CN102293796B

CN102293796B - 追风伞有效部位及其提取方法和应用

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Publication number: CN102293796B
Application number: CN 201110253810
Authority: CN
Inventors: 康文艺; 李园园; 魏金凤; 尹震花
Original assignee: Henan University
Current assignee: Central service project of Jinhu County
Priority date: 2011-08-31
Filing date: 2011-08-31
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2031-08-31
Also published as: CN102293796A

Abstract

本发明涉及一种追风伞有效部位，其选自追风伞醇提物的石油醚部位、乙酸乙酯部位或正丁醇部位中的一种或任意组合；具体的提取方法为：取干燥的追风伞粉末用甲醇或乙醇水溶液进行浸提，浸液浓缩得浸膏；将浸膏分散于蒸馏水中，然后依次用溶剂石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，各萃取三次；挥干溶剂后即分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。该追风伞有效部位对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制活性；对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠有较好的治疗效果，可以被用来制备降血糖药物。

Description

追风伞有效部位及其提取方法和应用

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种植物追风伞的提取物及其提取方法和其在制备降糖药物方面的应用。

背景技术

追风伞（Lysimachia paridiformis Franch. var. stenophylla Franch.）别名惊风伞、一把伞、公接骨丹、破凉伞、背花草、灯台草、伞叶排草，是报春花科珍珠菜属植物狭叶落地梅的全草或根，分布于贵州、湖北、湖南、广东、广西、四川、云南等地。其味辛、辣、苦、性热。入冷经。主要功效为祛风通络，活血止痛；主治风湿痹通，四肢拘挛，半身不遂，小儿惊风，跌仆，骨折等症。

糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征。其以高血糖为特征、以代谢紊乱为表现，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等，即“三多一少”症状，血糖一旦控制不好会引发并发症，导致肾、眼、足等部位的衰竭病变，且无法治愈，严重威胁着人类的健康。根据世界卫生组织的报道，1995年全球已确诊的糖尿病患者约1.35亿，而近期IDF 2006年报道全球糖尿病患者已达2.46亿，预测到2025年糖尿病患者将达到3.88亿。我国在2003年时已经成为糖尿病第二大国，糖尿病患者约6000万。因此，预防和治疗糖尿病已成为我国乃至全世界关注的保健问题。多年来糖尿病的治疗主要以控制空腹血糖为目标，治疗药物长期以来主要集中于磺脲类与双胍类药物。近年来研究发现，糖尿病病发过程中往往先出现餐后高血糖，而后逐渐发展成糖尿病，即前者是后者的先期征兆。对于糖尿病患者，特别是Ⅱ型病人，餐后高血糖对机体的危害远远超过空腹高血糖，餐后高血糖不仅极易诱发各种并发症，还会极大地提高糖尿病的死亡率。所以，降低餐后血糖是预防糖尿病、减少并发症和降低死亡率的重要措施之一。也就是说，控制餐后血糖是控制高血糖、防治糖尿病的重要举措。现有治疗糖尿病的药物中，磺脲类药物是通过刺激胰岛素的分泌而降低血糖；双胍类药物则是通过增加外周组织对葡萄糖的利用而降低血糖，两者对降低Ⅱ型糖尿病病人空腹血糖均有较好疗效，但对降低餐后血糖的作用却非常有限。

α-葡萄糖苷酶抑制剂是七十年代后期研发出的一类新型口服降血糖药物，其作用机理在于：通过竞争性抑制α-葡萄糖苷酶的活性，阻滞双糖水解成单糖，延缓糖的吸收，使血糖平稳并缓慢地维持在一定水平。α-葡萄糖苷酶抑制剂能够有效控制餐后血糖的升高，预防糖尿病的发生，减少糖尿病并发症，降低死亡率。α-葡萄糖苷酶抑制剂不仅对糖尿病有确切的疗效，对肥胖症、慢性乙肝、艾滋病及肿瘤等也都有一定的治疗作用。

目前，用于临床的此类药物有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇，而天然产物中的α-葡萄糖苷酶抑制剂是近年来研究的热点。研究发现，α-葡萄糖苷酶抑制剂的主要结构类型为黄酮类、生物碱类和皂苷类，此外还有茶多酚类。黄酮类化合物主要是通过多羟基结构发挥抑制作用，并且羟基组的糖化作用会减弱化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。生物碱类也是多羟基生物碱具有抑制作用。一些中草药的提取物也具有很好的抑制α-葡萄糖苷酶作用，如绿茶提取物和大黄、山茱萸、赤芍、五倍子水煮醇沉提取物，以及广西血竭全粉和分步提取物、五味子和虎杖的水提取物等。然而现有的此类上述药物成本较高，生产厂家很少，同时伴随有肠道副作用。

植物追风伞含有丰富的化学成分，但是国内外有关该植物药理学研究和临床应用方面的报道却很少，仅见齐柳娅等人提出追风伞总黄酮具有显著的镇痛抗炎作用。国内外尚未见关于追风伞有效部位对α-葡萄糖苷酶有抑制作用、可用于制备降糖药物的报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种追风伞有效部位，该提取物具有降血糖作用，可以用来制备降血糖药物。本发明还提供了该提取物的提取方法。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种追风伞有效部位，其选自追风伞醇提物的石油醚部位、乙酸乙酯部位或正丁醇部位中的一种或任意组合。

所述追风伞有效部位的提取方法，包括如下步骤：取干燥的追风伞粉末用甲醇或乙醇水溶液进行浸提，浸液浓缩得浸膏；将浸膏分散于蒸馏水中，然后依次用溶剂石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，各萃取三次；挥干溶剂后即分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

较好的，所述干燥的追风伞粉末用60－80V%的甲醇或乙醇水溶液在室温下浸泡浸泡2－4次，每次3天，合并每次所得浸液并浓缩成浸膏。

上述追风伞有效部位在制备降血糖药物和α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物方面的应用。

本发明提取物来自植物追风伞，且提取方法简便。以阿卡波糖（Acarbose）为阳性对照药进行体外试验，观察追风伞的石油醚部位（LPFPE）、乙酸乙酯部位（LPFEA）和正丁醇部位(LPFBU)对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。试验结果表明，上述的追风伞有效部位对α-葡萄糖苷酶均有明显的抑制作用，追风伞在质量浓度为1500 μg/mL时各有效部位对α-葡萄糖苷酶的抑制活性均较高 (抑制率均在95%以上)，远高于阳性对照Acarbose (抑制率为57.26% )，而各有效部位的半数抑制浓度IC₅₀值均小于50μg/mL，远小于阳性对照药Acarbose（IC₅₀值为1103.01μg/mL）。

进一步的，以阿卡波糖为阳性对照药进行体内试验，观察追风伞的石油醚部位（LPFPE）、乙酸乙酯部位（LPFEA）和正丁醇部位(LPFBU)对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的治疗作用。由体内糖尿病小鼠实验表明，乙酸乙酯部位高、中剂量组(1000，500 mg/kg)能显著降低空腹血糖，正丁醇部位高、中剂量组(800，400mg/kg)具有一定的降低餐后血糖作用，乙酸乙酯部位中、低剂量组(500，250 mg/kg)和正丁醇部位高、中剂量组(800，400 mg/kg)能显著升高肝糖原和显著降低血清中TG、TC的含量，乙酸乙酯部位高、中剂量组(1000,500 mg/kg)和正丁醇部位低剂量组(200 mg/kg)能显著降低MDA含量，升高血清中SOD的含量，但无显著性差别。

附图说明

图1为实施例1所得追风伞有效部位不同质量浓度对α-葡萄糖苷酶活性的影响；

图2为实施例2所得追风伞有效部位不同质量浓度对α-葡萄糖苷酶活性的影响。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

一种追风伞有效部位，其选自追风伞醇提物的石油醚部位、乙酸乙酯部位或正丁醇部位中的一种或任意组合；具体的提取方法为：追风伞全草阴干、粉碎，取1000 g干燥的追风伞粉末，用体积分数70%的甲醇水溶液（甲醇水溶液的添加量为追风伞粉末重量的3－5倍），室温下浸泡3次，每次3天，合并3次所得浸液并浓缩成浸膏；将浸膏分散于1000ml蒸馏水中，然后依次用溶剂石油醚（3000ml）、乙酸乙酯（3000ml）和正丁醇（3000ml）进行萃取，各萃取三次；挥干溶剂后即分别得到固态的石油醚部位（LPFPE）、乙酸乙酯部位(LPFEA)和正丁醇部位(LPFBU)，提取率分别为1.8%、6.2%和2.4%。

具体的萃取过程为：先用石油醚萃取三次，萃取液分层，取上层石油醚部分（挥干后即为石油醚部位），下层为水层；水层再用乙酸乙酯萃取三次，萃取液分层，取上层乙酸乙酯部分（挥干后即为乙酸乙酯部位），下层为水层；水层最后用正丁醇萃取三次，萃取液分层，取上层正丁醇部分（挥干后即为正丁醇部位）。这样操作的目的在于将浸膏中的有效成分按极性从小到大的顺序依次萃取出来，因溶剂石油醚、乙酸乙酯和正丁醇的极性是递增的。

实施例2

用体积分数70%的乙醇水溶液替换体积分数70%的甲醇水溶液，其它同实施例1，得到石油醚部位（LPFPE）、乙酸乙酯部位(LPFEA)和正丁醇部位(LPFBU)，提取率分别为1.5%、5.8%和2.2%。

效果试验

以下分别给出了实施例1选用70%甲醇水溶液和实施例2选用70%乙醇水溶液醇提最后得到的石油醚部位（LPFPE）、乙酸乙酯部位(LPFEA)和正丁醇部位(LPFBU)进行降血糖试验的结果。

试验一、追风伞有效部位的体外抑酶活性试验

1.1 试验方法：微孔板法

1.1.1 原理： α-D-葡萄糖苷酶催化水解4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），产生硝基苯酚（PNP，黄色物质，在400 nm左右有最大吸收），α-葡萄糖苷酶抑制剂可抑制α-葡萄糖苷酶与底物结合从而降低PNP的释放量。以一定时间内反应体系中PNP的含量变化来计算不同追风伞有效部位对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

仪器：Multiskan MK3酶标仪（Thermo Electron）；LRH-150恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)；DELTA 320型PH计（Mettler-Toledo）；电子天平（Mettler-Toledo）；旋转蒸发仪（Heidolph）。

试剂： α-葡萄糖苷酶（Sigma公司，EC 3.2.1.20，from baker’s yeast，批号：105K1313），4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG，Sigma公司，批号：026K1516），磷酸盐缓冲液（PH 6.8），阿卡波糖（拜糖平，Sigma 公司，批号：16869），其他试剂均为分析纯。

检测方法及数据处理

在112 μL、pH为6.8的磷酸钾缓冲液中，加入20 μL浓度0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶，8 μL样品溶液（样品溶液用DMSO溶解而得），37℃恒温15 min，加入20 μL浓度2.5 mmol/L的底物PNPG，37℃恒温反应15 min；再加入80 μL浓度0.2 mol/L的终止剂Na₂CO₃水溶液，于405 nm波长下测OD值。

实验共设4个组，每组三孔，阴性对照组（缓冲液+酶液+底物）、空白对照组（缓冲液）、样品组（样品+缓冲液+酶液+底物）、样品对照组（样品+缓冲液），按下述方法计算抑制率，并用Origin软件求出相应IC₅₀值。

抑制率

分别利用上述方法测定了实施例1和实施例2所得各追风伞有效部位（石油醚部位LPFPE、乙酸乙酯部位LPFEA和正丁醇部位LPFBU）以及阳性对照组阿卡波糖样品的IC₅₀。

实验结果

表1和表2分别是实施例1和实施例2提取得到的追风伞不同部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性，图1为实施例1提取的追风伞不同部位的α-葡萄糖苷酶抑制率随药物浓度的变化图；图2为实施例2提取的追风伞不同部位的α-葡萄糖苷酶抑制率随药物浓度的变化图。

从表1和表2可以看出，追风伞有效部位的IC₅₀值均远小于阳性对照药阿卡波糖，这表明从追风伞中提取出的这几组活性部位均具有很好的α-葡萄糖苷酶抑制作用。其中，正丁醇部位的IC₅₀值极小，显示其抑制效果最好，其次为石油醚部位，而乙酸乙酯部位的IC₅₀值最大。

图1和图2显示，本发明追风伞有效部位在浓度为1500 μg/mL时对α-葡萄糖苷酶的抑制活性均较高 (抑制率均在95%以上)，均远高于阳性对照组阿卡波糖Acarbose (抑制率57.26% )，表明追风伞有效部位具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。追风伞的石油醚部位LPFPE、乙酸乙酯部位LPFEA和正丁醇部位LPFBU对α-葡萄糖苷酶的抑制活性均先呈现剂量依赖性，但当抑制率达到一定程度时，再增加其质量浓度，对α-葡萄糖苷酶的抑制活性不再增加。

具体的，图1显示，在实验的浓度范围内，追风伞石油醚部位LPFPE和正丁醇部位LPFBU分别在浓度为62.5 μg/mL和46.88 μg/mL时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别达到93.10%和89.42%，再增加浓度其抑制率几乎不再增加，乙酸乙酯部位LPFEA在质量浓度为93.75 μg/mL对α-葡萄糖苷酶抑制率达97.58%，增加浓度其抑制率有下降趋势。

总而言之，上述体外抑酶活性试验证实，本发明给出的几组追风伞有效部位对α-葡萄糖苷酶均具有很强的抑制作用，其中以追风伞的正丁醇部位效果最为明显，是很好的α-葡萄糖苷酶抑制剂，可以用于制备降血糖药物。

试验二：追风伞有效部位的糖尿病体内降血糖试验

2.1试验材料：

主要试剂与仪器：四氧嘧啶（ALX，Alfa Aesar公司，批号：10122281）；阿卡波糖（拜糖平，Sigma 公司，批号：091010）；总胆固醇TC、甘油三酯TG (上海北海生物技术有限公司)；超氧化物歧化酶 SOD、丙二醛 MDA (南京建成生物工程研究所)；UV 2000型紫外可见分光光度计 (尤尼可上海仪器有限公司)；Multiskan MK3酶标仪 (Thermo Electron)；LRH-150恒温培养箱 (上海一恒科技有限公司)。

实验方法

120只4～6周龄、体重20±2 g雄性健康昆明小鼠，随机分为12组，每组10只。小鼠均先禁食12 h，然后除正常对照组外，其余组均尾静脉注射80 mg/kg 四氧嘧啶(ALX)。72 h后再禁食12h，接着从小鼠眼眶取血，测血糖水平。选用血糖水平在11.1 mmol /L以上的小鼠，随机分成糖尿病模型组，追风伞石油醚部位（LPFPE）高、中、低剂量组( 500，250，125mg/kg)；乙酸乙酯部位(LPFEA)高、中、低剂量组( 1000，500，250mg/kg)；正丁醇部位(LPFBU)高、中、低剂量组(800，400，200mg/kg)；阿卡波糖阳性对照组(75 mg/kg)和正常对照组。除糖尿病模型组外，正常对照组用0.5%的羟甲基纤维素钠水溶液（CMC-Na）灌胃，其它试验组用0.5%CMC-Na分别配制成相应浓度灌胃给药，1次/天，连续给药7天。于末次给药后2 h眼眶取血测定餐后血糖水平，并于当晚禁食12h，麻醉小鼠，摘眼球取血，分离血清，测定空腹血糖、丙二醛MDA、超氧化物歧化酶SOD、甘油三酯TG、总胆固醇TC。处死动物，取肝脏称重，并测定肝糖原含量。此外，每日观察动物进食、饮水、尿量等数据，并观察皮毛、活动等情况。

实施例1选用70%甲醇水溶液醇提最后得到的石油醚部位（LPFPE）、乙酸乙酯部位(LPFEA)和正丁醇部位(LPFBU)的试验结果，见表3至6。

由表3可以看出，糖尿病模型组小鼠餐后血糖明显升高，与正常对照组比较有显著差异(p<0.001)。经过7天灌胃治疗后，各追风伞有效部位给药组与模型组比较，无显著性差异。

由表4可以看出，给药前各试验组小鼠血糖与正常对照组相比差异较显著 (p<0.001)。灌胃治疗7天后，与糖尿病模型组比较，LPFEA高、中剂量(1000，500 mg/kg)组和阿卡波糖阳性对照组的小鼠空腹血糖显著降低(p<0.001，p<0.05)；与正常对照组比较，有显著性差异(p<0.05，p<0.001)。

由表5可以看出，灌胃7天后，除LPFBU低剂量(200 mg/kg)组，其它追风伞有效部位剂量组的肝糖原含量均比糖尿病模型组高，且均具有显著性差异(p<0.05，p<0.01，p<0.001)；与正常对照组相比，LPFPE中剂量组(250mg/kg)和LPFEA低剂量组(250mg/kg)，无显著性差异。各给药组的TG水平低于糖尿病模型组，且均具有显著性差异(p<0.05，p<0.01，p<0.001)；而与正常对照组相比，均无显著性差异。与模型组比较，LPFEA高、中、低剂量组(1000，500，250mg/kg)和LPFBU高、中剂量(800，400 mg/kg)的TC水平明显降低，具有显著性差异(p<0.05，p<0.001)；而与正常对照组相比，无显著性差异。

由表6可见，LPFPE中、低剂量组(250，125mg/kg)，LPFEA高、中剂量组(1000，500mg/kg)，LPFBU低剂量组(200 mg/kg)和阿卡波糖阳性对照组小血清中的MDA含量低于糖尿病模型组，且具有显著性差异(p<0.05，p<0.01，p<0.001)。LPFPE高剂量组(500mg/kg)、LPFEA低剂量组(250 mg/kg)、LPFBU中、低剂量组(400，200mg/kg)和阿卡波糖阳性对照组小鼠血清中的SOD水平高于糖尿病模型组，但不具有显著性差异。各给药组小鼠血清中SOD水平与模型组相比无显著性差异，而与正常组比较均有显著性差异(p<0.01，p<0.001)。

实施例2选用70%乙醇水溶液醇提最后得到的石油醚部位（LPFPE）、乙酸乙酯部位(LPFEA)和正丁醇部位(LPFBU)的试验结果，见表7至表10。

Claims

1.追风伞有效部位在制备降血糖药物方面的应用，所述追风伞有效部位选自追风伞醇提物的石油醚部位、乙酸乙酯部位或正丁醇部位中的一种或任意组合；所述追风伞有效部位经下述步骤提取获取：取干燥的追风伞粉末用甲醇水溶液进行浸提，浸液浓缩得浸膏；将浸膏分散于蒸馏水中，然后依次用溶剂石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，各萃取三次；挥干溶剂后即分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

2.追风伞有效部位在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物方面的应用，所述追风伞有效部位选自追风伞醇提物的石油醚部位、乙酸乙酯部位或正丁醇部位中的一种或任意组合；所述追风伞有效部位经下述步骤提取获取：取干燥的追风伞粉末用甲醇水溶液进行浸提，浸液浓缩得浸膏；将浸膏分散于蒸馏水中，然后依次用溶剂石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，各萃取三次；挥干溶剂后即分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。