞而且指这些细胞的子代或可能的子代细胞。因为突变或环境影响其后代可能发生某些变化。这些子代实际上与亲代细胞不相同，但这仍属于此术语的范畴。
可用常规转化或转染技术将载体DNA导入原核或真核细胞中。术语“转化”和“转染”本文用于指各种将外源核酸(如DNA)导入宿主细胞中的本领域已知技术，包括磷酸钙-氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂质转染、颗粒抢或电穿孔。转化或转染细胞的合适方法可见Sambrook等(1989)，《分子克隆：实验手册》(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)和其它标准的分子生物学实验手册。
在合适的培养基中培养用于产生本发明IL-2突变蛋白和其生物学活性变体的原核和真核细胞一般可见Sambrook等(1989)，《分子克隆：实验手册》(第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)中的描述。
药物组合物
产生和纯化人IL-2突变蛋白或其变体后，可将它们掺入到用于人和兽医治疗，如癌症治疗、免疫治疗和传染病治疗的药物组合物中。因此，可将人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体配制成药物组合物用于各种治疗。作为组合物，人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体用该领域已知方法经胃肠道外给予对象。所述对象包括哺乳动物如；灵长动物、人、狗、牛、马等。这些药物组合物可含有能提高本发明人IL-2突变蛋白药效或提高所需质量的其它化合物。该药物组合物通过所选途径给药必须安全，它们必须灭菌、保留生物活性、它们必须能稳定地溶解人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体。取决于制剂的加工，本发明的IL-2突变蛋白药物组合物可以液体形式，在大气环境、冷藏、或冷冻、或干燥制剂形式，如冻干粉末保存，可重建为液体溶液、悬浮液或乳液，再以各种方法之一，包括口服或胃肠道外给药途径给予。
这种药物组合物通常含有至少一种人IL-2突变蛋白、其生物学活性变体、或其组合，和药学上可接受的运载体。配制用于给药的本发明人IL-2突变蛋白的方法是该领域技术人员知道的。见例如，Gennaro(编)(1995)《雷明顿药物科学与实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)(第19版，Mack PublishingCompany，Easton，PA)。
语句“药学上可接受的运载体”本文用于指包括与给药相容的任何和所有的溶剂、分散剂、包衣剂、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。可用于药学活性物质的这种媒介和制剂是该领域熟知的。除了迄今已知与该活性化合物不相容的任何常规媒介和制剂外，这类介质均可用于本发明的人IL-2突变蛋白药物制剂中。也可在该组合物中加入添加的活性化合物。
可将含有本发明的人IL-2突变蛋白的IL-2突变蛋白药物组合物配制成与其给药途径相容。根据所需结果给药途径可以不同。可用药团剂型、连续输注或恒量输注(短时，如1-6小时输注)给予人IL-2突变蛋白药物组合物。可经口服、鼻内、胃肠道外包括静脉内、皮下、腹腔内、肌肉内等，皮内、透皮(局部)、透粘膜和直肠给药，或肺吸入给予人IL-2突变蛋白药物组合物。
胃肠道外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包含以下成分：灭菌稀释液如注射用水、盐水、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苄醇或甲基对羟基苯甲酸酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸钠；螯合剂如EDTA；表面活性剂如聚山梨酯80；SDS；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和调节张力的制剂如氯化钠或葡聚糖。可用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节pH。胃肠道外制品可封装在玻璃或塑料制的安瓿、一次性针筒或多剂小瓶中。
适合注射用的药物组合物包括灭菌水溶液(水溶性)或分散液，和即刻制备灭菌可注射溶液或悬浮液的灭菌粉末。制备过程中应尽量减少蛋白质凝聚物的形成，静脉内给药的合适运载体包括生理盐水、抑菌水、Cemophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，该组合物必须灭菌，应是易于装在注射器中的液体。应在操作和贮存条件下稳定，必须防腐防止微生物，如细菌和霉菌的污染作用。运载体可以是溶剂或分散剂，包括例如，水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可采用包衣剂如卵磷酯，通过维持所需的颗粒大小(分散液时采用表面活性剂)来维持适当的流动性。可用各种抗菌剂和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来预防微生物的作用。许多情况下此组合物中宜包含等渗剂，如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可在此组合物中包含能延迟吸收的制剂，如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。
如需要，可在合适的溶剂中掺入所需量的一种活性化合物或与上述成分的组合，然后过滤除菌，来制备无菌注射溶液。通常在含有基础分散介质和所需上述其它成分的无菌运载体中加入活性化合物来制备分散液。就制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法中真空干燥和冻干，产生活性成分的粉末加上先前无菌过滤溶液的其它所需成分。
口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食运载体。它们可封装在明胶胶囊中或压成片剂。为口服给药，可通过已知方法，将药物制成肠溶形式避免被胃内消化或进一步包衣或混合以在消化道特定部位释放。对于口服治疗给药，可在活性化合物中加入赋形剂和采用片剂、锭子剂或胶囊。也可用液体运载体制备口服组合物，用作漱口水。其中化合物随液体运载体口服吸入、咳出或吞入。可包括药学上相容的粘合剂，和/或辅佐物质作为组合物的一部分。药片、药丸、胶囊、锭剂等可含有以下成分或性质相似的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄原胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬酯酸镁或氢化植物油(Sterote)；润滑剂如胶质二氧化硅；增甜剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙子香精。
也可通过透粘膜或透皮方式全身给药。为了透粘膜或透皮给药、可在制剂中采用适合透过屏障的渗透剂。这种渗透剂通过是本领域知道的，包括例如，透粘膜给药的洗涤剂、胆酸盐和羧链孢酸衍生物。
在一实施方式中，用能保护该化合物抵抗被机体快速消除的运载体来制备该活性化合物，如控释制剂，包括植入和微胶囊包裹的运送***。可采用生物可降解、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这些制剂的方法是该领域技术人员知道的。也可从Alza Corporation和novaPharmaceutical，Inc.购买到这些物质。也可采用脂质体悬浮液(包括用抗病毒抗原的单克降抗体靶向感染细胞的脂质体)作为药学上可接受的运载体。这些可按该领域技术人员已知的方法，如美国专利4,522,811中所述来制备。
特别优选配制易于给药和剂量均一的口服或胃肠道外单位剂型的组合物。单位剂型本文用于指物理上分开的适合治疗对象的单位剂量；各单位含有与所需药物运动会混合的预定量经计算能产生所需治疗效果的活性化合物。说明书说明了本发明的单位剂型直接取决于该活性化合物的独特性能和可达到的特定治疗效果，和本专业对这种活性化合物治疗个体的固有限制。
本发明的人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体，可用本领域已知的人IL-2配制方法配制。当前方法中采用的合适制剂可见各种专利和出版物，例如美国专利4,604,377中所述，它们显示了含有治疗量的IL-2，但基本上没有非IL-2蛋白和内毒素，生理学上可接受水溶性运载体和溶解IL-2R足够量表面活性剂，如十二烷基磺酸钠的优选IL-2制剂。可包含有其它成分有，例如裉。美国专利4,766,106显示了含有聚乙二醇(PEG)修饰的IL-2制剂。欧洲专利申请出版物No.268,110显示含有选自聚乙烯山梨聚糖脂肪酸酯(Tween-80)、聚乙二醇单硬酯酸酯和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物(Triton X405)等各种非离子表面活性剂的IL-2制剂。美国专利4,992,271公开了含人血清白蛋白的IL-2制剂。美国专利5,078,997公开了含人血清白蛋白和氨基酸的IL-2制剂。美国专利6,525,102公开了含氨基酸基质作为该多肽主要稳定剂的IL-2制剂，和酸性和/或其盐形式以将溶液缓冲在可接受的pH范围来稳定该多肽。待批美国专利申请No.10/408,648公开了适合肺输送的IL-2制剂。
治疗用途
含有获自这些人IL-2突变蛋白的本发明人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体的药物制剂可用于刺激免疫***，治疗癌症，如目前IL-2或IL-2治疗的癌症。本发明的人IL-2突变蛋白和其合适的生物学活性变体优点是能降低促炎症细胞因子的产生，预计毒性较低，同时能保持或增强所需的功能活性，如NK细胞增殖、存活、NK-细胞介导的细胞毒性(NK、LAK和ADCC)和T细胞增殖。
由于预计毒性较低，在那些需要高剂量IL-2的临床病症中，可给予与天然IL-2或IL-2相似或更高剂量的本发明人IL-2突变蛋白和其生物学活性变体仍具有最低的毒性作用。因此，本发明提供减少经历IL-2给药作为治疗方案对象白介素-2(IL-2)诱导的毒性症状的方法，该方法包括给予上述IL-2突变蛋白作为IL-2。而且，本发明的人IL-2突变蛋白和其合适的生物学活性变体具有治疗效果更好的其它优点，因此较低剂量的这些人IL-2突变蛋白可提供比天然IL-2或
Figure A20058000707200403
IL-2更好的治疗效果。
给予对象药学上有效量的本发明IL-2突变蛋白药物组合物。“药学上有效量”指可用于治疗、预防或诊断某疾病或病症的量。“对象”指哺乳动物，如灵长动物、人、狗、猫、牛、马、猪、绵羊等。用本发明药物制剂治疗的对象优选人。
为治疗目的给药时，给药可以是预防性或治疗性。当预防性提供时，在出现症状前提供药物。预防性给药的作用是预防或减轻后续症状。当治疗性提供时，在症状发作时提供药物。治疗性给予药物作用是减轻现有症状。
因此例如，含有本发明人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体的有效量药物组合物的制剂可用于治疗、预防和诊断许多对用IL-2治疗有临床反应症状的疾病。可配制本发明人IL-2突变蛋白和其生物学活性变体用于治疗与天然序列的IL-2或
Figure A20058000707200404
IL-2所治疗的相同疾病。因此，含有本发明人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体的制剂可用于诊断、预防和治疗(局部或全身)细菌、病毒、寄生虫、原虫和霉菌感染；增强细胞介导的细胞毒作用；刺激淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞活性；介导淋巴细胞免疫功能的恢复；促进同种异体抗原反应；促进放疗后、或骨髓或自身干细胞移植后(功相结合)癌症病人的免疫重建；促进获得性免疫缺陷状态的免疫功能恢复；重建老人和老龄动物的正常免疫功能；开发诊断试验如利用酶扩增、放射标记、放射显象和本领域已知的监测疾病状态时IL-2水平的其它方法；促进用于治疗和诊断目的的T细胞体外生长；阻断淋巴因子的受***点；和各种其它治疗性、诊断性和研究应用。已调查了人IL-2或其变体如人IL-2突变蛋白的各种治疗和诊断应用，见Rosenberg等，N.Engl.J.Med.316：889-97，1987；Rosemberg，Ann.Surg.208：121-135，1988；Topalian，J.Clin.Oncol.6：839-53，1988；Rosenberg等，N.Engl.J.Med.319：1676-80，1988；W eber等，J.Clin.Oncol.10：33-40，1992；Grimm等，Cell Immunol.70(2)：248-59，1982；Mazumder，Cancer J.Sci.Am.3(增刊1)：S37-42；Mazumder和Rosenberg，J.Exp.Med.159(2)：495-507，1984；和Mazumder等，CancerImmunol.Immuther.15(1)：1-10，1983。含有本发明人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体的制剂可用作单一的治疗活性药物，或可与其它免疫学相关细胞或其它治疗药物联用。相关细胞的例子有B或T细胞、NK细胞、LAK细胞等，可用于与IL-2或其变体联用的示范性治疗药物是各种干扰素，特别是γ-干扰素、B-细胞生长因子、IL-1和抗体，例如抗HER2抗体，如
Figure A20058000707200411
(Trastuzumab；Genentech，Inc.，South SanFrancisco，California)或抗-CD20抗体，如
Figure A20058000707200412
(Rituximab；IDEC-C2B8；BiogenIDEC Pharmaceutical Corp.，San Diego California)。
给予人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体的剂量范围可在0.1-15mIU/m2之间。IL-2免疫治疗与抗癌症单克降抗体联用的治疗有效量和具体治疗方案是本领域知道的。见例如，题目为“非何杰金氏淋巴瘤的治疗方法(Methods of Therapy forNon-Hodgkin’s Lymphoma)”的待批美国专利申请第2003-0185796号和题目为“过度表达HER2受体蛋白为特征的癌症IL-2/抗-HER2抗体联合治疗(CombinationIL-2/Anti-HER2 Antibody Therapy for Cancers Characterized by Overexpression of theHER2Receptor Protein)”的待批美国专利20030235556，和题目为“慢性淋巴细胞白血病的治疗方法”的待批美国专利申请No.60/491,371，2003年7月31日提交的代理人备忘录No.59516-278。对于疾病如肾细胞癌和转移性黑色素瘤，可给予人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体300,000-800,000IU/kg/8小时作高剂量静脉药团注射。见上述美国专利申请中B-细胞淋巴瘤、HER2+癌症、乳腺癌和CLL的IL-2免疫治疗推荐剂量。
采用IL-2免疫疗法来治疗HIV感染也是本领域知道的。见例如，美国专利No.6,579,521中此临床疾病推荐的剂量和治疗方案。
因此，本发明提供治疗对象癌症或调节对象免疫应答的方法，该方法包括给予本发明治疗有效量的IL-2突变蛋白或其生物学活性变体。“治疗有效量”指足以诱导所需生物学结果但不诱导不可接受毒性作用的剂量水平。给予的量根据该药物组合物中人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体的浓度、需要的活性、被治疗哺乳动物的疾病状况、剂型、给药方法和病人因素如年龄、性别和疾病严重性而不同。认为可提供广泛范围浓度的治疗有效量，如需要可给予对象多次治疗有效量来减轻和/或缓解症状、体症或所述疾病的病因，或进行生物***的***的其它所需改变。通常，本发明的IL-2突变蛋白药物组合物含有人IL-2突变蛋白或其变体的浓度范围高于
Figure A20058000707200421
IL-2所用的范围。由于剂量比IL-2高，应密切监视对象以确定有无毒性副作用出现。这类临床实验分析是本领域技术人员熟知的，例如已用于确定
Figure A20058000707200423
IL-2免疫调节和癌症治疗当前所用的剂量。
监测人IL-2突变蛋白功能活性的生物试验
本发明也提供监测IL-2诱导的NK细胞增殖和产生TNF-α、IL-2诱导的NK细胞介导的细胞毒性、IL-2诱导的T细胞增殖、和IL-2诱导的NK细胞存活的生物试验方法。已开发了这些试验方法来筛选候选IL-2突变蛋白的所需功能特性，如减少促炎症细胞因子的产生(特别是TNF-α)改善耐受性、和改进NK细胞介导的功能，如反映于该突变蛋白保持或增强NK细胞和/或T细胞增殖、保持或增强NK细胞介导的细胞毒性(NK、LAK和ADCC)及保持或增强NK细胞的存活。
这些试验先前在本文中也称为“NK-92生物试验”，用于监测IL-2诱导产生的TNF-α和IL-2诱导的NK细胞增殖。此生物试验采用人NK-92细胞系(ATCCCRL-2407，CMCC ID#11925)。NK-92细胞系最初由Gong等，leukemia 8(4)：652-58，1994报导，显示具有活化NK细胞的表型和功能特性。NK-92的增殖是IL-2依赖的，如果在缺乏IL-2的培养基中培养72小时细胞将死亡。该细胞系在接触IL-2后48-72小时之内也产生可检测水平的TNF-α。
按照本发明的方法，可筛选用此NK-92细胞生物试验筛选IL-2突变蛋白诱导产生TNF-α和诱导的NK细胞增殖的相对能力。在此方法中，将NK-92细胞培养在由α-MEM、12％热灭活胎牛血清(FBS)、8％热灭活马血清、0.02mM叶酸、0.2mM肌醇、2mM 1-谷氨酰胺和0.1mM β-巯基乙醇组成的完全培养基(NK-92培养基)中。以最低密度1-3×105细胞/毫升接种培养物，添加1000IU/ml的参比重组人IL-2突变蛋白(例如称为脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或参比的C125S人IL-2突变蛋白)。准备此试验，将细胞置于新鲜的NK-92培养基中至少48小时然后用于试验。试验前一天，洗涤NK-92细胞三次，置于NK-92培养基中24小时不加IL-2。离心细胞，悬浮在NK-92培养基中(无IL-2)，以4×104细胞/孔密度，用NK-92培养基稀释的200微升含不同浓度参比IL-2突变蛋白，如脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2；或不同浓度的待筛选感兴趣功能特性的IL-2突变蛋白，接种在96孔平底板中。37℃，5％CO2培养72小时后，取100微升等量培养上清液冻存，随后用商品化购得的TNF-αELISA试剂盒(例如BioSource CytoscreenTM人TNF-αELISA试剂盒；Camarillo，california)定量检测TNF-α。对于培养中存活的细胞，用商品化购得的MTT染料试剂盒(
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非放射细胞增殖试验试剂盒(Promega Corp.，madison，Wisconsin)测定增殖，和根据比色读数计算刺激指数。
上述第二种IL-2生物试验提供了筛选IL-2候选突变蛋白诱导NK细胞介导的细胞毒性方法。此生物试验称为“NK-92细胞毒性生物试验”，采用了人NK3.3细胞系。NK3.3细胞系显示了外周血NK细胞的表型和功能特性(Kornbluth，J Immunol129(6)：2831-37，1982)，可通过Fc受体(CD16FcγRIIIA)介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。以下实验章节的表2小结了用此种IL-2生物试验检测NK3.3细胞的生物学活性。
按照本发明的方法，可用NK3.3细胞毒性生物试验筛选具有细胞毒活性的候选IL-2突变蛋白。在此方法中，扩增NK3.3细胞并维持在添加有15％热灭活胎牛血清、25mM hepes\2mM L-谷氨酰胺和20％人T-StimTM w/PHA作为IL-2来源的RPMI-1640培养基中。准备此试验，在无IL-2(“饥饿”)时培养NK3.3细胞24小时。此试验包括在U形底96-孔板中接种5×104个“饥饿的”NK3.3细胞，使其接触不同浓度的参比IL-2突变蛋白，如脱丙酰胺基-1、C125S或C125S人IL-2突变蛋白，或不同浓度的感兴趣候选IL-2突变蛋白，总体积100微升。培养18小时后将IL-2激活的NK3.3细胞效应细胞与5×103个钙黄绿素(calcein)AM-标记的靶细胞(K562或Daudi)或抗体包被的钙黄绿素AM-标记的靶细胞(包被有最终浓度2μg/ml的rituximab单抗的Daudi细胞)共培育，得到最终的效-靶比10∶1，最终体积为200微升。效应-靶细胞共培育4小时后，简单离心96孔板；取100微升培养上清液置于黑色透明平底96孔板中用荧光计定量测定钙黄绿素AM的释放。测定的量表示为特异性溶解百分比，用以下公式计算：％特异性溶解＝＝100×[(实验孔平均值-自发释放平均值)/(最大释放平均值-自发释放平均值)]；测定含有标记的靶细胞但无效应细胞孔的自发释放，和测定含有标记的酸细胞和1％Triton X-100孔的最大释放。
上述第三种IL-2生物试验提供了筛选IL-2候选突变蛋白诱导T细胞增殖能力的方法。在此方法中，T-细胞增殖IL-2生物试验采用人T-细胞系Kit225(CMCC ID#11234)，其衍生自一位慢性T-淋巴细胞白血病病人(Hori等，Blood 70(4)：1069-72)。Kit225细胞能组成性表达IL-2受体复合物的α、β、γ亚单位。Kit225增殖是IL-2依赖的，如果培养中长期缺乏IL-2细胞将死亡。
按照本发明，该试验包括在无IL-2时培养Kit225细胞24小时，然后接种入特定数目的细胞和不同浓度的参比IL-2突变蛋白，如脱丙酰胺基-1、C125S或C125S人IL-2突变蛋白，或不同浓度的感兴趣候选IL-2突变蛋白，培育48小时后，用标准的商品化购得的MTT染料还原试剂盒检测增殖，根据比色读数计算刺激指数。
本发明的第四种生物试验提供了筛选IL-2候选突变蛋白促进NK细胞存活能力的方法。在此方法中，筛选突变蛋白诱导NK细胞存活信号的能力。IL-2(即含有脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2突变蛋白的制剂)能在事先IL-2饥饿的NK3.3细胞中诱导AKT磷酸化，认为这是“存活信号”。按照此生物试验，扩增NK3.3细胞并维持在添加有15％热灭活胎牛血清、25mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺和20％人T-StimTM w/PHA作为IL-2来源的RPMI-1640培养基中。准备此试验，在无IL-2(“饥饿”)时培养NK3.3细胞24小时。作为细胞存活信号，通过加入2nM参比IL-2突变蛋白，如脱丙酰胺基-1、C125S或C125S人IL-2突变蛋白，或2nM感兴趣候选IL-2突变蛋白，刺激“饥饿的”NK3.3细胞(2×106)30分钟。用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞二次。用50微升含蛋白酶抑制剂的细胞抽提缓冲液溶解细胞团，进行一轮冻熔。4℃，13000rpm离心提取物10分钟。将1∶10稀释的澄清溶解液等份加入AKT[pS473]*免疫试验试剂盒(BioSource Internatioal)的孔中。按操作程序，用定量ELISA检测磷酸化AKT的水平。
本发明也提供用人外周血单个核细胞(PBMC)筛选IL-2突变蛋白功能特性的生物试验。这些试验之一是联合的增殖/促炎症细胞因子产生生物试验。当接触IL-2时，人PBMC增殖和以剂量依赖方式分泌细胞因子。设计此种联合试验来评估用参比IL-2突变蛋白(如脱丙酰胺基-1、C125S突变蛋白或C125S突变蛋白)，或感兴趣的候选IL-2突变蛋白刺激72小时后，增殖和细胞因子产生的水平。用密度梯度离心分离法(如用ACDA Vacutainer CPT试管)分离一名或多名正常供体的PBMC。在96孔组织培养处理平板的完全RPMI培养基(RPMI，10％热灭活人AB血清、25mM HEPES、2mM谷氨酰胺、青霉素/链霉素/两性霉素)中，与不同浓度(0.039nM-10nM)的IL-2，或作为阴性对照无IL-2，或不同浓度的感兴趣候选IL-2突变蛋白37℃，7％CO2，培养每孔200000个细胞。培育66小时后取100微升等量细胞培养上清液冻存，随后检测细胞因子。用1μCi3H-胸苷脉冲细胞6小时，然后收集细胞测定核苷酸掺入水平(如用Wallac Trilux microbeta平板读数仪)，作为细胞增殖的衡量。可用商品购得的ELISA试剂盒(如购自BioSource International)按厂商指南检测细胞培养上清液中的TNF-α水平。对不同供体，如6、8或10位供体的完全小组反复进行此试验，可提供“正常人群”对IL-2的代表性增殖和细胞因子应答反应的特征。然后可如表1所示分析数据，这将在以下实施例10中进一步描述。
可利用第二种PBMC生物试验来筛选IL-2候选突变蛋白介导效应细胞细胞毒性的能力。此试验中，用密度梯度离心分离全血的人PBMC。在存在10nM IL-2对照或感兴趣IL-2突变蛋白下刺激PBMC 3天产生LAK活性，如本领域目前通常所实施的那样(见例如，(人NK细胞的分离和LAK活性的产生》(Isolation of Human K Cellsand Generation of LAK activity)，选自《编免疫学实验指南》(Current protocol inImmunology)；1996John Wiley&Son，Inc.)。所得细胞群含有“效应”细胞，可分类为NK或LAK，其可分别杀伤K562和Daudi肿瘤靶细胞。这些效应细胞也能介导ADCC，因效应细胞能识别结合于Daudi靶细胞的特异性抗体的Fc部分。一实施方式中，能结合Daudi靶细胞的抗体是
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(rituximab)。
按照本发明的方法，将已用感兴趣的候选IL-2突变蛋白激活的人PBMC(效应细胞)与钙黄绿素AM-标记的靶细胞以不同的效：靶比(E∶T比例)共培养4小时。检测培养上清液中相对于钙黄绿素AM的细胞毒性量。所测量根据自发释放和最大释放对照量，表示为各E∶T比例时的特异性溶解百分比。该生物试验可检测以下生物学活性：自然/自发性细胞毒(NK)，其中靶细胞是K562细胞；淋巴因子介导的杀伤(LAK)，其中靶细胞是Daudi细胞；和抗体依赖的细胞毒(ADCC)，其中靶细胞是抗体包被的Daudi细胞(如
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包被的Daudi细胞)。
获得荧光仪测得的数据，表示为相对荧光(强度)单位(rfu)。此生物试验的对照包括只有标记的靶细胞(最小)和作为100％溶解衡量的标记靶细胞与最终浓度1％的Triton X-100(最大)。用以下公式计算衡量此试验有效性(如＞30％试验无效)的最小与最大比值的百分率：
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一旦该试验证实有效，计算出一式三份样品的平均值和标准差，然后用以下公式从一式三份样品的平均值计算出特异性溶解百分比：
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数据报告为特异性溶解百分比；此外，可用候选IL-2突变蛋白相对于IL-2参比对照(如脱丙酰胺基-1、C125S突变蛋白或C125S突变蛋白)的比值来确定在人供体的混合人PBMC群中细胞毒性水平面是否保持于IL-2参比对照的水平。
可利用上述试验来筛选IL-2候选突变蛋白库中具有所需功能特性者，其中感兴趣的功能活性包括以下一种或多种：IL-2诱导的促炎症细胞因子的产生(特别是TNF-α和/或INF-γ)、IL-2诱导的NK细胞和/或T细胞增殖、IL-2诱导的NK细胞介导的细胞毒(NK、LAK和ADCC)和IL-2诱导的NK细胞存活。
给予以下实施例是为了阐述而非限制。
实施例
IL-2的治疗应用受到与其给药相关毒性的阻碍，包括发热、寒战、低血压和血管渗漏综合征。具有改进的耐受性和IL-2介导的NK和T细胞效应功能的IL-2突变蛋白允许给予相似的能更好耐受的治疗剂量或较高剂量，因此提高了此蛋白更佳疗效的潜力。本研究的整体策略是选择新型人IL-2突变蛋白，利用一组全面的专门化产量适度的NK-细胞为基础的免疫试验筛选***显示其具有以下功能特性：能降低促炎症细胞因子(特别是TNF-α)的产生，因而改善了耐受性，和改进了NK细胞介导的功能，反映在该蛋白能保持或增强NK细胞和/或T细胞的增殖、保持或增强NK细胞介导的细胞毒(NK、LAK和ADCC)和保持或增强NK细胞的存活。
为了鉴定具有所需治疗特性的合适的IL-2突变蛋白，将候选的重组人IL-2突变蛋白的生物学活性与称为参比IL-2突变蛋白的脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2(在以下实施例中用其缩写“Pro”)和C125S人IL-2(在以下实施例中用其缩写“Ala-Pro”)显示的这些生物学活性相比较。阿地白介素是大肠杆菌产生的重组脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2突变蛋白，投放市场的制品商标名为
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IL-2(ChironCorporation，Emeryville，California)。
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IL-2是一种专门的冻干制剂，为该突变蛋白的非糖基化形式，用大肠杆菌生产，在下述生物试验中使用时以蒸馏水重建。在采用重组产生的C125S人IL-2突变蛋白初步筛选实验中，采用了AME哺乳动物表达***DirectAMETM和ExpressAMETM(Applied Molecular Evolution，Inc.，San Diego，California)。
下述的人IL-2突变蛋白在宿主哺乳动物293T细胞中表达。其中参比IL-2突变蛋白是C125S人IL-2，宿主细胞用含C125S突变的操作性连接有Pro-1启动子的天然人IL-2编码序列的表达构建物转化。在脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2(即SEQ IDNO：7)的编码序列上融合了含人IL-2的真正IL-2信号序列和N-末端丙氨酸密码子(即SEQ ID NO：1的核苷酸1-63)的编码序列。该蛋白质在293T细胞哺乳动物表达***中表达为GSHis-加尾蛋白，用NI-NTA珠纯化。
实施例1 初步筛选人IL-2突变蛋白
利用密码子诱变技术平台(Applied Molecular Evolution，Inc.，San Diego，California)构建了含有C125人IL-2分子(本实施例称为“Ala-Pro”)2508个所有可能的单个氨基酸突变变体。商品购得的
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IL-2产品中所用的脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2突变蛋白与Ala-Pro不同在于：C125S人IL-2突变蛋白中保留了天然产生的成熟人IL-2N-末端Ala残基。在重组生产Ala-Pro突变蛋白时采用了AME哺乳动物表达***DirectAMETM和ExpressAMETM(Applied Molecular Evolution，Inc.，San Diego，California)。
初步筛选用人NK-92细胞系功能性免疫试验进行，用人NK3.3细胞系测试了促炎症细胞因子(TNF-α)的产生、NK细胞增殖和NK溶细胞杀伤(NK、LAK和ADCC)及细胞存活(pAKT)。选择的初步功能终点包括：(1)与Ala-Pro IL-2(即C125S人IL-2突变蛋白)或IL-2(即脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2突变蛋白)观察到的相比，减少了NK-92细胞系的促炎症TNF-α产生；(2)与这二种参比IL-2突变蛋白观察到的相比，保持或增强了人NK-92细胞系的增殖；和(3)与这二种参比IL-2突变蛋白观察到的相比，保持或增强了人NK3.3细胞系介导的NK、LAK和ADCC-介导的溶细胞杀伤。第二种功能终点是，在NK3.3细胞系中，与Ala-Pro IL-2(即C125S人IL-2突变蛋白)或
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IL-2(即脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2突变蛋白)观察到的相比，保持或增强了人Kit225T细胞系的T细胞增殖。
此初步筛选方法鉴定到168个单氨基酸取代(见题目为“改进的白介素-2突变蛋白(Improved Interleukin-2 Muteins)”的待批美国专利申请No.60/550,868，代理人案卷号No.PP20354.001(035784/261164，2004年3月5日提交)，其中C125S人IL-2突变蛋白合并在设计用于联合C125S人IL-2突变蛋白的这些168个单氨基酸变体的所需功能特性的三个组合敲诈勒库中，以寻找其它具有提高的耐受性(即降低IL-2诱导NK细胞产生TNF-α)和保持或增强NK细胞效应功能的IL-2突变蛋白。组合文库由753个IL-2突变蛋白组成，它们含有多个氨基酸取代，范围从1个取代至多达6个可能的氨基酸取代(即除天然产生的成熟人IL-2突变蛋白的C125S取代外)。
除这三个组合文库外，利用一组全面的专门化产量适度的NK和T细胞为基础的免疫试验筛选***(开发此***用于定量IL-2依赖的人NK和T细胞系增殖、NK细胞的促炎症细胞因子(TNF-α)产生，和NK细胞介导的溶细胞活性(NK/LAK/ADCC))，鉴定到具有所需功能特性(与脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2突变蛋白或C125S人IL-2相比)的32个组合性突变蛋白(见表1这些突变蛋白的组合性取代)。所有32个突变蛋白的筛选资料见以下表7所示。
筛选到这些突变蛋白后的分析采用扩大的剂量反应，导致鉴定到特异性突变蛋白，其含有能预测临床效果是否改进的三种不同功能，见以下实施例2-4中所述。当与脱丙酰胺基-1、C125S或C125S人IL-2突变蛋白相比时，选出的所有IL-2突变蛋白保持了NK细胞的溶细胞功能(NK/LAK/ADCC)。筛选过程中采用了以下方案。
NK细胞增殖/TNF-α产生
自然杀伤(NK)细胞增殖和TNF-α产生的IL-2生物试验采用人NK-92细胞系(ATCC CRL-2407，CMCC ID#11925)。最初由Gong等，Leukemia 8(4)：652-658，1994报导的NK-92细胞系显示了活化NK细胞的表型和功能特性。NK-92的增殖是IL-2依赖的；如果在没有IL-2时培养细胞会死亡。接触IL-2后48-72小时内，该细胞系也产生可检测水平的TNF-α。
将NK-92细胞培养在由α-MEM、12％热灭活胎牛血清(FBS)、8％热灭活马血清、0.02mM叶酸、0.2mM肌醇、2mM 1-谷氨酰胺和0.1mM β-巯基乙醇组成的完全培养基(NK-92培养基)中。以最低密度1-3×105细胞/毫升接种培养物，添加1000IU/ml的参比重组人IL-2突变蛋白(脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2(即阿地白介素或
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IL-2，Chiron Corporation Emeryville，california)或C125S人IL-2突变蛋白(在上述AME哺乳动物表达***中重组产生)。准备此试验，将细胞置于新鲜的NK-92培养基中至少48小时然后用于试验。试验前一天，洗涤NK-92细胞三次，置于NK-92培养基中24小时不加IL-2。离心细胞，悬浮在NK-92培养基中(无IL-2)，以4×104细胞/孔密度，用NK-92培养基稀释的200微升含有作为参比IL-2分子的不同浓度脱丙酰胺基-1、C125S或C125S人IL-2突变蛋白；或不同浓度的本发明IL-2突变蛋白，接种在96孔平底板中。37℃，5％CO2培养72小时后，取100微升等量培养上清液冻存，随后用商品化购得的TNF-αELISA试剂盒(BioSource CytoscreenTM人TNF-αELISA试剂盒；Camarillo，California)定量检测TNF-α。对于培养中存活的细胞，用商品化购得的MTT染料试剂盒(非放射细胞增殖试验试剂盒(Promega Corp.，Madison，Wisconsin)测定增殖，和根据比色读数计算刺激指数。
NK细胞介导的细胞毒
自然杀伤(NK)细胞介导的细胞毒的IL-2生物试验采用人NK3.3细胞系。NK3.3细胞系显示了外周血NK细胞的表型和功能特性(Kornbluth，J.Immunol.129(6)：2831-2837，1982)，可通过Fc受体(CD16 FcγRIIIA)介导抗体依赖性细胞毒(ADCC)。该细胞系获自Jackie Kornbluth博士，限制许可在露易斯洲立大学中使用，保存于CMCC(ID 12022)。
表2 用IL-2生物试验检测的Nk3.3细胞的生物活性
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扩增NK3.3细胞并维持在添加有15％热灭活胎牛血清、25mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺和20％人T-StimTM w/PHA作为IL-2来源的RPMI-1640培养基中。准备此试验，在无IL-2(“饥饿”)时培养NK3.3细胞24小时。此试验包括在U形底96-孔板中接种5×104个“饥饿的”NK3.3细胞，使其接触作为参比IL-2分子的不同浓度的脱丙酰胺基-1、C125S或C125S人IL-2，或不同浓度的本发明IL-2突变蛋白，总体积100微升。培养18小时后将IL-2激活的NK3.3细胞效应细胞与5×103个钙黄绿素AM-标记的靶细胞(K562或Daudi)或抗体包被的钙黄绿素AM-标记的靶细胞(包被有最终浓度2μg/ml的rituximab单抗的Daudi细胞)共培育，得到最终的效-靶比10∶1，最终体积为200微升。效应-靶细胞共培育4小时后，简单离心96孔板；取100微升培养上清液置于黑色透明平底96孔板中用荧光计定量测定钙黄绿素AM的释放。测定的量表示为特异性溶解百分比，用以下公式计算：％特异性溶解＝＝100×[(实验孔平均值-自发释放平均值)/(最大释放平均值-自发释放平均值)]；测定含有标记的靶细胞但无效应细胞孔的自发释放，和测定含有标记的靶细胞和1％Triton X-100孔的最大释放。
T细胞增殖
T细胞增殖的IL-2生物试验采用人T细胞系Kit225(CMCC ID#11234)，其衍生自一位慢性T-淋巴细胞白血病病人(Hori等，Blood 70(4)：1069-72)。Kit225细胞能组成性表达IL-2受体复合物的α、β、γ亚单位。Kit225增殖是IL-2依赖的，如果培养中长期缺乏IL-2细胞将死亡。该试验包括将Kit225细胞在无IL-2时培养24小时，然后接种入特定数目的细胞和不同浓度的作为参比IL-2分子的脱丙酰胺基-1、C125S或C125S人IL-2突变蛋白，或不同浓度的本发明IL-2突变蛋白，培育48小时后，用标准的商品化购得的MTT染料还原试剂盒检测增殖，根据比色读数计算出刺激指数。
NK细胞存活信号
筛选了人IL-2突变蛋白库某亚组诱导NK细胞存活信号的能力。
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IL-2(即含有脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2突变蛋白的制剂)能在事先IL-2饥饿的NK3.3细胞中诱导AKT磷酸化，认为这是“存活信号”。按照此生物试验，扩增NK3.3细胞并维持在添加有15％热灭活胎牛血清、25mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺和20％人T-StimTM w/PHA作为IL-2来源的RPMI-1640培养基中。准备此试验，在无IL-2(“饥饿”)时培养NK3.3细胞24小时。为产生细胞存活信号，通过加入2nM参比IL-2突变蛋白，如脱丙酰胺基-1、C125S或C125S人IL-2突变蛋白，或2nM感兴趣候选IL-2突变蛋白，刺激“饥饿的”NK3.3细胞(2x106)30分钟。用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞二次。用50微升含蛋白酶抑制剂的细胞抽提缓冲液溶解细胞团，进行一轮冻熔。4℃，13000rpm离心提取物10分钟。将1∶10稀释的澄清溶解液等份加入AKT[pS473]*免疫试验试剂盒(BioSource Internatioal)的孔中。按操作程序，用定量ELISA检测磷酸化AKT的水平。
实施例2：鉴定能降低NK细胞产生TNF-α的有益突变
突变蛋白的第一种功能预计是当以1.0nM浓度检测时，其使NK细胞诱导的TNF-α产生为C125S人IL-2突变蛋白(在以下称为“Ala-Pro”)观察到的＜60％而具有改进的耐受性。属于此种功能的突变蛋白有二类：
(1)在浓度为1.0nM(即1000pM)时能诱导NK细胞产生低的TNF-α和保持NK细胞增殖，但在更低浓度时增殖活性降低的那些突变蛋白，包括脱丙酰胺基-1、C125S或C125S IL-2突变蛋白，它们在相对于成熟的人IL-2序列(即相对于SEQ IDNO：4)的残基位置(即19、36、40、61、65、81或91位)中含有19D40D、36D61R、36D65L、40D61R、40D65Y、40G65Y或81K91D组合取代，见下表3所示。
(2)在浓度为50pM时能诱导NK细胞产生低的TNF-α和保持NK细胞增殖不降低的那些突变蛋白，此外，NK细胞产生的TNF-α必须低于0.05nM(即50pM)和o.lnM(即100pM)的C125S人IL-2的80％；此亚类包括脱丙酰胺基-1、C125S或C125SIL-2突变蛋白，它们在相对于成熟的人IL-2序列(即相对于SEQ ID NO：4)的残基位置(即40、42、65、72、80、81、88或107位)中含有40D72N、80K65Y、81K88D、81K42E、81K72N、107H65Y或107R72N组合取代，见下表3所示。
表3鉴定到的具有降低诱导NK细胞产生TNF-α的IL-2突变蛋白。NK细胞对不同浓度IL-2突变蛋白产生的TNF-α表示为与C125S人IL-2(：Ala-Pro)观察到的比值。不同浓度IL-2突变蛋白的NK细胞增殖(NK-92-MTT)表示为与C125S人IL-2(Ala-Pro)观察到的比值。
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表4鉴定到的具有降低诱导NK细胞产生TNF-α的其它IL-2突变蛋白。NK细胞对不同浓度IL-2突变蛋白产生的TNF-α表示为与C125S人IL-2(：Ala-Pro)观察到的比值。不同浓度IL-2突变蛋白的NK细胞增殖(NK-92-MTT)表示为与C125S人IL-2(Ala-Pro)观察到的比值。
实施例3：能增强NK细胞增殖的优选突变鉴定
人IL-2突变蛋白的第二种功能是在一种或多种测试浓度(5pM、20pM、50pM、100pM和1000pM)时增强NK细胞的增殖比C125S人IL-2高＞200％，而对TNF-α产生无不良影响(低于浓度100pM或1nM参比IL-2突变蛋白观察到的TNF-α产生100％)。此外，选择标准包括在至少二种测试浓度下增殖指数大于参比IL-2突变蛋白，即C125S人IL-2(Ala-Pro)观察到的150％。此种功能的突变蛋白包括脱丙酰胺基-1、C125S或C125S人IL-2突变蛋白，它们在相对于成熟的人IL-2序列(即相对于SEQ ID NO：4)的残基位置(即19、36、40或81位)中含有19D81K、40G36D或81K36D取代。见下表5。
表5鉴定到的具有能增强NK细胞增殖而对NK细胞产生TNF-α无不良影响的IL-2突变蛋白。NK细胞对不同浓度IL-2突变蛋白产生的TNF-α表示为与C125S人IL-2(：Ala-Pro)观察到的比值。不同浓度IL-2突变蛋白的NK细胞增殖(NK-92-MTT)表示为与C125S人IL-2(Ala-Pro)观察到的比值。
Figure A20058000707200521
实施例4：“双功能”突变的鉴定
人IL-2突变蛋白的第三功能表现为增强NK细胞的增殖活性和降低TNF-α的产生，其中TNF-α产生低于任何一种测试浓度(5pM、20pM、50pM、100pM和1000pM)时C125S人IL-2突变蛋白所观察到的150％.此组包括脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2突变蛋白或C125S人IL-2突变蛋白，它们在相对于成熟的人IL-2序列(即相对于SEQID NO：4)的残基位置(即36、40、42、61、80、81、91、94、95或107位)中含有36D42R、36D80K、40D80K、81K61R、91N95G、107H36D、107R36D或91N94Y95G取代，见下表6。
表6鉴定到的具有能增强诱导NK细胞增殖而对NK细胞产生TNF-α无不良影响的双功能IL-2突变蛋白。NK细胞对不同浓度IL-2突变蛋白产生的TNF-α表示为与C125S人IL-2(：Ala-Pro)观察到的比值。不同浓度IL-2突变蛋白的NK细胞增殖(NK-92-MTT)表示为与C125S人IL-2(Ala-Pro)观察到的比值。
Figure A20058000707200522
表7小结了此筛选过程鉴定到的32种组合取代的功能特性
Figure A20058000707200541
实施例5：能降低正常人外周血单个核细胞促炎症细胞因子产生
同时保持或增强其增殖和细胞毒水平的优选IL-2突变蛋白的鉴定
从表8所示上述32种IL-2突变蛋白的组合性氨基酸取代中，选择18种IL-2突变蛋白进行小规模表达/纯化。测试了这些IL-2突变蛋白能否导致分离自几位正常人人供体的外周血单个核细胞(PBMC)耐受性提高和保持活性的类似功能特性，与相关的IL-2对照(脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2突变蛋白(存在于IL-2中))和酵母菌表达的脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2突变蛋白(在下述数据中称为Y-Pro)作比较。具体说，通过刺激衍生自一组正常人人供体的PBMC来筛选纯化的IL-2突变蛋白，测定增殖和促炎症细胞因子(TNF-α)的产生，及能否通过自然/自发性细胞毒(NK)、淋巴因子活化的杀伤(LAK)，或抗体依赖的细胞毒性(ADCC)而杀伤肿瘤靶细胞。
表8筛选在人PBMC中具有活性的含以下组合取代的C125S人IL-2(SEQ ID NO：6)或脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2(SEQ ID NO：8)氨基酸序列的人IL-2突变蛋白。1
  19D40D   80K65Y   91N95G   40D72N   81K61R
  40G36D   81K91D   40D65Y   81K42E   107R72N
  81K88D   40D61R   81K36D   107R36D
  36D42R   80K36D   107H36D   40D80K
1通过与成熟的人IL-2(SEQ ID NO：4)相关的氨基酸位置和该位置的氨基酸取代鉴定IL-2突变蛋白
采用了以下主要功能终点：
1)与相关的人IL-2突变蛋白对照相比，IL-2突变蛋白激活的人PBMC产生降低的促炎症细胞因子(TNF-α)；
2)与相关的人IL-2突变蛋白对照相比，能保持或增强IL-2诱导的人PBMC增殖，但不提高促炎症细胞因子的产生；
3)与相关的人IL-2突变蛋白对照相比，能保持或增强体外用IL-2突变蛋白激活的人PBMC的NK、LAK和ADCC介导的溶细胞杀伤。
试验说明
联合增殖/促炎症细胞因子产生试验的方法
接触IL-2后，人PBMC以剂量依赖方式增殖和分泌细胞因子。为最大程度提高数据输出效率，设计了联合试验来评估用参比IL-2突变蛋白或感兴趣人IL-2突变蛋白剌激72小时后的增殖和细胞因子产生水平。试验设置包括：用密度梯度离心分离法(ACDAVacutainer CPT试管)分离一名或多名正常人供体的PBMC。在96孔组织培养处理平板的完全RPMI培养基(RPMI，10％热灭活人AB血清、25mM HEPES、2mM谷氨酰胺、青霉素/链霉素/两性霉素)中，与不同浓度(0.039nM-10nM)的IL-2，或作为阴性对照无IL-2，37℃，7％CO2，培养每孔200000个细胞。培育66小时后取等量细胞培养上清液冻存，随后检测细胞因子。用1μCi3H-胸苷脉冲细胞6小时，然后收集细胞测定核苷酸掺入水平(Wallac Trilux Microbeta平板读数仪)，来衡量细胞增殖。用商品购得的ELISA试剂盒(BioSource International)按厂商指南检测细胞培养上清液中的TNF-α水平。对一完整组6名不同人供体反复进行此试验，提供了“正常人群”对IL-2的代表性增殖和细胞因子应答反应的特征分析。
数据分析
在不同的试验平板中一式二份接种PBMC样品来评估(试验)的可重复性。分析数据通过减去本底增殖(PBMC+无IL-2)和计算一式二份样品的平均值。从含PBMC的试验孔中取得绢培养上清液，合并后得到细胞因子数据，为一式二份孔的细胞因子平均水平。根据ELISA试剂盒中装的纯化TNF-α标准曲线，定量TNF-α的水平面，用pg/ml表示。进一步汇编一组6名正常人人供体的数据，概括在图1所示的示意图中。
细胞毒试验(NK/LAK/ADCC)
此试验中，用密度梯度离心分离全血的PBMC。如本领域目前通常进行的那样，如本领域目前通常所实施的那样(见例如，《人NK细胞的分离和LAK活性的产生》，选自《新编免疫学实验指南》；1996 John Wiley&Son，Inc.)，在存在10nM IL-2对照或感兴趣的IL-2突变蛋白时刺激PBMC产生LAK活性。所得细胞群含有“效应”细胞，可分类为NK或LAK，其可分别杀伤K562和Daudi肿瘤靶细胞。这些效应细胞也能介导ADCC，因效应细胞能识别结合于Daudi靶细胞的特异性抗体(此例是
Figure A20058000707200561
)的Fc部分。此试验包括以不同的效--靶比(E：T比例)共培养效应细胞与钙黄绿素AM-标记的靶细胞4小时。检测培养上清液中相对于钙黄绿素AM的细胞毒活性量。所测量根据自发释放和最大释放对照量，表示为各E：T比例时的特异性溶解百分比。小结此试验可检测以下生物学活性：
  活性   效应细胞   靶细胞   说明
  NK   PBMC   K562   自然细胞毒
  LAK   PBMC   Daudi   IL-2活化细胞
  ADCC   PBMC   Daudi+Rituxan   抗体依赖的
数据分析
获得荧光仪测得的数据，表示为相对荧光(强度)单位(rfu)。此生物试验的对照包括只有标记的靶细胞(最小)和作为100％溶解衡量的标记靶细胞与最终浓度1％的Triton X-100(最大)。用以下公式计算衡量此试验有效性(如＞30％试验无效)的最小与最大比值的百分率：
一旦该试验证实有效，计算出一式三份样品的平均值和标准差，然后用以下公式从一式三份样品的平均值计算出特异性溶解百分比：
Figure A20058000707200572
数据报告为特异性溶解％；此外，可利用IL-2突变蛋白与相关IL-2对照的比值来确定与对照相比，在混合的人PBMC群中是否保持了细胞毒活性。
结果
鉴定到在正常人PBMC中能降低促炎症细胞因子产生同时保持或增强增殖和细胞毒水平的二个优选组合性IL-2突变蛋白：40D72N和40D61R。对于以下提供的数据，只用相关对照，即在同一酵母***中表达式并纯化的脱丙酰胺基-1、C125S人IL-2(称为Y-Pro)测试了IL-2突变蛋白。先在二次独立试验中，用联合的增殖/促炎症细胞因子产生试验，测试了IL-2突变蛋白的剂量反应曲线(39pM-10nM)，各用三名正常人供体的PBMC作一式二份测试。数据分析包括人供体的个体概况、均值±标准差、与内参照IL-2的差异分析和细胞因子产量(pg/ml)按增殖(cpm)标准化，以得到每个细胞产生的细胞因子相对量。最后计算出与IL-2对照相比TNF-α产量减少的百分数。如果保持了增殖能力，10,000pM浓度时TNF-α产量减少25％以上的IL-2突变蛋白确实是优选的。表9小结了二种优选组合性IL-2突变蛋白骨架中的其它氨基酸组合取代。图2和3分别显示在人PBMC中，40D72N和40D61R介导的增殖和TNF-α产生。
表9IL-2对照TNF-α产生的降低百分比1
  ID   625pM   2500pM   10,000pM
  40D72N   -31.53   -29.94   -26.89
  40D61R   -19.62   -20.77   -27.69
1数值代表一组6名正常人人供体PBMC的Y-Pro对照平均降低百分比。细胞因子数据按增殖标准化
一旦鉴定到二种优选的IL-2突变蛋白，重要的是确定此IL-2突变蛋白激活的PBMC是否保留了通过NK、LAK和ADCC活性溶解肿瘤靶细胞的能力。如图4所示，观察到40D72N IL-2突变蛋白或40D61R IL-2突变蛋白与相关的IL-2对照之间在通过NK、LAK和ADCC活性溶解肿瘤靶细胞能力上未见差异。
本领域技术人员将倒记住上述的本发明的许多修改和其它实施方式，这些发明具有以上所述和附图显示的优点。因此应理解本发明不限于上述的具体实施方式，各种修改和其它实施方式也包括在本敲诈勒所述实施方式的范围内。虽然本敲诈勒采用了一些专门术语，但它们只按通用的含义使用，而不是限制本发明的范围。
序列表
<110>L.奥克曼(Lea Aukerman)
K.德尼斯-米泽(Kimberly Denis-Mize)
C.海斯(Carla Heise)
B.杰拉尔(Bahija Jallal)
D.门尼泽斯(Daniel Menezes)
S.T.威尔森(Susan T.Wilton)
<120>组合性白介素-2突变蛋白
<130>PP020568.0003
<140>60/585,980
<141>2004-07-07
<140>60/550,868
<141>2004-03-05
<140>60/646,095
<141>2005-01-21
<160>74
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>459
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(459)
<221>misc_feature
<222>(0)...(0)
<223>人IL-2前体
<400>1
atg tac agg atg caa ctc ctg tct tgc att gca cta agt ctt gca ctt    48
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
 1               5                   10                  15
gtc gca aac agt gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta    96
Val Ala Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
             20                  25                  30
caa ctg gag cat tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att    144
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
         35                  40                  45
aat aat tac aag aat ccc aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt    192
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
     50                  55                  60
tac atg ccc aag aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa    240
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
 65                  70                  75                  80
gaa gaa ctc aaa cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa    288
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
                 85                  90                  95
aac ttt cac tta aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata    336
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
            100                 105                 110
gtt ctg gaa cta aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct    384
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
        115                 120                 125
gat gag aca gca acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt    432
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
    130                 135                 140
tgt cag agc atc atc tca aca ctg act                                459
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145                 150
<210>2
<211>153
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
 1               5                  10                  15
Val Ala Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
            20                  25                  30
Gln Leu Glu His LeuLeu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
        35                 40                  45
 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
     50                  55                  60
 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
 65                  70                  75                  80
 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
                 85                  90                  95
 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
             100                 105                 110
 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
         115                 120                 125
 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
     130                 135                 140
 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
 145                 150
<210>3
<211>399
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<221>misc_feature
<222>(0)...(0)
<223>成熟的人IL-2
<400>3
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
         35                  40                  45
aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tgt cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
        115                 120                 125
atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>4
<211>133
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>5
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<223>C125S人IL-2突变蛋白
<400>5
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
         35                  40                  45
aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>6
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C125S人IL-2突变蛋白
<400>6
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>7
<211>396
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(396)
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cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat tta    48
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
 1               5                   10                  15
ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag aat    96
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
             20                  25                  30
ccc aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag aag    144
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
         35                  40                  45
gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa cct    192
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
     50                  55                  60
ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta aga    240
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
 65                  70                  75                  80
ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta aag    288
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
                 85                  90                  95
gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca acc    336
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
            100                 105                 110
att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc atc    384
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
        115                 120                 125
tca aca ctg act                                                    396
Ser Thr Leu Thr
    130
<210>8
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>脱丙氨酰1、C125S人IL-2突变蛋白
<400>8
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
 1               5                  10                  15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
            20                  25                  30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys  Phe Tyr Met Pro Lys Lys
        35                  40                   45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
    50                  55                  60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65                  70                  75                  80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
                85                  90                  95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
            100                 105                 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
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Ser Thr Leu Thr
    130
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<221>CDS
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Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg gat gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Asp Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa ctc acc agg atg gac aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Asp Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
         35                  40                  45
aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
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<212>PRT
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<223>19D40D，C125S人IL-2突变蛋白
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Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
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Leu Leu Asp Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Asp Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>11
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<223>19D81K，C125S人IL-2突变蛋白
<400>11
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg gat gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Asp Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
         35                  40                  45
aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt csc tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aag ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Lys Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ssr Thr Leu Thr
    130
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<211>133
<212>PRT
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<220>
<223>19D81K，C125S人IL-2突变蛋白
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Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                  10                  15
Leu Leu Asp Asp Leu Gln Met Ile Leu Ash Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Lys Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
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Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>13
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
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<223>36D42R，C125S人IL-2突变蛋白
<400>13
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa gac acc agg atg ctc aca aga aag ttt tac atg ccc aag    144
Asn Pro Lys Asp Thr Arg Met Leu Thr Arg Lys Phe Tyr Met Pro Lys
         35                  40                  45
aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>14
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<220>
<223>36D42R，C125S人IL-2突变蛋白
<400>14
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Lsu Gln Leu Glu His
 1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Asp Thr Arg Met Leu Thr Arg Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>15
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<223>36D61R，C125S人IL-2突变蛋白
<400>15
 gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
  1               5                   10                  15
 tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
              20                  25                  30
 aat ccc aaa gac acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
 Asn Pro Lys Asp Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
          35                  40                  45
 aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa aga gaa ctc aaa    192
 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys
      50                  55                  60
 cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
  65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>16
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>36D61R，C125S人IL-2突变蛋白
<400>16
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Asp Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
   130
<210>17
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<223>36D65L，C125S人IL-2突变蛋白
<400>17
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa gac acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    14
Asn Pro Lys Asp Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
         35                  40                  45
aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
ttg ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Leu Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    331
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210>18
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>36D65L，C125S人IL-2突变蛋白
<400>18
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Asp Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Leu Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>19
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<223>40D36D，C125S人IL-2突变蛋白
<400>19
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa gac acc agg atg gac aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
Asn Pro Lys Asp Thr Arg Met Asp Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
         35                  40                  45
aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
atc tca sca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>20
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>40D36D，C125S人IL-2突变蛋白
<400>20
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Asp Thr Arg Met Asp Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>21
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(399)
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<400>21
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa ctc acc agg atg gac aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Asp Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
         35                  40                  45
aag gcG aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa aga gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>22
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>40D61R，C125S人IL-2突变蛋白
<400>22
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Asp Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>23
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<223>40D65Y，C125S人IL-2突变蛋白
<400>23
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa ctc acc agg atg gac aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Asp Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
         35                  40                  45
aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
tac ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Tyr Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>24
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>40D65Y，C125S人IL-2突变蛋白
<400>24
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Asp Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys ALa Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Tyr Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
        130
<210>25
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<223>40D72N，C125S人IL-2突变蛋白
<400>25
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa ctc acc agg atg gac aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Asp Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
         35                  40                  45
aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat aac gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Asn Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>26
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>40D72N，C125S人IL-2突变蛋白
<400>26
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Asp Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Asn Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>27
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<223>40D80K，C125S人IL-2突变蛋白
<400>27
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa ctc acc agg atg gac aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Asp Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
         35                  40                  45
aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac aag    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Lys
 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>28
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>40D80K，C125S人IL-2突变蛋白
<400>28
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Asp Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Lys
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
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Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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aat ccc aaa gac acc agg atg ggt aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
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cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
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acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
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atc tca aca ctg act                                                399
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Ieu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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aat ccc aaa ctc acc agg atg ggt aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
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Pro Leu Glu Glu Va1 Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Lys
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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<400>35
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aag ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Lys Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
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atc tca aca ctg act                                                399
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Asn Pro Lys Asp Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
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    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Lys Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
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Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Va1 Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aag ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Lys Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>40
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Glu Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Lys Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
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<211>399
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<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(399)
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Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa aga gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys
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cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aag ccc agg gac tta atc agc aat atc aao gta ata gtt ctg gaa cta    288
Lys Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
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acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
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atc tca aca ctg act                                                399
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys
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Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Lys Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
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<221>CDS
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gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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aat ccc aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
tac ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Tyr Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aag ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Lys Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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Tyr Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
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Lys Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
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Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>45
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<223>81K72N，C125S人IL-2突变蛋白
<400>45
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
         35                  40                  45
aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat aac gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Asn Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                   70                  75                  80
aag ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Lys Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
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atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210>46
<211>133
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<400>46
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
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<220>
<221>CDS
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<400>47
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
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tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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aat ccc aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aag ccc agg gac tta atc agc gat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Lys Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asp Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
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atc tca aca ctg act                                                399
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<211>133
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<220>
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Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
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    130
<210>49
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(399)
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<400>49
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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aat ccc aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
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         35                  40                  45
aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aag ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gat ata gtt ctg gaa cta    288
Lys Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Asp Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>50
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>81K91D，C125S人IL-2突变蛋白
<400>50
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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        35                  40                  45
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    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Lys Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Asp Ile Val Leu Glu Leu
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Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
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aag ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Lys Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa cac gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu His Ala Asp Glu Thr Ala
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acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
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gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
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Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
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            100                 105                 110
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<400>57
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
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 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
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            100                 105                 110
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Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
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<212>DNA
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<220>
<221>CDS
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<400>59
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Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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         35                  40                  45
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa cac gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu His Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
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atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>60
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Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Glu Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu His Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>61
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<223>107H65Y，C125S人IL-2突变蛋白
<400>61
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
         35                  40                  45
aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
tac ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Tyr Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa cac gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu His Ala Asp Glu Thr Ala
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acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
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atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>62
<211>133
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<220>
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Tyr Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
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Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu His Ala Asp Glu Thr Ala
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Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
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Ile Ser Thr Leu Thr
    130
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<211>399
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<220>
<221>CDS
<222>(1)...(399)
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tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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aat ccc aaa gac acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
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cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
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aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa aga gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Arg Ala Asp Glu Thr Ala
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
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Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat aac gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Asn Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa aga gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Arg Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
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<211>133
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Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Asn Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
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    130
<210>67
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<213>人工序列
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<221>CDS
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gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa ctc acc agg atg gac aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
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         35                  40                  45
aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aag ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Lys Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa cac gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu His Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
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 65                  70                  75                  80
aag ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Lys Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa cac gct gat gag aca gca    336
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tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
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         35                  40                  45
aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
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 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac aac ata gtt tac ggt cta    288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Asn Ile Val Tyr Gly Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>72
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>91N94Y95G，C125S人IL-2突变蛋白
<400>72
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Asn Ile Val Tyr Gly Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>73
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<223>36D61R，C125S人IL-2突变蛋白，含有在大肠杆菌中表达优化的36D和61R密码子
<400>73
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa gat acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
Asn Pro Lys Asp Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
         35                  40                  45
aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa cgt gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>74
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<223>107R36D，C125S人IL-2突变蛋白，含有在大肠杆菌中表达优化的
     107R和36D密码子
<400>74
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat    48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
 1               5                   10                  15
tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag    96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa gat acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag    144
Asn Pro Lys Asp Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
         35                  40                  45
aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa    192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta    240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta    288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa cgt gct gat gag aca gca    336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Arg Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag agc atc    384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
atc tca aca ctg act                                                399
Ile Ser Thr Leu Thr
    130

Claims (42)

1.一种分离的核酸分子，其特征在于，该核酸分子含有选自以下的核苷酸序列：
a)编码人IL-2突变蛋白的核苷酸序列，所述突变蛋白含有选自SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72的氨基酸序列；
b)SEQ ID NO：9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69或71所示的核苷酸序列；
c)编码人IL-2突变蛋白的核苷酸序列，所述突变蛋白含有选自SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72所示序列残基2-133的氨基酸序列；
d)含有选自SEQ ID NO：9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69和71所示序列残基4-399的核苷酸序列；
e)a，)、b，)、c)或d)中任一所述的核苷酸序列，其中所述序列包含SEQ ID NO：9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69或71的核苷酸373-375被编码丙氨酸的三联密码子取代；
f)a，)、b，)、c)或d)中任一所述的核苷酸序列，其中所述序列包含SEQ ID NO：9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69或71的核苷酸373-375被编码半胱氨酸的三联密码子取代；和
g)a，)、b，)、c)或d)中任一所述的核苷酸序列，其中一个或多个编码所述突变蛋白的密码子在感兴趣宿主细胞中的表达已被优化。
2.如权利要求1所述的分离的核酸分子，其特征在于，g)所述的核苷酸序列选自SEQ ID NO：73的序列、SEQ ID NO：73的核苷酸4-399、SEQ ID NO：74的序列、和SEQ ID NO：74的核苷酸4-399。
3.一种含有如权利要求1或2所述核酸分子的表达载体。
4.一种含有如权利要求1或2所述核酸分子的宿主细胞。
5.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽含有选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72所示的氨基酸序列；
b)含有SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72的残基2-133的氨基酸序列；
c)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72第125位丝氨酸残基的丙氨酸残基；和
d)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72第125位丝氨酸残基的半胱氨酸残基。
6.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽含有人IL-2突变蛋白，其中所述突变蛋白含有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，在SEQ ID NO：4的125位丝氨酸取代了半胱氨酸，和在SEQ ID NO：4中至少有二处其它的氨基酸取代，其中所述突变蛋白：在相等试验条件下，与类似量的脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，1)能保持或增强自然杀伤(NK)细胞的增殖；2)能导致NK细胞产生促炎症细胞因子的水平降低，其中所述NK细胞的增殖和所述NK细胞产生促炎症细胞因子用NK-92生物试验检测。
7.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白还在SEQ ID NO：4的1位含有丙氨酸缺失。
8.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，所述SEQ ID NO：4中的其它取代选自19D40D、19D81K、36D42R、36D61R、36D65L、40D36D、40D61R、40D65Y、40D72N、40D80K、40G36D、40G65Y、80K36D、80K65Y、81K36D、81K42E、81K61R、81K65Y、81K72N、81K88D、81K91D、81K107H、81L107H、91N95G、107H36D、107H42E、107H65Y、107R36D、107R72N、40D81K107H、40G81K107H和91N94Y95G组合取代。
9.如权利要求8所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白还在SEQ ID NO：4的1位含有丙氨酸缺失。
10.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，所述促炎症细胞因子是TNF-α。
11.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，在相等试验条件下，与类似量的脱丙氨酰-1、C125S人IL-2突变蛋白或C125S人IL-2观察到的相比，所述突变蛋白提供了保持或增强的人NK细胞介导的自然杀伤细胞毒性、淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞毒性、或ADCC介导的细胞毒性，其中所述NK细胞介导的细胞毒性用用NK3.3细胞毒生物试验检测。
12.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，在相等试验条件下，所述突变蛋白诱导的NK细胞增殖比类似量的脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的高150％。
13.如权利要求12所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白诱导的NK细胞增殖比脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的高170％。
14.如权利要求13所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白诱导的NK细胞增殖为脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的约200％至约250％。
15.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，在相等试验条件下，所述突变蛋白诱导的NK细胞增殖高于类似量的脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的至少10％。
16.如权利要求15所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白诱导的NK细胞增殖高于脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的至少15％。
17.如权利要求16所述的分离的多肽，其特征在于，在相等试验条件下，所述突变蛋白诱导产生的促炎症细胞因子低于类似量的脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的100％。
18.如权利要求17所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白诱导的促炎症细胞因子的产生低于脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的70％。：
19.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽含有人IL-2突变蛋白，其中所述突变蛋白含有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，在SEQ ID NO：4的125位丝氨酸取代了半胱氨酸，和在SEQ ID NO：4中至少有二处其它的氨基酸取代，其中在相等试验条件下，所述突变蛋白的IL-2诱导的NK细胞增殖与IL-2诱导的TNF-α产生的比率，比类似量的脱丙氨酰-1、C125S人IL-2突变蛋白或C125S人IL-2突变蛋白观察到的至少高1.5倍，其中用NK-92生物试验检测0.1nM突变蛋白的NK细胞因子增殖和1.0nM突变蛋白的TNF-α产生。
20.如权利要求19所述的分离的多肽，其特征在于，所述比率比脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S观察到的至少高2.5倍。
21.如权利要求19所述的分离的多肽，其特征在于，所述比率比脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S观察到的至少高3.0倍。
22.如权利要求19所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白还在SEQ IDNO：4的1位含有丙氨酸缺失。
23.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽含有人IL-2突变蛋白的氨基酸序列，其中所述突变蛋白含有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，在SEQ ID NO：4的125位丝氨酸取代了半胱氨酸，和至少有二处其它的氨基酸取代，其中所述其它取代残基位于SEQ ID NO：4中选自以下的位置：19、36、40、42、61、65、72、80、81、88、91、95和107位。
24.如权利要求23所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白还在SEQ IDNO：4的1位含有丙氨酸缺失。
25.如权利要求23所述的分离的多肽，其特征在于，所述SEQ ID NO：4中的其它取代选自19D40D、19D81K、36D42R、36D61R、36D65L、40D36D、40D61R、40D65Y、40D72N、40D80K、40G36D、40G65Y、80K36D、80K65Y、81K36D、81K42E、81K61R、81K65Y、81K72N、81K88D、81K91D、81K107H、81L107H、91N95G、107H36D、107H42E、107H65Y、107R36D、107R72N、40D81K107H、40G81K107H和91N94Y95G组合取代。
26.如权利要求25所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白还在SEQ IDNO：4的1位含有丙氨酸缺失。
27.一种制造人白介素-2(IL-2)突变蛋白的方法，，在相等试验条件下，与类似量的选自脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S的参比IL-2突变蛋白相比，该突变蛋白能保持或增强NK细胞增殖也能诱导NK细胞产生较低水平促炎症细胞因子，其中，采用NK-92生物试验检测所述NK细胞的增殖和促炎症细胞因子产生，所述方法包括：
a)用含有权利要求1所述核酸分子的表达载体转化宿主细胞；
b)在允许所述核酸分子表达成多肽的条件下在细胞培养基中培养所述宿主细胞；和
c)分离所述多肽。
28.一种制造人白介素-2(IL-2)突变蛋白的方法，，在相等试验条件下，与类似量的选自脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S的参比IL-2突变蛋白相比，该突变蛋白能保持或增强NK细胞增殖也能诱导NK细胞产生较低水平促炎症细胞因子，其中，采用NK-92生物试验检测所述NK细胞的增殖和促炎症细胞因子产生，所述方法包括：
a)用含有编码权利要求23所述多肽的核酸分子的表达载体转化宿主细胞；
b)在允许所述核酸分子表达成多肽的条件下在细胞培养基中培养所述宿主细胞；和
c)分离所述多肽。
29.一种药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量的权利要求5所述人IL-2突变蛋白和药学上可接受运载体。
30.一种药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量的权利要求6所述人IL-2突变蛋白和药学上可接受运载体。
31.一种药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量的权利要求19所述人IL-2突变蛋白和药学上可接受运载体。
32.一种药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量的权利要求23所述人IL-2突变蛋白和药学上可接受运载体。
33.一种刺激哺乳动物免疫***的方法，其特征在于，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的人IL-2突变蛋白，其中，在相等试验条件下，与类似量的选自脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S，的参比IL-2突变蛋白相比，所述突变蛋白能诱导NK细胞产生较低水平的促炎症细胞因子，和保持或增强NK细胞的增殖，其中用NK-92生物试验检测NK细胞增殖和所述促炎症细胞因子的产生。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
35.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述人IL-2突变蛋白含有选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72所示的氨基酸序列；
b)含有SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72的残基2-133的氨基酸序列；
c)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72第125位丝氨酸残基的丙氨酸残基；和
d)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72第125位丝氨酸残基的半胱氨酸残基。
36.一种治疗哺乳动物癌症的方法，其特征在于，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的人IL-2突变蛋白，其中在相等试验条件下，与类似量的选自脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S的参比IL-2突变蛋白相比，所述突变蛋白能诱导NK细胞产生较低水平的促炎症细胞因子，和保持或增强NK细胞的增殖，其中用NK-92生物试验检测NK细胞增殖和所述促炎症细胞因子的产生。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
38.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述人IL-2突变蛋白含有选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72所示的氨基酸序列；
b)含有SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72的残基2-133的氨基酸序列；
c)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72第125位丝氨酸残基的丙氨酸残基；和
d)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72第125位丝氨酸残基的半胱氨酸残基。
39.一种减轻经历IL-2给药治疗方案对象白介素-2(IL-2)诱导的毒性症状的方法，其特征在于，该方法包括给予IL-2突变蛋白作为所述IL-2，其中所述IL-2突变蛋白含有选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72所示的氨基酸序列；
b)含有SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72的残基2-133的氨基酸序列；
c)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72第125位丝氨酸残基的丙氨酸残基；和
d)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72第125位丝氨酸残基的半胱氨酸残基。
40.人IL-2突变蛋白在刺激哺乳动物免疫***方法中的应用，其特征在于，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的所述人IL-2突变蛋白，其中在相等试验条件下，与类似量的选自脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S的参比IL-2突变蛋白相比，所述突变蛋白能诱导NK细胞产生较低水平的促炎症细胞因子，和保持或增强NK细胞的增殖，其中用NK-92生物试验检测NK细胞增殖和所述促炎症细胞因子的产生。
41.人IL-2突变蛋白在治疗哺乳动物癌症方法中的应用，其特征在于，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的所述人IL-2突变蛋白，其中在相等试验条件下，与类似量的选自脱丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S的参比IL-2突变蛋白相比，所述突变蛋白能诱导NK细胞产生较低水平的促炎症细胞因子，和保持或增强NK细胞的增殖，其中用NK-92生物试验检测NK细胞增殖和所述促炎症细胞因子的产生。
42.人IL-2突变蛋白在降低经历IL-2给药治疗方案对象白介素-2(IL-2)诱导的毒性症状方法中的应用，其特征在于，该方法包括给予所述IL-2突变蛋白作为所述IL-2，其中所述突变蛋白含有选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72所示的氨基酸序列；
b)含有SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72的残基2-133的氨基酸序列；
c)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72第125位丝氨酸残基的丙氨酸残基；和
d)有a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72第125位丝氨酸残基的半胱氨酸残基。
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