CN1919225A - 培养的水母雪莲细胞及其提取物在制备治疗ⅱ型糖尿病及预防其并发症的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了培养的水母雪莲细胞及其提取物在制备治疗II型糖尿病及预防其并发症的药物中的用途。本发明的优点：(1)与治疗II型糖尿病的化学药物相比，长期使用本发明毒副作用小，不仅是单纯降低血糖浓度，而且能降低胆固醇、甘油三脂和低密度脂蛋白(LDL)，预防高血脂，能保护心肌细胞，能改善肝功能，防止脂肪肝的形成；(2)与胰岛素治疗相比，本发明能提高胰岛素受体敏感性，使血液中胰岛素水平降至正常水平，并且服药方便；(3)由于本发明是采用现代生物技术，通过植物细胞培养的方法来获取药物，保护了珍稀的雪莲植物，也解决了稀有药物植物来源有限的问题，并且能很好地保证产品的均一性。

Description

培养的水母雪莲细胞及其提取物在制备治疗II型糖尿病及预防其并发症的药物中的用途

技术领域

本发明涉及培养的水母雪莲细胞及其提取物在制备治疗II型糖尿病及预防其并发症的药物中的用途，属于生物工程和中药现代化领域。

背景技术

糖尿病是一组病因和发病机理尚未完全阐明的内分泌代谢疾病，以高血糖为其共同标志。因胰岛素绝对或相对分泌不足所造成的糖、蛋白质、脂肪和继发的水、电解质代谢紊乱。它可以涉及全身各个***，甚至诱发许多致命性并发症，如感染合并症、视网膜病变、高血压、肾脏病变、冠心病、下肢血管病变和脑血管病变等，严重影响人的劳动能力，并威胁人的生命安全。糖尿病有几种类型：1)胰岛素依赖型糖尿病(I型糖尿病IDDM)；2)非胰岛素依赖型糖尿病(II型糖尿病NIDDM)；3)营养不良型糖尿病；4)其它类型糖尿病。其中II型糖尿病患者占糖尿病总患病人数的95％。

随着世界人口的老龄化，糖尿病已成为一种常见病、多发病，是成为继肿瘤和心脑血管疾病之后的第三大严重危害人类健康的疾病。据世界卫生组织(WHO)2005年统计，全世界约有2亿糖尿病患者，中国是糖尿病患者最多的三个国家(印度、中国、美国)之一，目前糖尿病患者数量已经超过4,000万人(《中国糖尿病防治指南》)。此外，尚有数千万的糖调节功能受损者(IGR)，此类人群成为糖尿病的庞大“后备军团”。防治糖尿病已成为临床上重要的、紧迫的医疗保健问题之一，日益为人们所重视。

临床治疗糖尿病的药物可分为口服降糖药、胰岛素、免疫抑制剂及其他药物，其中口服降糖药和胰岛素是最主要的类别。目前尚无治愈糖尿病的有效方法，控制患者血糖水平、预防并发症是治疗糖尿病的关键。临床常用的口服降糖药主要有磺脲类、双胍类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素增敏剂和膳食调节剂五类。其中，磺脲类、双胍类药属于老一代产品，α-葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素增敏剂属于中生代产品，膳食调节剂为新生代产品。五类西药的市场趋势是：磺脲类和双胍类药物依然是中国现阶段临床处方的一线用药，拜糖平的成功运作使得整个α-糖苷酶抑制剂市场份额迅速扩大，增敏剂和餐时血糖调节剂的销售金额和数量都呈明显的上升趋势，增长幅度也很接近。

直至20世纪90年代，口服降糖药只有磺酰脲(SU)类和双胍(BG)类2类。最近几年，α-葡萄糖苷酶抑制剂(α-GI)类，噻唑烷二酮(TZD)类和速效促胰岛素分泌药等新型降血糖药物相继开发上市。加之具有胰岛素抵抗改善作用的第三代SU类药物上市，及对BG类药物的重心评估，2型糖尿病治疗药物的选择范围变得越来越宽。

(1)磺酰脲(SU)类药物SU类药物的主要作用为促进胰岛素分泌。它的发展经历了三代：第一代主要是甲苯磺丁脲(tolbutamide)和氯磺丙脲(ehloromide)；第二代有格列本脲(glibenclamide，优降糖)、格列齐特(gliclazide，达美康)、格列吡嗪(glipizide，美吡达)和格列喹酮(gliquidone，糖适平)等；第三代有格列美脲(glimepiride)等。目前我国临床上所用的主要是第二代，第一代仍有少量使用，第三代尚未见临床应用报道。

第三代产品格列美脲虽然促进胰岛β-细胞胰岛素分泌作用比较弱，但是能增强胰岛素的敏感性。随着胰岛β-细胞中SU受体的实际情况被人们所掌握，研发具有双重作用的SU类药物应该是一个值得注意的方向。

(2)双胍(BG)类药物BG类药物的主要作用是增加周围组织对葡萄糖的利用和抑制肠道对葡萄糖的吸收，抑制肝糖异生和肝糖输出。此类药物包括：苯乙双胍(phenformin，降糖灵)和二甲双胍(flumamine，降糖片)等。

苯乙双胍有严重乳酸酸中毒的毒副作用，在许多国家已被禁止使用，国内临床也在减少用量。而二甲双胍可完全避免乳酸酸中毒，同时还能降低血脂，延缓糖尿病血管并发症的发生，使心机梗死的发生率降低39％；与磺脲类相比，二甲双胍降糖作用相对缓和，低血糖发生少。因此二甲双胍已成为临床应用最广泛的双胍类药物，主要用于联合用药，治疗肥胖型糖尿病患者。

(3)α-葡萄糖苷酶抑制剂(α-GI)类药物  α-GI类药物的主要作用是通过抑制α-葡萄糖苷酶，减慢水解及产生葡萄糖的速度并延缓葡萄糖的吸收，从而降低餐后血糖。由于这种抑制作用是可逆的，所以向葡萄糖的转化仅仅是推迟，而不是完全阻断。它还有一定的降血脂作用，能防治糖尿病的慢性并发症。代表药物有：阿卡波糖(acarbose)和伏格列波糖(voglibose)。目前此类药物被推荐为治疗2型糖尿病的二线药物，国内市场大多被进口品占据。主要毒副作用为肠道反应，并且价格较贵。

(4)非磺酰脲类胰岛素分泌促进剂此类药物和SU类药物结构虽然不用，但作用机制却有相同之处，均为促进胰岛β-细胞分泌胰岛素，不同之处在于它们与β-细胞结合的部位不同。已上市的药物有：瑞格列奈(repaglinide)和那格列奈(nateglinide)。处于III期临床研究阶段的药物有Kissei公司的mitiglinide。

那格列奈餐后0.78h胰岛素水平达峰值(瑞格列奈为0.92h)，给药1.5h后胰岛素水平与安慰剂相似(瑞格列奈为4h)。由于减少了总的胰岛素接触，减弱餐时葡萄糖的波动，所以诱发低血糖的危险更小。

(5)胰岛素抵抗改善药物  此类药物又叫胰岛素增敏剂，它能增加周围组织(肌肉和脂肪组织)对葡萄糖的利用率及降低肝脏对葡萄糖的输出率。最早发现有胰岛素增敏作用的化合物都具有2，4-噻唑烷二酮(2，4-thiazolidinedione)骨架，因此这类药物也叫做TZD类药物。代表药物有：罗格列酮(rosiglitagone)和吡格列酮(pioglitagone)。

临床研究表明，罗格列酮每日4mg或8mg口服，可使2型糖尿病患者空腹、餐后的血糖及HbAlc均下降，维持降糖效果可达30个月以上。在糖尿病发病早期应用罗格列酮有利于保护β-细胞功能。罗格列酮和他汀类药物联用可以治疗糖尿病血脂异常症，可以使HDL胆固醇上升，甘油三酯保持不变，FFA显著下降，LDL显著下降。罗格列酮还可以减少偏位二甲基精氨酸(asymdimethylarginene，ADMA)，降低心血管疾病危险性。在对一组64例非糖尿病的志愿者研究中，测定稳态血糖(steady state plasma glucose，SSPG)浓度及血清ADMA，发现ADMA的升高可减少葡萄糖的利用量，使SSPG上升；接着对其中7例伴IR、血清ADMA升高的高血压患者给罗格列酮4mg/d，共4周，然后改为8mg/d，共8周，经过12周的治疗后再次检查，发现这些患者在SSPG降低的同时，血清ADMA均有下降。说明即使对具IR的非糖尿病患者，罗格列酮在提高对胰岛素敏感性的同时具有对血管内皮的保护作用。

格列美脲、阿卡波糖、罗格列酮、吡格列酮和瑞格列奈进入市场较晚，但它们由于具有良好的临床疗效和巨大的市场潜力而被称为“五朵金花”，其对应产品的代表品牌分别是亚莫利、拜糖平、文迪雅、艾汀、诺和龙。第一代磺脲类药物格列苯脲(优降糖)已处于被淘汰的边缘；格列吡嗪(美吡达、迪沙、依必达、瑞易宁)，格列齐特和格列喹酮(糖适平)是第二代磺脲类药物，尽管目前购药金额较大，但均呈现缓慢向下的趋势。格列美脲是第三代磺脲类药物，上市时间较晚，由德国Hoechst Marion Roussel公司研制开发，1995年首次由全球第三大制药公司安万特生产上市，商品名为Amaryl，它是目前西方发达国家首选的治疗II型糖尿病的口服化学药，也是全球销售最好的磺硫脲类产品，2005年的年销售额为6.77亿欧元(相当于8亿美元)。磺脲类药物主要通过刺激胰岛细胞分泌胰岛素，提高体内胰岛素的水平。

由于糖尿病治疗是一个长期的过程，各种西药长期使用都有一定的局限性和不良反应，甚至是很严重的不良反应，如导致低血糖、乳酸性酸中毒等。到目前为止，还没有一个药物能治愈糖尿病，西药也只是控制血糖而已；使用胰岛素，不仅价格昂贵，而且需要每天注射给药，病人不易坚持，并且给药时间和剂量需要严格掌握，否则易导致夜间低血糖及黎明现象。故应用植物中的天然降糖物质治疗糖尿病，具有易于接受和坚持及毒副作用小的优点。

针对糖尿病患者多表现为消渴症，如口渴多饮、五心烦热、乏力多汗等，多运用清热泻火、益气生津之法，改善临床症状。代表药物如消渴丸(实际为中西药合剂)、参芪消渴颗粒等。但是中药制剂缺乏疗效肯定的、临床医生和患者都乐于接受的降糖药物，并且在动物实验和临床试验中极少建立药学界认可的降糖模型和选择国际公认的疗效确切的阳性对照药物，即中药的科学性往往被忽视或被人怀疑。西药一般是以降糖为主，而开发有良好降糖效果同时又可防治糖尿病并发症的新药是中医药工作者的当务之急。据统计，糖尿病患者由心脑血管疾病引起的死亡率约占80％，并使其预期寿命减少1/3。糖尿病患者合并血脂升高者在80％以上，血粘度升高者达90％。糖尿病并发症重在预防，即寻找既能降血糖，又能防治糖尿病并发症的长期使用毒副作用小的药物是目前最理想的选择。

水母雪莲(Saussurea medusa Maxim)系菊科凤毛菊属植物，是一种非常名贵的植物药材，产于我国甘肃、青海、西藏、新疆等地的海拔4800～5100米的高山砾石间。具有散寒除湿、壮阳补血、抗炎镇痛等作用，民间用于治疗风湿性关节炎、阳萎、妇女***、胎衣不下、高山不适应症等。最近临床及药理研究证明，雪莲有延缓衰老及治疗脑动脉硬化、缺血性中风等症。雪莲提取物acacetin、jaceosidin、hisidulin和quercetin等黄酮类化合物对治疗癌症、抗病毒、抗衰老(清除自由基)具有明显的作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供培养的水母雪莲细胞及其提取物在制备治疗II型糖尿病及预防其并发症的药物中的用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

培养的水母雪莲细胞在制备治疗II型糖尿病及预防其并发症的药物中的用途。

其中培养的水母雪莲细胞是利用生物工程技术，通过人工诱变使雪莲的愈伤组织发生基因突变，获得的稳定高产雪莲黄酮的雪莲细胞系。

所述人工诱变包括60Co-γ射线照射诱变、温度诱变和紫外诱变。对原始雪莲细胞系采用60Co-γ射线照射诱变，以获得黄酮产量更高的雪莲细胞系；对60Co-γ射线照射诱变获得的雪莲细胞系采用温度诱变即用高温和低温培养，使其基因发生突变，以适应较宽温度范围生长的需要，并且提高细胞生物合成次级代谢产物黄酮的能力；对雪莲细胞采用紫外光线照射，使其基因发生突变，以提高细胞生物合成次级代谢产物黄酮的能力。

本发明药效学试验使用了中国发明专利ZL02156868.5和ZL200310124256.5所述的水母雪莲细胞系，取得了意想不到的优异效果。根据本发明的试验结果可推知，通过诱变获得的雪莲细胞系均可能具有本发明所首次揭示的药效。因此，即使他人使用其他的雪莲细胞系用于制备治疗II型糖尿病的药物或者用于制备预防II型糖尿病并发症的药物，均属于本发明的保护范围。

本发明优选保护的雪莲细胞系为雪莲细胞系TUIP-8，其保藏号为CGMCC No.0855和水母雪莲细胞系SMXL-615，其保藏号为CGMCC No.1072。这两株雪莲细胞的培养不受自然条件限制，生长温度范围较宽，在18～30℃范围内生长良好，生长快，产品质量可控性好；该细胞株黄酮产量大，培养密度高，培养周期短；细胞遗传特性稳定，在连续传代培养过程中，细胞合成黄酮的能力不退化；细胞聚集生长，细胞团质地较硬，可以抵抗较高的剪切力，能在较高转速的反应器中生长良好，适合大规模反应器培养植物细胞实现产业化。

培养的水母雪莲细胞提取物在制备治疗II型糖尿病及预防其并发症的药物中的用途。该提取物为沸水提取物，可以但不限于通过如下方法制备得到：取一定质量的新鲜的水母雪莲细胞培养物，压榨并收集得到的汁液，将剩余水母雪莲细胞培养物加入8-12倍量的沸水中，搅拌1-3分钟，立即过滤，将得到的汁液与压榨得到的汁液合并即得。

运用中药学领域的常规方法，雪莲细胞提取物还可通过其他公知的技术得到，例如将雪莲细胞培养物加入一定量的水中煎煮、榨汁或加入有机溶剂萃取。但无论通过何种方式得到的具有本发明首次揭示的药效的雪莲细胞提取物的用途，均属于本发明的保护范围。

本发明以国际公认的II型糖尿病动物模型KK-Ay糖尿病小鼠(中国医学科学院实验动物中心)为实验对象，以水母雪莲细胞培养物(中国发明ZL02156868.5，中国发明200310124256.5)的沸水浸取物(Aqueous Extract of Saussurea Medusa，AESM)为治疗药物，以全球销量最好的II型糖尿病治疗药物格列美脲(glimepiride)为阳性对照，研究并揭示了AESM在降糖、调节血脂、保护心肌细胞和肝脏、改善肝功能、防止脂肪肝形成等方面，具有明显的疗效。

本发明的优点：(1)与治疗II型糖尿病的化学药物相比，AESM长期使用毒副作用小，不仅是单纯降低血糖浓度，而且能降低胆固醇、甘油三脂和低密度脂蛋白(LDL)，预防高血脂，能保护心肌细胞，能改善肝功能，防止脂肪肝的形成；(2)与胰岛素治疗相比，AESM能提高胰岛素受体敏感性，使血液中胰岛素水平降至正常水平，并且服药方便；(3)由于本发明是采用现代生物技术，通过植物细胞培养的方法来获取药物，保护了珍稀的雪莲植物，也解决了稀有药物植物来源有限的问题，并且能很好地保证产品的均一性。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所作出的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1-A为口服水母雪莲细胞培养物的沸水浸取物(AESM)可降低KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的血糖并改善其糖耐量结果1：连续口服给药28d，格列美脲组和AESM组小鼠血糖控制在正常水平，每组各10只小鼠，与模型组(生理盐水组)相比，有显著性差异(P＜0.001，以***表示)。

图1-B为口服水母雪莲细胞培养物的沸水浸取物(AESM)可降低KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的血糖并改善其糖耐量结果2：糖耐量实验表明，在注射葡萄糖后((2g/kg)，格列美脲组和AESM组可迅速将血糖浓度降至正常水平。每组各10只小鼠，与模型组(生理盐水组)相比，有显著性差异(***P＜0.001，**P＜0.01)；

图1-C为口服水母雪莲细胞培养物的沸水浸取物(AESM)可降低KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的血糖并改善其糖耐量结果3：在连续给药28d后，处死小鼠取血测定血清中胰岛素水平，格列美脲组和AESM组均维持在正常水平。每组各10只小鼠，与模型组(生理盐水组)相比，有显著性差异。(**P＜0.01)。

图2为口服水母雪莲细胞培养物的沸水浸取物(AESM)可有效调节KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的血脂结果图。

图3为口服水母雪莲细胞培养物的沸水浸取物(AESM)可有效保护KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的心肌细胞图。

图4-A为口服水母雪莲细胞培养物的沸水浸取物(AESM)可有效改善KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的肝功能并防止脂肪肝形成结果1：治疗终点各组KK/Ay小鼠肝脏形态。

图4-B为口服水母雪莲细胞培养物的沸水浸取物(AESM)可有效改善KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的肝功能并防止脂肪肝形成结果2：治疗终点各组KK/Ay小鼠肝脏组织切片。

图4-C为口服水母雪莲细胞培养物的沸水浸取物(AESM)可有效改善KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的肝功能并防止脂肪肝形成结果3：治疗终点各组KK/Ay小鼠血清天门冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)活性。

图4-D为口服水母雪莲细胞培养物的沸水浸取物(AESM)可有效改善KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的肝功能并防止脂肪肝形成结果4：治疗终点各组KK/Ay小鼠肝脏中糖原的浓度。

具体实施方式

实施例1水母雪莲细胞培养物的沸水浸取物(AESM)的制备

取50g摇瓶培养的新鲜的水母雪莲细胞TUIP-8的培养物(中国发明专利ZL02156868.5，本室保存)在研钵中研磨挤压，将研磨出的汁液单独收集。取500mL去离子水煮沸，将研碎的水母雪莲细胞培养物倒入沸水中，搅拌2分钟，立即倒在4层300目不锈钢丝网上，挤压收集汁液，并与研磨出的汁液混合，即制备出水母雪莲细胞培养物的沸水浸取物(AESM)。

将AESM分装至10mL玻璃试管中，冻存于-20℃。用前解冻并一次性使用完毕。

实施例2AESM用于治疗II型糖尿病模型动物KK/Ay小鼠

从中国医学科学院实验动物中心购得II型糖尿病模型动物KK/Ay小鼠，在25℃条件下连续光照12小时单独饲养，随意喂饲高脂肪高热量食物。经测定小鼠血糖筛选出血糖浓度高的KK/Ay小鼠，并随机分成3组，每组10只，雌雄各半。(1)模型组(阴性对照组)，每天口服(灌喂)生理盐水，剂量为2.5ml/100g体重/只小鼠。(2)水母雪莲(AESM)治疗组，每天1次口服(灌喂)1ml水母雪莲细胞培养物的沸水浸取物。(3)格列美脲治疗组(阳性对照组)，每天1次灌喂，每次剂量为0.5mg/kg/只。每周取尾静脉血一次，用GLUCOCARDTM Test(Arkray Inc.Japan)试剂盒测定血糖浓度。连续治疗28天后，处死小鼠，取血样和组织评价AESM的疗效。

实施例3  AESM可控制II型糖尿病模型KK/Ay小鼠的血糖和胰岛素水平连续给药28天，每周监测KK/Ay小鼠的血糖浓度，实验显示，口服AESM可很好控制KK/Ay小鼠的血糖水平(图1-A和表1)，模型组小鼠血糖一直维持在20-28mmol/L的高血糖状态，经格列美脲治疗，该组小鼠的血糖浓度一直维持在12mmol/L左右的较低水平，而水母雪莲组的小鼠血糖一直保持在8-10mmol/L的水平，这种血糖浓度非常接近于正常水平(7-8mmol/L)，与模型组有显著性差别(P＜0.001)，其控制血糖的水平也要优于格列美脲组。

                            表1雪莲细胞培养物水提物对KK/Ay小鼠血糖的影响

组别	血糖浓度(mmol/L)
							时间(天)	0	7	14	21	28
	生理盐水组格列美脲组雪莲组		20.56±8.8421.00±8.1019.63±8.57	19.36±4.5813.50±4.1611.29±4.59	23.96±4.6012.97±3.4210.75±4.24	26.85±3.5112.90±2.1512.02±3.47							21.61±3.3013.03±2.879.84±2.72

糖耐量实验(Glucose Tolerance Test)结果表明：AESM能迅速降低血糖水平(图1-B和表2)。糖耐量实验的方法：实验前实验动物禁食16小时，之后静脉注射葡萄糖(2g/kg)，分别从尾静脉在0，30，60，和120分钟取血测定血糖浓度。图1-B显示，静脉注射葡萄糖30分钟后，血糖浓度达到最高，之后便下降，模型组在120分钟时仍大于16mmol/L，而格列美脲和AESM组在120分钟时，血糖浓度均下降至7-8mmol/L的正常水平。

                   表2雪莲细胞培养物水提物对KK/Ay小鼠口服葡萄糖耐量的影响

组别	血糖浓度(mmol/L)
						时间(分钟)	0	30	60	120
	生理盐水组格列美脲组雪莲组		11.45±3.478.71±2.026.57±1.50	23.48±3.9214.89±5.6714.67±6.52	16.31±4.1310.13±4.258.96±2.82						13.71±3.297.57±2.636.49±1.42

28天治疗后处死小鼠取血测定血清中胰岛素的水平，采用放射免疫试剂盒(radioimmuno-assay kit)测定，测定步骤按厂家说明书进行(Linco Research，St.Charles，MI)。结果表明，格列美脲组和AESM组的胰岛素水平显著低于模型组(图1-C和表3)，血清中胰岛素水平高是II型糖尿病典型特征，即II型糖尿病为非胰岛素依赖性，血糖浓度高并非胰岛素分泌不足造成，而是由于相关细胞对胰岛素的敏感性下降引起的，这一结果也提示格列美脲和AESM具有胰岛素增敏作用。

         表3雪莲细胞培养物水提物对KK/Ay小鼠血液中胰岛素浓度和自由脂肪酸的影响

	生理盐水组	格列美脲组	雪莲组	Pvalue
					胰岛素浓度(μU/ml)自由脂肪酸(μmol/l)	21.60±4.67739.72±361.19	7.65±3.20430.11±224.54	8.69±2.10444.58±174.23	0.00030.03

实施例4  AESM具有调节II型糖尿病模型KK/Ay小鼠的血脂作用

28天治疗后处死小鼠取血测定血清中甘油三脂(TG)(TG E-test，Wako)，胆固醇(CHO)，高密度脂蛋白(HDL)，低密度脂蛋白(LDL)和未脂化的自由脂肪酸(NEFA)(NEFA C-test，Wako)的浓度，测定方法均按试剂盒生产厂家提供的方法进行。格列美脲组和AESM组均可显著降低TG、CHO、LDL和NEFA浓度(表3)，提高HDL的浓度，与模型组(生理盐水组)相比，有显著性差异(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)，见图2和表4所示。

高密度脂蛋白(HDL)浓度高，可有效防止动脉硬化的形成，而TG、CHO、LDL和NEFA浓度高，都会促进动脉硬化，导致心脑血管疾病。据统计，II型糖尿病患者一般都是饮食不当，摄入过多脂肪和热量食品引起的，患病初期大多肥胖，而后期会并发心脑血管疾病、高血脂。实际上II型糖尿病并发的心脑血管疾病引起的死亡率约占80％，并使其预期寿命减少1/3；糖尿病患者合并血脂升高者在80％以上，血粘度升高者达90％。因此，即能控制血糖水平、又能显著改善血脂代谢使水母雪莲细胞培养物成为一种非常有潜力的治疗II型糖尿病和降血脂的中药。

                 表4雪莲细胞培养物水提物对KK/Ay小鼠血脂的调节作用

	生理盐水组	格列美脲组	雪莲组	Pvalue
					CHO(mmol/L)TG(mmol/L)LDL(mmol/L)HDL(mmol/L)	5.32±1.642.06±0.708.66±2.800.30±0.07	4.21±1.471.03±0.403.28±1.470.48±0.13	3.49±0.921.04±0.393.38±1.350.38±0.09	0.020.0030.00030.07

实施例5  AESM具有保护II型糖尿病模型KK/Ay小鼠心肌细胞的作用

28天治疗后处死小鼠取血测定血清中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的浓度，测定方法均按试剂盒生产厂家提供的方法进行(LDH，CK体外诊断试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司)。格列美脲组和AESM组均可显著降低血清中LDH和CK的浓度(**P＜0.01，***P＜0.001)，见图3和表5所示。LDH和CK是表征心肌细胞功能的重要指标。II型糖尿病患者一般都会并发心脑血管疾病，供血不足可造成心肌细胞坏死，而心肌细胞坏死会释放出大量的LDH和CK，尤其是CK，是确诊急性心肌梗死最主要的生化指标。AESM可显著降低CK浓度，反映出AESM对心肌细胞具有良好的保护作用。

                表5雪莲细胞培养物水提物对KK/Ay小鼠心肌功能的影响

	生理盐水组	格列美脲组	雪莲组	Pvalue
					乳酸脱氢酶(U/L)肌酸激酶(U/L)	1224.38±239.30780.00±467.16	39.13±12.03183.00±18.21	36.75±10.73171.38±21.48	0.010.002

实施例6  AESM可有效改善KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的肝功能并防止脂肪肝形成

28天治疗后处死小鼠取血测定血清中天门冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)活性，测定方法均按试剂盒生产厂家提供的方法进行(AST，ALT体外诊断试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司)。取肝脏，一部分匀浆，测定肝脏中糖原和甘油三脂的含量。另一部分肝组织用10％中性***固定，用石蜡包埋，切片，用苏木精和伊红(hematoxylinand eosin，H&E)染色，在显微镜下观察其形态。

在28天治疗期间，格列美脲组和AESM组血清中两种反映肝功能的转氨酶——天门冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)——的活性均在正常水平(表6)，而模型小鼠的两种转氨酶的水平都偏高，超出正常值范围(图4-C)，表明AESM有改善肝功能的作用。

                  表6雪莲细胞培养物水提物对KK/Ay小鼠肝功能的影响

	生理盐水组	格列美脲组	雪莲组	Pvalue
					GPT(U/L)GOT(U/L)	76.88±20.90287.00±70.87	15.67±4.46864.00±124.89	12.34±3.67871.88±245.78	0.00030.0006

解剖小鼠显示，模型组小鼠的肝脏明显肿大，并且色泽发白，肉眼可见纤维化和脂肪化。肝组织染色可见，模型组小鼠肝脏有非常明显的脂滴，表明KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的肝脏有形成脂肪肝的倾向。格列美脲治疗组的肝脏体积和重量小于模型组，但大于AESM组，AESM组的肝脏色泽暗红，为正常肝组织，肝组织染色也表明，AESM治疗组的肝组织正常，没有脂滴，也没有脂肪化的现象，其效果明显优于格列美脲治疗组(图4-A、图4-B)。测定肝脏组织中糖原含量，AESM组含量最高，表明肝脏将多余糖份转化为糖原的能力明显增强(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)，见图4-D和表7。因此，AESM具有非常显著的改善KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的肝功能并防止脂肪肝形成的疗效。

表7雪莲细胞培养物水提物对KK/Ay小鼠肝脏组织中糖原和甘油三脂含量的影响

	生理盐水组	格列美脲组	雪莲组	Pvalue
					肝组织糖原含量(mg/g肝组织)肝组织甘油三脂含量(mg/g liver)	4.33±1.607.41±1.09	6.91±1.544.24±1.22	9.99±1.023.78±0.99	0.00040.0002

Claims (10)

1.培养的水母雪莲细胞在制备治疗II型糖尿病及预防其并发症的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述培养的水母雪莲细胞是利用生物工程技术，通过人工诱变使雪莲的愈伤组织发生基因突变，获得的稳定高产雪莲黄酮的雪莲细胞系。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述人工诱变包括60Co-γ射线照射诱变、温度诱变和紫外诱变。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述水母雪莲细胞系为雪莲细胞系TUIP-8，其保减号为CGMCC No.0855和水母雪莲细胞系SMXL-615，其保藏号为CGMCC No.1072。

5.培养的水母雪莲细胞提取物在制备治疗II型糖尿病及预防其并发症的药物中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述培养的水母雪莲细胞是利用生物工程技术，通过人工诱变使雪莲的愈伤组织发生基因突变，获得的稳定高产雪莲黄酮的雪莲细胞系。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述人工诱变包括60Co-γ射线照射诱变、温度诱变和紫外诱变。

8.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述水母雪莲细胞系为雪莲细胞系TUIP-8，其保减号为CGMCC No.0855和水母雪莲细胞系SMXL-615，其保藏号为CGMCC No.1072。

9.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述培养的水母雪莲细胞提取物通过如下方法制得：取一定质量的新鲜的水母雪莲细胞培养物，压榨并收集得到的汁液，将剩余水母雪莲细胞培养物加入8-12倍量的沸水中，搅拌1-3分钟，立即过滤，将得到的汁液与压榨得到的汁液合并即得。

10.根据权利要求1-9中任何一项所述的用途，其特征在于：所述治疗II型糖尿病及预防其并发症是指降血糖、调节血脂、保护心肌细胞和肝脏、改善肝功能和防止脂肪肝形成。

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