CN1930186A - 为获得梭菌毒素的梭菌细菌培养基及方法 - Google Patents

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Abstract

用于生产肉毒毒素的肉毒梭菌细菌的培养和发酵的不含动物产物(APF)的培养基和方法。所获得的肉毒毒素可用于配制和组合肉毒毒素药物组合物。APF培养基可包括具有显著降低的水平的肉类或乳品副产物，并使用非动物源性产物替代动物源性产物。优选地，所使用的APF培养基基本上不含或不含动物源性产物。

Description

为获得梭菌毒素的梭菌细菌培养基及方法
                        交叉引用
本申请是2003年9月25日提交的系列号为10/672,876的美国专利申请的部分继续申请，其全部内容通过引用的方式纳入本说明书。
                        背景技术
本发明涉及获得生物活性的肉毒毒素的培养基和方法。具体而言，本发明涉及生物体例如肉毒梭菌(Clostridium botulinum)细菌的基本上不含动物产物的培养基、培养物和厌氧发酵方法，以获得大量生物活性的肉毒毒素。
适用于因治疗、诊断、研究或美容的目的而给予人或动物的药物组合物可包括活性成分。该药物组合物还可包括一种或多种赋形剂、缓冲液、载体、稳定剂、防腐剂和/或填充剂。药物组合物中的活性成分可为生物学成分，例如肉毒毒素。用于制备肉毒毒素的药物组合物的肉毒毒素活性成分可通过多步的培养、发酵和组合的方法获得，该方法利用了一种或多种动物源性产物(例如用于获得原料肉毒毒素的一种或多种培养和发酵培养基中的肉汤和酪蛋白成分，和最终组合的肉毒毒素药物组合物中的血液组分或血源性赋形剂)。给予患者含有利用动物源性产物的方法得到的生物活性组分的药物组合物，可使患者具有接受摄入各种病原体或感染性制剂的潜在危险。例如药物组合物中可含有朊病毒。朊病毒是一种蛋白感染性颗粒，推测它来自产生正常蛋白的相同的核酸序列，作为异常构象的同种型而产生。进一步推测在翻译后水平的由正常同种型蛋白到朊病毒蛋白同种型的“募集反应”(“recruitmentreaction”)中存在感染性。看起来是正常的内源性细胞蛋白被诱导而错误地折叠成致病性的朊病毒构象。
克雅病(Creutzfeldt-Jacob disease)是一种罕见的神经变性病症——人类传染性海绵样脑病，其传染性因子似乎是朊病毒蛋白的一种异常同种型。患克雅病的个体可在六个月内从看上去完全健康的状态恶化为运动不能性缄默症(akinetic mutism)。因此，给予患者含有用动物源性产物获得或组合的生物组分例如肉毒毒素的药物组合物，存在感染朊病毒介导的疾病如克雅病的潜在危险。
肉毒毒素
梭菌属按照形态学和功能划分有多于127个种。厌氧性的***肉毒梭菌产生一种多肽性的强神经毒素：肉毒毒素，该毒素在人类和动物中引起被称为肉毒中毒的神经麻痹疾病。肉毒梭菌及其芽孢常见于土壤中，该细菌可在家庭式罐头工厂未适当灭菌和封闭的食品容器中生长，这可引发多种情形的肉毒中毒。肉毒中毒作用一般出现于食用了被肉毒梭菌培养物或芽孢感染的食品后18-36小时。肉毒毒素似乎可以不衰减地穿过肠内膜(lining)而攻击周围运动神经元。肉毒毒素中毒的症状可以由行走、吞咽及语言困难发展至呼吸肌麻痹和死亡。
A型肉毒毒素是已知对人类致死力最强的天然生物试剂。A型肉毒毒素(纯化的神经毒素复合物)对小鼠的LD50大约是50皮克。以摩尔计算，A型肉毒毒素的致死力比白喉毒素高1.8×109倍、比***高6×108倍、比眼镜蛇毒素高3×107倍，比霍乱毒素高1.2×107倍。Singh，Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins， Neuronal Toxings II，第四 章，63-84页，B.R.Singh等编著，Plenum Press，New York(1976)(根据0.05ngBOTOX等于1单位的事实对其中所述A型肉毒毒素的LD50为0.3ng等于1单位进行了校正)。BOTOX是Allergan公司(Irvine，California)市售的A型肉毒毒素纯化神经毒素复合物的商标。将腹膜内注射至每只重18-20克的雌性Swiss Webster小鼠的LD50定义为肉毒毒素的一个单位(U)。也就是说，杀死一群雌性Swiss Webster小鼠的50％的肉毒毒素的量为1个单位的肉毒毒素。鉴定了七种常见的免疫学上有差别的肉毒梭菌神经毒素，它们分别为肉毒神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G，其中的每一种血清型是用型特异性抗体中和来鉴别的。这些不同血清型的肉毒毒素在感染动物种类和引发***严重程度和持续时间上不尽相同。例如，用在大鼠体内产生***水平为量度，测得A型肉毒毒素的效力比B型肉毒毒素强500倍。此外还测得B型肉毒毒素在大约480U/kg的剂量时对灵长类动物是无毒的，该剂量是A型肉毒毒素对灵长类动物的LD50的12倍。肉毒毒素似乎是以高亲和力结合胆碱能运动神经元，还被移位至神经元内并阻断乙酰胆碱的突触前释放。
肉毒毒素在临床上，已用于治疗例如以骨骼肌机能亢进为特征的神经肌肉病症。美国食品药品监督管理局(U.S.Food and DrugAdministration)批准了A型肉毒毒素可用于12岁以上患者的自发性睑痉挛、斜视和偏侧颜面痉挛的治疗，颈肌张力障碍(cervical dystonia)的治疗和眉间线(面部)皱纹的治疗。FDA还批准了B型肉毒毒素可用于颈肌张力障碍的治疗。外周注射(即肌内或皮下注射)A型肉毒毒素的临床效果通常出现于在注射后的一周以内，经常出现于注射后几小时以内。单次肌内注射A型肉毒毒素后症状缓解(即肌肉麻痹松弛)的一般持续时间为大约三至六个月。
虽然所有血清型的肉毒毒素都能明显抑制在神经肌肉连接处的神经递质乙酰胆碱的释放，但它们是通过影响不同的神经分泌蛋白和/或在这些蛋白的不同位点进行切割起到抑制作用。A型肉毒毒素是一种锌内肽酶，它可特异性水解细胞内与囊泡相关的蛋白SNAP-25的肽键。E型肉毒毒素也切割这个25kDa的突触小体相关蛋白(SNAP-25)，但是与A型肉毒毒素相比，它靶向于该蛋白中的不同氨基酸序列。B、D、F和G型肉毒毒素作用于囊泡相关蛋白(VAMP，也叫小突触泡蛋白)，每种血清型切割该蛋白的不同位点。最后是C1型肉毒毒素，它表现为切割突触融合蛋白和SNAP-25。上述这些作用机制的差异影响了各种血清型肉毒毒素的相对效力和/或作用持续时间。
不论是哪种血清型，毒素中毒的分子机制似乎都差不多，都至少包含三个步骤或阶段。在该过程的第一步，毒素通过重链(H链)和细胞表面受体之间的特异性相互作用，结合到靶神经元的突触前膜；每种血清型的肉毒毒素的受体被认为是不同的。H链的羧基端片段Hc似乎对毒素至细胞表面的靶向作用十分重要。
在第二步中，毒素穿过中毒细胞的质膜。毒素首先通过受体介导的胞吞作用被细胞吞食，形成含有毒素的内含体。然后毒素从内含体逃脱至细胞的胞质中。上述的最后一步被认为是由H链的氨基端片段HN介导，它引发毒素对大约5.5或更低的pH值的反应——构象改变。已知内含体具有降低内含体内pH值的质子泵。构象改变暴露了毒素内部的疏水性残基，这使得毒素可以将自身埋入内含体膜中。然后毒素穿过内含体膜移位至胞质溶胶中。
肉毒毒素活性机制的最后一步似乎涉及连接H链和L链的二硫键的还原。肉毒梭菌和肉毒毒素的全部毒素活性都包含于全毒素的L链中；L链是锌(Zn++)内肽酶，它可选择性地切割蛋白，该蛋白对于包含神经递质的囊泡与原生质膜的胞质膜表面相识别和对接以及囊泡和质膜的融合十分重要。肉毒神经毒素——肉毒毒素B、D、F和G——引起小突触泡蛋白(也叫囊泡相关膜蛋白(VAMP))的降解，小突触泡蛋白是一种突触体膜蛋白。任何一种上述的切割事件都会导致大部分存在于突触囊泡的胞质表面的VAMP被除去。每种毒素特异性地切割不同的键。
对于所有这七种已知的肉毒毒素血清型，肉毒毒素蛋白分子的分子量都为约150kDa。有趣的是，梭菌细菌是以含有150kDa的肉毒毒素蛋白分子及一种或多种相关的非毒素蛋白的复合物的形式来释放肉毒毒素的。因此，梭菌细菌可以以900kDa、500kDa和300kDa的形式产生A型肉毒毒素复合物。B和C1型肉毒毒素似乎仅以500kDa复合物的形式产生。D型肉毒毒素以300kDa复合物和500kDa复合物的形式产生。最后，E和F型肉毒毒素仅以约300kDa复合物的形式产生。认为复合物(即分子量大于约150kDa)中包括非毒素血凝素蛋白和非毒素及非毒性非血凝素蛋白。因此肉毒毒素复合物可包括肉毒毒素分子(神经毒性成分)和一种或多种非毒性血凝素蛋白和/或非毒素非血凝素蛋白(后者可被称为NTNH蛋白)。这两种非毒素蛋白(可与肉毒分子一起组成有关的神经毒素复合物)可使肉毒毒素分子更为稳定，防止变性，并可在毒素被摄取时保护毒素抵抗消化性的酸。此外，可能较大的(大于约150kDa的分子量)肉毒毒素复合物会导致肉毒毒素从肌内注射肉毒毒素复合物的位置扩散的速度较慢。可以通过在pH7.3的条件用红细胞处理复合物，或通过使复合物经受分离过程的方式使毒素复合物解离为毒素蛋白和血凝素蛋白，所述的分离过程例如在pH约7-8的合适缓冲液中进行的柱层析。肉毒毒素蛋白在除去血凝素蛋白后就很不稳定。
由天然肉毒梭菌细菌产生的所有血清型的肉毒毒素都是无活性单链蛋白的形式，这种单链无活性蛋白必须经过蛋白酶的切割或切口才变得有神经活性。产生A型和G型肉毒梭素的细菌菌株具有内源性蛋白酶，因此A和G血清型可主要以活性形式从细菌培养物中回收。相反地，C1、D和E血清型的肉毒毒素是由非蛋白水解性菌株合成，所以从培养物中回收时通常是无活性的。蛋白水解性和非蛋白水解性的菌株均可产生血清型B和F，所以可以活性或无活性的形式被回收。然而，即使是蛋白水解性菌株，例如产生B型肉毒毒素的菌株，也只能切割一部分所产生的毒素。经切割的和未切割的分子的精确比例取决于培养时间的长度和培养物的温度。因此，例如，B型肉毒毒素的任何制剂中，可能都有一部分是无活性的，这可能能够解释所知的B型肉毒毒素的效力比A型肉毒毒素低得多。临床制剂中无活性肉毒毒素分子的存在会增加制剂的蛋白总负荷，从而导致抗原性提高而未提高临床效力。此外，还已知B型肉毒毒素在肌内注射的情况下，与同剂量水平的A型肉毒毒素相比，其活性持续时间较短，效力也较弱。
体外研究表明肉毒毒素抑制脑干组织原代细胞培养物的由钾离子诱导的乙酰胆碱和去甲肾上腺素的释放。此外，还报道过在脊髓神经元原代培养物中肉毒毒素抑制甘氨酸和谷氨酸的诱发释放，以及在脑突触体标本中肉毒毒素抑制下述每一种神经递质的释放：乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、CGRP和谷氨酸。
用于药物组合物的肉毒毒素可通过肉毒梭菌的厌氧发酵获得，所述厌氧发酵使用的是所熟知的Schantz方法的修改版(参见例如SchantzE.J.，et al.，Properties and use of botulinum toxin and other microbialneurotoxins in medicine，Microbial Rev 1992 Mar；56(1)：80-89；SchantzE.J.，et al.，Preparation and characterization of botulinum toxin type A forhuman treatment， Neurological Disease and therapy.Therapy with botulinum toxin(1994)(第三章)，Jankovic J著，New York，MarcelDekker；1994，41-49页，and；Schantz E.J.，et al.，Use of crystalline type Abotulinum toxin in medical research，in：Lewis GE Jr，ed. Biomedical Aspects of Botulism(1981)New York，Academic Press，143-50页.)。
肉毒毒素(150kDa的分子)和肉毒毒素复合物(300kDa至900kDa)可从下列公司或机构获得，例如：List Biological Laboratories，Inc.，Campbell，California；the Center for Applied Microbiology andResearch，Proton Down，U.K.；Wako(Osaka，Japan)和SigmaChemieals of St Louis，Missouri。市售的含有肉毒毒素的药物组合物包括：Allergan，Inc.，Irvine，California出售的BOTOX(纯化A型肉毒毒素神经毒素复合物和人血清白蛋白及氯化钠)(每瓶装100单位的冻干粉末，用前以0.9％氯化钠溶液重新溶解)，Ipsen Limited，Berkshire，U.K.出售的Dysport(肉毒毒素药物组合物中含纯化A型肉毒毒素血凝素复合物和人血清白蛋白及乳糖)(冻干粉末，用前以0.9％氯化钠溶液重新溶解)，和Solstice Neurosciences，San Diego，California出售(之前由Elan Corporation，Dublin，Ireland出售)的MyoBlocTM(注射用溶液，含B型肉毒毒素、人血清白蛋白、丁二酸钠和氯化钠，pH值为5.6)。
A型肉毒毒素在治疗各种临床病症方面的成功引起人们对其他血清型的肉毒毒素的关注。因此，至少A、B、E和F型的肉毒毒素已在临床上应用于人类。此外，纯(约150kDa)肉毒毒素已用于治疗人类。参见例如Kohl A et al.，Comparison of the effect of botulinum toxin A(BOTOX)with the highly-purified neurotoxin(NT 201)in the extensordigitorum brevis muscle test，Mov Discord 2000；15(Suppl 3)：165。由此，肉毒毒素药物组合物可用纯(约150kDa)肉毒毒素制备，而不使用肉毒毒素复合物制备。
已知A型肉毒毒素可溶于pH4-6.8的稀释水溶液中。在pH值大于7时，起稳定作用的非毒性蛋白从神经毒素上解离，使毒性逐渐丧失，尤其是pH值和温度升高时更是如此。Schantz E.J.，et al.，Preparationand characterization of botulinum toxin type A for human treatment(具体44-45页)，Jankovic J.，et al， Therapy with botulinum toxin(第三章)，Marcel Dekker，Inc(1994)。
与常见的酶一样，肉毒毒素(为细胞内肽酶)的生物活性至少部分依赖于其三维构象。因此，A型肉毒毒素可被热、各种化学表面延伸剂和表面干燥剂去毒。此外，还已知除非存在合适的稳定剂，否则将由已知的培养、发酵和纯化过程所得的毒素复合物稀释至用于药物组合物制剂的极低的浓度会使得毒素迅速失活。由毫克量的毒素稀释至每毫升含几纳克的溶液的过程存在很大的困难，因为在如此大稀释倍数的情况下特异性毒性会迅速消失。因为可能在含毒素的药物组合物制成的几个月或几年后才使用毒素，所以可使用例如白蛋白或明胶的稳定剂稳定毒素。
据报道，肉毒毒素已被用于各种临床处置中，包括：
(1)肌内注射(多处肌肉)每次约75-125单位的BOTOX以治疗颈肌张力障碍；
(2)肌内注射每次5-10单位的BOTOX以治疗眉间皱纹(眉沟)(肌内注射5单位至降眉间肌和肌内注射10单位至每块皱眉肌)。
(3)在***的***内注射30-80单位的BOTOX以治疗便秘。
(4)每块肌肉肌内注射1-5单位的BOTOX以治疗睑痉挛，注射上眼睑的侧睑板前眼轮匝肌和下眼睑的侧睑板前眼轮匝肌。
(5)在眼外肌肌内注射1-5单位的BOTOX以治疗斜视，注射量根据被注射肌肉的大小和所需的肌肉麻痹范围(即所需的屈光度校正量)有所变化。
(6)在五处不同的上肢屈肌肌内注射BOTOX以治疗中风后的上肢痉挛，注射量如下：
(a)指深屈肌：7.5U至30U
(b)指浅屈肌：7.5U至30U
(c)尺侧腕屈肌：10U至40U
(d)桡侧腕屈肌：15U至60U
(e)肱二头肌：50U至200U。
同一次治疗期间注射上述五处肌肉的每一处，这样患者在每一次治疗期间其上肢屈肌接受90U至360U的BOTOX的肌内注射。
(7)颅骨膜注射(对称注射至眉间肌、额肌和颞肌)25U的BOTOX以治疗偏头痛，在25U注射后三个月以内，通过对偏头痛发作频率、最严重程度、相关呕吐和急性药物使用的下降水平的测量，发现注射作为偏头疼的预防性治疗，与赋形剂治疗相比有明显的益处。
已知A型肉毒毒素的效力可最长达12个月(European J.Neurology6(Supp 4)：S111-S1150：1999)，在某些情况下可长达27个月。TheLaryngoscope 109：1344-1346：1999。然而，肌内注射BOTOX的通常持续时间一般为3至4个月。
一种市售含肉毒毒素的药物组合物以BOTOX的商标销售(由Allergan，Inc.，Irvine，California销售)。BOTOX由纯化A型肉毒毒素复合物、人血清白蛋白和氯化钠组成，灭菌、真空干燥形式包装。A型肉毒毒素由在含N-Z氨基酪蛋白和酵母提取物的培养基生长的肉毒梭菌Hall菌株产生。A型肉毒毒素复合物通过一系列酸或酸和醇沉淀方法从培养液中纯化为结晶复合物，该结晶复合物包括活性的高分子量毒素蛋白和相关的血凝素蛋白。将结晶复合物重溶于含盐和白蛋白的溶液中并过滤除菌(0.2微米)然后真空干燥。BOTOX可在肌内注射之前重新溶解于无菌、无防腐剂的盐溶液中。每小瓶BOTOX含约100单位(U)的A型肉毒毒素复合物、0.5毫克人血清白蛋白和0.9毫克氯化钠，为无菌真空干燥形式，不含防腐剂。
根据在合适大小的注射器中的合适的稀释液总量，用不含防腐剂的无菌的生理盐水(0.9％氯化钠注射液)重新溶解真空干燥的BOTOX。由于BOTOX会因气泡或类似的剧烈搅拌作用而变性，所以要将稀释液缓慢的注射至药瓶内。重新溶解的BOTOX可置于冰箱内(2°至8℃)储存，溶液为澄清的无色液体，无颗粒物。有报道称重新溶解的BOTOX可保持效力最多达30天。参见例如Guttman C.，Botox retainsits efficacy for blepharospasm treatment after freezing and storage，NewYork investigators find，Euro Times 2000 Nov/Dec；5(8)：16。真空干燥产品在冷冻箱内或低于-5℃储存。
通常，识别了四种肉毒梭菌的生理群(I、II、III、IV)。能产生不同血清型毒素的生物可来自一种以上的生理群。例如B型和F型毒素可由I群或II群的菌株产生。此外，也鉴定了能产生肉毒神经毒素的梭菌菌种其他菌株(巴氏梭菌(C.baratii)，F型；丁酸梭菌(C.butyricum)，E型；诺氏梭菌(C.novyi)，C1或D型)。
肉毒梭菌各型的生理群列于表1。
                                     表I.肉毒梭菌生理群
群   毒素血清型 生物化学   牛奶消化   葡萄糖发酵 脂酶   噬菌体及质粒   表型相关梭菌(不产毒素的)
  I   A，B，F   蛋白水解，糖分解   +   +   +   +   生孢梭菌
II B，E，F   非蛋白水解，糖分解，精神治疗 - + + +
  III   C，D   非蛋白水解，糖分解   ±   +   +   +   诺氏梭菌
  IV   G   蛋白水解，非糖分解   +   -   -   -   近端梭菌
上述各型毒素可通过从肉毒梭菌生物的适当生理群中筛选产生。指定为I群的生物通常被认为具有蛋白水解性并产生A、B和F型肉毒毒素而被提及。指定为II群的生物为糖分解性并产生B、E和F型肉毒毒素。指定为III群的生物仅产生C和D型肉毒毒素，并且因其产生大量丙酸而与I和II群相区别。IV群的生物仅产生G型肉毒毒素。
已知可使用基本上不含动物产物的特异培养基来获得破伤风毒素。参见例如美国专利6,558,926。但应注意到即使该专利公开的“不含动物产物”培养基也使用了细菌用蛋白胨——一种肉类消化物。很明显，由破伤风梭菌产生破伤风毒素和由肉毒梭菌细菌产生肉毒毒素，二者需要不同的生长、培养基和发酵参数及考虑因素。参见例如Johnson，E.A.，et al.，Clostridium botulinum and its neurotoxins：a metabolic and cellularperspective，Toxicon 39(2001)，1703-1722。
因此需要不含或基本不含动物产物(例如动物源性蛋白)的培养基和方法来获得或产生生物活性的肉毒毒素。
                        发明内容
本发明满足了上述需求并提供了用于获得或产生生物活性的肉毒毒素的不含或基本不含动物产物(例如动物源性蛋白)的培养基和方法。所获得的肉毒毒素可以用于制备肉毒毒素活性成分药物组合物。
定义
如本发明中所使用，下面提出的单词或术语具有如下定义。
“约”意为如此限定的项、参数或术语包括一个范围，该范围为所指出的项、参数或术语的值加上或减去10个百分点所构成。
“给药”或“给予”意为将药物组合物给(即给予)患者的步骤。在此公开的药物组合物为“局部给药”，具体方式例如：肌内(i.m.)、皮内、皮下给药、鞘内给药、颅内、腹膜内给药、表面(经皮肤)给药和植入(即植入例如聚合物植入物或微渗透泵的缓释装置)等常规给药方式。
“不含动物产物”或“基本上不含动物产物”分别包括“不含动物蛋白”或“基本上不含动物蛋白”，意为不含有或基本不含有血源性产物、血液混合物和其他动物源性产物或化合物。“动物”意为哺乳动物(例如人)、鸟类、爬行类、鱼类、昆虫、蜘蛛或其他动物种类。“动物”不包括例如细菌的微生物。因此，本发明范围内的不含动物产物培养基或方法或基本上不含动物产物的培养基或方法可包括肉毒毒素或肉毒梭菌细菌。例如，一种不含动物产物的方法或基本上不含动物产物的方法意为一种基本上不含动物源性蛋白或实质上不含动物源性蛋白或完全不含动物源性蛋白的方法，所述动物源性蛋白例如免疫球蛋白、肉类消化物、肉类副产物和奶或乳品产物或消化物。因此，不含动物源性产物的方法的一个实例为不含肉类和乳品的产物或肉类或乳品的副产物的方法(例如细菌培养或细菌发酵方法)。
“肉毒毒素”意为由肉毒梭菌产生的神经毒素，以及经修饰、重组、杂交和嵌合的肉毒毒素。重组的肉毒毒素可包括由非梭菌菌种重组产生的其轻链和/或重链。本发明中使用的“肉毒毒素”包括肉毒毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。本发明中使用的“肉毒毒素”还包括肉毒毒素复合物(即300、600和900kDa复合物)和纯肉毒毒素(即约150kDa的神经毒性分子)，上述两者均适用于本发明的实践。“纯化的肉毒毒素”意为与其他蛋白或杂质分离或基本分离的纯肉毒毒素或肉毒毒素复合物，所述其他蛋白或杂质可能伴随着肉毒毒素一起从培养物或发酵过程中获得。因此，除去非肉毒毒素蛋白和其他杂质的纯化的肉毒毒素纯度为至少90％，优选高于95％，最优选高于99％。肉毒C2和C3细胞毒素不是神经毒素，不在本发明的范围之内。
“梭菌神经毒素”意为梭菌细菌例如肉毒梭菌、丁酸梭菌或巴氏梭菌产生或天然具有的神经毒素及非梭菌菌种重组产生的梭菌神经毒素。
“完全不含”(即术语“由......组成”)意为在所使用的仪器或方法的检验范围内，该物质不能被检测到或不能肯定其存在。
“实质上不含”(或“实质上由......组成”)意为仅能检出痕量的该物质。
“经修饰的肉毒毒素”意为这样一种肉毒毒素，它与天然肉毒毒素相比，其氨基酸序列中至少有一处被缺失、被修饰或被置换。此外，经修饰的肉毒毒素可为重组产生的神经毒素或重组产生神经毒素的衍生物或片段。经修饰的肉毒毒素保留了天然肉毒毒素的至少一种生物学活性，例如与肉毒毒素受体结合的能力或抑制神经递质从神经元释放的能力。经修饰的肉毒毒素的一个实例是含有一种肉毒毒素血清型(例如血清型A)的轻链和另一种肉毒毒素血清型(例如血清型B)的重链的肉毒毒素。经修饰的肉毒毒素的另一个实例是与例如P物质的神经递质相偶联的肉毒毒素。
“患者”意为接受医学或兽医学治疗的人类或非人类受试者。因此，本发明的公开的药物组合物可用于治疗任何动物，例如哺乳动物。
“药物组合物”意为一种制剂，其中的活性成分可以是肉毒毒素。“制剂”一词意为药物组合物中除了神经毒素活性成分之外还含有至少一种附加成分(例如人血清白蛋白和/或氯化钠)。所以，药物组合物为一种适合对例如人类的受试者为诊断、治疗或美容而施用(即通过肌内或皮下注射或通过***贮库(depot)或植入物的方式)的制剂。该药物组合物可以是：冷冻干燥或真空干燥状态、用盐溶液或水将冻干或真空干燥的药物组合物重新溶解形成的溶液、或不需要重新溶解的溶液。活性成分可以为肉毒毒素血清型A、B、C1、D、E、F或G的一种或肉毒毒素，它们都可以由梭菌细菌天然地产生。如上所述，药物组合物可为液体或例如真空干燥的固体。药物组合物的组成成分可以包括于一种单一的组合物中(就是说除了任何必需的重溶溶液外，所有组成成分在药物组合物初始组合的时候都存在)或包括于二组分***中，例如真空干燥的组合物用稀释剂例如盐溶液重新溶解，而该稀释剂中含有在药物组合物初始组合时不存在的成分。双组分***的优点在于它可以引入成分，所述成分在长期与双组分***的第一组分共同贮存的情况下没有足够的相容性。例如，重溶赋形剂或稀释剂可含有对防止使用期间的微生物生长提供充分保护的防腐剂，所述使用期间例如一周的冷藏期，但在两年的冷冻储存期中没有防腐剂，因为在这期间它可能降解毒素。其他可能不适于与肉毒毒素或其他成分长期共存的成分，可用上述方式加入；也就是在接近使用的时候在第二赋形剂中(即在重溶溶液中)加入。组合肉毒毒素活性成分药物组合物的方法公开于美国专利公布20030118598 A1。
“基本上不含”意为存在的水平低于药物组合物重量百分比的1％。
“治疗制剂”意为可用于治疗并由此减轻病症或疾病的制剂，所述病症或疾病例如以周围肌肉的过度兴奋(即痉挛)为特征的病症或疾病。
本发明提供含有至少下降水平的动物或乳品副产物并优选基本上不含有动物或乳品副产物的培养基。“动物或乳品副产物”意为：不论是体内还是体外，在动物细胞(不包括细菌)中或由动物细胞产生的任何化合物或化合物的组合。优选的非动物来源的培养基成分例如蛋白、氨基酸和氮，包括植物、微生物(例如酵母)和合成化合物。
本发明还提供使用至少一种基本上不含动物或乳品副产物的培养基获得肉毒毒素的方法。例如，肉毒毒素可通过在基本上不含动物产物的发酵培养基中培养肉毒梭菌而获得。
本发明还包括通过在基本上不含动物产物、而含有植物源性产物的发酵培养基中培养肉毒梭菌而获得的肉毒毒素。此外，肉毒毒素还可通过在基本上不含动物产物、而含有一些基于大豆产物的发酵培养基中培养肉毒梭菌而获得。
在另一个优选实施方案中，肉毒毒素还可通过在基本上不含动物产物、而含有替换动物源性产物的水解大豆产物的发酵培养基中培养肉毒梭菌而获得。优选地，在培养基中的生长持续至至少出现细胞裂解。用于接种发酵培养基的肉毒梭菌的菌种可来自含肉毒梭菌的种子培养基。优选地，生长于种子培养基并用作发酵培养基接种物的肉毒梭菌处于其对数生长期。用于接种种子培养基的肉素梭菌的菌种可来自冻干的培养物。肉毒梭菌可以动物奶或豆奶中培养物的形式被冻干。优选地，肉毒梭菌以豆奶中培养物的形式被冻干。
本发明还提供用于培养肉毒梭菌的组合物，所述组合物包括基本上不含动物源性产物的培养基。
在一个实施方案中，该组合物构成基本上不含动物源性产物、而含有非动物来源的至少一种产物、还含有肉毒梭菌的培养基。
在另一个实施方案中，该组合物构成基本上不含动物源性产物、而含有源自植物的至少一种产物、还含有肉毒梭菌的培养基。本发明又一个实施方案可为一种组合物，构成基本上不含动物源性产物、而含有源自大豆的至少一种产物、还含有肉毒梭菌的培养基。
本发明包括通过下述步骤获得生物活性梭菌毒素(例如在APF培养基中的肉毒毒素)的方法：(1)提供发酵培养基(该培养基至少是基本上不含动物源性产物的，含有约4-8％(重量)的大豆来源产物)；(2)在可产生肉毒毒素的条件下，在发酵培养基中发酵肉毒梭菌；以及(3)从发酵培养基中回收生物活性的肉毒毒素。在此方法中，发酵培养基还可包括约0-3％(重量)的酵母提取物和约0.5-5％(重量)的葡萄糖。优选地，发酵培养基含有约1-2％(重量)的葡萄糖。进行发酵步骤的条件为：pH约5.0至5.5、时间约45小时至75小时、温度在约33°至36℃及厌氧性环境。
用于获得生物活性梭菌毒素的方法还可以(在上述步骤(1)提供发酵培养基之前)包括下述两个步骤：(a)获得基本上不含动物源性产物并含有约4-8％(重量)的大豆来源产物的培养基，和(b)在培养基中培养肉毒梭菌。
值得注意的是，在本方法中的从发酵培养基中回收生物活性的肉毒毒素的步骤(3)可以为或可包括APF纯化步骤。
用于获得生物活性梭菌毒素的方法的详细实施方案可以包括下述步骤：(a)获得基本上不含动物源性产物而含有约4-8％(重量)的大豆来源产物的培养基，并在培养基中培养肉毒梭菌；
(b)提供基本上不含动物产物的发酵培养基，该培养基包括：
(i)约4-8％(重量)的大豆来源产物，
(ii)约0-3％(重量)的酵母提取物，
(iii)约1-2％(重量)的葡萄糖，
(c)在下列可产生肉毒毒素的条件下，在发酵培养基中发酵肉毒梭菌细菌，包括：
(i)在pH约5.0至5.5的条件下进行发酵步骤，
(ii)进行发酵步骤约45小时至75小时，
(iii)在约33°-36℃的温度条件下进行发酵步骤，
(iv)在厌氧性环境中进行发酵步骤，以及；
(d)从发酵培养基中回收生物活性的肉毒毒素，其中回收步骤为APF纯化步骤。
本发明还包括用于培养或发酵肉毒梭菌的培养基，其中所述培养基基本上不含动物源性产物，而含有源自植物的蛋白产物。培养基可包括约4-8％(重量)的大豆来源产物、约0-3％(重量)的酵母提取物和约1-2％(重量)的葡萄糖。
本发明还涉及一种制备基本上不含动物产物的药物组合物的方法，所述药物组合物中的活性成分为肉毒毒素，所述方法包括下述步骤：
(a)通过以下步骤获得生物活性的肉毒毒素：
(i)提供基本上不含动物源性产物的发酵培养基；
(ii)在可产生肉毒毒素的条件下，在发酵培养基中发酵肉毒梭菌，以及；
(iii)从发酵培养基中回收生物活性的肉毒毒素，以及；
(b)使肉毒毒素与合适的赋形剂组合，由此制备基本上不含动物产物的药物组合物，所述药物组合物中的活性成分为肉毒毒素。
此外，本发明还涉及通过以下步骤获得生物活性的肉毒毒素的方法：(a)提供基本上不含动物产物、含有约4-8％(重量)的大豆来源产物的发酵培养基；(b)在发酵培养基中发酵肉毒梭菌，其中发酵培养基保持在pH约5到5.5的pH值；以及(c)从发酵培养基中回收生物活性的肉毒毒素。
最后，本发明还涉及用于培养和/或发酵肉毒梭菌细菌毒素的不含动物蛋白的培养基。优选地，培养基基本上不含动物源性产物，而含有约4-8％的大豆来源产物、约0-3％(重量)的酵母提取物和约1-2％(重量)的葡萄糖。
                        附图说明
下列附图解释或说明了本发明的一些方面。
图1的题目为“氮源(即HySoy加YE)％对比活性和pH”，本图显示按下述方法测得的肉毒毒素活性：(1)左侧Y轴小鼠致死剂量50(MLD 50)(蓝色柱)，和(2)左侧Y轴SNAP 25活性(红色柱)，不同的APF培养基经历的发酵时间示于各柱的顶端，APF培养基的pH值示于右侧Y轴的pH，APF培养基中的水解大豆和酵母提取物的％浓度(重量)示于X轴。图1中的所有培养基都含有1％(重量)的葡萄糖。
图2为概括流程图，比较了用于获得肉毒毒素的非APF方法(图2的上半部分)和本发明范围内的用于获得肉毒毒素的APF方法(图2的下半部分)的制备细胞库、培养和发酵步骤。图2省略了收获和纯化步骤。
图3是在APF发酵方法中，发酵培养基含1％(重量)的葡萄糖和1％(重量)的酵母提取物的条件下，比较了大豆蛋白浓度对A型肉毒毒素复合物产生的影响。图3中X轴代表发酵培养基中特定的水解大豆蛋白(HySoy)的重量百分比浓度，左侧Y轴代表最终纯化的肉毒毒素复合物的效力，右侧Y轴代表细胞裂解程度的百分数，细胞裂解程度按以下等式确定：
其中OD600 最大值对应于最大生长量时在600nm处测量的光密度，OD600 终点为发酵收获时的光密度。
                      具体实施方式
本发明基于下述发现：基本不含动物产物或动物副产物的培养基和方法可以用于能够产生生物活性肉毒毒素的生物(如肉毒梭菌细菌)的培养和发酵。所得的肉毒毒素可以用于制备肉毒毒素活性成分药物组合物。因此在此公开的是含有明显降低了肉类或乳品副产物水平的培养基，优选的培养基实施方案基本上不含所述的动物产物。
本发明涉及发明人的令人惊奇的发现：动物基础的产物在用于肉毒梭菌生长的培养基中并不是必需的，特别是植物基础的产物可以替代用于肉毒梭菌生长的培养基中一般使用的动物基础的产物。
现有技术中使用的用于细菌生长和发酵的培养基通常含有一种或多种动物源性成分，例如熟肉。根据本发明，优选的用于肉毒梭菌生长的培养基含有动物源性产物的量不超过培养基总重量的约5％至约10％。更优选地，本发明范围内的培养基中的动物源性产物的含量不超过培养基总重量的1％至小于5％。最优选地，所有用于生产肉毒毒素的肉毒梭菌生长的培养基和培养物完全不含有动物源性产物。上述培养基包括但不限于用于肉毒梭菌的小规模和大规模发酵的培养基、用于接种于种子(第一)培养基的肉毒梭菌的培养物生长的培养基和发酵(第二)培养基、以及用于长期储存肉毒梭菌培养物(例如原种培养物)的培养基。
在本发明的某一个优选实施方案中用于肉毒梭菌生长和肉毒毒素生产的培养基可包括大豆基础的产物以替代动物源性产物。或者，可以使用平原羽扇豆(Lupinus campestris)的脱苦味的种子替代大豆基础产物。已知平原羽扇豆的蛋白含量与大豆十分接近。优选地，上述培养基包括水解的和可溶于水的大豆或平原羽扇豆来源产物。但是，不溶性的大豆或平原羽扇豆产物也可以用于本发明以替代动物产物。可用大豆或平原羽扇豆产物替代的常见动物产物包括：牛心浸液(BHI)、动物源性胨产物例如细菌用蛋白胨、水解酪蛋白和乳品副产物例如动物奶。
优选地用于肉毒梭菌生长的含大豆基础或平原羽扇豆基础的产物的培养基与通常使用的含动物源性产物的相似，只是基本所有的动物源性产物均被植物源性产物所替代。例如，大豆基础发酵培养基可包括大豆基础产物、碳源例如葡萄糖、盐例如NaCl和KCl、含磷酸盐成分例如Na2HPO4、KH2PO4、二价阳离子例如铁和镁、铁粉和氨基酸例如L-半胱氨酸和L-酪氨酸。用于接种(即接种或第一培养基)发酵(第二)培养基的肉毒梭菌的培养物生长的培养基，优选地至少含有大豆基础产物、盐源例如NaCl和碳源例如葡萄糖。
本发明提供用于最大化肉毒毒素产量的肉毒梭菌的生长方法，所述方法使用基本上不含动物产物的培养基。用于生产肉毒毒素的肉毒梭菌的生长可通过在含有替代动物源性产物成分的大豆副产物的培养基中的发酵而发生。发酵培养基的接种菌可以来源于小规模生长培养基(种子培养基)。根据发酵步骤的大小和体积，种子培养基中的为提高菌体量的连续生长步骤的数目可能变化。为培养用于接种发酵培养基的肉毒梭菌的合适的量，可以在种子培养基中进行包括一步或多步的生长步骤。对于不含动物产物的培养肉毒梭菌的方法来说，优选地肉毒梭菌的生长从储存于非动物来源的培养基的培养物开始。储存培养物，优选为冻干的储存培养物通过在含有大豆来源蛋白和缺少动物副产物的培养基中的生长产生。肉毒梭菌在发酵培养基中的生长可以通过储存的冻干培养物直接接种而发生。
在本发明优选的实施方案中，肉毒梭菌的生长经过两个时期——种子生长和发酵。这两个时期均在厌氧性环境下进行。种子生长期通常用于从储存培养物“放大”微生物数量。种子生长期的目的是使微生物的数量增加至可用于发酵。此外，种子生长期使得储存培养物中相对休眠的微生物恢复活力并生长为活性生长的培养物。而且，用活性生长的培养物比用储存培养物能够更精确地控制用于接种发酵培养物的成活微生物的体积和数量。因此，用于接种于发酵培养基的种子培养物的生长是优选的。此外，可以使用涉及种子培养基中生长的任何次数连续步骤的生长以放大用于接种发酵培养基的肉毒梭菌数量。应注意到肉毒梭菌在发酵期中的生长是可以通过直接接种而直接从储存培养物开始的。
在发酵期中，使用含有来自种子生长的肉毒梭菌的一部分种子培养基或全部种子培养基来接种发酵培养基。优选地，使用约2-4％的含有来自种子生长的肉毒梭菌的种子培养基来接种发酵培养基。利用发酵在大规模厌氧环境下生产最大量的微生物(Ljungdahl et al.，Manual ofindustrial microbiology and biotechnology(1986)，Demain等著的American Society for Microbiology，Washington，D.C.84页)。
肉毒毒素的分离和纯化可以使用蛋白纯化领域的普通技术人员所熟知的方法进行。参见例如Coligan et al.，Current Protocols in ProteinScience，Wiley & Sons；Ozutsumi et al.Appl.Environ.Microbiol.49；939-943：1985。
为了生产肉毒毒素，可使肉毒梭菌的培养物在用于接种发酵培养基的种子培养基中生长。涉及在种子培养基中生长的连续步骤的数目根据在发酵期肉毒毒素的生产规模可有所不同。然而，如前所述，发酵期的生长可以直接由储存培养物的接种开始。用于肉毒梭菌生长的通常的动物基础种子培养基包括BHI、细菌用蛋白胨、NaCl和葡萄糖。如前所述，备选种子培养基可根据本发明制备，其中的动物基础组分被非动物基础组分替代。例如但不限于：在用于肉毒梭菌生长和肉毒毒素生产的培养基中，大豆基础的产物可以替代BHI和细菌用蛋白胨。虽然肉毒梭菌培养物可以在含有不溶性大豆的培养基中生长，优选地，该大豆基础的产物可溶于水并包括水解大豆。但是在来源于可溶性大豆产物的培养基中的生长水平和后续的毒素产量更高。
根据本发明可使用任何来源的大豆产物。优选地，大豆为水解大豆，并且水解使用非动物酶进行。各种来源的水解大豆可从许多商业售主那里获得。上述大豆的来源包括但不限于：Hy-Soy(Quest international)、Soy胨(Gibco)、Bac-soytone(Difco)、AMISOY(Quest)、NZ soy(Quest)、NZ soy BL4、NZ soy BL7、SE50M(DMV InternationalNutritionals，Fraser，N.Y.)和SE50MK(DMV)。最优选地，水解大豆的来源为Hy-Soy或SE50MK。水解大豆的其他潜在来源是已知的。
根据本发明Hy-Soy在种子培养基中的浓度范围为25-200g/L。优选地，Hy-Soy在种子培养基中的浓度范围为50-150g/L。最优选地，Hy-Soy在种子培养基中的浓度为约100g/L。此外，NaCl的浓度范围为0.1-2.0g/L。优选地，NaCl的浓度范围为0.2-1.0g/L。最优选地，NaCl在种子培养基中的浓度为约0.5g/L。葡萄糖的浓度范围为0.1g/L-5.0g/L。优选地，葡萄糖的浓度范围为0.5-2.0g/L。最优选地，葡萄糖在种子培养基中的浓度为约1.0g/L。本发明还优选但非必需的是将葡萄糖与种子培养基的其他组分一起高压灭菌。在生长前种子培养基的pH水平可为7.5-8.5。例如，在肉毒梭菌的生长前种子培养基的pH可为约8.1。
肉毒梭菌在种子培养基中的生长可以分一个或多个阶段进行。优选地，在种子培养基中的生长分两个阶段进行。在阶段一，将肉毒梭菌悬于一定量的培养基中，并在厌氧性环境下、在34±1℃、培养24-48小时。优选地，阶段一的生长进行约48小时。在阶段二，将含有肉毒梭菌的一部分或全部的阶段一培养基接种到阶段二种子培养基上进一步生长，接种后的阶段二培养基也在厌氧性环境下、在34±1℃、培养约1-4天。优选地在阶段二种子培养基中的生长进行约3天。还优选在用种子培养基中的最后的生长物接种发酵培养基之前，在任一阶段的种子培养基中的生长都不导致细胞裂解。
用于肉毒梭菌生长的含动物副产物的标准发酵培养基基于Mueller和Miler的配方(MM；J.Bacteriol.67：271，1954)。含有动物副产物的MM培养基中的成分包括BHI和NZ-CaseTT。NZ-CaseTT为一种市售肽和氨基酸源，它源自酪蛋白的酶消化物，为存在于动物奶中的一群蛋白质。本发明证实非动物基础产物可以在发酵培养基中替换BHI和NZ-CaseTT。例如但不限于大豆基础产物可以替换用于肉毒梭菌发酵的MM培养基的动物基础组分。虽然如前所述，不溶性大豆产物可以用于实践本发明，但优选地该大豆基础产物为水溶性的并源自水解大豆。
根据本发明均可使用任何来源的大豆基础产物，优选地，水解大豆从Quest International(Sheffield)公司获得，其商品名为Hy-Soy，或者从DMV International Nutritionals(Fraser，N.Y.)公司获得，其商品名为SE50MK。可溶性大豆产物还可从包括但不限于下列的来源获得：Soy胨(Gibco)、Bac-soytone(Difco)、AMISOY(Quest)、NZ soy(Quest)、NZ soy BL4、NZ soy BL7和SE50MK(DMV InternationalNutritionals，Fraser，N.Y.)。
在本发明的另一个优选实施方案中，用于发酵肉毒梭菌的培养基不含动物副产物，而含有水解大豆、葡萄糖、NaCl、Na2HPO4、MgSO47H2O、KH2PO4、L-半胱氨酸、L-酪氨酸和粉末状铁。如同公开的种子培养基一样，水解大豆可以替代发酵培养基中的动物副产品。这些动物副产品包括BHI和NZ-CaseTT(酶消化的酪蛋白)。
Hy-Soy在用于生产肉毒毒素的发酵培养基中的浓度范围优选地为约10-100g/L。优选地Hy-Soy的浓度为约20-60g/L。最优选地Hy-Soy在发酵培养基中的浓度为约35g/L。为获得肉毒毒素的最大产量，特别优选的发酵培养基中的各组分浓度约为：7.5g/L的葡萄糖、5.0g/L的NaCl、0.5g/L的Na2HPO4、175mg/L的KH2PO4、50mg/L的MgSO47H2O、125mg/L的L-半胱氨酸和125mg/L的L-酪氨酸。粉末状铁的用量范围可在50mg/L至2000mg/L，优选地，粉末状铁的用量范围为约100-1000mg/L。最优选地，粉末状铁在发酵培养基中的用量范围为约200mg/L至600mg/L。
为获得毒素产量的最佳水平，大豆基础发酵培养基的初始pH值(高压灭菌前)优选地在约5.0至7.1。发现pH控制增加了肉毒毒素回收率。优选地发酵培养基的初始pH值约为7。如实施例7中所解释的，发现如果pH值下降并保持于5-5.5，则可获得稳定肉毒毒素的高产率。如同在种子培养基中的描述一样，优选地，将包括葡萄糖和铁的发酵培养基各组分一起高压灭菌。
优选地将用于肉毒梭菌生长的一部分第二阶段种子培养基接种发酵培养基。在厌氧箱中于34±1℃进行发酵约7至9天。细菌生长可以通过测量培养基的光密度(O.D.)来监测。发酵优选在出现细胞裂解后至少48小时以后停止，细胞裂解可由生长测量法(光密度)测定。当细胞裂解时，培养基的O.D.下降。
在本发明的一个优选实施方案中，用于肉毒梭菌长期储存和种子培养基接种的肉毒梭菌培养物在豆奶中生长并冻干后储存于4℃。在动物奶中冻干以备保存的肉毒梭菌培养物也可以用于生产肉毒毒素。但是为保持在整个肉毒毒素的生产过程中培养基基本上不含动物副产物，优选将肉毒梭菌的初始培养物保存于豆奶中而不是动物奶中。
                      实施例
下述实施例说明了本发明所涉及的具体方法，并非意在限制本发明的范围。肉毒梭菌培养物可从各种来源获得，包括List Laboratories，Campell，California。在下述的所有实施例中，“肉毒梭菌”指的是A型肉毒梭菌的Hall A(ATCC命名号3502)菌株。
实施例1：用于肉毒梭菌的不含动物产物的种子培养基的制备
使用下述成分制备对照种子培养基，每升培养基含：NaCl(5g)、细菌用蛋白胨(10g)、葡萄糖(10g)、BHI(至1升)，pH8.1(用5N NaOH调节)。
使用下述成分制备试验用(不含动物产物)培养基，每升培养基含：NaCl(5g)、大豆蛋白胨(10g)、葡萄糖(10g)、Hy-Soy(35g/L，制成1升培养液)，pH8.1(用5N NaOH调节)。
实施例2：在不含动物产物的种子培养基中培养肉毒梭菌
可将肉毒梭菌的冻干培养物分别悬浮于1ml的实施例1中的对照种子培养基和试验用种子培养基中，(将每一种子培养基)分成两管，每管分别含有10ml种子培养基，然后在34℃培养约24-48小时。然后可用1ml的培养物接种于(分别)含40ml种子培养基的125ml DeLongBellco培养瓶中。接种培养物可置于Coy厌氧箱(Coy LaboratoryPruducts Inc.，Grass Lake，Mich.)中，于33℃±1℃培养24小时。
实施例3：用于肉毒梭菌的不含动物产物的发酵培养基的制备
可使用下述成分制备基础发酵培养基，每两升培养基含：葡萄糖(15g)、NaCl(10g)、Na2HPO4(1g)、KH2PO4(0.350g)、MgSO47H2O(0.1g)、半胱氨酸-HC(0.250g)、盐酸酪氨酸(0.250g)、粉末状铁(1g)、ZnCl2(0.250g)和MnCl2(0.4g)。
可使用下述成分制备对照发酵培养基，每两升培养基含：BHI(500ml；这相当于45.5克的干重牛心浸液)、NZ-CaseTT(30g)和基础培养基(至2升)，pH6.8。
可以先制备基础发酵培养基并调节其pH值至6.8。然后制备牛心浸液(BHI)并用5N NaOH调节其pH值至8。然后可将BHI加至基础培养基中。再准备NZ-CaseTT。然后将NZ-CaseTT加到已加入牛心浸液的基础培养基中，并通过加入HCl使其溶解。然后可用5N NaOH调节pH值至6.8。然后将培养基分装至16个100mm试管中，每管8ml，然后在120℃高压灭菌25分钟。
试验用发酵培养基(不含动物产物)可通过用试验氮源替换对照培养基中存在的BHI而制备。合适的试验发酵培养基氮源包括：Hy-Soy(Quest)、AMI-Soy(Quest)、NZ-Soy(Quest)、NZ-Soy BL4(Quest)、NZ-Soy BL7(Quest)、Sheftone D(Sheffield)、SE50M(DMV)、SE50(DMV)、SE50MK(DMV)、Soy Peptone(Gibco)、Bacto-Soyton(Difco)、Nutrisoy 2207(ADM)、Bakes Nutrisoy(ADM)、Nutrisoyflour、Soybean meal、Bacto-Yeast Extract(Difco)、Yeast Extract(Gibco)、Hy-Yest 412(Quest)、Hy-Yest 441(Quest)、Hy-Yest 444(Quest)、Hy-Yest 455(Quest)、Bacto-Malt Extract(Difco)、CornSteep和Proflo(Traders)。
试验发酵培养基可以按照上述的对照培养基的方法制备，不过不加入BHI并且先用3N HCl或5N NaOH调节相关的氮源pH值至6.8。可将培养基分装至16个100mm试管中，每管8ml，然后在120℃高压灭菌20-30分钟。
实施例4：肉毒梭菌在不含动物产物的发酵培养基中的生长
可将40μl的试验种子培养基培养物(不含动物产物)用于接种每一管16×100mm试管中的8ml的对照或试验发酵培养基等分试样。培养物可置于33±1℃培养24小时。然后可将试管置于厌氧箱中培养以使细菌生长。每一次培养基分析可平行进行三份(即，在同样的培养基中包含三次独立的接种)，还可包括一个作为分光光度计上的空白的未接种对照。可使用Turner分光光度计(型号330)在660nm处每24小时测量生长(用光密度OD测定)。在细胞裂解持续大约48小时之后可停止培养，然后测定肉毒毒素产量。
可使用含下列成分的Hy-Soy发酵培养基进行附加的试验，每500ml培养基含：Hy-Soy(17.5g)、葡萄糖(3.75g)、NaCl(2.5g)、Na2HPO4(0.25g)、MgSO47H2O(0.025g)、KH2PO4(0.0875g)、L-半胱氨酸(0.0625g)、L-酪氨酸(0.0625g)、粉末状铁(0.25g)、pH 6.8。
      实施例5：在不含动物产物的发酵培养基中生长的
              肉毒梭菌的肉毒毒素的产量测定
可离心实施例4中的培养细胞，然后测定上清液的pH值。给定样品中的肉毒毒素水平可以通过加入标准抗毒素并测量出现絮凝作用所需时间来测定。可以测定Kf(出现絮凝作用所需时间，以分钟计)和Lf(絮凝作用的限度；相当于1国际单位的标准抗毒素，以絮凝作用测定)。从给定培养物的每一发酵物试管中取4ml发酵培养基，并将其混合于15ml离心管中，这样总体积为12ml。将试管以5000rpm(3400g)、4℃离心30分钟。可将1ml上清液的等分试样加入到含有0.1-0.6ml标准肉毒毒素抗血清的试管中，然后小心振荡试管以混合内容物。然后可将试管置于45±1℃的水浴中，并记录初始时间。可经常检查试管并将絮凝作用开始的时间记录为Kf。絮凝作用最先开始的那一管中的毒素浓度可被命名为LfFF。絮凝作用第二开始的管中的毒素浓度可被命名为LfF。
可在下列培养基中进行平行的发酵、生长和毒素产量分析：(1)对照种子培养基(用于接种对照发酵培养基)和对照发酵培养基；和(2)试验种子培养基(不含动物产物、用于接种于试验发酵培养基)和试验发酵培养基(不含动物产物)。值得注意的是，可以测得在不含动物产物的培养基中的肉毒梭菌的发酵以及从也不含动物产物(使用大豆来源产物替代动物产物)的培养物中的接种会导致近似为50或更多的Lf毒 素。最小的Lf毒素约等于10。优选的Lf毒素至少为20。最优选的Lf毒素大于50。
此外，还可测得不同的大豆产物在缺少BHI的发酵培养基中可以支持肉毒梭菌的生长。因此，可溶性的大豆产物可以替代BHI用于肉毒梭菌的生长。最佳的浓度可为12.5或25g/L。Hy-Soy(Sheffield)可提供最高量的生长。不溶性的大豆产物效率可能低一些。
而且，所得的结果显示在替代BHI用于肉毒梭菌生长的能力方面，Quest Hy-Soy、DMV SE50MK和Quest NZ-Soy可能是有效的大豆产物。结果可以显示最适用于生长的大豆产物(例如Quest Hy-Soy、DMVSE50MK和Quest NZ-Soy)可以有效地替代BHI用于毒素生产。用于毒素生产的最佳的大豆产物可为22.75g/L的Quest Hy-Soy。更高浓度的该产物可能产生更好的生长，但不能提高毒素产量。提出了用SE50MK也可以得到类似的结果，更高的浓度可能使生长增加但不能提高毒素产量。另一方面，NZ-Soy在其更高浓度时可能提供更好的生长和更高的毒素产量。
最后，测得大豆产物可有效地替代BHI和NZ-CaseTT。从大豆基础培养基中去除NZ-CaseTT会使生长降低2-4倍。在NZ-CaseTT存在和不存在的条件下，用于生长的最佳大豆产物可为SE50MK。Hy-Soy可替代BHI和NZ-CaseTT用于毒素生产。然而发酵循环可能需要延长至1或2天。在培养基中HY-Soy可替代BHI和NZ-CaseTT用于毒素生产。然而可以测得酵母提取物可能抑制毒素生产。
可以测得HY-Soy在22.75g/L时可完全替代BHI和NZ-CaseTT用于毒素生产。56.88g/L的HY-Soy对于生长的效果可能是最佳的，与此不同，34.13g/L的HY-Soy对于毒素生产时期的效果可能是最佳的。
因此，令人惊奇的测定了培养基中Hy-Soy或[Hy-Soy+Hy-Yest]是否可以替代BHI和细菌用蛋白胨用于肉毒梭菌的种子生长。此外，可以设计试验以测定在种子培养基中使得肉毒梭菌的肉毒毒素产量达到最高水平的最佳组分浓度。在不含BHI和NZ-CaseTT的种子培养基和发酵培养基中生长的肉毒梭菌的毒素产量可以达到或超过在含有BHI和NZ-CaseTT的培养基中所得的毒素产量。
可以测定用于在种子培养基中生长的Hy-Soy或[Hy-Soy+Hy-Yest]的最佳浓度。试验可以证实，Hy-Soy可以替代BHI和细菌用蛋白胨作为氮源用于肉毒梭菌在种子培养基中的生长，以及用于在随后的发酵期中的肉毒毒素的生产。并且，Hy-Soy作为种子培养基中的氮源，与[Hy-Soy+Hy-Yest]相比可在后续的发酵步骤中产生更高水平的肉毒毒素。提供最高毒素水平的种子培养基中的Hy-Soy的浓度范围约为62.5g/L至100g/L。
可以设计附加的试验以测定在种子培养基中使得肉毒梭菌发酵产生的肉毒毒素产量达到最高水平的Hy-Soy的最佳浓度。由此，种子培养基中30g、50g、75g和100g的Hy-Soy均可使肉毒梭菌发酵产生的肉毒毒素产量接近或超过在含有BHI和细菌用蛋白胨作为氮源的培养基中所得的肉毒毒素水平。
发现了种子培养基中100g/L的Hy-Soy的浓度可导致在后续的发酵步骤中毒素产量的最高水平。此外，数据显示Hy-Soy种子培养基的种子步骤-1在48小时后比在24小时后产生了更多的生长。
         实施例6：用于获得肉毒毒素的非APF方法
通过肉毒梭菌细菌的发酵获得了梭菌毒素，因此按下述步骤实行了改良的Schantz(非APF)方法以获得高效力和高度纯化的肉毒毒素(即原料毒素(bulk toxin))。改良的Schantz(非APF)方法可提供高产量的肉毒毒素。Schantz方法和改良的Schantz方法在所有发酵培养基中均使用了酪蛋白。
原种培养物的制备
从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，Manassas，Virginia可以获得各种梭菌细菌。或者，可通过分离各种来源的肉毒梭菌制备肉毒梭菌细胞库瓶(cell bank vial)，所述来源包括土壤或腐烂动物尸体的深度采样(在厌氧性或准厌氧性部位)。通常，可从诊断为肉毒中毒的患者的生理液体(即创伤肉毒梭菌中毒患者的伤口擦拭物)的样品中获得肉毒毒素。图1的上半部分概括了用于制备细胞库瓶和用于肉毒毒素的培养和发酵的非APF方法。
将从天然或患者来源获得的肉毒梭菌在血琼脂平板上培养，然后将高生长菌落接种至细胞库瓶培养基中。用于肉毒梭菌的细胞库瓶培养基为含有新鲜碎牛肉的熟肉培养基。将活跃生长的培养物与甘油混合以制备肉毒梭菌细菌的细胞库瓶(即原种培养物)，将其冷冻以备后用。
种子培养
将肉毒梭菌细胞库瓶在室温下融化，然后进行下列4个培养步骤。(1)为了选择合适形态的菌落，从融化的细胞库瓶取等分试样，通过在预还原Columbia血琼脂平板上的细菌划线进行培养，在34℃±1℃的条件下厌氧性培养30-48小时。(2)然后，将选出的菌落接种于含酪蛋白生长培养基的试管中，于34℃培养6-12小时。然后将具有最快生长速度和最高密度(生长筛选步骤)的试管中的内容物通过下述两个扩大厌氧性培养步骤培养：(3)在1升的种子培养瓶中于34℃进行12-30小时的第一次培养，接着(4)在25升含酪蛋白生长培养基的种子发酵罐中于35℃进行6-16小时的第二次培养。上述两个扩大培养步骤在含有如下成分的营养培养基中进行：2％酪蛋白水解酶(酪蛋白[奶蛋白质]消化物)、1％酵母提取物和1％葡萄糖(右旋糖)，溶于水，pH7.3。
发酵
在扩大培养后进行进一步的培养，所述培养在35℃、在商业规模(即115升)发酵罐中、含酪蛋白培养基中、在受控厌氧性环境的条件下进行60-96小时。细菌的生长通常在24至36小时后完成，并且在60-96小时的发酵过程中大多数细菌经过裂解并释放肉毒毒素。在Schantz方法或改良的Schantz方法中不需要对发酵培养基的pH值进行控制。认为毒素通过细胞裂解释放，由存在于培养发酵液中的蛋白酶激活。视情况所需，可以使用单层厚度滤器对该培养基进行过滤除去粗大的杂质(即完整的和破裂的细胞)，以获得称为澄清培养物的澄清溶液。
收获
可通过在20℃用硫酸降低pH值至3.5以沉淀粗制毒素实现毒素的收获。然后将粗制毒素通过超微过滤然后渗滤而浓缩。
纯化
将收获的粗制毒素转移至消化容器中，并加入蛋白酶抑制剂盐酸苯甲脒以稳定毒素。加入DNA酶和RNA酶以消化核酸。含毒素的物质经过UF/DF和三个沉淀步骤(冷乙醇、盐酸和硫酸铵沉淀)。纯化的肉毒神经毒素复合物(原料毒素)以在磷酸钠/硫酸铵缓冲液中的悬液形式储存于2-8℃。
所得的原料毒素为高质量的结晶型900kDA型肉毒毒素复合物，它由肉毒梭菌的HallA菌株产生、具有≥3×107U/mg的特异效力、小于0.60的A260/A278值和在凝胶电泳上的独特条带形式，并且它适用于肉毒毒素药物组合物的组合。
组合可能涉及如下步骤：原料毒素的多倍稀释，与一种或多种赋形剂(例如白蛋白和氯化钠)混合以形成毒素组合物，和以低压冻干、冷冻干燥或真空干燥组合物的方法制备对储存和装运稳定的组合物形式。
由Schantz方法或改良的Schantz方法得到的纯化的肉毒毒素复合物可以用pH 7-8的缓冲液从离子交换柱上洗脱，以使非毒素复合蛋白与肉毒毒素分子解离，从而得到(取决于发酵的肉毒梭菌的类型)：近似150kD分子量、特异效力为1-2×108LD50U/mg或更高的纯的A型肉毒毒素；或近似156kD分子量、特异效力为1-2×108LD50U/mg或更高的纯化B型肉毒毒素；或近似155kD分子量、特异效力为1-2×107LD50U/mg或更高的纯化F型肉毒毒素。
      实施例7：用于获得肉毒毒素的APF培养基和方法
本实施例阐明了一种为获得高效力和高纯度A型肉毒毒素(即原料毒素)而进行的APF方法。该方法可用于肉毒毒素的其它血清型。
原种培养物制备
如实施例6所述，肉毒梭菌可从ATCC、各种天然来源或肉毒中毒的患者处获得。图2的下半部分概括了用于制备细胞库瓶和用于肉毒毒素的培养和发酵的APF方法。通过在植物琼脂平板上培养肉毒梭菌制备APF细胞库瓶。将大豆来源HySoy(Quest)和酵母提取物和葡萄糖按3∶1∶1(重量百分比)的比例与琼脂混合并使其凝固而制备植物琼脂平板。其他市售的APF琼脂平板和用于制备平板的脱水粉末也认为是适用的。将选出的高生长菌落接种至APF细胞库瓶培养基中。所用的APF细胞库瓶培养基含有同样3∶1∶1比例的水解大豆蛋白、酵母提取物(在酵母培养或由此制备的酵母提取物的制备方法中均不使用动物产物)和葡萄糖。其它的营养物比例(即6∶1∶1、6∶0∶1和6∶3∶1)也认为是适用的。所用的水解大豆(HySoy)和酵母提取物(HyYest)浓缩物从Quest International公司获得。将APF培养基中的肉毒梭菌培养物与甘油混合、等分至冷冻瓶中冷冻以备后用。所研制的APF培养基可用于储存肉毒梭菌细菌一年或更久而不丧失活力。这些在冷冻瓶中的冷冻培养物和甘油的混合物就是APF细胞库瓶。
种子培养
将APF细胞库瓶在室温下融化，然后进行一步培养：用APF细胞库瓶的内容物直接接种(即不***血琼脂培养或试管生长步骤)于一升种子培养瓶中，使用相同的培养基(APF细胞库瓶[储存]培养基可以与APF发酵[生长]培养基不同)并保持于35℃、初始的培养基pH为7.0、厌氧环境(氮气)中培养15至24小时。
发酵
接着将种子瓶培养物转移至含有APF培养基的商业规模的10升生产发酵罐中，保持于35℃、初始的培养基pH为7.0、厌氧环境(氮气)中培养52-72小时。在发酵开始约15个小时以后(培养物的pH自然地降低到6.0以下)，通过将HCl加至培养物中而开始pH控制程序，使pH范围在5.0-5.5。发现为了获得活性肉毒毒素令人满意的产量，有必要将APF发酵培养基的pH控制在一个窄范围以内。由此发现将pH值控制在pH 5.0至5.5基本上防止了肉毒毒素的降解和效力损失。认为在发酵过程中大多数细胞都经过裂解并释放肉毒毒素，并且由细胞裂解释放的毒素被存在于培养发酵液中的蛋白酶激活。使用单层厚度滤器对该培养基进行过滤除去粗大的杂质(即完整的和破裂的细胞)并得到称为澄清培养物的澄清溶液。
收获
肉毒毒素的收获可按照实施例6进行(即硫酸沉淀，接着用微滤和渗滤浓缩)。
纯化
毒素的纯化可按照实施例6所述进行，即：加入盐酸苯甲脒和DNA酶和RNA酶，硫酸沉淀，冷乙醇沉淀，磷酸盐缓冲液提取，盐酸沉淀，磷酸盐缓冲液提取和原料毒素储存。
作为实施例6的收获和纯化步骤的备选方案，也可以进行柱层析步骤。
所得的原料毒素为高质量的结晶型900kDA型肉毒毒素复合物，它由肉毒梭菌的Hall A菌株产生、具有≥3×107U/mg的特异效力、小于0.60的A260/A278值和在凝胶电泳上的独特条带形式，并且它适用于肉毒毒素药物组合物的组合。因此，用于肉毒毒素的APF方法可以生产高质量的毒素。
由APF方法得到的纯化的肉毒毒素复合物可以用pH 7-8的缓冲液通过离子交换柱并从柱上洗脱，以使非毒素复合蛋白与肉毒毒素分子解离，从而得到(取决于发酵的肉毒梭菌的类型)：近似150kD分子量、特异效力为1-2×108LD50U/mg或更高的纯化肉毒毒素；或近似156kD分子量、特异效力为1-2×108LD50U/mg或更高的纯化B型肉毒毒素；或近似155kD分子量、特异效力为1-2×107LD50U/mg或更高的纯化F型肉毒毒素。例如，使用本发明的APF培养基可得到肉毒毒素特异效力为1.02×108LD50U/mg的A型肉毒毒素复合物。
在本实施例7中，使用了含1％(重量)或2％(重量)葡萄糖的APF培养基(注意1％(重量)葡萄糖意为每100ml培养基有1g葡萄糖，2％(重量)葡萄糖意为每100ml培养基有2g葡萄糖)，并测得在1％葡萄糖的APF培养基中，最大细菌生长(以培养物的峰值光密度[于600nm处测量光密度]测定)出现于发酵后约20小时，而在2％葡萄糖的APF培养基中，最大细菌生长出现于发酵后约40小时，但是在培养基的葡萄糖含量如此变化的情况下，它们的峰值光密度并无明显不同。认为在1％葡萄糖APF培养基中，在发酵55小时后细胞自溶和毒素释放导致活性肉毒毒素的最大含量(以对活性毒素的SNAP-25分析测定)，但是在2％葡萄糖APF培养基中，在培养基中的活性肉毒毒素的含量出现得晚一些(以对活性毒素的SNAP-25分析测定)，并且在发酵65小时以后仍旧增加。因此，较快的毒素释放发生于使用较低含量(1％)葡萄糖的APF培养基时，这表明在使用较低含量(1％)葡萄糖的APF培养基时，可能进行了较有效的毒素生产过程(即每单位时间得到较多的毒素)。
如图1所示，还测得使用APF培养基生产肉毒毒素的最佳参数为以下参数的组合：(1)APF发酵培养基中约6％(重量)的水解大豆浓缩物(图1中的“HySoy Conc.”)。6％大豆意为每100ml培养基含6g大豆蛋白；(2)APF发酵培养基中约0％至3％的酵母提取物浓缩物(图1中的“YE Conc.”)；(3)在33-35℃的温度下，厌氧性(氮气环境)条件下进行50-72小时的发酵；(4)在初期的细胞生长后，整个发酵过程中发酵培养基的pH保持于pH 5.0至5.5，和(5)APF发酵培养基中含1％(重量)葡萄糖。
因此，如图1所示，当APF培养基中存在较多的蛋白(以HySoy和YE的总量计)时，培养基的pH趋于升高并使得毒素稳定性较低，当培养基中总的蛋白营养含量相同而pH值降低时，毒素产量会大大增加。在非APF方法中，总的蛋白含量较低使得pH值并不趋于上升，所以就不会有因pH升高而对毒素产量的不良影响。图1显示当培养基的pH被控制在约5.3至5.5的窄范围内时，一致地具有较高活性(以MLD50和SNAP-25分析测定)。图1还显示用含有6％水解大豆和1％酵母提取物的培养基获得了最高的毒素产率(以SNAP-25分析测定)。
所使用的SNAP-25分析是一种基于ELISA测定肉毒毒素的SNAP-25蛋白水解活性的方法。SNAP-25是分子量为25kDa的神经突触体相关蛋白的缩写。SNAP-25是一种与神经元胞吐作用有关的206个氨基酸的质膜蛋白。该分析基于Ekong T.，et al.，RecombinantSNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxinendopeptidase activity in vitro，Microbiology(1997)，vol 143，pages3337-3347所公开的方法。该分析使用结合于聚苯乙烯96孔微量培养板的截短型SNAP-25蛋白(206个氨基酸残基的肽)和识别切割产物(197个氨基酸残基的肽)的单克隆抗体，所述切割产物由还原型A型肉毒毒素在SNAP-25的197和198氨基酸的酶水解而产生。然后用第二抗体(辣根过氧化物酶[HRP]偶联的山羊抗小鼠IgG)检测结合于切割产物的单克隆抗体，这可在显色底物(TMB)存在的情况下产生颜色改变。
MLD50(小鼠50％致死剂量)分析是一种测量肉毒毒素效力的方法，在所述分析开始时，将肉毒毒素腹膜内注射到每一只重17至22克的雌性小鼠(约4周龄)。将小鼠以头部向下倾斜的仰卧姿势固定，使用25至27规格的3/8”至5/8”针头将一份在盐水中系列稀释的肉毒毒素以约30度的角度腹膜内注射至小鼠的右下腹部。记录对于每一稀释度的后续72小时中的死亡率。制备的稀释液应使得最大浓度的稀释液对被注射的小鼠产生至少80％的死亡率，最小浓度的稀释液对被注射的小鼠产生不高于20％的死亡率。必须有最少四种稀释度属于死亡率的单调下降区间。单调下降区间的起始死亡率不小于80％。在四个或更多的单调下降死亡率中，最高的两个和最低的两个死亡率必须是递减的(即不相等的)。在注射后三天以内的观察期内，使50％的小鼠死亡的稀释液被定义为含有一单位(1U)肉毒毒素的稀释液。
值得注意的是，本发明的APF方法至少在以下方面不同于实施例6的非APF方法：(1)用APF培养基替代了细胞库瓶的熟肉培养基；(2)除去了血琼脂菌落筛选步骤；(3)除去了随后的酪蛋白培养基基础试管生长步骤；和(4)在整个过程中用APF培养基替代了非APF发酵培养基。
图2概括了工业规模(非APF)Schantz方法(实施例6)和实施例7的工业规模的APF方法，经过细胞库的建立、培养和发酵步骤的差别。图2省略了收获和纯化步骤。
还发现APF培养基可用于筛选肉毒梭菌细菌。因此，同时实行实施例6和7初始培养步骤，可使得具有有助于在APF培养基之中或之上生长和产生肉毒毒素的特征的肉毒梭菌细菌分离与生长。肉毒梭菌培养物从非APF培养基到APF培养基的转移富集并筛选了适合于新环境的细菌，或者通过那些不能在新环境中生长和繁殖的细菌的选择性相继死亡来富集并筛选。
本发明中引用了多种出版物、专利和/或出版文献，它们的内容整体通过援引的方式纳入本发明。
虽然就某些优选方法详细描述了本发明，但在本发明范围内也可能有其他的实施方案、形式和变动。例如，在本发明范围内会有各种各样的不含动物产物的方法。
因此，下述权利要求的精神和范围并不限于上述优选实施方案的描述。

Claims (17)

1.一种获得生物活性肉毒毒素的方法，包括下述步骤：
(a)提供一种发酵培养基，所述培养基基本上不含动物源性产物并包括约4-8％(重量)的大豆来源产物；
(b)在允许肉毒毒素生产的条件下，在发酵培养基中发酵肉毒梭菌细菌，和；
(c)从发酵培养基中回收生物活性肉毒毒素。
2.根据权利要求1的方法，其中所述发酵培养基还包括约0-3％(重量)的酵母提取物。
3.根据权利要求1的方法，其中所述发酵培养基还包括约1-2％(重量)的葡萄糖。
4.根据权利要求1的方法，其中所述发酵步骤在pH值约为5.0-5.5的条件下进行。
5.根据权利要求1的方法，其中所述发酵步骤进行约45小时-75小时。
6.根据权利要求1的方法，其中所述发酵步骤在约33-36℃的温度下进行。
7.根据权利要求1的方法，其中所述发酵步骤在厌氧性环境中进行。
8.根据权利要求1的方法，在提供步骤之前，还包括下述步骤：获得基本不含动物源性产物而包括约4-8％(重量)的大豆来源产物的培养基并在所述培养基中培养肉毒梭菌细菌。
9.根据权利要求1的方法，其中所述回收步骤为不含动物蛋白(APF)纯化步骤。
10.一种获得生物活性肉毒毒素的方法，包括如下步骤：
(a)获得基本上不含动物源性产物的，含有约4-8％(重量)的大豆来源产物的培养基，并在培养基中培养肉毒梭菌；
(b)提供基本上不含动物源性产物的发酵培养基，所述培养基包括：
(i)约4-8％(重量)的大豆来源产物，
(ii)约0-3％(重量)的酵母提取物，
(iii)约1-2％(重量)的葡萄糖，
(c)在下列可产生肉毒毒素的条件下，在发酵培养基中发酵肉毒梭菌，包括：
(i)在初期细胞生长后，pH值约5.0到5.5的条件下进行发酵步骤，
(ii)进行发酵步骤约45小时至75小时，
(iii)在约33°-36℃的温度条件下进行发酵步骤，
(iv)在厌氧性环境中进行发酵步骤，以及；
(d)从发酵培养基中回收生物活性的肉毒毒素，其中所述回收步骤为APF纯化步骤。
11.一种用于培养或发酵肉毒毒素的培养基，其中所述培养基基本上不含动物源性产物，并包括植物源性蛋白产物。
12.根据权利要求11的培养基，其中所述培养基包括约4-8％(重量)的大豆来源产物。
13.根据权利要求11的培养基，其中所述培养基包括约0-3％(重量)的酵母提取物。
14.根据权利要求11的培养基，其中所述培养基还包括约1-2％(重量)的葡萄糖。
15.一种用于培养和/或发酵肉毒梭菌细菌的培养基，其中所述培养基基本上不含动物源性产物，并且所述培养基包括：
(a)约4-8％(重量)的大豆来源产物；
(b)约0-3％(重量)的酵母提取物，和；
(c)约1-2％(重量)的葡萄糖。
16.一种制备基本上不含动物产物的药物组合物的方法，所述药物组合物中的活性成分为肉毒毒素，所述方法包括下述步骤：
(a)通过以下步骤获得生物活性的肉毒毒素：
(i)提供基本上不含动物源性产物的发酵培养基；
(ii)在可产生肉毒毒素的条件下，在发酵培养基中培养肉毒梭菌，以及；
(iii)从发酵培养基中回收生物活性的肉毒毒素；
(b)使肉毒毒素与合适的赋形剂组合，由此制备基本上不含动物产物的药物组合物，所述药物组合物中的活性成分为肉毒毒素。
17.一种获得生物活性的肉毒毒素的方法，包括如下步骤：
(a)提供基本上不含动物源性产物、并包括约4-8％(重量)的大豆来源产物的发酵培养基；
(b)在发酵培养基中发酵肉毒梭菌，其中所述发酵培养基在初期细胞生长后保持在pH 5-5.5的pH值；以及
(c)从发酵培养基中回收生物活性的肉毒毒素。
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