CN1894399A - 白喉毒素的制备 - Google Patents

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Abstract

提供了用于制备白喉毒素的白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)培养基以及制备毒素的方法。培养基基本不含有动物来源的产物并含有水、碳水化合物源、氮源以及起始浓度的大量游离氨基酸，其中每种游离氨基酸的起始浓度不会限制毒素的生产。

Description

白喉毒素的制备
发明领域
本发明涉及用于制备白喉毒素的细菌生长培养基以及白喉毒素的制备方法。
发明背景
白喉是由白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)感染引起的一种危及生命的疾病，白喉棒杆菌是革兰氏阳性、需氧、棒状的细菌。疾病是由白喉棒杆菌的产毒素菌株对鼻咽组织局部侵袭引起的。生物在覆盖疼痛、出血和坏死病灶的粗糙的纤维蛋白膜内生长，所述膜可能位于扁桃体或鼻咽区域内。在以往的典型流行期间，疾病的传播是通过飞沫传染。除非用抗生素进行强有力的治疗，否则恢复的白喉病人在其喉部和鼻咽可能携带产毒细菌数周或数月。
白喉的多数临床症状是由携带tox基因的棒杆菌原噬菌体产生的强白喉毒素引起的。在原噬菌体感染白喉棒杆菌后，发生溶原化，菌株变成毒性菌株。由白喉毒素的非毒性形式(类毒素)的活性免疫诱导产生的毒素中和抗体(抗毒素)能预防白喉。目前的免疫策略是利用白喉疫苗，白喉疫苗是通过用甲醛处理将白喉毒素转换成非毒性、但具有抗原性的类毒素形式制备的。在世界范围内，白喉类毒素用于与其他疫苗组分的各种组合来进行大规模免疫。世界卫生组织(WorldHealth Organization)(WHO)最近估计，世界范围内每年大约有100,000病例和最多8,000例死亡是由于婴儿免疫的减少、成人对白喉免疫的降低以及疫苗的供应不足。
白喉棒杆菌的Parke Williams 8(PW8)株变体常被用来产生外毒素，由此通过化学修饰来制备类毒素。通常，含有氨基酸、痕量维生素、无机盐以及碳水化合物源如麦芽糖的培养基制剂促进细菌的良好生长。不同的培养基，如酪蛋白的酸消化产物以及牛肌肉的酶消化产物(胰蛋白酶或木瓜蛋白酶)是毒素制备的合适培养基。在常规的方法中，细菌培养在含有动物来源的蛋白性物质的培养基中。白喉生产的常用培养基是NZ-Amine Type A培养基，其含有酪蛋白消化产物。在合适的条件下，使用絮凝限量方法，用NZ-Amine Type A培养基制备的毒素量是180Lf/mL。(参考文献1-3，在本申请中，各参考文献均在括号中引用来更充分描述本发明所属的现有技术状态。各参考文献的全部著录信息列于本说明书之后权利要求之前。各参考文献的公开内容均以引用的形式并入本公开内容)。
动物来源的蛋白性材料的使用导致在用培养基制备的白喉毒素中引入不希望的污染物。
El Kholy等1967(Ref.4)将从黄羽扇豆(Lupinus luteus)的发芽种子制备的营养培养基(大豆提取物)用于白喉棒杆菌生长的培养基。尽管细菌在其中生长良好，但是白喉类毒素的产生却是最小限度的。El Kholy和Karamya(1979)(Ref.5)得出结论，大豆提取物中的皂苷会抑制毒素的产生。Taha和Kholy(1985)(Ref.6)对大豆先高压灭菌，再用沸水连续提取，以得到产生毒素的水性提取物，所得毒素的Lf值与对照(肉汤)相当，推测原因可能是蒸汽高压灭菌破坏了三种胰蛋白酶抑制剂以及连续的煮沸降低了提取物中的皂苷含量。大豆食品在pH4.6的酸提取导致产生具有与对照(肉汤)的Lf值比得上的Lf值的提取物，因为在此pH皂苷和胰蛋白酶抑制剂的提取量均有限。
Wolfe等的2000年8月31日公布，并转让给NYCOMEDIMAGING AS的国际专利申请WO00/50449中描述了制备白喉毒素的培养基和方法。WO00/50449中所述的所有培养基均含有酪蛋白氨基酸，其通过乳蛋白酪蛋白的酸水解得到。因此，WO00/50449中所述的所有培养基均含有动物来源的蛋白性材料。
Oliveri等的1998年12月3日公布，并转让给Chiron S.P.A.的国际专利申请WO98/541296中描述了制备白喉毒素的含有Soytone的培养基。
已描述了无毒，且常被称作CRM(交叉反应材料)的白喉毒素的类似物(参见例如Ref7)。实例有CRM-197、CRM-9、CRM-45、CRM-102、CRM-103和CRM-107。
仍然需要基本上不含或完全不含动物成分的细菌生长培养基用于白喉棒杆菌的培养以及白喉毒素及其类似物的制备。
发明概述
本发明涉及制备白喉毒素及其类似物的生长培养基及其方法。
在本发明的第一方面，提供了制备白喉毒素或其类似物的培养基，其中培养基基本不含有动物来源的产物并含有水、碳水化合物源以及氮源，还含有起始浓度的大量游离氨基酸，其中每种游离氨基酸的起始浓度不会限制白喉毒素或其类似物的产生水平。培养基可含有所有天然存在的氨基酸，碳水化合物源可包含麦芽糖，且培养基可不含有葡萄糖。氮源可含有酵母提取物。培养基可完全不含有动物源性产物。
在本发明的第二方面，提供了白喉棒杆菌的培养基，其含有碳水化合物源、氮源以及含有至少四种游离氨基酸的添加剂***，其每一种的量足以促进白喉棒杆菌产生一定水平的白喉毒素或其类似物，其中所述培养基基本不含有动物来源的产物。培养基可含有所有天然存在的氨基酸，碳水化合物源可以是麦芽糖。氮源可以是酵母提取物。合适的氨基酸浓度范围是每升培养基约0.5g-约1g。培养基可完全不含有动物源性产物。
在本发明的第三方面，提供了制备白喉毒素或其类似物的方法，其包括在本文所提供的任何培养基中培养白喉棒杆菌的步骤。白喉棒杆菌菌株生长直至稳定期，且可获得至少100Lf/mL白喉毒素或其类似物的生产。回收白喉毒素或其类似物，将其纯化并去毒以得到白喉类毒素，后者可制备成疫苗用于免疫宿主，以免于其患由白喉棒杆菌感染引起的疾病。
在另一方面，本发明延伸到免疫宿主以免于其患由白喉棒杆菌感染引起的疾病的方法，其包括给宿主施用此处描述的疫苗。从而，此处提供的疫苗可用于免疫宿主以免于其患由白喉棒杆菌感染引起的疾病，此处提供的白喉类毒素可用于制备免疫宿主以免于其患由白喉棒杆菌感染引起的疾病的制剂。
在另一方面，本发明提供了一种组合物，其含有此处提供的白喉棒杆菌菌株及培养基。
在另一方面，本发明提供了一种制备白喉毒素或其类似物的方法，其包括在培养基中生长白喉棒杆菌培养物并给培养物提供至少一种被选氨基酸以防止被选氨基酸的浓度限制毒素(或其类似物)的产生，其中所述培养基基本不含有动物来源的产物。培养基可进一步含有酵母提取物，其浓度为例如约3g/L。
在另一方面，本发明提供了一种对在培养基中培养白喉棒杆菌的培养方法的改进，所述培养基含有用于制备一定生产水平的白喉毒素或其类似物的氨基酸，并且在培养过程中其中至少一种被选氨基酸被耗尽并限制白喉毒素或其类似物的生产水平，所述改进包括在所述培养过程中外源添加额外量的至少一种被选氨基酸，并且其中至少一种被选氨基酸不限制白喉毒素或其类似物的生产水平。至少一种被选氨基酸选自Glu、Asn、Ser、His、Gly、Thr、Met、Trp和异亮氨酸。
附图简述
本发明通过参考附图的如下说明将得到进一步阐释，其中：
图1是显示通过酵母提取物氨基酸互作效应导致的毒素产量中的变量互作效应；
图2是用含有动物成分及不含动物成分的培养基制备的白喉毒素及类毒素的SDS-PAGE分析；
图3是用含有动物成分及不含动物成分的培养基制备的白喉毒素及类毒素的蛋白印迹分析；
图4是用含有动物成分及不含动物成分的培养基制备的白喉毒素及类毒素的等电凝胶分析；
图5是用含有动物成分及不含动物成分的培养基制备的白喉毒素的圆二色性分析；
图6是用含有动物成分及不含动物成分的培养基制备的白喉类毒素的圆二色性分析；以及
图7是用含有动物成分及不含动物成分的培养基在200L规模制备的白喉类毒素的圆二色性分析。
发明详述
不含劝物成分的氨基酸培养基的配制
NZ Amine是氨基酸和肽的来源，其由酶消化酪蛋白制备。它是氨基氮(游离氨基酸)和有机氮(肽)两者的良好来源。制备白喉类毒素的白喉棒杆菌培养基中的氨基酸和肽的另一个来源是动物来源的Toxiprotone-D。这些培养基的组成在表和如下显示：
含有NZ Amine的培养基的组成
表1.含有NZ Amine的培养基的组成
成分 每升的量
NZ Amine 30g
乙酸 7.2mL
麦芽糖 25g
生长因子 8mL
10％L-胱氨酸 2mL
60％乳酸钠 1.7mL
PH 7.5
表2.生长因子溶液的组成
成分 量
硫酸镁 225g
β丙氨酸 2.30g
庚二酸 0.15g
硫酸锌 0.80g
硫酸铜 0.50g
氯化锰 0.24g
烟酸 4.6g
盐酸，浓的 30mL
注射用水 1000mL
表3.含有Toxiprotone的培养基的组成
培养基组分  量(g/L)
Toxiprotone D  52.5g
溶液葡萄糖-氨基酸
β环糊精  1.7
无水葡萄糖  125
L-His  5.55
L-天冬酰胺  27.7
L-谷氨酰胺  8.3
谷氨酸  2.8
L-半胱氨酸  0.55
麦芽糖-生长因子溶液  28.9
不含动物成分的氨基酸培养基的配制
在氨基酸培养基制备中，方法是在含有Toxiprotone-D和NZ-Amine动物成分的培养基中选择更高浓度(nM)的每种氨基酸以制备能支持白喉棒杆菌生长和毒素产生的培养基。
白喉棒杆菌生长在含有NZ-Amine的培养基中。在发酵过程中在不同的时间间隔(24、30和41小时)鉴定几种消耗的氨基酸(表4)。
表4：通过HPLC确定的在含有Toxiprotone-D动物成分(Toxiprotone-D)和NZ-Amine动物成分的培养基中氨基酸的组成以及使用NZ Amine培养基发酵过程中氨基酸的消耗。
  样品  ASP  GLU     ASN   SER     GLN HIS   GLY  THR  ALA  ARG  TYR
  NZ Amine Diph-20L-11T＝0  3.61  8.59     2.65   4.6     0 2.08   1.39  4.2  5.34  4.89  3.29
  Diph-20L-11T＝24  0.21  1.45     0   0.3     0 1.85   3.34  2.91  11.7  3.85  2.72
  Diph-20L-11T＝30  0.26  1.06     0   0.4     0 1.3   3.11  1.03  15.4  3.29  2.48
  Diph-20L-11T＝41  0.17  0.95     0   0.2     0 0.53   0.7  0.21  9.67  2.14  1.32
  Toxiprotone D  1.32  3.23     1.44   3.6     0.63 1.16   3.5  2.66  7.61  9.12  1.92
    样品  VAL  MET  TRP  PHE  ILE  LEU  LYS  PRO
    NZ Amine Diph-20L-11T＝0  7.33  3.47  1.27  5.6  5.3  13.8  10  1.9
    Diph-20L-11T＝24hrs  7.58  2.68  0.62  4.71  4.81  11  8.22  4.77
    Diph-20L-11T＝30hrs  7.67  2.15  0.37  4.57  4.75  10.8  7.81  6.9
    Diph-20L-11T＝41hrs  3.61  0.7  0  2.59  1.76  5.42  7.37  6.75
    Toxiprotone D溶液  3.27  2.29  1.02  2.8  2.7  6.94  3.77  1.65
氨基酸浓度以mM表示。
通过使氨基酸消耗和毒素产生之间相互关联，发酵实验用以下含有氨基酸Asn、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Met、Trp、Iso和Leu的培养基进行。
表5.含有氨基酸Asn、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Met、Trp、Iso和Leu的生长培养基的组成
 组分 量
 乙酸 7.2mL
 麦芽糖 25g
 60％乳酸钠 1.7mL
 生长因子溶液 8mL
 10％L-胱氨酸(不含动物成分) 2mL
 L-谷氨酸 1g
 L-天冬酰胺，一水化物 0.5g
 L-丝氨酸 0.5g
 L-组氨酸 0.5g
 L-甘氨酸 0.5g
 L-苏氨酸 0.5g
 L-甲硫氨酸 0.5g
 L-色氨酸 0.5g
 L-异亮氨酸 1g
 加注射用水到1000mL
然而，仅用这些少量氨基酸不会引起细胞生长或毒素产生。
设计一种含有所有天然存在的氨基酸的培养基(CDM)。所有这些氨基酸都是非动物来源的。该培养基的组成如下表6所示。
表6：不含动物成分的培养基CDM的组成
 组分 量
 乙酸 7.2mL
 麦芽糖 25g
 60％乳酸钠 1.7mL
 生长因子溶液 8mL
 10％L-胱氨酸(不含动物成分) 2mL
 酵母提取物 3g
 L-天冬氨酸 0.5g
 L-谷氨酸 1g
 L-天冬酰胺，一水化物 0.5g
 L-丝氨酸 0.5g
 L-谷氨酰胺 0.5g
 L-组氨酸 0.5g
 L-甘氨酸 0.5g
 L-苏氨酸 0.5g
 L-精氨酸 2g
 L-缬氨酸 1g
 L-色氨酸 0.5g
 L-苯丙氨酸 1g
 L-异亮氨酸 1g
 L-亮氨酸 2g
 盐酸L-赖氨酸 2g
 L-脯氨酸 2g
 β-丙氨酸 0.5g
 L-酪氨酸 0.5g
 L-甲硫氨酸 0.5g
 注射用水至1000mL
使用含有NZ amine或Toxiprotone的培养基以20L规模进行的白喉棒杆菌菌株的发酵批次的对比分析
使用含有NZ amine的培养基的发酵
在第一次预培养中，将亲液种子从亲液种子繁殖到Loefflers斜面，培养物在所述斜面在36±2℃生长22±2小时。在第二次预培养中，22±2小时的培养后，将细胞从斜面转移到100mL的NZ amine培养基的原代烧瓶中并在36±2℃于180rpm下培养22小时。烧瓶还包含1mL的1∶10稀释的磷酸盐溶液(32％(w/v))和0.5mL的1∶2稀释的氯化钙溶液(53％(w/v))。在第三次预培养中，将约5mL的原代培养物从100mL的原代摇瓶中取出并接种到250mL的NZ Amine培养基，然后在36±2℃于180rpm下培养22小时。培养物中还包含2.5mL的1∶10稀释的磷酸盐溶液(32％(w/v))和1.25mL的1∶2稀释的氯化钙溶液(53％(w/v))。在发酵中，将15mL的第三次预培养物接种至发酵罐中15 L NZ Amine培养基中。培养物还包括100.7mL的0.32％(w/v)磷酸盐溶液以及125mL的1∶2稀释的氯化钙溶液(53％(w/v))和23.44mL的七水合硫酸亚铁溶液(0.1％(w/v))。发酵在36±2℃的控制温度下、在有1个Rushton涡轮高速搅拌机的Braun Fermentor中、用600rpm的搅动、通过液面上空间进行1.57vvm的通气下进行。经过25小时的发酵后，搅动加快至800rpm并将发酵罐加压至0.4巴。发酵再继续进行另外16小时。
使用含有Toxiprotone的培养基的发酵
3.1.1在第一次预培养中，将亲液种子从亲液种子繁殖到含有5％羊血的细菌中胰蛋白琼脂平板，并在36±2℃生长24±2小时。在第二次预培养中，将细胞从血液琼脂平板转移到90mL培养基的原代烧瓶中并在室温静止培养48小时，然后在36±2℃于180rpm下培养24小时。将约1.6mL的原代培养物从90mL的原代摇瓶中取出并接种到800mL的培养基中，在36±2℃于180rpm下培养22小时。然后将800mL的培养物接种发酵罐中的10L培养基。发酵在具有2个Rushton涡轮高速搅拌机、1个喷雾器和4个挡板的New BrunswickScientific Fermentor中进行。培养在220rpm搅动、在36±2℃以0.2vvm的通气下进行。从发酵8小时往上直至32小时的发酵结束，用葡萄糖氨基酸溶液将pH控制在7.5-7.6。所产生的Lf/mL是80-90Lf/mL。
使用CDM培养基的发酵
第一次预培养
将湿的的冷冻种子(甘油原种)繁殖至CDM+5g/LYE琼脂培养基并在36℃培养24小时。
第二次预培养
将平板上的培养物重悬于5mL的CDM+3g/LYE培养基并将其中的2.5mL用于接种90mL的CDM+3g/LYE培养基的原代烧瓶。将烧瓶在200rpm的持续振荡下，在36℃温育24小时。原代烧瓶中还含有0.9mL的1∶10稀释的磷酸盐溶液(32％(w/v))和0.45mL的1∶2稀释的氯化钙溶液(53％(w/v))。
发酵
将约800mL第三次预培养物用于接种发酵罐中的10LCDM+3g/L YE培养基。向发酵中加入100mL的1∶10稀释的磷酸盐溶液(32％(w/v))和50mL的1∶2稀释的氯化钙溶液(53％(w/v))以及3.4mL的七水合硫酸亚铁溶液(0.1％(w/v)。发酵在NewBrunswick Scientific或B.Braun发酵罐中，在受控的温度36℃下进行。过程参数是：250rpm的搅动、0.45vvm的通气。在发酵过程中，用5N氢氧化钠和2.5M磷酸将pH控制在6.5-7.6。
通过絮凝方法(Lf试验)和ELISA定量的毒素量(表7)
表7：CDM中白喉棒杆菌的发酵
       1°SF      2°SF
批号  种子的体积  OD  到2°SF的体积  OD  到发酵罐的体积  发酵的或最大的OD Lf/ml  pH控制 备注
Diph-20L-28  0.5ml  2.75  5ml  6.30  11ml  8.23 -  6.5-7.5 CDM+202mL的1∶10Phos+55mL的1∶2CaCl2+3.8mL的0.1％FeSO4，7H2O(11L规模)
Diph-20L-29  0.5ml  2.75  5ml  6.30  11ml  3.12 -  7.0 CDM+202mL的1∶10Phos+55mL的1∶2CaCl2+3.8mL的0.1％FeSO4，7H2O11L规模)
Diph-20L-30  0.5ml  3.03  5ml  12.4  6ml  9.11 -  - CDM+110mL的1∶10Phos+30mL的1∶2CaCl2+2mL的0.1％FeSO4，7H2O(6L规模)
Diph-20L-31  0.5ml  3.03  5ml  12.4  6ml  10.63 120  6-8 CDM+110mL的1∶10Phos+30mL的1∶2CaCl2+2mL的0.1％FeSO4.7H2O(6L规模)
用CDM培养基与麦芽糖、铁和磷酸盐浓度的不同组合以240L的规模进行发酵。结果总结于如下的表8中：
表8：用不含动物成分的CDM的发酵
    麦芽糖(g/L)   浓磷酸盐体积(L)     氯化钙体积(L)     0.1％FeSO4.7H2O体积(L)   反压从(小时)     生长OD600     Lf/mL
    25   0.44     0.6     0.2   -     15-20     60-100
    25   0.44     0.6     0.083   -     15-20     60
    25   2-2.5     1.0     0.25-0.45   -     差     无
    25   0.44     0.6     0.2   55     17     60
    25   0.88     0.6     0.2   55     16     60
    25   0.44     0.6     0.12   24     16     70
    25   0.44     0.6     0.1   24     16     70
    25   0.44     0.6     0.035   24     16     90
    15   0.44     0.6     0.025-0.075   24     14     30-50
    10   0.44     0.6     0.025   24     17     40
尽管达到OD600为15-20的生长，但是所产生的毒素水平为90-100Lf/mL，该值低于使用含有动物来源的蛋白性材料如NZ amine或Phytone的培养基所得到的值。
氨基酸消耗的时间进程研究表明氨基酸如(Asp、Glu、Asn、Ser、Gln、Gly和Thr)在发酵的12小时内消耗，如20L批次所示(表9)，且在毒素表达阶段则不可利用。
表9：CDM培养基中氨基酸消耗的时间进程研究
  样品   ASP   GLU   ASN   SER   GLN   HIS   GLY   THR   βALA   ALA   ARG   TVR   VAL   MET   TRP   PHE   ILE   LEU   LYS   PRO
  Dlph-ZOL-31T＝0   4.53   6.42   2.02   4.02   2.95   2.75   5.63   3.66   12.65   0.15   10.33   2.25   7.82   2.94   2.01   5.72   7.20   14.11   7.75   17.85
  Dlph-20L-31T＝31.5   0.17   7.43   0   0.13   0   2.60   5.05   2.80   13.65   1.48   10.53   2.36   7.51   2.91   2.01   5.72   6.71   13.49   9.84   17.49
  Dlph-ZOL·31T＝49   0   0.72   0   0.17   0   1.75   0.50   0   12.81   1.47   8.84   2.13   4.56   1.41   1.43   4.22   3.44   8.73   8.62   13.85
  Dlph-ZOL-31T＝55   0   0.97   0   0.19   0   1.48   0.30   0   12.54   0.92   8.38   1.87   3.69   1.05   1.21   3.71   2.60   7.04   7.71   16.36
  Dlph-ZOL·31T＝71.5   0   0.69   0   0.21   0   1.15   0.35   0   12.02   0.52   7.75   1.72   2.48   0.69   1.11   2.80   1.67   4.74   8.05   13.77
这些结果表明培养基应该富含有机或无机氮。
有机和无机氮补充物的筛选
发酵过程中氨基酸消耗的时间进程研究表明关键的氨基酸在生长的前12-18小时消耗，且在发酵的后期当毒素产生时则不可利用。培养基应当补充氮来支持生长以及将培养基中的氨基酸用作毒素合成的前体。如下所述，将酵母提取物和硫酸铵加至CDM：
用于白喉棒杆菌生长以及白喉毒素制备的不同培养基：
a)CDM+5g/L酵母提取物；
b)CDM+5g/L硫酸铵；和
c)含有培养基中一半浓度的氨基酸+5g/L酵母提取物和5g/L硫酸铵的改进的CDM。
在这些发酵中白喉毒素的生产如下表10所示：
表10：补充有机和无机氮的CDM培养基中的白喉毒素生产
培养基     OD600T＝48hr    OD600 T＝72hr     Lf/mL
(a)CDM     5.61    4.18     40
(b)CDM+5g/L YE     4.48    5.17     40-60
CDM+5g/L(NH4)2SO4     7.44    8.10     40
(d)CDM+5g/L YE+5g/L(NH4)2SO4     9.24    10.95     40
使用统计学设计对培养基中的不同组分进行最优化以得到更高的毒素产量
使用计算机统计学设计(FusionPro)来最优化培养基组成。在设计中，三种组分(酵母提取物，氨基酸混合物和铁)的三个不同浓度被用作统计学设计中的输入项。选择分数的因子设计(参见表11)，如下：
表11：试验设计改变酵母提取物、氨基酸和铁浓度的量来最优化白喉棒杆菌的毒素生产
  运行号码     酵母提取物(g/L)     氨基酸(浓度/含量)   Fe(mL/L)这个单位是什么？？？     DT生产(μg/mL)
  1     10     0.5   0     37.13
  2     5     0.5   0.34     45.61
  3     2.5     0.5   0.34     30.46
  4     10     0*   0.66     2.70
  5     10     1   0.34     1.12
  6     5     0.5   0.66     30.66
  7     2.5     1   0.66     71.13
  8     2.5     0*   0     0.45
  9     5     0*   0.34     0.11
  10     5     0.5   0.34     19.35
  11     5     1   0     148.60
磷酸盐和氯化钙溶液保持为常量。
在不同条件下进行试验，并通过ELISA对所制备的毒素的量进行定量。尽管毒素的浓度是大约150Lf/mL，但是所产生的毒素比在发酵过程中使用动物组分所得毒素要纯。在铁浓度为0.34mL/L下，酵母提取物和氨基酸量的反应图被外推为使氨基酸混合物的浓度加倍，如图1所示。在这种酵母提取物浓度(3g/L)和氨基酸浓度(2x)条件下，根据等值线作图分析，毒素的量加倍。但是，在实践中，这个并不容易实施，因为它将会提高成本以及培养基的摩尔渗透压浓度，导致细胞死亡。
统计学设计表明，在毒素产量中有重要的变量互作效应。最重要的影响(如图1所示)是酵母提取物-氨基酸互作效应(A*B)。酵母提取物和氨基酸对毒素产量有负效应。如果酵母提取物浓度太高(即，5g/L)，那么该条件将支持细菌生长，但不支持毒素产生。而且，如果氨基酸浓度提高至两倍，就可能会由于渗透压不平衡而出现对生长不利的环境。因此，需对酵母提取物和氨基酸浓度进行最优化以制备高毒素浓度。图5的一般回归统计学表明R方值是0.92。这意味着所观察到的毒素产量数据非常接近由FusionPro设计预期的毒素产量数据。
毒素的最佳量在酵母提取物浓度3g/L、1倍氨基酸浓度以及铁浓度0.34mL/L条件下产生。
基于早期的发酵试验以及在生长和毒素产生阶段氨基酸消耗状况，发现氨基酸Asp、Glu、Asn、Ser、Gln、Gly和Thr消耗较快，且在毒素表达阶段不可利用。这些氨基酸而非所有19种氨基酸是由FusionPro外推反应曲线推定的获得更高产量的毒素以2x浓度所需要的关键氨基酸。从而进行了2x浓度关键氨基酸(改进的CDM1+3g/L YE)对毒素合成的影响的摇瓶研究。将上述关键氨基酸的浓度加倍会使毒素水平(289μg/mL)与1x浓度的(157μg/mL)相比加倍，这一点支持如下假定：这些氨基酸在生长期完全消耗，是毒素合成所需要的。将这些氨基酸的2x浓度条件按比例扩大至20L发酵罐，发现细胞生长很差。最优化的不含动物成分的培养基是CDM+3g/L酵母提取物，如表12所示。
表12：CDM+3g/L酵母提取物的培养基组成
组分 量
乙酸 7.2mL
麦芽糖 25g
60％乳酸钠 1.7mL
生长因子溶液 8mL
10％L-胱氨酸(不含动物成分) 2mL
细菌用酵母提取物 3g
L-天冬氨酸 0.5g
L-谷氨酸 1g
L-天冬酰胺，一水化物 0.5g
L-丝氨酸 0.5g
L-谷氨酰胺 0.5g
L-组氨酸 0.5g
L-甘氨酸 0.5g
L-苏氨酸 0.5g
L-精氨酸 2g
L-缬氨酸 1g
L-色氨酸 0.5g
L-苯丙氨酸 1g
L-异亮氨酸 1g
L-亮氨酸 2g
盐酸L-赖氨酸 2g
L-脯氨酸 2g
β-丙氨酸 0.5g
L-酪氨酸 0.5g
L-甲硫氨酸 0.5g
注射用水 至100mL
白喉类毒素的纯化和去毒
将10L发酵培养物在12,500×g，4℃下离心20分钟，收集上清液。然后，将上清液通过0.22μm薄膜滤器过滤以除去残余的细菌。在4℃，持续搅拌下，将27％(w/v)的硫酸铵加入过滤后的上清液中，然后在12,500g，4℃下离心20分钟。收集上清液用于进一步加工。持续搅拌下，将13％(w/v)的硫酸铵加入上清液。将混合物进一步在4℃搅动过夜，然后在12,500g，4℃下离心20分钟。所得沉淀溶解在约1000mL的0.9％(w/v)的盐水中。
将上述毒素溶液用具有10kDa盒子(cassette)的超滤单元对0.9％(w/v)盐水进行渗滤以除去硫酸铵。存留物用0.22μm的薄膜滤器过滤，然后保存在4-8℃。在去毒之前，将存留物用0.9％(w/v)的盐水稀释至500 Lf/mL。白喉毒素的纯度为至少75％。在室温持续搅动下在20分钟内将0.5％(v/v)甲醛和0.5％(w/v)碳酸氢钠加至稀释的毒素溶液。20分钟后，加入溶于0.9％(w/v)盐水中的0.913％(w/v)L-赖氨酸溶液，接着将混合物通过0.22μm的薄膜滤器过滤，然后在37℃持续振荡下温育6周以去毒。将类毒素保存在4-8℃。
用含有动物成分和不含动物成分的培养基制备的白喉毒素和类毒素的表征
将用含有动物成分和不含动物成分的培养基制备的白喉毒素和类毒素通过SDS-PAGE、蛋白印迹、圆二色性谱确定以及N-末端测序进行分析。结果表明用含有动物成分和不含动物成分的培养基制备的白喉毒素和类毒素基本不能区分。
总蛋白的浓度通过用二辛可宁酸(bicinchoninic acid)(BCA)进行微量培养板BCA测定及通过与浓度已知的参考标准蛋白对比而进行。
SDS PAGE
进行SDS-PAGE以确定白喉毒素和类毒素的相对分子量(Mr)，从而评价毒素和类毒素的纯度；以及评估蛋白带的分布模式。蛋白通过在还原条件下在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE进行分析。凝胶用考马斯蓝染色，接着进行光密度分析。参考图2，显示了为确定白喉毒素和类毒素的相对分子量(Mr)而进行的SDS-PAGE，以评价毒素和类毒素的纯度以及蛋白带的分布模式。蛋白在还原条件下在12.5％的聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE进行分析。凝胶用考马斯蓝染色，接着进行光密度分析。泳道是1.MW标记物(kDa)，250，150，100，75，50，37，25，15，10kDa；2.白喉毒素，CO3105(含动物成分的培养基)；3.白喉毒素Diph-20L-40F(含动物成分的培养基)；3.白喉毒素Diph-20L-48F(CDM+含酵母提取物的培养基)；4.白喉毒素Diph-20L-50F(CDM+含酵母提取物的培养基)；5.白喉毒素Diph-20L-55F(CDM+含酵母提取物的培养基)；6.白喉类毒素CO3152；7.白喉类毒素Diph-20L-40F(含动物成分的培养基)；8.白喉类毒素Diph-20L-48F(CDM+含酵母提取物的培养基)；9.白喉类毒素Diph-20L-50F(CDM+含酵母提取物的培养基)
蛋白印迹分析
参考图3，显示了用白喉毒素特异性抗体进行的蛋白印迹分析。样品在12.5％ SDS-PAGE凝胶上进行分辨，然后转移到PVDF膜，并用DT特异性抗体进行印迹。泳道是1.相对分子量标记物(kDa)，250，150，100，75，50，37，25，15，10kDa；BioRad MW标记物；2.白喉毒素CO3105；3.白喉毒素Diph-20L-40F(含动物成分的培养基)；4.白喉毒素Diph-20L-48F(CDM+含酵母提取物的培养基)；5.白喉毒素Diph-20L-50F(CDM+含酵母提取物的培养基)；6.白喉毒素Diph-20L-55F(CDM+含酵母提取物的培养基)；7.白喉类毒素CO3152；8.白喉类毒素Diph-20L-40F(含动物成分的培养基)；9.白喉类毒素Diph-20L-48F(CDM+含酵母提取物的培养基)；10.白喉类毒素Diph-20L-50F(CDM+含酵母提取物的培养基)。
N-末端测序
N-末端测序分析用于监控导致N-末端变化的任何蛋白修饰。将蛋白在12.5％SDS-PAGE凝胶上进行分辨，然后转移到固体支持物如PVDF。通过传统的Edman降解方法将N-末端氨基酸释放并衍生化，然后通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行鉴定。对于加工的对照白喉毒素和类毒素以及“不含动物”的毒素/类毒素均观察到期望的N-末端序列。
表13：白喉毒素的N-末端序列
 批号  培养基 序列 匹配
 CO3105  NZ Amine GADDVVDSSKSF 白喉毒素蛋白GADDVVDSSKSF
 Diph-20L-11  NZ Amine GADDVVDSSKSF 白喉毒素蛋白GADDVVDSSKSF
 Diph-20L-31  CDM+酵母提取物(15g/L) GADDVVDSSKSF 白喉毒素蛋白GADDVVDSSKSF
 Diph-20L-33  CDM+酵母提取物(15g/L) GADDVVDSSKSF 白喉毒素蛋白GADDVVDSSKSF
 Diph-20L-64  CDM+酵母提取物(15g/L) GADDVVDSSKSF 白喉毒素蛋白GADDVVDSSKSF
表14：白喉类毒素的N-末端序列
 批号  培养基  序列 匹配
 CO3152  NZ Amine  GADDVVDSSKSF 白喉毒素蛋白前体GADDVVDSSKSF
 Diph-20L-11  NZ Amine  GAD-VVDSSKSF 白喉毒素蛋白前体GADDVVDSSKSF
 Diph-20L-64  CDM+酵母提取物(15g/L)  GADDVVD 白喉毒素蛋白前体GADDVVDSSKSF
-缺失的序列循环是由于仪器问题
等电聚焦(IEF)
用参考蛋白估计白喉毒素的等电点。参考图3，显示等电聚焦凝胶。泳道是：1.IEF stds-pI＝7.80，7.50，7.10，7.00，6.50，6.00，5.10，4.65；2.白喉毒素CO3105(含动物成分的培养基)；3.白喉毒素Diph-20L-11(含NZ Amine的培养基)；4.白喉毒素Diph-20L-31(CDM+含酵母提取物的培养基)；5.白喉毒素Diph-20L-31(CDM+含酵母提取物的培养基)；6.白喉类毒素CO3152(含动物成分的培养基)；7.白喉类毒素Diph-20L-11(CDM+含酵母提取物的培养基)；8.白喉类毒素Diph-20L-31(CDM+含酵母提取物的培养基)；9.白喉类毒素Diph-20L-31(CDM+含酵母提取物的培养基)。
圆二色性谱
圆二色性(CD)分析用于确定各批次构象或二级结构的不一致性。通过软件程序分析样品对圆偏振光的吸收光谱，得到α-螺旋、β-折叠、转角和无规卷曲结构的相对百分比组成。用Jasco CD旋光分光计在22℃分析白喉毒素和类毒素。(参见图5-7)。
N-末端测序。将蛋白在12.5％SDS-PAGE凝胶上进行分辨，然后转移到固体支持物如PVDF。通过传统的Edman降解方法将N-末端氨基酸释放并衍生化，然后通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行鉴定。
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Claims (40)

1.一种培养白喉棒杆菌菌株以制备一定水平的白喉毒素或其类似物的培养基，其中培养基基本不含有动物来源的产物，并含有
a.水；
b.碳水化合物源和氮源；
c.起始浓度的大量游离氨基酸，其中每种游离氨基酸的起始浓度不会限制白喉毒素或其类似物的生产水平。
2.权利要求1的培养基，其含有所有天然存在的氨基酸。
3.权利要求1的培养基，其中所述碳水化合物源包含麦芽糖。
4.权利要求1的培养基，其基本不含有葡萄糖。
5.权利要求1的培养基，其中所述氮源包含酵母提取物。
6.权利要求1或2或3或4或5的培养基，其中所述培养基不含有动物来源的产物。
7.一种白喉棒杆菌的培养基，其含有：
碳水化合物源和氮源及含有至少四种游离氨基酸的添加剂***，其每一种的量足以促进白喉棒杆菌产生一定水平的白喉毒素或其类似物，其中所述培养基基本不含动物来源的产物。
8.权利要求7的培养基，其含有所有天然存在的氨基酸。
9.权利要求7的培养基，其中所述碳水化合物源是麦芽糖。
10.权利要求7的培养基，其中所述氮源是酵母提取物。
11.权利要求7或8或9的培养基，其中所述氨基酸的浓度范围是每升培养基大约0.5g-大约1g。
12.权利要求7或8或9或10或11的培养基，其中所述培养基不含动物来源的产物。
13.一种制备白喉毒素或其类似物的方法，其包含步骤：
在允许白喉毒素生产的条件下，在培养基中培养白喉棒杆菌菌株，其中所述培养基基本不含动物来源的产物并含有含有水；
a.碳水化合物源及氮源；
b.起始浓度的大量游离氨基酸，其中每种游离氨基酸的起始浓度不会限制白喉毒素或其类似物的生产水平。
14.权利要求13的方法，其中所述培养基含有所有天然存在的氨基酸。
15.权利要求13的方法，其中所述碳水化合物源包含麦芽糖。
16.权利要求13的方法，其中所述培养基基本不含有葡萄糖。
17.权利要求13的方法，其中所述氮源包含酵母提取物。
18.权利要求13的方法，其中所述白喉棒杆菌生长直至稳定期。
19.权利要求13的方法，其中获得至少100Lf/mL的白喉毒素或其类似物生产。
20.权利要求10的方法，其进一步包括回收白喉毒素或其类似物以提供回收的白喉毒素或其类似物的步骤。
21.权利要求17的方法，其进一步包括纯化回收的白喉毒素或其类似物以提供纯化的白喉毒素或其类似物的步骤。
22.权利要求17或18的方法，其进一步包括使回收或纯化的白喉毒素或其类似物去毒以提供白喉类毒素或其类似物的步骤。
23.权利要求19的方法，其进一步包括将白喉类毒素或其类似物配制成疫苗以免疫宿主以免于其患由白喉棒杆菌感染引起的疾病。
24.权利要求13-23任一项的方法，其中所述培养基不含动物来源的产物。
25.一种免疫宿主以免于其患由白喉棒杆菌感染引起的疾病的方法，其包括给宿主施用权利要求23的疫苗。
26.权利要求23的疫苗在免疫宿主以免于其患由白喉棒杆菌感染引起的疾病的用途。
27.权利要求22的白喉类毒素或其类似物在制备免疫宿主以免于其患由白喉棒杆菌感染引起的疾病的药物中的用途。
28.一种组合物，其含有白喉棒杆菌菌株和用于制备白喉毒素或其类似物的培养基，其中所述培养基基本不含有动物来源的产物并含有其中所述培养基基本不含有动物来源的产物并含有含有
a.水；
b.碳水化合物源和氮源；
c.起始浓度的大量游离氨基酸，其中每种游离氨基酸的起始浓度不会限制白喉毒素或其类似物的生产水平。
29.权利要求24的方法的组合物，其中所述培养基含有所有天然存在的氨基酸。
30.权利要求24的方法的组合物，其中所述碳水化合物源包含麦芽糖。
31.权利要求24的组合物，其中所述培养基基本不含葡萄糖。
32.权利要求24的方法的组合物，其中所述氮源包含酵母提取物。
33.权利要求21或22或23或24或25的培养基，其中所述培养基不含有动物来源的产物。
34.一种制备白喉毒素或其类似物的方法，其包括在培养基中培养白喉棒杆菌，以及给培养物提供至少一种被选的氨基酸，以防止被选氨基酸的浓度限制毒素的生产，其中培养基基本不含动物来源的产物。
35.权利要求1的方法，其中所述培养基进一步包含酵母提取物。
36.权利要求4的方法，其中所述酵母提取物的浓度大约是3g/L。氨基酸的浓度。
37.在培养基中培养白喉棒杆菌的培养方法，所述培养基含有用于制备一定生产水平的白喉毒素或其类似物的氨基酸，并且在培养过程中其中至少一种被选氨基酸被耗尽并限制白喉毒素或其类似物的生产水平，所述改进包括在所述培养过程中外源添加额外量的至少一种被选氨基酸，并且其中所述至少一种被选氨基酸不限制白喉毒素或其类似物的生产水平。
38.权利要求33的方法，其中所述至少一种被选氨基酸选自Glu、Asn、Ser、His、Gly、Thr、Met、Trp和异亮氨酸。
39.权利要求33的方法，其中所述培养基含有酵母提取物。
40.权利要求35的方法，其中所述酵母提取物的浓度大约为3g/L。
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