CN1221426A - 来普亭(鄂毕肽)片段 - Google Patents

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J·R·S·阿奇
P·卡米勒里
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Abstract

leptin或ob肽或其功能衍生物、类似物或变体,所述肽主要通过调节能量消耗来调节体重;含所述化合物的药物组合物,制备所述化合物的方法以及所述化合物在药物中的用途。

Description

来普亭(鄂毕肽)片段
本发明涉及新化合物，具体地说，本发明涉及新肽，含所述化合物的组合物以及所述化合物在药物中的用途。
有关身体-食物摄入对能量输出的能量平衡的生理调节机制-是多年来讨论的对象。在最近的《自然》杂志中，Y.Zhang等人提出(自然，372,425-431,1994)在能量平衡调节中起关键作用的一种分子是ob(鄂毕)蛋白质。Zhang等人还报道克隆并定序了小鼠和人ob基因蛋白质或leptin。
在英国专利申请GB2292382(公开号)中公开了人leptin(来普亭)或(人ob蛋白质)的结构以及其在调节动物体重方面的用途。该申请还公开了认为能够调节体重的特定leptin片段。
Collins等(自然，380卷，677页，1996)认为leptin减轻体重的特性是通过增加能量的利用，同时减少食物摄入达到的。
我们现在发现了leptin的某些新片段，所述片段令人惊奇地基本上通过提高能量消耗可调节体重。因此，认为这些片段在治疗营养性和代谢性疾病，特别是肥胖和糖尿病中是特别有用的。
因此，第一方面，本发明提供了主要通过调节能量消耗来调节体重的肽或其功能衍生物、类似物或变体。
优选地，体重的调节是体重的减轻。
优选地，能量消耗的调节是经提高能量消耗来实现的。
优选地，所述肽是ob蛋白质，主要是人ob蛋白质，的片段，或其功能衍生物、类似物或变体。
下文，根据人ob蛋白质的氨基酸序列，用下列类似物缩写，来命名蛋白质片段(或肽)：将“由氨基酸残基1-6组成的蛋白质片段”缩写为“ob1-6”。
具体的肽包括ob21-26(MVPIQK),ob27-32(VQDDTK),ob33-36(TLIK),ob(37-41(TIVTR),ob42-54(INDISHTQSVSSK),ob55-56(QK),ob57-74(VTGLDFIPGLHPILTLSK),ob93-105(NVIQISNDLENLR),ob106-115(DLLHVLAFSK),ob116-149(SCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSR)和ob150-167(LQGSLQDMLWQLDLSPGC)，特别是ob57-74(VTGLDFIPGLHPILTLSK)。
适宜地，本发明还包括从前述任何一种或多种具体肽形成的肽。
有利的是，本发明包括从任意两个连续的前述具体肽形成的肽。
如所说明的，本发明还包括本文所述肽的功能衍生物、类似物和变体。
功能衍生物包括本文所述肽的盐和溶剂化合物以及通过连接基团或部分而化学修饰的本发明的肽，所述修饰是为了提高所述蛋白质的物理特性如稳定性或治疗特性如药物动力学特性。
功能类似物包括功能类似物，其中本文所述肽的一个或多个氨基酸被其他氨基酸取代。
其他氨基酸包括与ob蛋白质中的氨基酸的立体化学不同的氨基酸。
功能类似物还包括本文所述肽的小分子激动剂或拮抗剂。用已知方法，如GB2292382中公开的那些方法可以制备并测试所述化合物。
盐包括可药用的盐，特别是可药用的酸加成盐。
在适宜溶剂中，从母体化合物和过量的酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、马来酸、琥珀酸或甲磺酸，用标准方法制备所述肽的酸加成盐。乙酸盐形式是特别有用的。一些化合物形成可接受的内盐或两性盐。通过用过量碱试剂如含适宜阳离子的氢氧化物、碳酸盐或醇盐处理母体化合物来制备阳离子盐。阳离子如Na2+,K+,Ca2+和NH4 2+是在可药用盐中存在的阳离子的实例。
溶剂化物包括可药用溶剂化物，如水合物。
应理解本发明包括肽和非肽化合物。
另外，本发明还包括具体肽ob21-26、ob27-32、Ob33-36、ob37-41、ob42-54、ob55-56、ob57-74、ob93-105、ob106-115、ob116-149和ob150-167、尤其ob57-74的亚片段；或从所述具体肽的任何一个或多个、优选任何两个连续成员形成的肽；或其功能衍生物、类似物或变体。
适宜的肽或亚片段含有至少4个氨基酸。
通过常规的消化方法、合成技术或利用标准表达方法，可以制备本发明的肽。
因此，在另一方面，本发明提供了制备肽或其功能衍生物的方法，所述方法包括下列步骤：将肽，尤其是ob蛋白质，特别是人ob蛋白质水解成至少两个肽片段；分离所述肽片段；此后，任选地制备其功能衍生物。
通过酶消化如利用胰蛋白酶适当地完成所述蛋白质的水解。
通过适宜的色谱法如柱色谱很容易分离所需的肽。
根据所用具体试剂的性质来确定处理ob蛋白质所需的具体反应条件，只要它们与所需产物的稳定性相称，例如，试剂为胰蛋白酶时，通常在25-40℃pH7-9，优选37℃pH7.4下完成反应。
如所说明的，通过常规合成法，如利用液相或固相肽合成法，也可制备本发明的肽。
因此，本发明提供了合成肽或其功能衍生物、类似物或变体，它们主要通过调节能量消耗来调节体重。
本文所述的任何肽作为合成肽构成本发明的部分。
与本发明有关的蛋白质的肽结合单元可利用肽合成仪(Atherton,E.and Sheppard,R.C.(编)(1989)固相肽合成法：实践方法，LRL出版社，牛津)，通过标准肽合成技术，然后用适宜于直接的二硫键或酰胺键形成方法来合成。
Ali等药物化学杂志(J.Med.Chem.),29:984(1986)和药物化学杂志(J.Med.Chem.),30:2291(1987)描述了熟知的肽合成法，所述文献引入本文作为参考。优选通过Merrifield的固相技术(美国化学会志(J.Am.Chem.Soc).85:2149(1964)制备所述肽。但是，可将固相和溶液合成法联用，作为一种集中的合成法，其中用固相合成可制备三，四或五肽片段，然后用溶液合成法偶联或进一步修饰。
在合成过程中，在偶联反应中，保护侧链功能基团(如-NH2,-COOH,-OH,-SH)。通常将α-氨基暂时保护为芴基甲氧基羰基(Fmoc)，但也可使用其他酸-或碱活泼的保护基，如叔丁氧基羰基(Boc)。将赖氨酸的氨基侧链保护为叔丁氧基羰基，苄氧基羰基或对氯苄氧基羰基(Z或Cl-Z)。将乙酰氨基甲基、三苯甲游基、叔丁基、S-叔丁基或对甲基苄基(p-MBz)保护用于半胱氨酸。将羟基保护为丁基或苄基醚，将羧基保护为丁基、苄基(Bz)或环己基酯。
从C末端或N-末端，优选从前者合成肽。在偶联前，将(α-羧基(适宜保护的氨基酸的)激活。本领域技术人员可以用许多方法激活被保护的基团。例如，一种方法可以使用N,N’-二环己基碳化二亚胺(DCC),2(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(uronium)(HBTU)六氟磷酸盐，对硝基苯基酯(pNp)，羟基苯并***酯(HOBt)，N-羟基琥珀酰亚胺酯(OSu)混合的酐或对称的酐。
用常规方法完成肽的溶液合成以形成酰胺键。通常任选地在存在1-羟基苯并***(HOBT)和二甲基氨基吡啶(DMAP)的条件下，用适宜的碳化二亚胺偶联剂，如N,N’-二环己基碳化二亚胺(DCC)，将带有游离羧基的被保护的Boc-氨基酸与带有游离氨基的被保护氨基酸偶联。
在液相合成中，优选在如二氯甲烷(DCM)、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)，四氢呋喃(THF)，乙腈(ACN)或二噁烷之类的溶剂中，在较低的温度(如-20℃)完成偶联反应。
如果使用固相法，从羧基末端开始合成肽，向所述肽的氨基末端反应。固相合成是从将被保护氨基酸的C末端与适宜的树脂如4-(2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基树脂(Rink酰胺树脂，H.Rink，四面体通讯28,3787(1987)),4-苄氧基苄基醇树脂(Wang树脂，S.S.Wang,JACS,95,1328(1973))或4-羟基甲基苯氧基乙酸树脂共价偶联开始。
在固相合成中，通常将第一个氨基酸残基与不溶性聚合物相连。例如两种常用的聚合物是聚苯乙烯(与二乙烯基苯以1％交联的)和1％交联的聚丙烯酰胺。将这些聚合物功能化，使其含有活泼基团如-OH、-NH2和-CH2Cl以便连接靶肽的第一个氨基酸(即羧基末端)。第一个氨基酸与聚合物之间的键的选择由所述肽的羧基末端来决定。例如将在C末端带有羧基的肽通过酯键相连，对于带有甲酰胺末端的肽应使用酰胺键。
将第一个被保护的氨基酸与所需树脂偶联后，通过用仲胺如哌啶处理来去除氨基保护基，然后将第二个(被保护的)氨基酸的游离羧基与所述氨基偶联。该过程可连续进行，不需分离中间产物，直到形成所想要的肽。然后，以任意顺序将合成的肽脱保护和/或从树脂上裂解。
用于偶联反应的优选溶剂包括，但不限于，二氯甲烷(DCM)、二甲基甲酰胺(DMF)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)。当所需的序列合成后，用三氟乙酸或三氟甲磺酸将肽脱保护并从树脂上裂解下来。
从载体树脂上裂解肽的优选方法是，将载有肽的树脂用三氟乙酸在存在适宜阳离子和碳阳离子清除剂如苯酚、茴香醚、硫代茴香醚、乙二硫醇、水或乙基甲基硫醚的条件下进行处理。
为了得到本发明的化合物，可将合成的肽用本领域公知的方法环化/偶联。
例如，通过将一条链上的游离硫醇与另一条链上适当活化了的半胱氨酸衍生物反应，可以以选择性的方式将均含有半胱氨酸残基的两条直链肽通过二硫键偶联。特别适于作为可被替代的保护基的基团是，S-(甲酯基-烃硫基(sulphenyl))衍生物。该方法的例子是，将两条直链肽的半胱氨酸残基均用乙酰氨基甲基(Acm)保护。将一条链依次用乙酸汞(Ⅱ)和β-巯基乙醇处理除去乙酰氨基甲基保护基。将第二条链用甲酯基烃硫基氯化物处理进行活化。将两种肽在pH值约7-8的稀水溶液中搅拌，从而脱除甲酯基烃硫基并形成链间的二硫化物。
如果要形成分子内二硫化物，则可将相应的直链肽完全脱保护形成二硫醇。本领域已知的可将二硫醇转变为二硫化物的任何氧化剂均可使用。所述氧化剂的例子是，碱金属铁氰化物(铁***或铁***)、氧气、二碘甲烷或碘。反应在适宜的惰性溶剂如甲醇水溶液或水中、在0至约40℃的温度下、在高度稀释的条件下进行。pH值通常保持在约7-8。环化反应可以在仍连接在载体树脂上或其它功能基仍被保护的肽上进行，但优选在脱保护后的游离肽上进行。
当要在两条直链肽之间形成二硫化物时，可使用两种类型的半胱氨酸保护基，例如Acm和三苯甲基。每一种肽含有其中一种类型的保护基，从而要偶联的一对半胱氨酸用三苯甲基保护，另一对用Acm保护。从各肽上单独脱除三苯甲基可生成两种单硫醇衍生物，将一种肽上的硫醇用2,2’-二吡啶基二硫化物活化然后加入另一种单硫醇肽将上述两种单硫醇衍生物偶联，生成二(S-乙酰氨基-甲基)二硫键连接的肽。将该产物按照Kamber(B.Kamber，瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta),54,927,(1971))和Kamber等(B.Kamber等，瑞士化学学报，63,899,(1980))的描述，直接用碘氧化可以得到第二二硫化物。
还可以用连接基如-NH(CH2)nCO-将肽链偶联。这很容易通过将相应氨基酸(NH2(CH2)nCOOH)的Na-Fmoc衍生物在常规固相合成过程中掺入到增长的肽链中来完成。可以利用类似的方案用酸性氨基酸如谷氨酸的侧链羧基和碱性氨基酸如赖氨酸的侧链氨基来偶联肽链。在该情况下，可将化合物例如如下的N6-g谷氨酰基赖氨酸衍生物在常规固相合成过程中掺入到增长的肽链中。
Figure A9719531100091
将其通过谷氨酸残基上的羧基偶联到增长的肽链上，脱除赖氨酸上的Fmoc基团后，氨基提供了供其它氨基酸加成的起点。
或者，可将Na-三苯甲基保护基用于谷氨酸残基，偶联后，可用80％乙酸来脱除该保护基并用乙酸酐进行N-乙酰化。进一步偶联可按照以上的描述进行。
通过将脱除氨基保护基后蛋白质化的游离氨基用乙酸酐乙酰化，可引入N-末端N-乙酰基。通过使用适宜的固相合成树脂如Rink酰胺树脂可以得到C-末端甲酰胺基团。
如上所述，本发明的肽还可以用重组DNA技术，通过表达编码多肽序列的DNA进行制备。
因此，本发明还涉及主要通过调节能量消耗来调节体重的重组肽或其功能衍生物、类似物或变体。
本文所述的所有的肽作为重组肽构成了本发明的一部分。
另一方面，本发明提供制备本发明化合物的方法，该方法包括将编码所述化合物的DNA在重组宿主细胞中表达并回收产物。
含有编码化合物的核苷酸序列的DNA聚合物也构成了本发明的一部分。
可通过常规的重组技术如Maniatis等，分子克隆-实验室手册；冷泉港，1982和DNA克隆，第Ⅱ、Ⅱ和Ⅲ卷(D.M.Glover编，IRLPress Ltd)完成本发明的方法。
具体地说，该方法包括下列步骤：
ⅰ)制备能够在宿主细胞中表达DNA聚合物的复制型表达载体，所述DNA聚合物含有编码所述化合物的核苷酸序列；
ⅱ)用所述载体转化宿主细胞；
ⅲ)在可以表达所述DNA聚合物以产生所述化合物的条件下培养所述转化宿主细胞；和
ⅳ)回收所述化合物。
本发明还提供了通过缩合适宜的单-、二-或寡核苷酸单元来制备DNA聚合物的方法。
本发明通过化学法、酶促法或两种方法联用，适当的话，在体外或体内完成制备。因此，通过常规方法，如D.M.Roberts等在生物化学(Biochemistry)1985,24,5090-5098中描述的方法，用酶处理适宜的DNA片段可制备DNA聚合物。
通过用适宜限制酶消耗含所需核苷酸序列的DNA，通过化学合成，通过在DNA或RNA模板上进行酶促聚合，或通过这些方法的组合，可得到DNA片段。优选使用DNA片段的全合成。
在20-70℃，在适宜缓冲液中，优选在含0.1-10mg DNA的50毫升或小于50毫升体积中用限制酶进行消化。
按照需要，在10-37℃，在含核苷三磷酸dATP,dCTP,dGTP和dTTP的适宜缓冲液中，优选以50毫升或小于50毫升的体积，用DNA聚合酶如DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)体外完成DNA的酶促聚合。
在4℃至室温，于适宜缓冲液中，以50毫升或小于50毫升的体积，用DNA连接酶如T4 DNA连接酶完成DNA片段的酶促连接。
通过常规磷酸三酯、亚磷酸酯或氨基亚磷酸酯(phosphoramidite)化学法，用例如下列固相技术完成DNA聚合物或片段的化学合成，所述固相技术见于“蛋白质片段的化学和酶促合成-实验室手册(Chemical and Enzymatic Synthesis of ProteinFragments-A Laboratory Manual)”(H.G.Gassen and A.Lang编)，Verlag Chemie,Weinheim(1982)，或其他科学文献，例如M.J.Gait,H.W.D.Matthes,M.Singh,B.S.Sproat,and R.C.Titmas，核酸研究(Nucleic Acids Research)1982,10,6243；B.S.Sproat andW.Bannwarth，四面体通讯(Tetrahedron Letters)1983,24,5771；M.D.Matteucci and M.H.Caruthers，四面体通讯(TetrahedronLetters)1980,21,719；M.D.Matteucci and M.H.Caruthers，美国化学会志(Journal of the American ChemicalSociety)1981,103,3185；S.P.Adams等，美国化学会志1983,105,661；N.D.Sinha,J.Biernat,J.McMannus和H.Koester，核酸研究，1984,12,4539；以及H.W.D.Matthes等，EMBO杂志，1984,3,801。优选使用自动DNA合成仪。
优选通过连接两个或多个DNA分子来制备DNA聚合物，所述DNA分子都含有编码所述化合物的DNA序列。
用适宜的限制酶消化携带所需编码序列的载体可以达到DNA分子。
DNA分子的精确结构和得到所述DNA分子的方法取决于所需产物的结构。构建编码所述化合物的DNA分子之适宜策略的设计对于本领域技术人员来说是常规的。
在重组宿主细胞中表达编码所述化合物的DNA聚合物可通过在宿主细胞中能够表达所述DNA聚合物的复制型表达载体来完成。所述表达载体是新的并构成本发明的部分。
根据本发明，通过裂解与宿主细胞相容的载体以提供含有完整复制子的线性DNA，在连接条件下，将所述线性片段与一个或多个DNA分子相连，使所述DNA分子与所述线性片段一起编码所述化合物，从而制备复制型表达载体。
根据需要，可同时或连续完成线性片段和一个以上DNA分子的连接。
因此，根据需要，DNA聚合物可在载体构建的过程中预先形成或形成。
载体的选择部分取决于宿主细胞，所述宿主细胞可以是原核的，如大肠杆菌，或真核的，如小鼠C127，小鼠骨髓瘤，中国仓鼠卵巢，真菌如丝状真菌或单细胞酵母或昆虫细胞如果蝇。宿主细胞还可以是转基因动物。适宜的载体包括质粒，嗜菌体，粘粒和衍生于如杆状病毒或牛痘的重组病毒。
用用于DNA限制、聚合和连接的适宜酶，通过例如上述Maniatis等描述的方法，方便地完成复制型表达载体的制备。按上述有关DNA聚合物制备所述的方法完成聚合和连接。在20-70℃，优选(proteinrally)在50ml或少于50ml含0.1-10mg DNA的适宜缓冲液中，完成用限制酶的消化。
在转化条件下，用本发明的复制型表达载体转化宿主细胞来制备本发明的重组宿主细胞。适宜的转化条件是本领域熟知的并描述于例如上述Maniatis等的文献中，或“DNA克隆(DNA Cloning)”Ⅱ卷，D.M.Glover编，IRL出版社，1985。
转化条件的选择由宿主细胞决定。因此，可将细菌宿主如大肠杆菌用CaCl2溶液(Cohen等，国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci)，1973,69,2110)或用含RbCl,MnCl2乙酸钾和甘油的混合物组成的溶液，然后用3-[N-吗啉代]-丙烷-磺酸，RbCl和甘油处理。通过将载体DNA钙共沉淀到细胞上来转化培养中的哺乳动物细胞。
本发明还涉及含本发明化合物的载体。
本发明还涉及用本发明复制型表达载体转化的宿主细胞。
通常按照例如上述Maniatis等方法和“DNA克隆”所述，在可表达DNA聚合物的条件下培养转化的宿主细胞。因此，优选给细胞提供营养并在低于45℃培养。
根据宿主细胞，用常规方法回收表达产物。因此，若宿主细胞是细菌如大肠杆菌，可将其经物理、化学或酶促溶解，然后从所得的溶解产物中分离蛋白质产物。如果产物是从细菌细胞中分泌的，可以从壁膜间隙或营养培养基中回收。若宿主细胞是哺乳动物，可优选(proteinrally)从营养培养基中分离产物。
可将DNA聚合物组装到载体中，所述载体用于分离表达产物的稳定的转化的哺乳动物细胞系；如牛***瘤病毒载体或在中国仓鼠卵巢细胞中扩增的载体(DNA克隆，Ⅱ卷，D.M.Glover编，IRL出版社1985；Kaufman,R.J.等，分子和细胞生物学(Molecular and CellularBiology)5,1750-1759,1985；Pavlakis G.N.and Hamer,D.H.,国家科学院院报(Proceedings of the National Academy ofSciences)美国80,397-401,1983；Goeddel,D.V.等，欧洲专利申请0093619,1983)。
如果需要，可用许多技术纯化由上述方法制备的肽。优选的实施方案包括凝胶过滤、色谱法、反相HPLC和结晶法，优选使用色谱法。然后用HPLC，氨基酸分析，氨基酸定序和快原子轰击和/或电喷射质谱分析纯化产物的纯度。
通过与本文所述类似的常规方法可制备本文所述蛋白质的功能衍生物、类似物和变体。
如所说明的，本发明化合物具有有用的药物学特性。因此，还提供了作为活性治疗物质的本发明化合物。
具体地说，认为本发明化合物主要通过提高能量消耗来调节体重，因此，其在营养性和代谢性疾病、具体地说是肥胖症和糖尿病的治疗中有潜在的用途。
本发明还提供了治疗营养性和代谢性疾病的方法，所述方法包括施用有效的、药物可接受的且非毒性量的本发明化合物。
因此，本发明还提供了包含本发明化合物和可药用载体的药物组合物。
在使用中，尽管组合物的确切形式取决于给药方式，但通常将活性化合物与人或兽的药用载体、稀释剂和/或赋形剂一起以药物组合物的形式使用。例如可将活性化合物以片剂、胶囊、糖锭或糖浆剂的形式用于口服给药；以嗅剂、气雾剂或可喷雾溶液的形式用于吸入；以无菌溶液的形式用于胃肠外给药，或以乳膏、洗剂、搽剂、凝胶或喷雾剂的形式用于局部给药。胃肠外给药途径包括静脉、肌内、皮下、经皮和腹膜内给药。
还包括适用于皮下植入泵或缓释装置，经皮贴剂的上述衍生物的制剂和适用于鼻内给药的微细的粉末。
本发明化合物的给药剂量范围是对待治疗疾病产生理想效果的范围，剂量优选(proteinrally)随年龄、疾病的程度和严重性以及禁忌证(如果有的话)的不同而改变。剂量可以为0.001mg/kg/天-50mg/kg/天，但优选0.01-1.0mg/kg/天。
固体口服剂量形式可含有常规赋形剂如稀释剂例如乳糖、微晶纤维素、磷酸二钙、甘露糖醇、碳酸镁、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、山梨糖醇和碳酸钙；粘合剂如液体葡萄糖，糖浆，***胶，明胶，淀粉胶浆，甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，藻酸盐和预明胶化淀粉；崩解剂如淀粉，藻酸，微晶纤维素，果胶，交联的聚乙烯吡咯烷酮，淀粉羟乙酸钠和羧甲基纤维素钠；助流剂如滑石和二氧化硅；润滑剂如硬脂酸和硬脂酸镁；防腐剂如抗坏血酸和对羟苯甲酸甲酯或丙酯，或可药用湿润剂如十二烷基硫酸钠。
胶囊由通常是明胶的壳与其他组分如甘油，山梨糖醇，表面活性剂，不透明填料，防腐剂，甜味剂，矫味剂和着色剂组成。胶囊的内含物可包括稀释剂，润滑剂和崩解剂。片剂由压制的粉末或颗粒组成，可以是包衣或未包衣的，并且可以设计成可以使该片剂在向患者给药前溶解、分散或泡腾，或在吞咽后立即在胃肠道内溶剂或分散，或者对于包有酸不溶包衣的片剂，在经过一段时间后在胃肠道内溶剂或分散。片剂通常含有赋形剂如稀释剂、粘合剂、崩解剂、助流剂、润滑剂，并可含有着色剂和矫味剂。泡腾片优选(proteinrally)含有酸和碳酸盐或碳酸氢盐。片剂的包衣可由天然或合成树脂，胶，不溶性填充剂，糖，增塑剂，多元醇和蜡组成，并可含有着色剂和矫味剂。糖锭和锭剂用于在口腔中溶解。糖锭可以是模制或压制的，通常含有矫味基质。锭剂从明胶和甘油或***胶和蔗糖基质中模制得到。其中可以含有防腐剂以及着色剂和矫味剂。
膜包衣树脂包括纤维素衍生物、玉米醇溶蛋白、乙烯基聚合物和丙烯酸树脂，包衣组合物通常包括增塑剂如蓖麻油或甘油三乙酸酯。肠溶包衣树脂包括纤维素乙酸酯邻苯二甲酸酯以及甲基丙烯酸的共聚物。
适于口服给药的固体组合物可以通过混合、填充、造粒、压片等常规方法制得。对于使用大量填充剂的组合物，可反复进行混合操作，以使活性成分分布在整个组合物中。
适于口服给药的液体组合物可以是例如酏剂、混合物、浓缩溶液、混悬液、乳液或咳嗽药水的形式。它们可以是用于在临用前用水或其它适宜载体重新配制的干燥产物的形式。这样的液体组合物可以含有常规赋形剂如悬浮剂，例如蔗糖、山梨糖醇、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、藻酸钠、黄原胶、***胶、角叉菜胶、硬脂酸铝凝胶；乳化剂，例如卵磷脂、***胶、脱水山梨醇单油酸酯；水性或非水性载体，包括食用油、油状的酯例如甘油的酯、乙醇、甘油；缓冲剂，例如碱金属的柠檬酸盐或磷酸盐；防腐剂，例如苯甲酸钠、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；如需要，还可含有常规的矫味剂和着色剂。
该组合物还可皮下植入，例如，以压制片剂或缓释胶囊的形式皮下植入。
或者，适于注射的组合物可以是溶液、混悬液或乳液的形式，或用于在临用前溶解或悬浮在适宜载体中的干燥粉末。
液体单位剂型用化合物和无热原的无菌载体制得。根据所用的载体和浓度，化合物可以溶解或悬浮在载体中。溶液剂可用于所有的胃肠外给药形式，特别是用于静脉内注射。在制备溶液时，可将化合物溶于载体中，如需要，通过加入氯化钠将溶液调至等渗，用无菌技术通过用无菌滤器过滤进行灭菌后将其填充到适宜的无菌小瓶或安瓿中并密封。或者，如果溶液具有足够的稳定性，可将溶液在密封其的容器中通过高压釜灭菌。还可以在载体中溶解添加剂，例如缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、悬浮剂或乳化剂和/或局部麻醉剂。
用于在临用前溶解或悬浮在适宜载体中的干燥粉末可以通过将预先灭菌的药物和其它成分通过无菌技术在无菌区内填充到无菌容器中进行制备。或者，可将药物和其它成分溶解在含水载体中，将溶液通过过滤灭菌并用无菌技术在无菌区内分到适宜的容器中。然后将产物冷冻干燥并将容器无菌密封。
适于肌肉内、皮下或真皮内注射的胃肠外给药的混悬液以基本相同的方式制备，所不同的是将无菌化合物悬浮而不是溶解在无菌载体中，并且不能通过过滤进行灭菌。可将化合物以无菌状态进行分离，或可以在分离后进行灭菌，例如通过γ辐射进行灭菌。有利的是，可在组合物中加入悬浮剂如聚乙烯吡咯烷酮以促进化合物的均匀分布。
另一方面，本发明提供治疗营养和代谢性疾病的方法，该方法包括向患者施用有效、无毒量的本发明化合物。
本发明还提供本发明的化合物在生产用于治疗营养和代谢性疾病、例如肥胖和糖尿病的药物中的用途。
将本发明的化合物按照本发明的描述进行给药时，没有意想不到的毒理学作用。
以下实施例说明本发明的化合物。药理学方法：
按照下面所列方法评估本发明化合物的活性：
           Leptin片段对SD大鼠食物摄取的影响外科手术
在麻醉前，将大鼠用Synulox(0.1ml/100g)预处理约1小时，然后用Domitor(0.04ml/100g，肌肉内)和芬太尼(0.9ml/100g，腹膜内)将其麻醉。在无菌条件下，将套管趋实体性(stereotaxically)植入每个大鼠的侧脑室中。用Antisedan和Nubain(50％v/v:50％v/v0.02ml/100g)腹膜内逆转麻醉。手术后，每只大鼠接受0.05ml Zenecarp。试验方法：
试验1：手术后，在整个过程中每天监测每只动物的体重。
为了确定套管在侧室，静脉内注射血管紧张素Ⅱ(100ng/5μl)并在注射后监测水摄取5分钟。
在手术后5和6天，测量24食物摄取。在第6天，将动物根据其体重分成3组(a,b和c，每组8只大鼠)并禁食过夜。在试验当天(第7天)，按如下给大鼠进行静脉内注射：
a组-载体(PBS，磷酸盐缓冲液，5μl/大鼠)；
b组-人leptin(11.5μg/5μl)；和
c组-leptin胰蛋白酶消化产物(30μg/5μl)。
在静脉内注射过程完成后，立即给大鼠提供超过日需要的已知数量的食物。24小时后，测量食物摄取和体重。所得结果列于表1。
试验2：完全按照上述方法制备各组动物，但在禁食后试验当天，给每组大鼠注射如下成分：
a组-载体(PBS 5μl/大鼠)；
b组-人leptin(8.75μg/5μl)；
c组-鼠leptin(10μg/5μl)；
d组-ob57-74，序列VTGLDFIPGLHPILTLSK(3.33μg/5μl)；
注射后，再提供超过每日需要的量的已知数量的食物；24小时后，记录体重变化和食物消耗量。结果列于表2。结果：
表1：脑室内施用人leptin和其片段对SD大鼠体重和食物摄取的影响*P＜0.05
               24小时食物     体重变化
                 摄取(g)     (g/24小时)载体               36.68±2.5    31.44±1.2(5μl/大鼠，n=8)人-leptin          30.62±1.5*  22.88±2.05*(11.5μg/大鼠，n=8)人-leptin          34.6+1.99     23.88±1.2*胰蛋白酶消化产物(30μg/大鼠，n=8)
表2：脑室内施用人leptin、鼠leptin和leptin片段57-74(VTGLDFIPGLHPILTLSK)对SD大鼠体重和食物摄取的影响*P＜0.05
                24小时食物摄取(g)    体重变化(g/24小时)载体                32.16±0.8           30.55±0.67(5μl/大鼠，n=8)人-leptin           33.7+1.6             24.5+3.7(8.75μg/大鼠，n=8)鼠-leptin           31.3+1.7             23.7±2.18*(10μg/大鼠，n=8)leptin片段          33.6±0.9            26.8±1.2*57-74(3.33μg/大鼠，n=8)

Claims (19)

1．肽或其功能衍生物、类似物或变体，它们主要通过调节能量消耗来调节体重。
2．肽或其功能衍生物、类似物或变体，它们主要通过调节能量消耗来减轻体重。
3．根据权利要求1或2的肽，其中所述肽是ob蛋白质的片段，或其功能衍生物、类似物或变体。
4．根据权利要求1至3任一项的肽，选自下列人ob蛋白质片段：ob21-26、ob27-32、Ob33-36、ob37-41、ob42-54、ob55-56、ob57-74、ob93-105、ob106-115、ob116-149和ob150-167。
5．根据权利要求1至4任一项的肽，其中所述肽具有氨基酸序列VTGLDFIPGLHPILTLSK。
6．根据权利要求1的肽，它从权利要求4的一个或多个肽形成。
7．根据权利要求1的肽，它从权利要求4的两个连续肽成员形成。
8．合成或重组肽，它是权利要求1至7的任一肽。
9．编码权利要求1至7任一肽的核苷酸序列。
10．含编码权利要求1至7任一肽之核苷酸序列的载体。
11．用权利要求9的复制型表达载体转化的宿主细胞。
12．制备权利要求1的肽或其功能衍生物的方法，该方法包括下列步骤：
将肽水解为至少2个肽片段；
分离肽片段；此后任选地制备其功能衍生物。
13．制备权利要求1至7任一肽的方法，该方法包括在重组宿主细胞中表达编码所述肽的DNA并回收产物。
14．根据权利要求13的方法，该方法包括下列步骤：
ⅰ)制备在宿主细胞中能够表达DNA聚合物的复制型表达载体，所述DNA聚合物含有编码所需肽的核苷酸序列；
ⅱ)用所述载体转化宿主细胞；
ⅲ)在允许表达所述DNA聚合物以产生所述肽的条件下培养所述转化宿主细胞；和
ⅳ)回收所述肽。
15．含有权利要求1的化合物和可药用载体的药物组合物。
16．作为活性治疗物质的权利要求1的化合物。
17．用于治疗营养性和代谢性疾病的权利要求15的化合物。
18．治疗营养性和代谢性疾病的方法，该方法包括施用有效的药物学可接受的非毒性量的权利要求1的化合物。
19．权利要求1的化合物用于制备治疗营养性和代谢性疾病的药物的用途。
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