CN1621523A - 棉花腺苷酸核糖基化作用因子1基因及其启动子 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种棉花基因组中的ARF1基因及其启动子序列。该基因及其启动子可在棉花的花蕾、花、纤维及其棉铃铃壳中优势表达。该基因及其启动子可用于棉花生殖器官的发育、品质改良以及外源基因在棉花生殖器官中的特异表达研究。

Description

棉花腺苷酸核糖基化作用因子1基因及其启动子

技术领域

本发明涉及一种棉花基因组中的ADP-ribosylation factor 1(arf1)基因及其启动子序列。该基因及其启动子可在棉花的花蕾、花、纤维及其棉铃铃壳中优势表达。该基因及其启动子可用于棉花生殖器官的发育、品质改良以及外源基因在棉花生殖器官中的特异表达研究。

背景技术

棉纤维是已知纤维素纯度最高的天然资源之一。它成本低廉，产出量大，且具有吸湿、通气、保暖性好，不带静电，手感柔软等人造纤维难以比拟的优点。由于世界纺织工业加工速度的加快和人民生活水平的提高，对棉纤维品质的要求愈来愈高。因此，弄清纤维细胞的表达模式以及可能的生物学功能，***阐明棉纤维细胞发育调控的分子机理，对充分利用棉花自身基因资源、提高棉花产量、改良纤维品质乃至发展人工棉纤维都具有重要意义(贾士荣，郭三堆，2002，转基因棉花，p265-270)。

虽然棉纤维形成和发育的过程已经基本清楚，但对纤维发育的分子机理还知之甚少。分离鉴定与棉纤维细胞分化、伸长和次生壁沉淀等过程相关的基因，了解它们在纤维发育不同阶段的功能及其与纤维品质的关系，可以为利用基因工程方法定向改良纤维品质提供依据。

涉及到棉纤维的分化、发育过程中的基因有几千种(贾士荣，郭三堆，2002，转基因棉花，p265-270)。虽然目前已经克隆到几十个棉纤维发育相关基因，且多数是在纤维伸长阶段的纤维细胞中特异表达(JhonM E，1992，Proc Natl Acad Sci USA，89：5769-5773；Jhon M E，1995，Plant Physiol 107：1478-1486；Jhon M E，1996，Plant Molecular Biology 30：297-306；1999，New York：Food Products Press，271-292)。但绝大部分基因在棉纤维发育中的确切功能还不清楚或有待确定，因此，还不能有效地应用于纤维品质的遗传改良，棉纤维的转基因改良已有一些成功实例，但由于目标基因缺乏，利用分子生物学方法改良棉纤维的潜力还远没有发挥(贾士荣，郭三堆，2002，转基因棉花，p265-270)。

小G蛋白是一类重要的信号转导蛋白，在真核生物基因的表达调控中起到重要作用(Terryn N.，MontaguM.V.，1993，The plant Cell，.5：1761-1769.)。至于在棉纤维发育过程中的作用，Delmer等人从棉花cDNA文库中筛选出2个与哺乳动物rac基因高度同源的克隆Rac13和Rac9，其中Rac13在棉纤维发育过程中优势表达，且于纤维伸长向次生壁增厚的转换期表达量达到最大。Rac13编码的蛋白可参与调控细胞骨架形成的信号转导(Delmer D P，Pear J R，1995，Mol Gen Genet，48：43-51)。

ADP-ribosylation factor 1(arf1)是属于Ras小G蛋白超级家族中的ARF亚族，在真核生物中普遍存在并高度保守。人类和植物的arf1基因均可互补于酵母arf1突变株。ARF1是高尔基体/内质网运输小泡的重要组成部分和调控因子，在物质运输***中起到重要的调控作用(Lee M H，Min M K，2002，Plant Physiology，129(4)：1507-1520)。ARF1在胞内细胞膜运输中起重要作用，尤其是芽生小泡的关键调控因子。在酵母中对arf1基因进行突变研究，结果出现了对低温敏感、生长缓慢、对氟敏感、多种分泌突变等表型(Yahara N，Ueda T，2001，Molecular Biology of the Cell，12，221-238)。在拟南芥细胞中的研究表明：arf1在内织网和高尔基之间的小泡运输起重要作用，并且对维持高尔基体的正常形态结构至关重要(Takeuchi M，Ueda T，2002，The Plant Journal 31(4)：499-515)。另外，Arf1在质膜和细胞质之间生长素的极性运输中起到重要作用。目前尚未见到arf1基因参与棉纤维发育、形成的报道。

有人通过RNA斑点杂交证明：在棉花中，ARF1主要在花器官的各种组织中高效表达，而在根、茎、叶等生殖器官中不表达。(候磊等，2002，遗传学报，29(4)：359-363)。这说明在棉花中ARF1的顺式调控元件具有生殖器官组织特异性。

但到目前为止，国内外尚未见到对arf1基因及其启动子在棉纤维及棉花生殖器官中的研究报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种与棉纤维发育有关的基因：arf1基因。它全长为3609bp(如序列表SEQ ID：2所示)，具有7个外显子和6个内含子(如图3所示)。其含有一个1125bp的ORF结构(如序列表SEQ ID：3所示)。Northern blot结果证明，它在棉纤维及棉花生殖器官中呈优势表达，在国内外尚未见到有类似报道。

本发明的另一个目的是提供一种新的棉纤维发育有关的启动子(如序列表SEQ ID：1所示)，该启动子DNA序列上具有Initiator、TATA box、CCAA box和GC box等明显启动子特征序列(如图3所示)。Northernblot结果证明，该启动子驱动的arf1基因在棉纤维及棉花生殖器官中优势表达(如图4所示)。在国内外尚未见到有类似报道。

本发明的再一个目的是提供一种新的棉纤维及棉花生殖器官优势表达的蛋白质(如序列表SEQ ID：4所示)。Arf1蛋白，它具有181个氨基酸(如序列表SEQ ID：4所示)。

本发明再一个目的是提供一种我们自己独创的同尾酶反向PCR(isocaudarner inverse PCR，II-PCR)技术，在棉花基因组上连续步移，获得了棉花arf1上游1865bp的DNA序列(如图2所示)。再用我们自己独创的快速分离目的基因cDNA-5”未知序列和启动子(rapid isolation of cDNA 5’unknown sequence and promoter，RICUP)的技术，获得了arf1的全长cDNA序列和启动子(如图3所示)。

下面结合附图对本发明做进一步说明

附图表说明

图1为从棉花基因组中用PCR扩增的arf1基因的4924bp DNA序列的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为用反向PCR和同尾酶反向PCR进行染色体步移扩增到棉花arf1基因上游1865bp DNA序列的琼脂糖凝胶电泳图及II-PCR流程示意图。

图3为棉花arf1基因全长cDNA的步移和启动子定位过程琼脂糖凝胶电泳图及RICUP流程示意图。

图4为用Northern blot确定启动子在棉花生殖器官中高效表达。1、2、3、4、5、6、7分别代表棉花根、茎、叶、蕾、花、铃壳和纤维中提取的总RNA电泳泳道

具体实施方式

实施例1

棉花arf1基因上游1865bp DNA序列的分离克隆

1 DNA和RNA模板的制备：用改良的CTAB法提取陆地棉品种Y18基因组DNA，要求DNA片段大于50Kb，OD260/OD280大于1.8。采用改良的热硼酸法提取陆地棉品种Y18 7-10dpa纤维总RNA，用于cDNA序列扩增和未知cDNA序列步移。

2用RT-PCR获取棉花ARF1基因EST序列的3’端全长和相应的DNA序列：RT-PCR按照TaKaRa RNA

                                PCR引物表

染色体步移	正向引物	DFP1：AGGGTCCTATGGTTTTTGTTCCTTDFP2：GTTTGCCTTTCATTTCTTTCTCTATT
			反向引物	DIP1：CTATACTATAACAACGACTACATDIP2：GACACTTTTTCTGCTTCCACTAAC
	arf1 cDNA步移	正向引物			ACF1：GTTTGCCTTTCATTTCTTTCTCTATTACF2：TCTGAAATCACTCACCCCCGCCTCCACF3：AGTGTTTGCCCCAACATATGTTAACF4：AAGTCACTAAAGCTGGTGACAGAACF5：CGTACTTACTTTGACCATAA
反向引物			ACR1：ATACTAGTGGACTTGAGATTAAGGOligo(dT18)：TTTTTTTTTTTTTTTTTT
		启动子片段缺失用PCR引物		正向引物	APF1：GGAAGCTTGCAGAGTGTTTTAGTGGGTTTTATAPF2：GGAAGCTTAGTTGGGCCCTGCTTCGTGAAPF3：GGGAAGCTTGATTTGCAGTTTTAGTTTTTGTG
反向引物	APR1：CCCCCGGGTTTTTATCTTCGCTGACACCAAPR2：CCCTCTAGACGTTGCGATGCCCTTTGATTAG
			Northern blot探针用PCR引物	正向引物	NPF1：ACTCACCCCCGCCTCCAG
反向引物	NPR1：AAAGCCAGTCCAGTCCCTCATACA
		Southern blot探针用PCR引物		正向引物	SPF1：TTCCTTGCTTTGATTTGTGTATGG
反向引物	SPR1：GTGGCATTAGGAAATGTAAC

PCR Kit(AMV)Ver.2.1说明书操做。根据棉花ARF1基因EST序列(GenBank Accession Number BF272643)设计引物ACF1与Oligo(dT18)组成引物对(见PCR引物表)，从棉花7-10dpa纤维总RNA扩出859bp和1295bp两条特异条带，经测序分析发现，859bp条带的5’端730bp序列与EST序列完全相同，故此条带看作是ARF1基因cDNA3’端全长序列(图2A)；并可以将polyA前的核甘酸序列看作arf1基因的转录终止位点。以polyA前23个核甘酸的反义链(ACR1)为下游引物(见PCR引物表)，仍以ACF1为上游引物，从棉花基因组中扩增出4124bp特异条带(图1A)。序列分析表明：该序列为ARF1基因842bp cDNA序列所对应的基因组DNA序列。

3用反向PCR和同尾酶反向PCR获取arf1基因上游1865bp的DNA序列：第一次反向PCR步移选用BsrGI、Csp6I、MfeI、SalI、EcoRI等酶消化棉花基因组DNA，环化后以DIP1和DFP1(见PCR引物表)为引物进行反向PCR步移，结果仅从Csp6I和MfeI处理的DNA环化产物中分别扩增716bp和385bp的带(图2A)，选取前者克隆测序，减去474bp的重叠部分，使序列向5’端步移242bp。第二次反向PCR采用BglII、XbaI、HpaI充分消化基因组DNA，酶解产物环化后进行反向PCR，结果均未有特异带扩增。于是采用II-PCR，首先选用Bgl II充分消化基因组DNA，再利用Bgl II六碱基同尾酶BamH I和Bcl I分别消化Bgl II处理过的基因组DNA，产物环化后进行反向PCR，分别扩增出497bp和1879bp的条带(图2B)。选取较大者克隆测序，减去交叠的256bp序列，再次将序列向前推进1623bp。加上第一次反向PCR步移的242bp，共向前推进了1865bp的DNA序列(图2C)。

实施例2

棉花ARF1基因启动子的分离

1 arf1基因上游1865bp的DNA序列中外显子的捕获和cDNA步移引物的设计在NCBI/GenBank的nr、EST和蛋白数据库中对该序列进行Blast搜索，结果未发现有与该序列同源的序列。于是利用DNAStar软件将DNA全序列译成三种可能氨基酸序列，对比分析后，将所有大于40个氨基酸的序列作为外显子可能的位置。在各可能外显子处设计用于ARF1基因5’端cDNA步移引物：ACF2、ACF3、ACF4、ACF5和ACR2(见PCR引物表)。

2棉花ARF1全长cDNA序列的获取和替换剪接现象的发现在用ACF1与Oligo(dT18)组成引物对进行arf1 3’RACE时，从棉花7-10dpa纤维总RNA中扩增到859bp和1295bp两条特异条带。经进一步分析发现，859bp条带与部分1295bp条带完全重叠，后者在5’端比前者多436bp的***序列。与4124bp基因组DNA对比后发现，436bp恰为第一个内含子。当其被剪掉时形成859bp的cDNA，若保留则形成1295bp的cDNA(图2A)。arf1cDNA5’端第一次步移是将ACF2、ACF3和ACF4分别与ACR1组成引物对，从棉花7-10dpa纤维总RNA进行RT-PCR扩增，仅从ACF2和ACR1引物对扩出873bp、949bp和1385bp三条cDNA条带(图2B)。测序表明，第一个内含子又向5’端延伸76bp，形成512bp的内含子。若其被完全剪掉，则形成873bp的cDNA；若仅保留其5’端76bp，则形成949bp的cDNA；若完全保留，则形成1385bp的cDNA。由于ACF3和ACF4两条引物组合均未有扩增，估计它们可能被设计在内含子中或转录起始位点之前。对ACF2上游序列分析发现，1629bp处有一个典型的启动子特征结构：Initiator(图4所示)。故进行第二次步移，以确定其是否为Initiator，即cDNA5’末端。于此处设计一条上游引物ACF5，以ACR1为下游引物，从棉纤维总RNA中扩增出1008bp、1084bp和1520bp三条cDNA条带(图2C)。测序发现，这三条cDNA条带均是在前次步移所获片断的基础上分别向5’端推进135bp。从而证明1629bp处确为Initiator，同时说明已获该基因cDNA5’端全长序列。将全长cDNA序列和DNA进行同源比较发现，ARF1含有6个内含子和7个外显子(图5)，其中第一个内含子位于5’端非翻译区。由于第一个内含子存在替换剪接现象，从而形成三种不同的cDNA。进一步分析发现，三种cDNA都有一个546bp含有Kozak序列的完整ORF结构(图4)，编码182个氨基酸，。利用GenBank的blastp软件进行蛋白序列查询，发现其与多种生物ARF1蛋白具有98％以上同源性。

3 ARF1基因转录起始位点的确定和启动子位置的定位通过对Initiator上游序列的分析发现：在-61bp处具有典型的TATA box结构，在-98bp和-102bp处具有两个典型CCAAT box，在-374bp处具有典型的GCbox。对Initiator下游序列的分析发现：起始密码子ATG位于+752bp处，在起始密码子ATG和Initiator之间具有大量富含AT序列和回文结构。根据以上信息可将arf1的转录起始位点定位在Initiator结构中的保守的A处。并可将ARF1基因的启动子定位在-1628bp-+751bp之间的位置。由于在启动子的下游区域存在替换剪接现象，这表明该启动子具有复杂的表达调控机制。至于决定启动子表达强度和表达特异性的元件，还需要进一步做区段缺失的功能鉴定。

实施例3

棉花ARF1基因启动子表达特性分析

Northern blot：分别从棉花根、茎、叶、蕾、花、纤维和铃壳中提取总RNA，各取总RNA 15μg，用1.5％的甲酰胺-甲醛琼脂糖凝胶对RNA进行电泳分级分离，然后按照试剂盒说明书进行转膜、Northern杂交，杂交探针为地高辛标记的arf1 cDNA特异片段。结果表明arf1在棉花的根、茎、叶中表达量很弱，而在蕾、花、纤维和铃壳中呈显著优势表达，其中蕾和花中表达量最高(图4)。

实施例4

棉花ARF1基因启动子功能结构域的分析确定

将棉花ARF1基因的启动子序列构建了350bp、896bp、1913bp和2370bp四种启动子缺失片段，各自的引物对分别是APF1/APR1、APF2/APR1、APF3/APR1和APF3/APR2(见PCR引物表)。其中2370bp片段是位于起始密码子上游的启动子全长序列，350bp、896bp、1913bp三种启动子缺失片段是位于第一个内含子之前的序列。将这四种启动子片段与pBI121植物表达载体上的gus基因融合，然后用花粉管通道技术将其导入到棉花品种Y18中。用gus染色法对阳性植株的根、茎、叶、蕾、花、纤维和玲壳进行染色，结果表明2370bp的启动子区段在棉花的蕾、花、纤维和玲壳中的表达效果最好。

               棉花arf1基因及其启动子.ST25

    SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>棉花arf1基因及其启动子

<130>棉花arf1基因及其启动子

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2380

<212>DNA

<213>陆地棉Y18

<400>1

tgatcacggt tccttttctt ccttctcagc aaaagcctat ggctaacatc aaaatgacca      60

ttgatgaatg cagggcaaca gcgaaccagg ttttttattt tgtagggctg caaaatacta     120

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ttcatctgat aaattgtcga atttgatgtt caatatatag acaagaagct gtggggataa     300

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ctttccttgt aatggccagt gctgttgctt gggcactatg gttcataatc cagggacaaa     540

caagcaagag cttcccagct ccttacacaa gcactactct aatgtgcttc atggcgagca     600

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tcgatatcga tatcgatatc gatatcgata tctatatata ttatattatc agtttcgtaa     780

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                棉花arf1基因及其启动子.ST25

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ttctctgtct aaatagaagt ccttccttgc tttgatttgt gtatgggcct ttctctaatt    2040

gattccagat ctagatctgg atcttggttt tctttgttct gctttgatct gctcatttca    2100

ttctatatga tatgatattg ttgctgatgt agatctgttt gtttagattt gtattgcttt    2160

gcaagatttt ctcaaatgaa attgttttta atgttgttca actctttatt ttggcaatgt    2220

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<210>2

<211>3609

<212>DNA

<213>陆地棉Y18

<400>2

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                棉花arf1基因及其启动子.ST25

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gatttaaaca tgtggagttt ggtagcatgt aatgttctga aagcttttat ggacactttc    2700

agattcgacc tttgtggagg cactacttcc aaaacactca gggtctaatc tttgttgttg    2760

atagcaatga ccgtgaccgt gtggttgagg ccagggatga gcttcatcgt atgctaaatg    2820

aggtactaat ttgctttagg catgttgccg agtggtcttt gggacttgga agtacattgt    2880

ttgaaactgt gatatacttg tcatatgtgt agaaattacg aggctgtgta aattagttga    2940

                棉花arf1基因及其启动子.ST25

ttattatcat acacatgtaa taaccttttc caatcattat gttacttgtg atatgtgtag    3000

gacgagctga gggatgctgt gcttcttgtg tttgcaaaca agcaagatct gccgaatgct    3060

atgaatgctg ctgagattac tgataagctt ggccttcact cccttcgtca gcgccactgg    3120

tattatgtta ttaactgttt ccctgtttgc ttactactta ttagggtatt tgtttgtttg    3180

catttgcaaa atgtaatcgc ttgtattcat attcttgtgc gtctctcaca ggtatatcca    3240

gagtacttgt gccacctctg gcgaagggct gtatgaggga ctggactggc tttccaacaa    3300

cattgctaac aaggtaggat gagactcaca actcacgtgc atccattttg tggatattgt    3360

tcagttgtaa cttattgcgt tgcttgtttt gtttccatag ggttgagggt tggttgaatt    3420

ccagtcatat cttcaggcag ctatccttat tattttctgg ttcctttttt aagttttaca    3480

ggaaatgtat cagattgtgt tatataatta atatatattc accgtactac tgaaattagg    3540

catttgcctg ctttgtagat tgatttctca aataattttt ttctatatga tcacctgaac    3600

tctaattcc                                                            3609

<210>3

<211>1085

<212>DNA

<213>陆地棉Y18

<400>3

catccgtact tactttgacc ataattgatt aatttaaaga ataaaaaaat ctgtgaaaaa      60

gacgaaggtg attgggattt ccaaaacggc agcgtttgga tctaatcaaa gggcatcgca     120

acgttttaag aaaacctaat ctgaaatcac tcacccccgc ctccagctcc tccaattgcg     180

taataaatag ccccaaagcc caaccccttc ccccatcgaa tttgatattt gtaagtgtta     240

aacattgttt gcctttcatt tctttctcta ttccttgttg cttcttcggc agcctctcgg     300

tttctgagta atataaaaaa ggatggggct gtcttttgct aagctgttta gtcgactgtt     360

tgccaagaaa gagatgcgaa ttcttatggt gggtcttgat gctgctggta agactaccat     420

tttgtacaag ctcaagctcg gtgagattgt cactaccatt cccaccattg gctttaatgt     480

ggagaccgta gaatataaga acattagctt cactgtttgg gatgttggtg gtcaggacag     540

gattcgacct ttgtggaggc actatttcca aaacactcag gggctaatct ttgttgttga     600

tagcaatgac cgtgaccgtg tggttgaggc cagggatgag cttcatcgta tgctaaataa     660

ggacgagctg agggatgctg tgcttcttgt gtttgcaaac aagcaagatc tgccgaatgc     720

tatgaatgct gctgagatta ctgataagct tggccttcac tcccttcgtc agcgccactg     780

gtatatccag agtacttgtg ccacctctgg cgaagggctg tatgagggac tggactggct     840

ttccaacaac attgctaaca agggttgagg gttggttgaa ttccagtcat atcttcaggc     900

agctatcctt attattttct ggttcctttt ttaagtttta caggaaatgt atcagattgt     960

gttatataat taatatatat tcaccgtact actgaaatta ggcatttgcc tgctttgtag    1020

attgatttct caaataattt ttttctatat gatcacctga actctaattc caaaaaaaaa    1080

aaaaa                                                                1085

              棉花arf1基因及其启动子.ST25

<210>4

<211>181

<212>PRT

<213>陆地棉Y18

<400>4

Met Gly Leu Ser Phe Ala Lys Leu Phe Ser Arg Leu Phe Ala Lys Lys

1               5                   10                  15

Glu Met Arg Ile Leu Met Val Gly Leu Asp Ala Ala Gly Lys Thr Thr

            20                  25                  30

Ile Leu Tyr Lys Leu Lys Leu Gly Glu Ile Val Thr Thr Ile Pro Thr

        35                  40                  45

Ile Gly Phe Asn Val Glu Thr Val Glu Tyr Lys Asn Ile Ser Phe Thr

    50                  55                  60

Val Trp Asp Val Gly Gly Gln Asp Arg Ile Arg Pro Leu Trp Arg His

65                  70                  75                  80

Tyr Phe Gln Asn Thr Gln Gly Leu Ile Phe Val Val Asp Ser Asn Asp

                85                  90                  95

Arg Asp Arg Val Val Glu Ala Arg Asp Glu Leu His Arg Met Leu Asn

            100                 105                 110

Lys Asp Glu Leu Arg Asp Ala Val Leu Leu Val Phe Ala Asn Lys Gln

        115                 120                 125

Asp Leu Pro Asn Ala Met Asn Ala Ala Glu Ile Thr Asp Lys Leu Gly

    130                 135                 140

Leu His Ser Leu Arg Gln Arg His Trp Tyr Ile Gln Ser Thr Cys Ala

145                 150                 155                 160

Thr Ser Gly Glu Gly Leu Tyr Glu Gly Leu Asp Trp Leu Ser Asn Asn

                165                 170                 175

Ile Ala Asn Lys Gly

            180

Claims (8)

1一种启动子序列，它具有如序列表SEQ ID：1所示的核苷酸序列及其功能等同序列。

2按照权利要求1所述的启动子，其特征在于能够驱动基因在棉花纤维中优势表达，并且在棉花的花蕾、花、铃壳中也能优势表达。

3一种蛋白质，它具有如序列表SEQ ID：4所示的氨基酸序列及其功能等同序列。

4按照权利要求3所述的蛋白质，其特征在于能够在棉花纤维中优势表达，并且在棉花的花蕾、花、铃壳中也能优势表达。

5一种编码权利要求3所述蛋白质的棉花基因组DNA序列及其功能等同序列。

6按照权利要求5所述的棉花基因组DNA序列SEQ ID：2，其特征在于含有5个内含子和6个外显子，它具有如序列表2所示的核苷酸序列。

7一种从真核生物基因组中分离目的基因及其启动子的方法。

8按照权利要求7所述的方法，其特征在于利用限制性内切酶及其同尾酶切割棉花基因组DNA，使反向PCR能够应用于棉花基因组连续步移。

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