CN1889963A - 方法 - Google Patents

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董立春
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Abstract

本发明涉及一种在哺乳动物宿主受试者中诱发针对T细胞表位的T细胞应答的方法，所述方法包括：(i)第一次免疫，包括对受试者进行相隔1到14天的至少两次给药，其中每次给药包括给予编码T细胞表位的所研究核酸(NOI)，并且任选地，(ii)第二次免疫，包括给予受试者至少一次(a)编码T细胞表位的NOI，或者(b)包含T细胞表位的蛋白，其中第一次免疫的第一次给药与第二次免疫的第一次给药之间的时间间隔为21到365天。

Description

方法
相关专利申请的交叉引用
依据美国法典第35卷第119条(e)款，本申请要求2003年10月10日提交的美国申请60/510,086、2003年12月4日提交的美国申请60/526,571和2004年5月5日提交的美国申请60/567,771的权益，其全部内容通过援引的方式纳入本文。
技术领域
本发明涉及一种诱发免疫应答的方法。
背景技术
现有技术中记载了疫苗接种方法，例如可参见Prayaga et al((1997)Vaccine 15(12-13)：1349-1352)，Kilpatrick et al(1997)Hybridoma 16：381-389，Kilpatrick et al(1998)Hybridoma 17：569-576，Pertmer et al(1995)Vaccine 13；1427-1430以及Olsen et al(1997)Vaccine 15；1149-1156。然而，仍需对核酸给药方案进行优化，包括可特异性诱导增强的细胞介导免疫(CMI)应答的核酸给药方案。这对于预防和治疗很大范围的免疫、炎性和感染性疾病和障碍特别有益。
发明内容
本发明提供了一种诱发(或增强)体内CMI应答的方法。具体地说，该方法诱发(或增强)体内T细胞应答。
因此，本发明提供了一种在哺乳动物宿主受试者中诱发针对T细胞表位的免疫应答的方法，该方法包括：
(i)第一次免疫，包括对受试者进行相隔1到14天的至少两次给药，其中每次给药包括给予编码T细胞表位的所研究核酸(NOI)，并且任选地，
(ii)第二次免疫，包括给予受试者至少一次(a)编码T细胞表位的NOI，或者(b)包含T细胞表位的蛋白，其中
-第一次免疫的第一次给药与
-第二次免疫的第一次给药
的时间间隔为21到365天。
本发明概述
以下公开内容讨论了由所给予的NOI编码的序列，如表位或抗原。应该理解，在第二次以及随后免疫的情形下，可给予包含相同表位或抗原的蛋白代替所述NOI。
本发明涉及一种诱发针对所研究的T细胞表位(EOI)的T细胞应答的方法。如上所述，该方法包括给予编码EOI的NOI。在该方法中，可给予至少2、4、6、10或20或更多(高达并且包括例如40)种不同的NOI，其中每种NOI编码相同的表位。或者每次给予NOI时均给予相同的NOI。类似地，在给予包含EOI的蛋白的实施方案中，应该理解，可给予包含该表位的至少2、4、10或更多(高达并且包括例如20)种不同的蛋白。或者每次给予蛋白时，给予相同的蛋白(它包含该表位)。
本发明一方面提供了一种诱发针对哺乳动物宿主受试者中的至少一种靶抗原(TA)的增强的细胞介导免疫(CMI)应答的方法；其中该方法包括对哺乳动物宿主受试者给予至少两次编码TA中的一种或多种所研究表位(EOI)的所研究的核苷酸序列(NOI)；其中每次给予NOI的时间间隔从约48小时到约144小时；并且该方法可有效提供针对哺乳动物宿主受试者中的所述或每种表达的EOI的增强的CMI应答。
本发明可用于预防性和/或治疗性地免疫调节对靶抗原(TA)的所研究的一个或多个表位(EOI)的CMI应答。所诱导的应答的时程使得可以开发对已经存在的T细胞介导障碍进行免疫治疗，以及帮助较宽地保护免受随后遇到的抗原的伤害的有效方案。
本发明该方面的另一个优点是能够在不使用相关的生物应答调节剂和/或佐剂的前提下增强CMI应答。
本发明方法可导致产生活化T细胞。活化T细胞可有多种潜在用途。例如，在人类治疗的情况下，可考虑分离活化T细胞，经体外培养后给予宿主受试者，以治疗T细胞介导的免疫障碍和/或病毒感染或癌症患者。T细胞可由下列过程制备：体内给予NOI，然后分离T细胞，在适当的生物应答调节剂和/或免疫调节剂和/或佐剂(例如但不限于肽、细胞因子和抗原呈递细胞)的存在下进行体外扩增。
用于本发明方法的NOI包括但不限于调节序列控制下的DNA序列，所述调节序列指导哺乳动物宿主细胞内DNA序列的表达。所述NOI编码T细胞表位，因而通常编码包含该表位的蛋白。因此，所述NOI优选能够在受试者细胞中表达所述表位(包括包含该表位的蛋白)。
在优选的实施方案中，所述T细胞表位可为辅助T细胞和/或CD8+T淋巴细胞(CD8+T细胞)表位。因而，由本发明方法诱发的T细胞应答可为辅助和/或CD8+T细胞应答。该应答更优选为CD8+T淋巴细胞应答，如细胞毒应答。
给药方案
本发明方法包括多组给药，这里称为“免疫”。因而，该方法可包括1、2、3、4、5或更多(例如高达并包括10)组免疫，这里称为“第一次免疫”“第二次免疫”等。
任何一次免疫(例如第一次和/或第二次或所有的免疫)的一次或多次或所有的给药可进行2到14天(即该次免疫的第一次和最后一次给药相互间隔2到14天以内)，如3到12天或4到8天。第一次免疫优选进行2到14天，如3到12天或4到8天。
一次或多次或所有的免疫可包括2到50(如5到40或10到30)次给药。因而，通常在一次或多次或所有的免疫中，可进行至少2次，如至少3、5、10、30、50或更多次(例如高达并且包括100次给药)给药。第一次免疫优选(并且随后视情况进行一次或多次免疫)包括3到20次给药。在一个实施方案中，该方法(即所有的免疫总共)包括3到50次，如5到40次或10到30次给药。
在一个实施方案中，一次以上的给药(通常2到5次给药)可在相同时间点(如同一天，或者相互之间在一天内、相互之间在12小时内、相互之间在2小时内或相互之间在1小时内)进行。如下文所述，在相同时间点的给药可给予至相同或不同的部位。
一次或多次或所有的免疫可包括在2到10个，如3到5个不同的时间点给药，其中所述时间点优选在不同的天。因而，一次或多次或所有的免疫可包括在2到10个，如3到5个不同的天中给药。在第一次和第二次免疫中，优选在3或4个不同的天中给药。
在一次或多次或所有的免疫情况下，该次免疫的2、3、4或更多次给药可相隔2到14天，如相隔3到10天或4到8天。对于一次或多次或所有的免疫，该次免疫的2、3、4或更多次给药优选相隔2到6天。
两次免疫之间的时间在这里限定为两次免疫的第一次给药之间的时间。通常第一次和第二次免疫之间的时间(优选所有免疫之间的时间)为21到365天，如28到300天、50到250天或者100到200天。在一个实施方案中，本方法所有免疫进行21到365天，如28到300天、50到250天或者100到200天。
在本发明方法的一个实施方案中，NOI通常给予2到5次(在2到5个不同的时间点)，如2、3或4次(分别在2、3或4个不同的时间点)。通常所述给药进行2到14天，例如4到12天或6到10天。在优选的实施方案中，至少2、3或4次给予NOI可间隔3天或少于3天进行，如间隔2天或少于2天。在一个实施方案中，第一次和第二次给药之间的时间少于4天，通常少于3.5天，如3天或少于3天，或者2天或少于2天。
优选地，在本文所述的给药之间不将NOI给予受试者，通常在所述的NOI给药之间不给予可激发免疫应答的其他制品(如多肽抗原)。在一个实施方案中，在本文所提及的任何给药方案中，在第一次NOI给药前至少7天，如至少14天或至少28天，不将NOI或可激发免疫应答的其他制品(如多肽抗原)给予受试者。在一个实施方案中，在本文所提及的任何给药方案中，在最后一次NOI给药后至少7天，如至少14天或至少28天，不将NOI或可激发免疫应答的其他制品(如多肽抗原)给予受试者。
在给予NOI的各次给药中(或者在各个时间点)，通常为受试者提供约1pg至约5mg NOI，优选约10pg至约100μg，如25pg至1μg或50pg至约500pg。如上所述，在第二次以及随后的(如果可用)免疫中可给予蛋白。在各次给药(或者在各时间点)通常给予约0.1μg至20mg蛋白，优选1μg至5mg，如10μg至500μg。
如上所述，在本发明方法中，给予NOI，以及任选地还给予蛋白。在某些实施方案中，将NOI或蛋白与佐剂或编码该佐剂的NOI同时给药。在该实施方案中，佐剂优选为无毒性形式的大肠杆菌(E.coli)热不稳定性肠毒素(LT)或者霍乱弧菌(Vibrio Cholerae)霍乱毒素(CT)。佐剂可包括LT肠毒素的A或B亚基(LTB)，或者CT霍乱毒素的B亚基(CTB)。
加入佐剂，特别是加入基因佐剂可用于进一步增强或调节CMI应答。因此，用于增强CMI应答的本发明方法可通过在NOI或蛋白(或者包括NOI或蛋白的组合物)中加入佐剂来改进，这样可产生可诱发长期存在并持续增强的CMI应答的特别有效的组合物和方法。
NOI或蛋白优选以粒子形式给药。在本发明方法中的一个优选的实施方案中，NOI或蛋白透皮给药。在更加优选的实施方案中，粒子通过粒子加速设备给予哺乳动物宿主受试者。
在一个实施方案中，进行给药方案之后，确定该方案是否导致激发CMI(如CTL应答)。这可通过例如测定来自受试者的样本中的T细胞(如CTL)的存在或者水平来实现。所检测的T细胞通常对于由NOI编码的表位具有特异性。
本发明的其他方面在所附的权利要求书以及下面的叙述和附图中提出。这些方面在不同的小节标题下进行说明。然而，应该理解，各小节中的教导无需限制于具体的小节标题。
定义
应该理解，本发明并不限于具体的实例性分子或工艺参数，因为它们理所当然地可以变化。还应理解，本文使用的术语仅出于描述本发明具体的实施方案的目的，并非意在限定。另外，除非另有说明，本发明的实施采用病毒学、微生物学、分子生物学、重组DNA技术和免疫学中的常规方法，它们都是本领域中的普通技术。这些技术在文献中有详细解释。参见例如Sambrook，et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第2版，1989)；DNA Cloning：A Practical Approach，第I和II卷(D.Glover编著)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait编著，1984)；A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；以及Fundamental Virology，第2版，第I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编著)。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请，不论出现于上文还是下文，均通过援引的方式全文纳入本文中。必须注意，在本说明书和所附的权利要求书中使用的单数形式“一”“一种”和“该”包括复数的指代对象，除非内容中另有明确说明。本申请中使用的所有科技术语具有本领域中的通用含义，除非另有限定。本申请中使用的下列词语或短语具有限定的含义。
免疫应答
免疫***控制疾病的机理包括通过体液免疫诱导中和抗体，以及通过细胞免疫产生T细胞应答。本文使用的术语——针对靶抗原(TA)(包括EOI)的“免疫应答”是指在哺乳动物宿主受试者中产生针对该TA的体液和/或细胞免疫应答。
本文使用的术语“体液免疫应答”是指由抗体分子介导的免疫应答。由体液免疫产生的抗体主要对细胞外传染物有效。
本文使用的术语“细胞介导的免疫(CMI)应答”是由T淋巴细胞和/或其他白细胞介导的免疫应答。CMI免疫机制通常对细胞内感染和疾病更加有效，这是因为CMI机制中T细胞的作用方式为，当TA出现于晚期时，记忆T细胞被活化，产生CMI应答，破坏细胞表面上具有相应TA或其部分的靶细胞，从而杀灭感染性病原体。CMI应答由效应细胞(它通过直接的细胞间接触破坏感染的宿主细胞)和/或释放分子(如细胞因子，它具有抗病毒活性)介导，致力于破坏感染源。这样，以特异性T淋巴细胞的细胞应答为特征的CMI应答，在产生针对由癌症、病毒、病原微生物和其他细胞内微生物引起的疾病的抗性中至关重要。
CMI应答涉及的T细胞
至少需要两类专门的T细胞来起始和/或增强CMI和体液应答。表达CD4辅助受体的特定T细胞亚类上的抗原受体可为T辅助(Th)细胞或CD4T细胞(下文称T辅助细胞)，它们识别与MHC II类分子结合的抗原肽。与之相比，表达CD8辅助受体的特定T细胞亚类上的抗原受体称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或者CD8+T细胞(下文称CD8+T细胞)，它们与展示于MHC I类分子上的抗原反应。
辅助T细胞
辅助T细胞或CD4+细胞可进一步分为功能上不同的两个亚类：Th1和Th2，它们在细胞因子和效应物功能上不同。Th1和Th2应答不仅可正向调节还可负向调节，使得Th1细胞应答通过Th1细胞因子如IL-2、IL-12和IFN-γ增强，通过Th2细胞因子如IL-4和IL-10减弱。与之相比，抗体应答通过Th2细胞因子如IL-4和IL-10增强，但通过Th1细胞因子如IFN-γ，以及由单核细胞产生的、可增强IFN-γ的另一种细胞因子IL-12下调。因此，Th1类细胞因子如IFN-γ、IL-2和IL-12可看作诱导炎症应答的免疫辅助因子。相反，Th2类细胞因子如IL-4和IL-10可看作在某些情况下抑制严重的炎症应答的细胞因子。
CD8+T细胞
CD8+T细胞可以多种方式作用。CD8+T细胞的最熟知的作用是在MHC I类分子的存在下杀伤或溶解荷肽抗原的靶细胞。这就是这些细胞为什么常被称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的原因。然而，也许在某些感染的保护中具有更大关联性的另一种作用是CD8+T细胞能够分泌干扰素-γ(IFN-γ)。因此，溶解活性试验和IFN-γ释放试验在测量CD8+T细胞免疫应答中都有价值(如下文所述的ELISPOT试验)。在感染性疾病中，有证据显示，在疾病的早期，疾病症状产生之前，CD8+T细胞可通过杀伤包含传染性抗原的传染物来起到保护作用。
增强的CMI应答
本发明涉及一种能够在宿主受试者中增强和/或调节针对靶抗原的CMI应答的方法。本文使用的术语“增强”涵盖了CMI应答在所有方面的提高，它包括但不限于对重复给予NOI(它编码TA的EOI)产生的CMI应答的强度和/或持续时间和/或质量受到激发和/或增加和/或加强和/或上调。举例来说，CMI应答可通过下列途径增强：(i)增强可识别靶抗原的CD8+T细胞的活化和/或产生和/或增殖；和/或(ii)将CMI应答从Th2型变为Th1型应答。这种增强Th1相关的应答对响应细胞内感染来说有特别重要的价值，这是因为，如上所述，CMI应答通过活化的Th1(例如IFN-γ诱导的)细胞增强。
通常，这种增强的免疫应答的特征在于，产生干扰素的CD4+和/或CD8+T淋巴细胞的效价提高，抗原特异性CD8+T细胞活性提高，以及针对所研究的抗原的T辅助细胞1样免疫应答(Th1)(其特征在于，一般与细胞免疫相关的亚类(例如IgG2a)的抗原特异性抗体效价提高，通常伴随着一般与体液免疫相关的亚类(例如IgG1)的抗体效价降低)而不是T辅助细胞2样免疫应答(Th2)。
由本发明方法诱发的应答(如CMI应答的增强)可通过多种已知的测定法来测定，例如通过淋巴增生(淋巴细胞活化)测定、CD8+T细胞测定，或者通过测定对致敏受试者中的表位具有特异性的T淋巴细胞来进行(参见例如Erickson et al.(1993)J.Immunol.151：4189-4199；以及Doe et al.(1994)Eur.J.Immunol.24：2369-2376)或者可测量干扰素γ产量的CD8+T细胞ELISPOT测定(Miyahara et alPNAS(USA)(1998)95：3954-3959)。
在一个实施方案中，本方法诱发调节性或抑制性T细胞应答。诱发这样一种应答可用于例如预防或治疗自身免疫性疾病。
增强的T细胞应答
在本公开中，诱发应答通常在诱发CMI应答方面进行讨论。诱发CMI应答被理解为包括诱发T细胞应答。由本发明方法诱发的应答可以是“增强的”应答。如果由本发明方法诱发的应答强于由对照方法诱发的应答，其中在对照方法中给予NOI(如果可用，还可为等量的蛋白)的量与本发明方法相同，就可以说存在“增强的”应答。此类对照方法例如可以由在一次给药中给予NOI(如果可用，还可以是蛋白)构成。或者，对照方法可以由在相隔28天的两次给药中给予NOI(如果可用，还可以是蛋白)构成。
本文使用的术语“增强T细胞应答”涵盖了T细胞应答在所有方面的提高，它包括但不限于对重复给予NOI(它编码靶抗原的EOI)产生的T细胞应答的强度和/或持续时间和/或质量受到激发和/或增加和/或加强和/或上调。举例来说，T细胞应答可通过下列途径增强：增强诱导的T细胞的活化和/或产生和/或分布和/或增殖，和/或延长对诱导/调节T细胞的NOI(它编码来自TA的EOI)的T细胞应答的寿命。宿主受试者中T细胞应答的增强可与宿主受试者中Th1免疫应答的增强和/或调节有关。
T细胞应答的增强可通过多种已知的测定法来测定，例如通过淋巴增生(淋巴细胞活化)测定、CD8+T细胞细胞毒性细胞测定，或者通过测定对致敏受试者中的表位具有特异性的T淋巴细胞来进行(参见例如Erickson et al.(1993)J.Immunol.151：4189-4199；以及Doe etal.(1994)Eur.J.Immunol.24：2369-2376)或者可测量干扰素γ产量的CD8+T细胞ELISPOT测定(Miyahara et al PNAS(USA)(1998)95：3954-3959)。
抗原
每种引发疾病的媒介物或疾病状态都与抗原或者抗原上的免疫显性表位相关，在宿主中，这些抗原或者抗原上的免疫显性表位在免疫识别中以及最终消除或控制引发疾病的媒介物或疾病状态中是十分重要的。为了增强对特定疾病的体液和/或细胞免疫应答，宿主免疫***必须与和该疾病状态相关的抗原或者抗原上的免疫显性表位接触。
本文使用的术语“抗原”是指在个体中可诱发免疫应答的任何媒介物，通常是大分子。免疫应答可为B和/或T淋巴细胞应答。该术语可用于指代单个大分子或者同质或异质的一组抗原性大分子。本文使用的“抗原”用于指代包含一个或多个抗原决定簇或表位的蛋白分子或其部分。
靶抗原
本文使用的术语“靶抗原(TA)”是指所研究的包含一个或多个表位的免疫原性肽或蛋白，所述表位能够诱导针对感染性病原体的CMI应答，所述感染性病原体例如但不限于细菌、病毒、真菌、酵母、寄生虫以及能够感染哺乳动物种类的其他微生物。靶抗原包括但不限于自身抗原、自体抗原、交叉反应抗原、异型抗原、耐受原、变应原、半抗原、免疫原或者其部分，以及它们的任何组合。因此，EOI可来自本文提及的任何类型的抗原或蛋白，或者来自本文提及的任何具体的抗原或蛋白。
表位
本文使用的术语“表位”通常指位于靶抗原上可由T细胞受体和/或抗体识别的位点。它优选为来自蛋白抗原的短肽或者作为蛋白抗原一部分的短肽。然而该术语还意在包括带有糖肽和糖类表位的肽。单个抗原分子可包括几个不同的表位。术语“表位”还包括能够激发可识别整个有机体的应答的修饰的氨基酸或糖类序列。所选表位最好是引起感染性疾病的传染物(如细菌或病毒)的表位。
本文使用的术语所研究的表位(EOI)是指可用于本发明方法的一个或多个EOI。本发明方法可用于诱发针对1、2、3、4、5到10个或者更多不同的表位的T细胞应答。因此，本方法可包括给予一种或多种NOI，它们总共编码1、2、3、4、5到10个或者更多不同的表位，和/或给予一种或多种蛋白，它们总共编码1、2、3、4、5到10个或者更多不同的表位。
在一个实施方案中，采用本发明方法诱发针对预定(或预先确定)和/或已知表位的T细胞应答，该表位通常来自预定和/或已知蛋白。
表位来源
EOI可根据肽或多肽的氨基酸序列以及相应的DNA序列的知识产生，也可从具体氨基酸的性质(如大小、电荷等)和密码子字典产生，无需过多的实验。参见例如Ivan Roitt，Essential Immunology，1988；Kendrew，同上；Janis Kuby，Immunology，1992例如pp.79-81。决定所研究的蛋白或表位是否可激发应答的一些指标包括：肽长度——肽应该至少8或9氨基酸长以适合MHC I类复合物，至少8～25，例如至少13～25氨基酸长以适合II类MHC复合物。此长度是使肽与MHC复合物结合的最小长度。因为细胞可切割肽，所以肽优选大于这些长度。肽应该包含适当的锚定基序(anchor motif)，它可使肽与各种I类或II类分子以足够高的特异性结合，以产生免疫应答(参见Bocchia，M.et al，Specific Binding of Leukemia Oncogene Fusion ProteinPentides to HLA Class I Molecules，Blood 85：2680-2684；Englehard，VH，Structure of peptides associated with class I and class II MHCmolecules Ann.Rev.Immunol.12：181(1994))。这可通过将所研究的蛋白序列与公开的MHC分子相关肽的结构对比来实现，而无需过多的实验。因此，技术人员可通过对比蛋白序列与蛋白数据库中所列序列来确定所研究的表位。
本发明方法通常用于增强针对编码任何来源(如来自病原体)的EOI的NOI的CMI应答，所述EOI包括来自于多种传染物如病毒或寄生虫的EOI。举例来说，EOI可来自来源于肿瘤细胞的致病体，所述肿瘤细胞可在有机体中无限制地增殖，因而可导致病理性生长。此类致病体的实例记载于Davis，B.D.et al(Microbiology，第3版，Harper International Edition).
表位可来自非哺乳动物、非小鼠或者非人类蛋白。表位可来自细胞内蛋白或细胞外蛋白。在一个实施方案中，表位来自分泌型蛋白，例如由病原体分泌的蛋白。表位可以也可以不来自于正在诱发T细胞应答的受试者的蛋白。表位可来自于能够感染受试者的病原体。表位可为天然存在的表位，或者非天然存在的人工表位。
然而，在优选的实施方案中，通过增强针对HIV病毒家族的成分的CMI应答来实施本发明。可产生针对位于任何病毒基因(例如gag、pol、nef和env基因)产物内的EOI的增强的CMI应答，env基因产物为优选靶标。
因而在一个实施方案中，本发明方法诱发针对特定抗原的免疫应答，以治疗和/或预防HIV感染和/或由HIV感染所引发或加重的任何疾病，如AIDS。
T细胞表位
在本发明方法或过程之中，TA的EOI可包含一个或多个T细胞表位。本文使用的术语“T细胞表位”通常指能够诱导T细胞应答的肽结构特征。关于这一点，本领域中普通认为，T细胞表位包括线性的肽决定簇，它在MHC分子的肽结合缺口内呈现出延伸的构象(Unanue et al.(1987)Science 236：551-557)。本文使用的T细胞表位通常是具有至少约3～5个氨基酸残基的肽，优选至少5～10个或更多氨基酸残基，例如8到25个氨基酸残基。然而，本文使用的术语“T细胞表位”涵盖了任何MHC I类或MHC II类限制性肽。特定的T细胞表位激发/增强CMI应答的能力可由多种已知的试验测定，例如通过淋巴增生(淋巴细胞活化)试验、CD8+T细胞细胞毒性细胞试验，或者通过测定对致敏受试者中的表位具有特异性的T淋巴细胞来进行。参见例如Erickson et al.(1993)J.Immunol.151：4189-4199；以及Doe et al.(1994)Eur.J.Immunol.24：2369-2376或者可测量干扰素γ产量的CD8+T细胞ELISPOT试验(Miyahara et al PNAS(USA)(1998)95：3954-3959)。
CD8+T细胞表位
EOI优选为CD8+T细胞EOI。可诱导CD8+T细胞的EOI是在给予宿主受试者之后能够激发特定CD8+T细胞形成，或者增强其活性的表位。CD8+T细胞表位可以多种不同的形式提供，例如一个或两个或更多表位的重组串。多种不同疾病的CD8+T细胞表位已被识别，并可在文献中发现。可以设计表位串以产生针对包含此类CD8+T细胞EOI的任何所选TA的CD8+T细胞应答。在NOI中，CD8+T细胞EOI最好以多个EOI串的形成提供，它们相互连接在一起，没有***序列，以避免不必要的核酸物质。在一个实施方案中，NOI还编码可作为蛋白酶切割位点的序列，以使表位从表达的蛋白上切割下来。
T辅助细胞表位
EOI优选为辅助T淋巴细胞EOI。多种识别T辅助细胞EOI的方法适用于本发明。例如，已知肽序列的两亲性可影响它作为T辅助细胞诱导物的能力。关于可诱导T辅助细胞的表位的详细讨论在美国专利5,128,319中给出，该专利通过援引纳入本文。
B细胞表位
EOI优选为CD8+T细胞EOI和B细胞EOI的混合物。本文使用的术语“B细胞表位”通常指特异性抗体分子可结合的TA上的位点。可利用本领域已知的技术容易地识别能够诱发抗体应答的表位。参见例如Geysen et.al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002(快速合成肽以测定给定抗原中免疫原性表位位置的一般方法)；美国专利4,708,871(识别和化学合成抗原表位的方法)；以及Geysen et al.(1986)Molecular Immunology 23：709-715(识别对给定抗体具有高亲和力的肽的技术)。
表位的组合
在本发明优选的实施方案中，EOI是可诱导CD8+T细胞的EOI和可诱导T辅助细胞的EOI的混合物。
本领域公知，诱导T细胞和B细胞的表位通常彼此不同，可包括不同的肽序列。因而蛋白质肽链上的某些区域可具有T细胞或B细胞表位。因此，除了CD8+T细胞表位，还优选包括可被T辅助细胞识别的一个或多个表位，以增强由CD8+T细胞表位产生的免疫应答。
T辅助细胞诱导物增强体内CD8+T细胞诱导的应答的机制还不完全清楚。然而，在并非与理论结合的前提下，可能由于增强剂能够诱导T辅助细胞，因而它导致在特定的CD8+T细胞的克隆性增殖和扩散中必需的细胞因子水平升高。不管基本的机制如何，可以预见在本发明方法中使用可诱导辅助T细胞和CD8+T细胞的EOI的混合物有助于增强CMI应答。特别适当的T辅助细胞表位是在不同的HLA型个体中均有活性的表位，例如来自破伤风(多数个体已经对其有了初次免疫)的T辅助细胞表位。包括B细胞EOI也可有助于激发B细胞应答和抗体产生。还可构建合成NOI以产生两类免疫应答：只有T细胞应答，以及T细胞应答与B细胞应答的组合。
免疫显性表位
当个体使用编码TA上的多个EOI的NOI免疫时，在许多情况下，多数答应的T淋巴细胞针对来自该TA的一个或多个线性EOI具有特异性，和/或多数应答的B淋巴细胞针对来自该TA的一个或多个线性或构象EOI具有特异性。对于本发明目的而言，此类EOI被称为“免疫显性表位”。在具有几个免疫显性EOI的抗原中，某一个EOI在引发特异性T或B细胞应答方面可为最强显性。
优选地，本发明方法或过程可有效增强针对一个或多个HSV-2表位的CMI应答。优选地，本发明方法或过程可有效增强针对一个或多个免疫显性HSV-2表位的CMI应答。优选地，本发明方法可有效产生/增强针对一个或多个HbsAg表位的CMI应答。优选地，本发明方法可有效产生/增强针对一个或多个免疫显性HbsAg表位的CMI应答。
如实施例所示，针对HSV-2和HbsAg EOI获得增强的CMI应答说明，本发明方法对来自多种感染性病原体的EOI通常都有效。而且，对病毒激发的防护作用表明，产生强CD8+T细胞应答在开发预防性和治疗性接种方案中是有价值的。
优选地，本发明方法或过程可有效诱发针对与肿瘤相关抗原(TAA)有关的一种或多种EOI的增强的CMI应答。来自肿瘤相关抗原(TAA)的EOI最好可作为宿主免疫***的靶标诱发应答，致使肿瘤破坏。此类TAA的实例包括但不限于MART-1(被T细胞1识别的黑素瘤抗原)、MAGE-1、MAGE-3、5T4、gp100、癌胚抗原(CEA)、***特异性抗原(PSA)、MUCIN(MUC-1)、酪氨酸酶。其他的TAA可由本领域公知的方法，如美国专利4,514,506中公开的方法来识别、分离和克隆。
在优选的实施方案中，NOI编码至少两个HIV抗原。NOI可包括编码HIV gag蛋白的序列，或者它的包含一个表位的片段，以及一种或多种其他HIV抗原或者它的包含一个表位的片段。抗原可来自任何可用的HIV分离株(通常为HIV-1)，如HXB2。抗原可包括gag抗原(或者它的包含一个表位的片段)，如p24gag和p55gag，以及来自HIV的pol、env、tat、vif、rev、nef、vpr、vpu和LTR区的蛋白(或者它们的包含一个表位的片段)。
在更加优选的实施方案中，NOI编码至少三个HIV抗原，优选为Gag、nef和RT(或者，不是整个蛋白，而是这些蛋白之一的包含一个表位的片段)。这些编码序列可为任何顺序，但优选的顺序为Nef-RT-Gag、RT-Nef-Gag或RT-Gag-Nef。
在一个实施方案中，表达的HIV表位/蛋白为融合蛋白，如含有来自(包括上述的片段)Nef、RT和Gag的序列的融合蛋白。
在优选的实施方案中，gag基因不编码gag p6肽。优选截短NOI中的nef基因以去掉编码N末端81个氨基酸的序列。
由NOI编码的gag或者任何其他HIV抗原(如nef或RT)的片段通常包括一个表位。由NOI编码的蛋白(包括所述片段)通常至少8个氨基酸长，例如8～10个氨基酸或者最高达20、50、60、70、80、100、150或200个氨基酸长。任何此类蛋白可经密码子优化，例如使得该片段的密码子选择模式与高水平表达的哺乳动物基因的模式相似。
在一个实施方案中，NOI编码下列多肽组合之一：
I.p17、p24，融合于截短的NEF(缺少编码末端氨基酸1～85的核苷酸)。
II.p17、p24、RT、截短的NEF(缺少编码末端氨基酸1～85的核苷酸)。
III.p17、p24(优化的gag)、截短的NEF(缺少编码末端氨基酸1～85的核苷酸)。
IV.p17、p24(优化的gag)、RT(优化的)、截短的NEF(缺少编码末端氨基酸1～85的核苷酸)。
V.p17、p24、RT(优化的)、截短的NEF(缺少编码末端氨基酸1～85的核苷酸)。
在优选的实施方案中，NOI包括失活的密码子优化的RT，截短的Nef和密码子优化的gag基因的p17/p24部分(例如如WO 03/025003中所公开)，任选地与爱荷华长度(Iowa length)HCMV启动子+外显子1下游有效连接，和/或与兔珠蛋白多腺苷酸化信号的上游有效连接。多腺苷酸化信号可为兔β珠蛋白基因中的信号。
在优选的实施方案中，NOI包括图18至22所示的一个或多个多核苷酸序列，或者这样一个序列的编码至少一个表位(优选T细胞表位)的片段；或者图18至22中任何序列的同源体(homologue)或者所述片段的同源体。此类片段或同源体通常至少50个核苷酸长，例如至少100、200、500或1000个核苷酸长。在一个实施方案中，NOI是如图17或20至22之一所示的质粒形式，或者此类质粒的片段或衍生物(包括同源体)形式。质粒的构建在WO 03/080112中记载(通过援引纳入本文)。
优化的密码子
在本发明优选的实施方案中，优化NOI的编码序列，使其密码子选择与哺乳动物细胞中高水平表达的基因相似。DNA密码有4个字母(A、T、C和G)，使用它们拼写三字母“密码子”，这些密码子代表了有机体的基因编码的蛋白中的氨基酸。沿着DNA分子的线性的密码子序列被翻译成由这些基因编码的蛋白中的线性的氨基酸序列。密码高度简并，61个密码子编码20种天然氨基酸和3个代表“终止”信号的密码子。因此，多数氨基酸由一个以上的密码子编码——实际上，有几种氨基酸由四种或者更多种不同的密码子编码。
当有一种以上密码子可用于编码给定的氨基酸时，已观察到有机体的密码子选择模式具有高度的非随机性。不同的物种在其密码子选择上显示出不同的偏爱，而且，在同一物种中的高水平和低水平表达的基因之间，其密码子选择也显著不同。这种偏爱在病毒、植物、细菌和哺乳动物细胞中均不同，有些物种比其他物种显示出更强的远离随机密码子选择的偏爱。
例如，人和其他哺乳动物不如某些细菌或病毒的偏爱程度强烈。由于这些原因，哺乳动物基因在大肠杆菌(E.coli)中表达或者病毒基因在哺乳动物细胞中表达时，极有可能会由于具有不适当的密码子分布而无法高效表达。人们相信，当在异源DNA序列中存在在要表达的宿主中极少发现的密码子组时，可以预见在该宿主中的异源表达水平较低。
在NOI中，可将密码子选择模式从天然状态变为更加接近反映靶有机体(如哺乳动物，特别是人)的密码子偏爱的状态。“密码子选择系数”是给定的多核苷酸序列的密码子模式与靶物种的相似程度的量度。密码子频率可从许多物种的高水平表达的基因的文献来源获得(参见例如Nakamura et.al.Nucleic Acids Research 1996，24：214-215)。61种密码子中的每一种的密码子频率(以所选类别的基因中每1000个密码子中每种密码子的出现次数来表示)对20种天然氨基酸中的每一种进行标准化，将每种氨基酸的最常用的密码子的值设置为1，较少使用的密码子的频率在0和1之间。这样，对于靶物种中高水平表达的基因，61种密码子中的每一种都分配了等于或小于1的数值。为了计算特定多核苷酸的密码子选择系数，相对于该物种的高水平表达的基因，标出特定多核苷酸中的每一密码子的换算值，取所有值的几何平均数(这些值的自然对数的和，除以密码子总数，取反对数)。系数的值在0和1之间，系数值越高就表明在多核苷酸中有越多的密码子为常用密码子。如果多核苷酸序列的密码子选择系数为1，则所有密码子均为靶物种中的高水平表达的基因的“最常用”密码子。
根据本发明，NOI的密码子选择模式优选排除在靶有机体的高水平表达的基因中RSCU值小于0.2的密码子。同义密码子相对使用度(RSCU)值是密码子的实测数目除以如果该氨基酸的所有密码子的使用频率均相等时的预期数目。NOI对高水平表达的人类基因的密码子选择系数通常大于0.3，优选大于0.4，最优选大于0.5。人类的密码子选择表还可在GenBank中发现。比较起来，高水平表达的β肌动蛋白基因的RSCU为0.747。人类(homo sapiens)的密码子选择表如下所示：
人类[gbpri]：27143个CDS(12816923个密码子)
字段：[三联体][频率：每一千]([数目])
UUU 17.0(217684)  UCU 14.8(189419)  UAU 12.1(155645)  UGU 10.0(127719)
UUC 20.5(262753)  UCC 17.5(224470)  UAC 15.8(202481)  UGC 12.3(157257)
UUA  7.3( 93924)  UCA 11.9(152074)  UAA  0.7(  9195)  UGA  1.3( 16025)
UUG 12.5(159611)  UCG  4.5( 57572)  UAG  0.5(  6789)  UGG 12.9(165930)
CUU 12.8(163707)  CCU 17.3(222146)  CAU 10.5(134186)  CGU  4.6( 59454)
CUC 19.3(247391)  CCC 20.0(256235)  CAC 14.9(190928)  CGC 10.8(137865)
CUA  7.0( 89078)  CCA 16.7(214583)  CAA 12.0(153590)  CGA  6.3( 80709)
CUG 39.7(509096)  CCG  7.0( 89619)  CAG 34.5(441727)  CGG 11.6(148666)
AUU 15.8(202844)  ACU 12.9(165392)  AAU 17.0(218508)  AGU 12.0(154442)
AUC 21.6(277066)  ACC 19.3(247805)  AAC 19.8(253475)  AGC 19.3(247583)
AUA  7.2( 92133)  ACA 14.9(191518)  AAA 24.0(308123)  AGA 11.5(147264)
AUG 22.3(285776)  ACG  6.3( 80369)  AAG 32.6(418141)  AGG 11.3(145276)
GUU 10.9(139611)  GCU 18.5(236639)  GAU 22.4(286742)  GGU 10.8(138606)
GUC 14.6(187333)  GCC 28.3(362086)  GAC 26.1(334158)  GGC 22.7(290904)
GUA  7.0( 89644)  GCA 15.9(203310)  GAA 29.1(373151)  GGA 16.4(210643)
GUG 28.8(369006)  GCG  7.5( 96455)  GAG 40.2(515485)  GGG 16.4(209907)
编码GC 52.51％第一字母GC 56.04％第二字母GC 42.35％第三字母GC 59.13％
佐剂
本发明方法或过程不需要佐剂的存在即可显示增强的CMI应答。然而，加入佐剂特别是基因佐剂有助于进一步增强或调节CMI应答。佐剂可通过下列途径增强CMI应答：增强免疫的受试者中同时给予的抗原的免疫原性，以及诱导针对同时给予的抗原的Th1样免疫应答，其中抗原为疫苗制品中的有益成分。
因此，本发明的增强CMI应答的方法或过程可如下改进：在NOI或蛋白，或者含NOI或蛋白的组合物中加入佐剂，这样可形成可诱发长期存在并持续增强的CMI应答的特别有效的组合物和方法。
本文使用的术语“佐剂”是指能够特异性或非特异性改变、增强、指导、更改、加强或引发抗原特异性免疫应答的任何物质或组合物。
术语“佐剂”包括但不限于细菌ADP核糖基化外毒素，生物活性因子，免疫调节分子，生物应答调节剂或者免疫激发分子如细胞因子、白介素、趋化因子或者配体或者表位(如辅助T细胞表位)以及它们任选的组合，当它们与NOI一起给药时，与单独给予NOI或单独给予蛋白产生的CMI应答相比，可增强或加强或调节CMI应答。佐剂可为本领域已知的适于人或动物使用的任何佐剂。
免疫调节分子如细胞因子(TNF-α、IL-6、GM-CSF和IL-2)以及辅助激发分子和辅助分子(B7-1、B7-2)可以各种组合用作佐剂。在一个实施方案中，在给药方案之前、之中或之后，不将GM-CSF给予受试者。在EOI的表达部位同时产生免疫调节分子和EOI可增强特异性效应物的产生，以帮助增强CMI应答。CMI应答增强的程度要依赖于具体使用的免疫激发分子和/或佐剂，这是因为不同的免疫激发分子可诱发不同的可增强和/或调节CMI应答的机制。举例来说，不同的效应物机理/免疫调节分子包括但不限于增强求助信号(helpsignal)(IL-2)，募集专职APC(GM-CSF)，增加T细胞频率(IL-2)，作用于抗原加工途径和MHC的表达(IFN-γ和TNF-α)，以及使免疫应答从Th1应答向Th2应答转换(LTB)(见WO 97/02045)。含寡核苷酸的未甲基化CpG(见WO 96/02555)也是Th1应答的优选诱导物，适用于本发明。
在不受理论约束的前提下，加入佐剂是有益的，因为佐剂可帮助增强针对NOI或蛋白的CMI应答，这通过如下方式实现：使Th2应答转向Th1应答，和/或使特异性效应物相关的机制转向表达的EOI，并且随后产生和维持增强的CMI应答(参见例如WO 97/02045中的教导)。
在NOI或蛋白中加入佐剂是有益的，还因为它可使得在给予NOI或蛋白的受试者中，只需较低剂量或较少剂量的NOI或蛋白即可实现预期的CMI应答，或者它可导致受试者中质量上和/或数量上不同的免疫应答。佐剂的效果可通过如下方式测定：将佐剂与NOI或蛋白给予动物，与只给予动物NOI或蛋白的实验平行进行，使用标准的测定法比较这两组中的抗体和/或细胞介导的免疫，所述标准的测定法例如放射免疫测定、ELISA、CD8+T细胞测定等等，均为本领域所熟知。通常，佐剂是与抗原相独立的部分，但单个分子也可同时具有佐剂和抗原属性。
本文使用的术语“基因佐剂”是指由NOI编码的佐剂，并且当将其与编码EOI或蛋白(包含一个表位)的NOI一起给药时，相对于只给予NOI或蛋白而产生的CMI应答来说，该佐剂可增强CMI应答。
在一个优选的实施方案中，基因佐剂为细菌ADP核糖基化外毒素。ADP核糖基化细菌毒素是相关的细菌外毒素家族，包括白喉毒素(DT)、百日咳毒素(PT)、霍乱毒素(CT)、大肠杆菌不耐热毒素(LT1和LT2)、假单胞杆菌(Pseudomonas)内毒素A、假单胞杆菌外毒素S、仙人掌杆菌(B.cereus)胞外酶、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)毒素、肉毒梭菌(C.botulinum)C2和C3毒素、泥渣梭菌(C.limosum)胞外酶，以及来自产气荚膜梭菌(C.perfringens)、螺状梭菌(C.spiriforma)和艰难梭菌(C.difficile)的毒素，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)EDIN，以及ADP核糖基化细菌毒素突变株，如CRM197，一种非毒性的白喉毒素突变株(参见例如Bixler et al.(1989)Adv.Exp.Med.Biol. 251：175；以及Constantino et al.(1992)Vaccine)。多数ADP核糖基化细菌毒素以A:B多聚体的形式构成，其中A亚基包含ADP核糖基转移酶活性，B亚基作为结合部分。用于本发明组合物的优选的ADP核糖基化细菌毒素包括霍乱毒素和大肠杆菌不耐热毒素。
霍乱毒素(CT)和相关的大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)是其相应的肠毒性细菌菌株的分泌产物，当全身、口服或粘膜给药时，它们是有效的免疫原，并显示强烈的毒性。已知当通过肌内或口服途径给药时，CT和LT均可为抗原提供佐剂作用。已经在低于毒性所需的剂量下观察到这些佐剂作用。这两种毒素是极其相似的分子，在氨基酸水平上具有至少约70～80％的同源性。
基因佐剂优选霍乱毒素(CT)、肠毒性大肠杆菌不耐热毒素(LT)，或者保留佐剂性的CT或LT的衍生物、亚基或片段。在更加优选的实施方案中，基因佐剂为LT。在另一个优选的实施方案中，基因佐剂可为CTB或LTB。
肠毒素优选为非毒性肠毒素。举例来说，可将至少一个肠毒素亚基编码区在基因上进行修饰，以去除它所编码的亚基肽的毒性，例如其中，已将截短的A亚基编码区在基因上进行修饰，以使亚基肽表达产物中的ADP核糖基转移酶破坏或失活(见WO 03/004055)。
在下述实施例中，由质粒载体表达的包含天然A亚基和B亚基的LT全毒素用作基因佐剂，将其与表达HSV-2/HbsAg抗原的NOI同时给药，以获得增强的CMI应答。结果表明，在产生全身T细胞应答方面，与给予不含佐剂的NOI或蛋白相比，加入佐剂可显著提高诱发CMI应答的能力。
因此，这些结果表明，当需要更加增强的CMI应答时，该基因佐剂特别理想。其他理想的基因佐剂包括但不限于编码IL-10、IL-12、IL-13、干扰素(IFN)(如IFN-α、IFN-ss和IFN-γ)的NOI，以及其优选的组合。本领域技术人员可容易地选择其他可增强CMI应答的此类生物活性因子，含有这些因子的适当的质粒载体可由已知技术构建。
NOI
本发明的EOI可以编码该EOI的核苷酸序列的形式给药。本文使用的术语所研究的核苷酸序列(NOI)是指编码一种或多种可用于本发明方法的EOI的一种或多种NOI。术语“所研究的核苷酸序列(NOI)”与术语“多核苷酸”同义。NOI可为基因组或合成来源的、或者重组来源的DNA或RNA。NOI可为双链或单链，代表有义链或反义链或其结合。对于某些应用，NOI优选为DNA。对于某些应用，NOI优选通过使用重组DNA技术制备(如重组DNA)。对于某些应用，NOI优选为cDNA。对于某些应用，NOI优选与天然存在的形式相同。NOI可为分离或纯化形式，如非细胞形式。
载体
在本发明的一个实施方案中，将NOI直接给予宿主受试者。在本发明的另一个实施方案中，将包含NOI的载体给予宿主受试者。NOI优选使用基因载体制备和/或给药。本领域中熟知，载体是允许或帮助实体从一个环境向另一个环境转移的工具。根据本发明，举例来说，用于重组DNA技术的某些载体可使实体，如DNA片段(如异源DNA片段，如异源cDNA片段)，转移进入宿主和/或靶细胞中，以实现复制包含本发明NOI的载体，和/或表达由该NOI编码的本发明EOI的目的。用于重组DNA技术的载体的实例包括但不限于质粒、染色体、人工染色体或病毒。术语“载体”包括表达载体和/或转化载体。术语“表达载体”是指能够体内或体外/离体表达的构建体。术语“转化载体”是指能够从一个物种转移至另一物种的构建体。
在一个实施方案中，使用病毒启动子来启动NOI的表达。启动子可为巨细胞病毒(CMV)启动子。优选的启动子元件(特别是在NOI编码HIV抗原的情况下)为缺少内含子A但包括外显子1的CMV立即早期(IE)启动子。这样，NOI的表达可处于HCMV IE早期启动子的调控之下。
裸露DNA
包含本发明的NOI的载体可以“裸露核酸构建体”的形式直接给药，优选进一步包含与宿主细胞基因组同源的侧翼序列。本文使用的术语“裸露DNA”是指包含本发明的NOI以及调控其产生的短启动子区的质粒。称之为“裸露”DNA的原因是该质粒没有携带于任何传送媒介物中。当这种DNA质粒进入宿主细胞如真核细胞时，它所编码的蛋白在细胞内被转录和翻译。
病毒载体
或者，包含本发明NOI的载体可使用本领域已知的各种病毒技术引入适当的宿主细胞中，所述病毒技术例如使用重组病毒载体如反转录病毒、单纯疱疹病毒和腺病毒进行感染。载体可为重组病毒载体。适当的重组病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、痘病毒载体或者细小病毒载体(参见Kestler et al 1999 Human GeneTher 10(10)：1619-32)。在病毒载体的情况下，给予NOI通过病毒感染靶细胞来进行。
靶向载体
术语“靶向载体”是指感染或转染或转导细胞的能力或者在宿主和/或靶细胞中表达的能力局限于宿主受试者中特定细胞类型的载体，通常局限于具有共同或相似的表型的细胞中。
表达载体
***载体中的本发明NOI优选与调控序列有效连接，所述调控序列能够由宿主细胞提供EOI的表达，也就是说，该载体为表达载体。由宿主细胞产生的产物可分泌出来或者包含在细胞内，这取决于所用的NOI和/或载体。本领域技术人员可以理解，包含NOI的表达载体可设计成带有信号序列，所述信号序列可指导EOI穿过特定的原核或真核细胞膜而分泌。
融合蛋白
本发明NOI可以融合蛋白的形式表达，所述融合蛋白包括与EOI融合的佐剂和/或生物应答调节剂和/或免疫调节剂，以进一步增强和/或提高所获得的CMI应答。生物应答调节剂可用作佐剂，也就是说，它可为CMI应答提供泛发性刺激。EOI可附着于生物应答调节剂的氨基或羧基末端。
包含表位的蛋白
蛋白序列可与表位序列相同(即在N或C末端不添加任何序列)。蛋白通常为分离或纯化形式，如非细胞形式。蛋白通常为8到400个氨基酸长，如10到300或者15到150个氨基酸。
NOI和蛋白的给药
NOI或蛋白可通过多种不同途径，单独或作为组合物的一部分给药。对于某些组合物来说，某些途径较为适合，因为它们可导致产生更加有效的CMI应答，或者诱导副作用的可能性较小，或者方便给药。疫苗组合物的给药途径可根据待预防或治疗的病原体或感染而变化。
NOI或蛋白可通过全身途径或粘膜途径或经皮途径给药，或者，将其直接给予至特定的组织如肝、骨髓，或者在癌症治疗的情况下，直接给予至肿瘤。本文使用的术语“全身给药”包括但不限于任何肠胃外给药途径。具体地说，肠胃外给药包括但不限于皮下、腹膜内、静脉内、动脉内、肌内或者胸骨注射，静脉内、动脉内或者肾透析输注技术。全身、肠胃外给药优选为肌内注射。
在本方法的一个优选的实施方案中，NOI或蛋白通过皮肤，例如通过经皮途径给药。根据本发明，相信可以采用任何可接受的实施方式和免疫途径，并且仍然获得一些优点，但是下述实施例表明，使用经皮NOI给药具有特别的优点。在这点上，在并非受理论约束的前提下，相信经皮给药是优选的，因为它可更加有效地活化细胞介导的免疫***武装(arm)。
术语“经皮”给药意指皮内(如进入真皮或表皮)、经皮(如“经由皮肤”)和穿粘膜给药，也就是说，使药剂进入或穿过皮肤或粘膜组织而给药。参见例如Transdermal Drug Delivery：Developmental Issuesand Research Initiatives，Hadgraft和Guy(编著)，Marcel Dekker，Inc.，(1989)；Controlled Drug Delivery：Fundamentals and Applications，Robinson和Lee(编著)，Marcel Dekker Inc.，(1987)；以及TransdermalDelivery of Drugs，Vols.1-3，Kydonieus和Berner(编著)，CRC Press，(1987)。因此，该术语涵盖了使用粒子给药装置(如无针注射器)给药，如美国专利5,630,796所述，以及使用粒子介导的给药装置给药，如美国专利5,865,796所述。
本文使用的术语“粘膜给药”包括但不限于口服、鼻内、***内、直肠内、气管内、肠内和眼部给药。
粘膜途径，特别是鼻内、气管内和眼部给药，优选适用于防护自然暴露于环境中的病原体如RSV、流感病毒和感冒病毒，或者变应原如禾草和豕草花粉以及房尘螨。增强CMI应答可增强对随后遇到的靶抗原如变应原或微生物媒介的防护作用。
在本发明方法的一个实施方案中，第一次和/或第二次和/或随后的免疫中的所有给药的部位，均通向相同的***。
在本发明另一个优选的实施方案中，可将NOI或蛋白给予至从宿主受试者分离的细胞。在该优选的实施方案中，优选将编码来自肿瘤相关抗原(TAA)的EOI的NOI给予至专职抗原呈递细胞(APC)，如树突细胞。
APC可来自宿主受试者，经离体修饰可表达EOI，然后转移回宿主受试者中诱导针对TAA的增强的CMI应答，以诱发抗肿瘤应答。树突细胞被认为是激发增强的CMI应答的最有效APC，因为表达的EOI必须由专职APC获得、加工并呈递至T细胞(Th1和Th2辅助细胞，以及CD8+T细胞)，以诱导增强的CMI应答。在另一个实施方案中，来自宿主受试者的癌细胞可经原位或体外修饰。
NOI粒子给药
使用粒子介导的方法给予NOI或蛋白制剂已为本领域所知。为此，上述NOI一经制备并适当纯化后，可使用多种本领域已知的技术包被于核心载体粒子上。载体粒子选自在一般用于从基因枪设备进行细胞内传送时的粒子大小范围内具有适当密度的材料。最佳载体粒子大小当然取决于靶细胞直径。
“核心载体”是指这样一种载体，其上包被有客体核酸(如DNA、RNA)，以使其具有确定的粒子大小以及足够高的密度，以获得穿过细胞膜所需的动量，以便使用粒子介导技术传递客体分子(参见例如美国专利5,100,792)。核心载体通常包括诸如钨、金、铂、铁氧体、聚苯乙烯和胶乳等材料。参见例如Particle Bombardment Technology forGene Transfer，(1994)Yang，N.编著，Oxford University Press，NewYork，NY第10-11页。优选钨和金粒子。钨粒子很容易制成直径0.5～2.0微米的平均大小。金粒子或微晶金(如金粉A1570，购自EngelhardCorp.，East Newark，NJ)也可用于本发明。金粒子具有均一的大小(购自Alpha Chemicals的粒子大小为1～3微米，购自Degussa，SouthPlainfield，NJ的具有一定范围的粒子大小，包括0.95微米)。微晶金具有各种粒子大小分布，通常在0.5～5微米的范围内。然而，微晶金具有不规则的表面积，可被核酸高效包被。
已知并且已经描述了许多将NOI或蛋白包被或沉淀于金或钨粒子上的方法。多数方法通常是将预定量的金或钨与质粒DNA、CaCl2和亚精胺组合到一起。产生的溶液在包被过程中不断搅拌，以确保反应混合物的均一性。NOI沉淀后，包被的粒子可转移至适当的膜上，使其在使用前干燥，包被于样品模块或样品盒(cassette)表面，或者装载于用于特定基因枪设备的传递盒上。
“粒子传送设备”是指不使用常规针刺穿皮肤而将粒子组合物经皮传递的设备。用于本发明的粒子传送设备在整个本文件中讨论。适用于粒子介导的传送的各种粒子加速设备为本领域所公知，并且均可用于实施本发明。目前的设备设计采用***、电或气体放电来驱使包被的载体粒子飞向靶细胞。包被的载体粒子本身可释放地附着于移动的载体片上，或者可除去地附着于有气流经过的表面，从表面上抬升粒子，使之加速，飞向靶标。一种气体放电设备的实例在美国专利5,204,253中记载。一种***型设备在美国专利4,945,050中记载。一种氦放电型粒子加速设备的实例为PowderJect XR设备(PowderJectVaccines，Inc.，Madison)，WI，该设备在美国专利5,120,657中记载。适用于本发明的一种放电设备在美国专利5,149,655中记载。所有这些专利的公开内容通过援引的方式纳入本文。
或者，粒子型NOI或蛋白组合物可使用无针注射器装置经皮给药。例如，包含本发明NOI的粒子组合物可使用常规制药方法如简单蒸发(结晶)、真空干燥、喷雾干燥或冻干制得。如果需要，粒子可使用公有的国际公布WO 97/48485中记载的技术进一步增加密度，该公布的内容通过援引纳入本文。然后这些粒子组合物可由无针注射器***传送，所述无针注射器***例如在国际公布WO 94/24263、WO 96/04947、WO 96/12513和WO 96/20022中所记载，其全部内容通过援引的方式纳入本文。当由上述无针注射器***传送包含抗原或变应原的粒子时，粒子大小通常大约在0.1～250微米范围内，优选在大约10～70微米范围内。大于约250微米的粒子仍可由这些设备传送，其上限为粒子大小将导致皮肤细胞不利损伤的点。传送的粒子穿透靶表面的实际距离取决于粒子大小(如标称粒子直径，假定粒子大致为球状)、粒子密度、粒子与表面碰撞时的初始速度以及靶皮肤组织的密度和运动粘度。在这点上，用于无针注射的最佳粒子密度通常在约0.1到25g/cm3的范围，优选在约0.9到1.5g/cm3之间，注射速度通常在约100到3,000m/sec的范围内。在适当的气压下，平均直径为10～70Rm的粒子在喷嘴处被加速到接近驱动气流的超音速的速度。
将粒子组合物或包被的粒子以与药物制剂相容的方式、以实现本发明目的的有效剂量给予至个体。所给予组合物的量(例如约0.1mg至1mg，更优选1到50μg抗原或变应原)取决于待试验的个体。精确的需要量依据待治疗个体的年龄和总体状况而变化，本领域技术人员在阅读本说明书后可容易地确定合适的有效量。
金或钨微粒还可用作运输物质，如WO 93/17706和Tang petal.，Nature(1992)356：152中所述。在这种情况下，在氯化钙和亚精胺存在的条件下，NOI沉淀于微粒上，然后使用无针的设备整个高速射入真皮或表皮中来进行给药，例如美国专利4,945,050和5,015,580，以及WO 94/24243所述。用于接种宿主受试者的NOI的数量取决于多种因素，例如用于表达抗原的启动子的强度，表达产物的免疫原性，欲给药的哺乳动物的状况(如体重、年龄和总体健康状况)，给药方式，以及制剂类型。通常，成年人用于预防或治疗的适当剂量为约1pg至约5mg，优选约10pg至约1mg，最优选约25pg至约500pg。粒子介导的传送技术与其他的NOI给药方式相比，发现具有显著的优越性。Fynan et al.(1995)Int.J.Immunopharmacology 17：79-83，Fynan et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11478-11482，以及Raz et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9519-9523。这些实验研究了将基于核酸的疫苗通过粒子介导传送至浅表皮肤和肌肉组织。使用基因枪取得极好效果的一个可能原因是NOI可传送至细胞内，而通过肌内注射只能传送至细胞外。
靶抗原(TA)给药之间的时间间隔优选为约48小时到约192小时。靶抗原(TA)给药之间的时间间隔更优选为约72小时到约168小时。靶抗原(TA)给药之间的时间间隔更加优选为约72小时到约144小时。
哺乳动物宿主受试者
本文使用的术语“哺乳动物宿主受试者”是指脊索动物亚门(subphylum cordata)中的任何成员，包括但不限于：人类和其他灵长类，包括非人类灵长类如黑猩猩和其他类人猿和猴子种类；家畜，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养动物，如狗和猫；实验动物，包括啮齿动物如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟类，包括家禽、野生鸟和猎鸟，如鸡、火鸡和其他鹑鸡类、鸭、鹅等等。优选的动物包括用于体育项目的动物，如供赛马比赛用的马或者供超越障碍比赛用的马。
该术语并不指明特定的年龄。因此，成年和新生个体均涵盖于其中。本文所述方法可用于上述任何脊椎动物种类，这是由于所有这些脊椎动物的免疫***的机制是类似的。如果是哺乳动物，受试者优选为人类，但也可以是家畜、实验受试者或宠物动物。
预防和/或治疗
本发明方法或过程可广泛应用于接种法，并且涉及开发预防性和/或治疗性疫苗(包括免疫治疗疫苗)。应该理解，本文所有提及的治疗包括治愈、缓和和预防治疗。
在本发明方法中，可单独采用本文所述的NOI或蛋白作为组合物的一部分，所述组合物例如但不限于药物组合物或者疫苗组合物或者免疫治疗组合物，用以预防和/或治疗T细胞介导的免疫障碍。给予NOI或蛋白或者包含NOI或蛋白的组合物可出于“预防”或“治疗”目的。本文使用的术语“治疗性”或“治疗”包括以下任意方面：预防感染或再感染；减轻或消除症状；减少或完全消除病原体。治疗可以起到预防性作用(感染前)或者治疗性作用(感染后)。
预防或治疗包括但不限于诱发针对NOI的有效的CMI免疫应答，和/或缓和、减少、治愈或至少部分中止由T细胞介导的免疫障碍的症状和/或并发症。当预防性给药时，通常在任何症状出现之前给予本发明的组合物。预防性给予本发明的NOI或者组合物是为了防止或改善任何后来发生的感染或疾病。当治疗性给药时，通常在感染或疾病的症状的起始时(或者稍后)给予本发明的NOI或者组合物。因此，本发明组合物可在预期暴露于引起疾病的媒介物或疾病状态之前给药，或者在感染或疾病起始之后给药。
预防性还是治疗性给予NOI或蛋白(单独或者作为组合物的一部分)哪一种更加适合，通常要取决于疾病的性质。举例来说，本发明的免疫治疗组合物可用于免疫治疗方案中，通过使用肿瘤细胞或其抗原性组分接种，积极地诱导肿瘤免疫。后一种治疗形式较为有利，因为该免疫持续时间长，并且通常认为，去除肿瘤的最佳途径之一是诱导强烈的特异性抗肿瘤CTL应答。另一方面，疫苗组合物可优选而非必要地预防性应用，以诱导针对随后遇到的与靶抗原相关的抗原或其部分(如表位)的有效的CMI应答。
预防或治疗有效量
在本发明环境中，给予宿主受试者的NOI或蛋白的剂量，应该足以在受试者中产生一段时间的有益的预防性或治疗性CMI应答。
本文使用的术语“预防或治疗有效剂量”是指足以诱发针对特异性靶抗原的一个或多个EOI的增强的CMI应答，和/或缓和、减少、治愈或至少部分中止由疾病如T细胞介导的免疫障碍导致的症状和/或并发症的剂量。
剂量
预防或治疗可通过在单一时间点或多个时间点单次直接给药实现。给药还可给至单个或多个部位。某些给药途径，如使用滴眼液进行粘膜给药，可需要较高的剂量。本领域技术人员可调整剂量和浓度以适应具体的给药途径。有利的是，实施例说明NOI或者含NOI的组合物的单次剂量通常足以实现增强的CMI应答。
病症和疾病
因为本发明方法诱发增强的CMI应答，所以本方法可用于防护免受后来病原体如病毒、细菌、寄生虫或者其他感染媒介物的感染。靶抗原优选为与感染性疾病相关的病原体或抗原，变应原或者癌症。感染性疾病的实例包括但不限于病毒、细菌、分枝杆菌和寄生虫疾病。变应原的实例包括但不限于植物花粉、尘螨蛋白、动物皮屑、唾液和真菌孢子。肿瘤相关抗原(TAA)的实例包括但不限于活的或者照射的肿瘤细胞、肿瘤细胞提取物以及肿瘤抗原的蛋白亚基。该抗原还可为用于避孕的***蛋白。在某些实施方案中，该抗原为环境抗原。环境抗原的实例包括但不限于呼吸道合胞体病毒(“RSV”)、流感病毒和感冒病毒。经粘膜入侵的病原体还包括引起呼吸道合胞体病毒、流感、其他上呼吸道疾病的病原体，以及引起肠感染的媒介物。
还有其他一些疾病，针对它们的增强的CMI应答也很重要，其中已知的几个实例为：由病毒引起的感染和疾病，例如但不限于HIV、单纯疱疹、带状疱疹、丙型肝炎、乙型肝炎、流行性感冒、非洲淋巴细胞瘤病毒(Epstein-Barr virus)、麻疹、登革热(dengue)、HTLV-1和人***瘤病毒(HPV)(如HPV 16)；由细菌引起的疾病，例如但不限于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和李斯特菌属种(Listeria sp)、衣原体(Chlamydia)、分枝杆菌(Mycobacteria)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、军团菌(Legioniella)以及致肠病的、肠毒性的、肠侵染性的、致肠出血性的和肠聚集性的大肠杆菌；以及由病原性原生动物引起的疾病，包括但不限于疟疾、巴贝虫(Babesia)、血吸虫(Schistosoma)、Toxiplasma和犬弓蛔虫(Toxocaracanis)，或者由原生动物寄生虫弓形虫(Toxoplasma)和锥虫(Trypanosoma)引起的疾病。而且，本文所述的给药方案预期在针对T细胞应答起保护作用的癌症形式的免疫中具有价值。可使用本发明方法和组合物治疗的哺乳动物癌症的实例包括但不限于黑素瘤、转移癌(metastases)、腺癌、胸腺癌、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、非霍杰金淋巴瘤、霍杰金淋巴瘤、白血病、子宫癌、乳腺癌、***癌、卵巢癌、***、膀胱癌、肾癌、胰腺癌等等。在一个实施方案中，癌症为与HPV(如HPV 16)有关的癌症，例如由HPV引起的癌症。此类癌症可以是***。
癌症
在本发明方法中的一个优选的实施方案中，使用编码来自肿瘤相关靶抗原(TAA)的EOI的NOI(或者包含表位的蛋白)，使得可以开发用于癌症治疗的靶抗原特异性疫苗。给予编码来自TAA的EOI的NOI，并且任选地给予编码免疫调节分子的NOI，提供了诱发特异性增强的CMI应答的强有力的***，这体现在以下方面：预防宿主受试者中发生癌症的风险增加(预防性免疫)，预防首次手术后疾病复发(抗转移接种)，或者作为增加体内T细胞数目的工具，以提高它们消灭扩散肿瘤的效果(治疗已发生的疾病)。而且，本发明方法可通过处理离体细胞后将其转移回肿瘤载体中，用于在宿主受试者中诱发增强的CMI应答(也称过继免疫治疗)。使用本发明方法或过程将NOI给予宿主受试者，可在癌症如黑素瘤的任何迹象出现之前进行(预防接种)，或者用于介导患有癌症如黑素瘤的哺乳动物的疾病的消退(治疗或免疫治疗接种)。
在一个实施方案中，NOI编码来自HPV(如HPV 16)的抗原，例如E6或者E7。
活化的T细胞
在其他方面，本发明涉及一种制备活化的T细胞的方法。在最一般意义上，该方法包括向宿主受试者给予，优选经皮给予编码靶抗原的预先选择的EOI的NOI，所述靶抗原能够以增强的T细胞应答的方式增强CMI应答。根据本发明的这一方面，从宿主的***中回收T细胞备用。
可以预见特异性活化的T细胞的多种潜在用途。例如，在人类治疗的情况下，可考虑将特异性活化的T细胞离体培养，并给予至人体，以治疗病毒感染或癌症患者。根据本发明的这一方面，T细胞通过如下过程制备：体内给予NOI，然后分离T细胞，在适当的生物应答调节剂和/或免疫调节剂和/或佐剂(例如但不限于肽、细胞因子和抗原呈递细胞)存在的条件下进行体外增殖。
同源体
本发明中使用的(由NOI编码的)蛋白(包括蛋白抗原)，例如Gag、nef和/或RT，可与天然存在的形式具有同源性和/或序列同一性。类似地，能够表达此类蛋白的NOI编码序列通常与天然存在的序列具有同源性和/或序列同一性。确定核酸和氨基酸“序列同一性”的技术也为本领域所公知。通常，此类技术包括确定基因的mRNA的核苷酸序列，和/或确定由其编码的氨基酸序列，并将这些序列与第二条核苷酸或氨基酸序列对比。
通常，“同一性”是指两条多核苷酸或多肽序列中，逐个核苷酸或者逐个氨基酸相比，分别完全对应。两条或多条序列(多核苷酸或氨基酸)可通过测定其“同一性百分率”来进行比较。两条序列的同一性百分率，不论是核酸还是氨基酸序列，是两条比对的序列之间完全匹配的数目，除以较短序列的长度，再乘以100。
Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)的局部同源算法提供了核酸序列的近似比对方法。使用由Dayhoff，Atlas of Protein Sequences and Structure，M.O.Dayhoff编著，5增补本3：353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.，USA开发的，并由Gribskov，Nucl.Acids Res.14(6)：6745-6763(1986)标准化的评分矩阵，可将上述算法应用于氨基酸序列。由the Genetics Computer Group(Madison，WI)开发的“BestFit”实用程序提供了该算法用于确定序列的同一性百分率的示例性实现。该方法的默认参数记载于Wisconsin Sequence Analysis PackageProgram Manual，Version8(1995)(购自Genetics Computer Group，Madison，WI)。在本发明环境中，确定同一性百分率的优选方法是使用University of Edinburgh拥有版权的、由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发的、由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)发行的MPSRCH软件包。
由该软件包可进行Smith-Waterman算法，其中评分表采用默认参数(例如空位开放罚分为12，空位扩展罚分为1，空位为6)。由该数据产生的“匹配”值反映了“序列同一性”。其他适当的可计算序列之间同一性百分率或相似性的程序为本领域所公知，例如，另一个比对程序是以默认参数使用的BLAST。例如，BLASTN和BLASTP可以下列默认参数使用：genetic code(遗传密码)＝standard(标准)；filter(过滤器)＝none(无)；strand(链)＝both(两条)；cutoff(截止值)＝60；expect(预期值)＝10；Matrix(矩阵)＝BLOSUM62；Descriptions(说明)＝50sequences(50条序列)；sort by(排序)＝HIGH SCORE(高分)；Databases(数据库)＝non-redundant(非冗余)，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。关于这些程序的详细信息，可参看以下网址：http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
或者，可由以下方法确定同源性：在同源区之间可形成稳定双链体的条件下使多核苷酸杂交，然后使用单链特异性核酸酶消化，确定消化片段的大小。以该方法进行测定，当两条DNA或者两条多肽序列在确定的长度上，序列显示至少约80％～85％，优选至少约90％，最优选至少约95％～98％的序列同一性时，它们相互之间“基本同源”。
本文使用的基本同源或者同源还指与特定的DNA或多肽序列显示完全同一性的序列。基本同源或同源的DNA序列可通过DNA印迹杂交实验，在具体的体系所确定的例如严格条件下进行识别。例如，严格的杂交条件可包括50％甲酰胺、5×登哈特溶液、5×SSC、0.1％SDS和100pg/ml变性的鲑鱼***DNA，洗涤条件可包括在37℃下，2×SSC、0.1％SDS，随后在68℃下，1×SSC、0.1％SDS。确定适当的杂交条件在本领域的技术范围之内。
测定方法
本发明方法的效果可由以下步骤验证：(i)如本文所述将NOI给予宿主受试者，例如人类受试者或者实验动物如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、山羊、猕猴或者黑猩猩；(ii)然后从宿主受试者的血液、脾脏或淋巴组织中收集细胞；(iii)测定组织中是否存在活化的T细胞，例如已被致敏可杀伤或溶解产生感染媒介物组分的细胞的T细胞。
一旦完成NOI给药，即从宿主受试者的淋巴组织中回收T细胞。优选的淋巴组织是***组织，最优选接近NOI给药部位的、药物所流向的***组织。本文使用的词语“临近的***”意指靠近NOI给药部位的***。
这种***在物理上位于NOI给药部位附近，或者在给药部位所流向的区域，还包括那些在物理上与给药部位相距较远的所流向的***。
本测定方法的最后一步包括测定T细胞是否被活化。通常，可测量T细胞活化水平的测定方法包括但不限于放射性铬释放测定，或者其他的放射性同位素测定，或者单细胞测定。此外，还可以采用使用活体株和/或细胞分选仪的单细胞T细胞测定。优选的测量T细胞活性的方法包括：将杀伤有效量的T细胞与细胞表面显示候选EOI的MHC匹配的靶细胞接触；使接触维持一段时间，以使T细胞溶解靶细胞；测量T细胞介导的溶解靶细胞的程度。然而，可以采用能够检测特异性T细胞应答的任何方法，包括但不限于铬释放测定、单细胞测定或者细胞间缀合物测定。
在一个实施方案中，本发明提供了一种测试诱发T细胞应答的方法的有效性的检测方法，其中诱发T细胞应答的方法与本文所述的方法相同。因此，该方法包括(i)第一次免疫，包括向受试者进行相隔1到14天的至少两次给药，其中各次给药包括给予编码T细胞表位的所研究的核酸(NOI)，以及任选地，
(ii)第二次免疫，包括向受试者给予至少一次(a)编码T细胞表位的NOI，或者(b)包含该T细胞表位的蛋白，
其中，
-第一次免疫的第一次给药和
-第二次免疫的第一次给药
之间的时间为21到365天，
其中该测定包括对于哺乳动物受试者进行该方法，然后测量受试者中对所述表位具有特异性的活化或记忆T细胞的水平。
若出现以下情况即可认为实现了较高水平的T细胞应答：(i)在第一次免疫的所有给药时，由首次给药产生的活化T细胞水平还未返回至基础水平，以及(b)第二次免疫时T细胞已经返回至基础水平。因而上述测定可用于确定一种给定的诱发T细胞应答的方法相对于活化T细胞水平来讲，第一次和第二次免疫的时间是否合适。在一个实施方案中，该测定包括确定(i)第一次免疫的给药是否都落在第一次免疫的第一次给药和活化T细胞水平下降至基础水平之间的时间段内，和/或(ii)第二次免疫的第一次给药是否发生于活化T细胞水平下降至基础水平之后。
其他方面
在另一方面，还提供了一种选择性诱发增强的体液应答而无需诱发相关的CMI应答增强的方法，其中该方法包括向宿主受试者给予至少三次编码TA上的一个或多个EOI的NOI，其中各次NOI给药之间的时间间隔为约48小时，并且其中该方法可在哺乳动物宿主受试者中有效提供针对该或各表达的EOI的增强的体液免疫应答。
在另一方面，还提供了一种诱发增强的体液应答的方法，其中该方法包括向宿主受试者给予至少三次编码TA上的一个或多个EOI的NOI，其中各次NOI给药之间的时间间隔为约28天，并且其中该方法可在哺乳动物宿主受试者中有效提供增强的CMI应答，该应答可帮助增强针对该或各表达的EOI的体液免疫应答。
组合物
本发明提供了可用于预防和/或治疗T细胞介导的免疫障碍的组合物。在一个实施方案中，该组合物是药物组合物。在另一个优选的实施方案中，该组合物是免疫治疗组合物。在更加优选的实施方案中，该组合物是疫苗组合物。该组合物可包括治疗或预防有效量的、本发明上述的编码TA上的EOI的NOI。该组合物还可包括载体，例如制药上或者免疫学上可接受的载体。制药上可接受的载体或者免疫学上可接受的载体部分由所给予的具体的组合物以及给予该组合物所用的具体的方法确定。因此，有多种本发明的药物组合物或者疫苗组合物或者免疫治疗组合物的适当制剂。
制剂
NOI或蛋白可配制成药物组合物或者免疫治疗组合物或者疫苗组合物。这种制剂包括NOI或蛋白，并结合有制药上可接受的载体，例如无菌水或者无菌等渗盐水。这种制剂可以适于快速浓注给药(bolusadministration)或者持续给药的形式制备、包装或者销售。可注射制剂可以单位剂量的形式制备、包装或者销售，例如在含有防腐剂的安瓿或者多剂量容器中。制剂包括但不限于悬浮液、溶液、油性或水性介质中的乳浊液、糊剂以及可植入的缓释或者可生物降解的制剂。这种制剂可进一步包括一种或多种附加成分，包括但不限于助悬剂、稳定剂或者分散剂。在用于肠胃外给药的制剂的一个实施方案中，活性成分以干燥(例如粉状或颗粒)的形式提供，首先使用适当的介质(例如无热原的无菌水)复水(reconstitution)，然后肠胃外给予复水的组合物。药物组合物可以无菌的可注射的水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或者销售。这种悬浮液或溶液可根据现有技术配制，除活性成分外，还可包括附加成分，例如本文所述的分散剂、湿润剂或者助悬剂。这种可注射的无菌制剂可使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或者溶剂(例如水或1，3-丁二醇)制备。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格溶液、等渗氯化钠溶液以及不挥发性油如合成的单或二甘油酯。
其他可用于肠胃外给药的制剂包括包含微晶体形式、脂质体制剂形式或者作为可生物降解的聚合物体系的一个组分的活性成分的制剂。缓释或植入组合物可包括制药上可接受的聚合物材料或者疏水材料，例如乳胶、离子交换树脂、微溶聚合物或者微溶盐。
本发明还包括一种可增强针对靶抗原上的EOI的CMI应答的试剂盒。这种试剂盒包括编码TA上的EOI的NOI，和/或包含该表位的蛋白。该试剂盒还可包括佐剂，优选为与NOI或蛋白一起给药或者作为其一部分给药的基因佐剂，以及NOI或蛋白给药的说明书。其他优选的试剂盒组件包括用于NOI或蛋白给药的用药器。本文使用的术语“用药器”是指用于向宿主受试者全身或粘膜或经皮施用NOI的任何装置，包括但不限于皮下注射器、基因枪、粒子加速装置、雾化器、滴管、支气管镜、栓剂、可放入***的浸渍或包被的材料如棉塞、冲洗制剂、用于***冲洗的溶液、保留灌肠制剂、栓剂、或者用于直肠或结肠冲洗的溶液。
实施例
现将以下发明仅以示例性方式并参考以下附图进行进一步说明。以下实施例仅仅说明本发明，以帮助本领域技术人员制备和利用本发明。实施例并非意在以任何方式限制本发明的范围。已经努力确保所使用的有关数字(如数量、温度等)的准确性，但是理所应当允许一些实验误差和偏差。
附图说明
图1提供了在一周内，分别在第7天(D 7)、第0和7天(D 0，7)或者第0、2、4和7天(D 0，2，4，7)经1、2或4次NOI给药后的(CD8+T细胞)应答。每次NOI给药注射1针或2针，在一组中，LT佐剂与NOI同时给药。
图1A显示给予ICP27单基因质粒后的CD8+T细胞应答。
图1B显示给予PJV7630多基因质粒后的CD8+T细胞应答。
图2显示使用成组NOI给药(clusterd NOI adminstration)保护小鼠免受感染攻击。
图3A显示给予ICP27单基因质粒成组给药的最佳时间间隔。
图3B显示进行HbsAg单基因质粒的成组NOI给药后获得的细胞应答。
图3C显示进行HbsAg单基因质粒的成组NOI给药后获得的抗体效价。
图4A显示以0、1、2、4和6天的给药时间间隔，进行多基因质粒(PJV7630)的成组NOI给药后1周的ELISPOT测量结果。
图4B显示以0、1、2、4和6天的给药时间间隔，进行多基因质粒(PJV7630)的成组NOI给药后3周的ELISPOT测量结果。
图5A是显示每次“给药”由1到4次XRI给药以及各次给药之间的间歇期组成的示意图。
图5B显示基因LT佐剂和成组NOI给药方案相结合而获得的、有关IFN-γ释放的CMI应答。
图5C显示基因LT佐剂和成组NOI给药方案相结合而获得的抗体应答。
图6A显示家猪经第一次成组免疫后获得的IFN-γELISPOT数据。
图6B显示经pPJV7630免疫的猪(4只)在抗原给药部位出现的红斑的平均面积。
图7显示家猪中抗HA抗体应答。
图8显示质粒pPJV1671，它是编码流感A/巴拿马/2007/99(H3N2)的血凝素(HA)抗原的人DNA疫苗载体。
图9显示H3巴拿马HA天然序列与由pPJV1671编码的H3巴拿马HA的比较以及其共有序列。
图10显示pPJV2012质粒图。
图11显示pPJV7563质粒图。
图12提供pPJV7563质粒的核苷酸序列。
图13提供构建PJV7563的流程图。
图14(i)到(viii)提供在构建pPJV7563中的关键质粒的特征图。
图15提供了衍生制备质粒WRG7074和WRG7128的流程图。
图16(i)到(v)提供其他的关键质粒特征图。
图17到22涉及表达HIV抗原的构建体以及编码HIV抗原的序列。
图23到28涉及使用HPV E6和E7抗原免疫。
图29到38显示研究使用本发明方法所获得的应答的其他实验结果。
常规技术
除非另有说明，本发明中使用的重组DNA技术是本领域技术人员熟知的标准方法。该技术在许多文献来源中有所记载和解释，例如J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley和Sons(1984)；J.Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)；T.A.Brown(编者)，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，第1和2卷，IRLPress(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编者)，DNA Cloning：APractical Approach，第1-4卷，IRL Press(1995和1996)；以及F.M.Ausubel et al.(编者)，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括到目前为止的所有更新)，并且通过援引的方式纳入本文。本发明方法包括将编码TA上的至少一个或多个EOI的NOI直接在体内引入受试者的组织中，以由受试者的组织细胞表达该EOI。
本发明的NOI构建体可由本领域技术人员熟知的常规方法制备。构建DNA质粒或者重组载体的方法在常规文件中记载，例如Burger etal.，J.Gen.Virol.，72：359-367(1991)，且为本领域所公知。另外参见Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York；以及Ausubel et al.，1997，Current Protocols in Molecular Biology，Green & Wiley，New York.
举例来说，编码TA上的一个或多个EOI或者与TA上的已知EOI的同源性较高，足以诱导CMI应答的序列的NOI，可通过从多种微生物中分离NOI的技术中记载的下列已知熟知的方法来获得。或者，编码TA上的EOI的NOI可在核酸合成仪中合成。因此，本发明包括合成形式的编码TA上的EOI的NOI。包含该分离的NOI的，优选在宿主细胞中能够指导由NOI编码的TA上的EOI表达的其他重组细菌质粒或者病毒载体；以及包含该载体的细胞，不论是真核细胞还是原核细胞，优选真核细胞，也可由已知技术制备。为了确保TA上的EOI可由NOI在质粒或病毒载体形式中表达，将NOI有效连接于在宿主细胞中能够促使抗原高水平表达的启动子/调控区。本领域中有许多此类启动子/调控序列可用，包括但不限于，例如人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子序列、SV40早期启动子、劳氏肉瘤病毒启动子以及其他哺乳动物启动子/增强子序列。本文使用的术语“启动子/调控序列”是指表达与该启动子/调控序列有效连接的NOI所需的DNA序列。在某些情况下，该启动子/调控序列可以组织特异性方式作用，即该启动子/调控序列只能促使在特定组织类型的细胞中表达。除非另有说明，选择任何特定的质粒载体或者其他的DNA载体或者病毒载体并非本发明的限制因素，当阅读本文公开内容后，其他DNA或者病毒载体可代替本文所公开的载体。选择具体的启动子/调控序列并将该启动子/调控序列与编码所需抗原的DNA序列有效连接是本领域的常规技术。该技术为本领域所公知，并记载于，例如Sambrook(ibis)和Ausubel(ibid)。
使用下列常规方法进行以下实施例1～5中所述的实验。每项实验中，含有EOI的NOI包被于金粒子上，以提供根据本发明的示例性组合物。将包被的粒子给予动物受试者，然后评估组合物诱发抗原特异性T细胞和/或抗体应答的能力。
核心载体粒子包被
直接在1.5mL Eppendorf管中称取适当重量的金粒子。然后加入大约300μl 0.05M亚精胺溶液使金悬浮，并使用超声波仪使金分散。然后将含相关DNA质粒的溶液(约50μl)以2μg DNA/mg金的浓度加入金/亚精胺溶液中。DNA溶液中可包含一种类型的质粒，或者在某些实验中，两种或多种质粒(例如基因佐剂)可在与金溶液混合之前先相互混合。轻轻搅拌DNA/金混合物，搅拌时滴加300μl 10％ CaCl2溶液。使DNA/金粒子在室温下沉淀，然后短暂离心(10～15秒)使金沉淀成团。沉淀使用约800μl EtOH洗涤三次。然后将DNA/金粒子悬浮于0.03mg/mL PVP(聚乙烯吡咯烷酮)的EtOH溶液中，使其浓度达到每3mL PVP溶液中含有大约1mg DNA/金。然后将该溶液如前所述包被于Tefzel管上。参见例如PCT专利申请PCT/US95/00780以及美国专利5,733,600；5,780,100；5,865,796和5,584,807，其公开内容通过援引的方式纳入本文。
乙型肝炎表面抗原(HBSAG)
构建质粒(PWRG7128构建体)
如下构建乙型肝炎表面抗原(HBsAg)载体质粒。为了产生HBsAg编码区，将pAM6构建体(从American Type Culture Collection″ATCC″获得)使用NcoI切割，并使用绿豆核酸酶处理以去掉X抗原的起始密码子。然后将产生的DNA使用BamHI切割，并使用T4 DNA聚合酶处理以产生DNA平端，以及建立HBsAg表达盒。该HBsAg表达盒为1.2kB的片段。将含有全长人CMV(Towne株)立即早期启动子(带有增强子)的质粒构建体pPJV7077(Schmaljohn et al.(1997)J.Virol.71：9563-9569)使用HindIII和BglII切割，然后使用T4 DNA聚合酶和小牛碱性磷酸酶处理以产生DNA平端，将HBsAg表达盒与该质粒连接，产生pWRG7128构建体。
体外免疫测定
使用ELISA测定测试个体小鼠的血清样品中，对HBsAg具有特异性的抗体。为进行ELISA，将Falcon Pro Bind微量滴定板在4℃下使用0.1μg/孔、在PBS(磷酸盐缓冲液，BioWhittaker)中的纯化的HBsAg(BioDesing)包被过夜。该板在室温(RT)下使用5％奶粉/PBS封闭1小时，然后使用冲洗缓冲液(10mM Tris缓冲盐水，0.1％ Brij-35)洗涤3次，将在稀释缓冲液(2％奶粉/PBS/0.05％吐温20)中稀释的血清样品加入板中，在RT下温育2小时。将板洗涤3次，将在稀释缓冲液中以1∶8000稀释的生物素化山羊抗小鼠抗体(SouthernBiotechnology)加入板中，RT下温育1小时。温育后，将板洗涤3次，然后加入在PBS中以1∶8000稀释的链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物(Southern Biotechnology)，将板在RT下再温育1小时。另外洗涤3次后，将板洗涤3次，然后加入TMB底物溶液(BioRad)，30分钟后以1N H2SO4中止反应的进行。读取450nm的吸光度。将样品与已知效价的标准品对照，计算端点效价(endpoint titer)。
为进行细胞免疫测定，将取自经过免疫的动物的脾脏的脾细胞的单细胞悬液，在对应于Balb/c小鼠中的已知CD8表位的肽存在的条件下进行体外培养。该肽溶于DMSO(10mg/ml)中，并以10μg/ml稀释于培养物中。该肽的序列为IPQSLDSWWTSL(SEQ ID NO：20)。
为进行IFN-γ ELISPOT测定，将Millipore Multiscreen多孔滤膜板使用50μl 15μg/ml溶于0.1M无菌碳酸盐缓冲液(pH9.6)的抗IFN-γ抗血清(Pharmingen)在4℃下包被过夜。将板使用无菌PBS洗涤6次，然后使用含10％胎牛血清(FBS)的组织培养基在RT下封闭1～2小时。除去培养基，将脾细胞分装到孔中，每孔共1×106个细胞。对于所加入的经过免疫的动物的细胞不足1×106的孔，再加入来自未免疫动物的细胞，使其总数达到1×106。将细胞在上述肽存在的条件下在培养箱中过夜培育。然后将板使用PBS洗涤2次，使用蒸馏水洗涤1次，然后再使用PBS洗涤3次。将生物素化抗IFN-γ单克隆抗体(Pharmingen)加入板中(50μl 1μg/ml溶于PBS的溶液)，RT下培育2小时。将板使用PBS洗涤6次，然后加入50μl链霉亲和素碱性磷酸酶缀合物(1∶1000溶于PBS，Pharmingen)，RT下培育2小时。将板使用PBS洗涤6次，加入碱性磷酸酶显色底物(BioRad)，使反应进行到出现暗点。用水洗涤3次以中止反应进行。使板风干，在显微镜下数出斑点数。
HIV-1 GP120抗原
构建编码HIV-1 GP120抗原的质粒
如下构建编码HIV-1 gp120的质粒载体。使用Bluescript(Stratagene，La Jolla，CA)质粒骨架、人巨细胞病毒(hCMV)立即早期启动子(Fuller et al.(1994)Aids Res.Hum Retroviruses  10：1433)和SV40病毒晚期多腺苷酸位点开始构建载体。hCMV启动子包含于619碱基对(bp)的AccII片段中，并从立即早期转录起始位点向上游延伸522bp，向下游延伸96bp。SV40病毒晚期多腺苷酸序列包含于来自pSV2dhfr(以前可购自Bethesda Research Laboratories，分类号5369SS)的大约800bp的BamHI-BglII片段。首先，构建编码HIV-1gp160的质粒，称为“pC-Env”。该质粒包含来自LAV-1BRU(ATCC编号53069，GenBank编号K02013)的2565bp的KpnI-XhoI片段，它起始于编码成熟gp160氨基末端第4位氨基酸的序列。env编码序列片段被置于紧邻一个160bp的合成片段的下游，并与其框内融合，该合成片段如上所述编码单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)信号肽，没有成熟gD氨基末端的氨基酸(Fuller et al.(1994)Aids Res.HumRetroviruses 10：1433)。
然后如下构建编码HIV-1 gp120的质粒，本文称之为“pCIA-Env/T”。pCIA-Env/T质粒编码HIV-1 gp120的截短形式，并且除了env编码序列在第8188位核苷酸的HindIII位点被截短外，与pC-Env构建体是相同的。这样产生了截短型gp160翻译产物，截去点位于gp120/gp41加工位点下游128氨基酸残基处。
体外免疫测定
在第5周和第6.5周(分别为首次免疫后和加强免疫后)采集样品，使用ELISA检测针对HIV gp120抗原的血清抗体应答。为进行ELISA，将Costar高结合性EIA板使用0.3μg/孔的溶于50μl PBS的重组HIV gp120(Intracel)，通过在4℃下过夜培育来进行包被。将板洗涤3次，使用溶于PBS的2％BSA在室温下封闭2小时。将血清的连续稀释液加入包被的板中，37℃下培育1小时。洗涤后，将板使用与碱性磷酸酶结合的羊抗小鼠IgG(H+L)(BioRad)的1∶1500的稀释液培育，然后使用磷酸对硝基苯酯(PNPP)(BioRad)显色，在405nm处读取OD。
使用流式微珠测定(cytometric bead assay)来测量由脾细胞分泌的抗原特异性IFN-γ的量。96孔板的每个孔中加入1×106个脾细胞，并且在仅有培养基(阴性对照)的条件下激发，或者在含有1μg/ml具有下列序列的HIV gp120肽的培养基中激发：RIQRGPGRAFVITGK(SEQ ID NO：21)。在37℃、5％CO2的条件下培育48小时后，去掉上清液，通过流式微珠测定(BD Biosciences)来测量IFN-γ的水平。
HSV-2抗原
构建编码HSV-2 ICP27的质粒
构建编码ICP27的DNA疫苗，然后与当前各种佐剂质粒载体的缀合物相结合，以提供疫苗组合物。免疫后，经过免疫的动物使用HSV-2攻击，测量各种疫苗组合物的防护效果。
关于构建DNA抗原质粒，可使用标准的PCR技术来进行。用于构建该载体的标准PCR条件如下：含1.5mM MgCl2的1×PCR核心缓冲液(Promega Corp.，Madison，WI)；每种引物0.400μM；每种dNTP200μM(USB Inc.，Cleveland，OH)；2.5μg Taq聚合酶(Promega Corp.，Madison，WI)；1.0ng模板DNA；加水至100μl；以及矿物油(AldrichChemical Inc.，Milwaukee WI)涂层。为PTC-200热循环器(MJResearch Inc.，Waltham，MA)设定程序以运行以下规则：95℃4分钟；30个循环(95℃1分钟/55℃1分15秒/72℃1分钟)；72℃10分钟；4℃保持。使用QIAquick7 PCR纯化试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia CA)从PCR反应中取出扩增产物，然后使用限制酶(New England Biolabs，Beverly，MA)切割。
更具体地说，按如下方法构建编码HSV-2早期ICP27抗原的DNA疫苗质粒载体。HSV是一种双链DNA病毒，其基因组约为150～160kbp。该病毒基因组包装于二十面体的核壳中，而核壳又以膜包被。膜(包膜)包括至少10种病毒编码的糖蛋白，其中最为丰富的是gB、gC、gD和gE。病毒基因组另外编码超过70种其他的蛋白，包括一组大约五种立即早期抗原。这些早期蛋白在病毒复制周期的早期被合成，而包膜糖蛋白与之不同，它只在病毒生活史的晚期被合成。有关HSV的分子结构和组织的综述，可参见例如Roizman和Sears(1996)″Herpes simplex viruses and their replication″in Fields Virology，第3版，Fields et al.编著，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，PA。HSV-2ICP27抗原可容易地从HSV-2基因组获得，例如，HSV-2基因组中大约114589到134980位的核苷酸范围的基因组区，或者HSV-2基因组中110931到139697位的核苷酸范围的EcoRI片段。HSV-2基因组序列可由公开来源获得，例如GenBank中编号为NC_001798的序列。
为了构建用于本实验的ICP27载体，使用下列引物：5′CGCC ACTCTC TTC CGA CACC3′(SEQ ID NO：25)和5′CCAA GAA CATCAC ACG GAA CC3′(SEQ ID NO：26)，从HSV-2基因组中对ICP27编码区进行PCR扩增，以获得含HSV-2的核苷酸序列114523-116179(GenBank)的核苷酸片段，它即对应于ICP27编码区。然后将ICP27片段克隆进入pTarget载体(Promega Corp.，Madison，WI)的多克隆区。
构建PJV7630质粒
pPJV7630的抗原基因的来源是HSV-2毒株MS的基因组片段，它已经被克隆进入被称为粘粒23的粘粒载体。粘粒23由来自HSV-2的3个EcoRI片段组成，该片段在已经公开的序列(HG52株)中横跨核苷酸110,931到147,530。粘粒23使用EcoRI部分消化再重新连接，然后选择只有大约28,000bp片段(110,931-139,697)的构建体。该分子命名为OP23。对该分子进行6种修饰，以改变OP23中的序列。该步骤是为了除去HSV-2序列中的非立即早期基因以及骨架DNA序列。最后一步修饰是使用适当的抗生素抗性基因代替骨架序列，使之可供临床应用。这些步骤如下所述。
1.Bst1107I和ScaI消化并重新连接(去掉氨苄西林抗性基因)。生成OP23-1。
2.NsiI消化并重新连接，去掉SV40复制起点。生成OP23-2。
3.BstXI部分消化并重新连接，去掉ICP27和ICP0之间的区域，生成OP23-3。
4.使用BspHI完全消化，接着使用BsiWI部分消化，然后重新连接，去掉ICP22基因之后的序列以及某些骨架序列。生成OP23-4。
5.SrfI消化并重新连接生成OP23-5。去掉ICP4和ICP0之间的序列。
6.BstXI完全消化并重新连接，生成OP23-6。去掉ICP27和ICP0之间的小片段。
7.使用含卡那霉素抗性基因的片段代替编码上述抗生素抗性基因的骨架序列，生成pPJV7630。
构建体pPJV7630比较大(19517个碱基)，包含编码ICP0、ICP4、ICP22和ICP27立即早期抗原的基因。
体外免疫测定
小鼠
由小鼠脾脏获得单细胞悬液。将脾脏挤过筛孔，生成单细胞悬液，然后使细胞沉淀，并经ACK缓冲液(Bio Whittaker，Walkersville MD)处理以溶解红细胞。然后使用添加HEPES、1％谷氨酰胺(BioWhittaker)和5％热灭活胎牛血清(FCS，Harlan，Indianapolis IN)的RPMI 1640培养基，将细胞洗涤2次。细胞计数，并重新悬浮于适当浓度的“全”培养基中，该培养基由以下成分构成：含HEPES和1％谷氨酰胺的RPMI 1640，添加有5％热灭活FCS、50μM巯基乙醇(Gibco-BRL，Long Island NY)、庆大霉素(Gibco-BRL)、1mM MEM丙酮酸钠(Gibco-BRL)以及MEM非必需氨基酸(Sigma，St.LouisMO)。为进行CD8特异性测定，细胞在对应于已知CD8表位的肽存在的条件下进行体外培养。对于BALB/C小鼠中的ICP27，此肽的序列为HGPSLYRTF(QCB Inc)。肽在DMSO(10mg/ml)中制备，并使用培养基稀释至10μg/ml。
为进行IFN-γ ELISPOT测定，将Multiscreen多孔滤膜板使用50μl 15μg/ml溶于0.1M无菌碳酸盐缓冲液(pH9.6)的抗IFN-γ抗血清(Pharmingen)在4℃下包被过夜。将板使用无菌PBS洗涤6次，然后使用含10％胎牛血清(FBS)的组织培养基在RT下封闭1～2小时。除去培养基，将脾细胞分装到孔中，每孔共1×106个细胞。对于所加入的经过免疫的动物的细胞不足1×106的孔，再加入来自未免疫动物的细胞，使其总数达到1×106。将细胞在上述肽存在的条件下在培养箱中过夜培育。然后将板使用PBS洗涤2次，使用蒸馏水洗涤1次，然后再使用PBS洗涤3次。将生物素化抗IFN-γ单克隆抗体(Pharmingen)加入板中(50μl 1μg/ml溶于PBS的溶液)，RT下培育2小时。将板使用PBS洗涤6次，然后加入50μl链霉亲和素碱性磷酸酶缀合物(1∶1000溶于PBS，Pharmingen)，RT下培育2小时。将板使用PBS洗涤6次，加入显色底物(BioRad)，使反应进行到出现暗点。用水洗涤3次以中止反应进行。使板风干，在显微镜下数出斑点数。
体内测定
小鼠
使用感染攻击模型(infectious challenge model)来验证各种免疫方案保护小鼠免受HSV-2致死攻击的能力。攻击前先免疫小鼠，感染时进行麻醉，鼻内给予溶于30μl PBS的致死剂量的HSV-2。感染后跟踪观察小鼠20天，记录疾病和死亡情况。
体外免疫测定
家猪
为了分离外周血单核细胞(PBMC)，全血使用Histopaque-1077cushion(3000rpm，30分钟)在室温下离心，从梯度的条带中回收PBMC。PBMC使用全培养基洗涤3次，重新悬浮于25mL全培养基中用于计数，在全培养基中重新悬浮至1×107个细胞/ml。按小鼠测定中所述的方法进行ELISPOT测定，除了抗原由来自HSV-2抗原的重叠肽文库的肽汇集而成，并且使用对家猪IFN-γ具有特异性的抗IFN抗体对(R & D systems)进行检测。
体内测定
家猪
用于检查家猪中免疫应答的另一种测定是迟发型超敏反应(DTH)测定。该测定使用DNA质粒和蛋白提取物作为抗原来源，分别使用XR1装置和针头注射给予至猪的皮肤中。给药后48小时测量抗原给药部位周围发红的(红斑)面积，作为DTH反应的指标。在免疫完成后7天，将抗原给药至皮肤。
实施例1
使用包含NOI的两种不同质粒免疫小鼠。它们是：HSV-2临床疫苗多基因质粒(PJV7630)和单基因质粒，它们都包括与HCMV启动子有效连接的ICP27 NOI。ICP27 NOI编码位于PJV7630中的显性表位，曲线图代表对该蛋白具有特异性的CD8应答。
NOI给药方案
在一周内，分别在第7天(D 7)、第0和7天(D 0，7)或者第0、2、4和7天(D 0，2，4，7)进行1、2或4次NOI给药。每次NOI给药注射1针或2针，在一组中，LT佐剂与NOI同时给药。
结果
ICP27基因是发现于PJV7630中的显性抗原，图1A和1B代表对该靶抗原具有特异性的CD8应答。
通常质粒PJV7630(图1B)和ICP27(图1A)在仅一次NOI给药后产生500 ELISPOT/百万细胞，两次NOI给药后产生1500ELISPOT/百万细胞。当两次NOI给药后给予LT基因佐剂时，可发现产生大约3500 ELISPOT。即使在没有LT佐剂的情况下，四次NOI给药后也可获得超过3500 ELISPOT/百万细胞，但LT基因佐剂同样可增强该应答。在图1A中，LT与NOI同时给药的应答由于超出测量范围而未测量。
小结
根据在使用PJV7630免疫的小鼠中所测量的ICP27特异性CD8IFN-γ ELISPOT的数据，可以发现成组NOI给药可产生增强的细胞免疫应答。
实施例2
以下三个实验的目的是评估由单基因质粒的成组NOI给药导致的增强的CMI应答，是否与致死攻击中增强的保护相关。
方法
在一周内给予小鼠质粒PJV7630。在一周时间内，进行1次(第7天)、2次(第0和7天)或者4次(第0、2、4和7天)NOI给药。有一组在每次免疫时接受2倍剂量，但多数小鼠在每次免疫时接受单剂量PJV7630。
结果
图中标示的是“给药次数×每次给药的剂量数”，所以4×1表示4次NOI给药，每次给药为单剂量的动物。为期1周的NOI给药后，动物休息1周或2周，然后进行病毒感染。病毒的剂量约为LD50的5倍。
图2A显示C57B1/6小鼠休息2周后的结果。该结果清晰地表明，4×1方案(即4次给药×每次给药1倍剂量)保护效果更好。该结果似乎并非由剂量增加而导致，因为2×2(即2次NOI给药×2倍剂量)同样总共有4倍剂量。
图2B显示C57B1/6小鼠休息1周后的结果。从图2B中可以明显看出，该结果与图2A所示的休息2周的结果实质上是相同的。然而，在图2B中还有一组只进行一次NOI给药。
图2C显示Balb/c小鼠休息1周后的结果。从该结果可以明显看出，攻击剂量不足以在死亡率上造成明显差异，但在患病情况上有差别。括号中的数字表示疾病计分，数越大，则动物病情越重。该结果与图2A和2B中的结果相一致，均表明4×1(即4次给药×单剂量)可实现最佳保护。
小结
在1周内4次给药×每次给药量为单剂量的成组给药方法可快速产生强保护性CMI应答，它比单次给药或者每次给药量为多剂量的给药方法产生的应答都要强。
实施例3
本实验的目的是改变单基因质粒的DNA给药之间的时间间隔。
方法
对所有小鼠进行总共4次给药，各次给药的日期以及给药之间的时间间隔不同。小鼠在给药之间有6、4、2、1或0天的时间间隔(即0表示一天内注射4针)。各种方案的最后一次给药安排在相同的历法日中，最后一次给药后7天处死所有动物。
结果
图3A提供了以0、1、2、4和6天的时间间隔进行ICP27单基因质粒成组给药的CD8 ELISPOT结果。该结果表明增加给药间的时间间隔可提高CD8 ELISPOT结果，当NOI给药之间的时间间隔为4天(即96小时)时，所得结果最大。
图3B提供了以0、1、2、4和6天的时间间隔进行HbsAg单基因质粒成组给药的CD8 ELISPOT结果。该结果表明增加给药间的时间间隔可提高CD8 ELISPOT结果，当NOI给药之间的时间间隔为4到6天时，所得结果最大。
小结
在小鼠中进行成组NOI给药之间的时间间隔的实验表明，在进行4次NOI给药时，当给药相隔4或6天时，在CD8+T细胞应答方面，可获得最佳应答。
图3C提供了来自HbsAg单基因质粒成组给药的抗体结果。所得的抗体效价相当弱。这些结果表明，以0、1、2、4或6天的给药时间间隔进行成组NOI给药似乎在增强CD8+T细胞应答的同时并未显著提高抗体效价。
实施例4
本实验的目的是评估成组的多基因质粒(PJV7630)的NOI给药引发的与CD8+T细胞应答有关的CMI应答。
方法
对动物总共进行4次NOI给药，但NOI给药之间的时间间隔不同。每组的最后一次给药在同一天进行(NOI给药的起始时间不同)，完成给药后1周和3周测量应答情况。增加了3周取样是为了尽量减小不同的方案对给药时间的影响。例如，以6天的给药时间间隔进行4次NOI给药的动物，第一次和第四次给药之间的时间间隔是18天，而给药时间间隔为0的动物，所有注射均在第18天进行。
结果
图4A和4B的结果显示以ICP27特异性CD8IFN-γ ELISPOT测量的细胞应答。NOI给药之间的时间标于图中。所有动物总共注射4针。明显可以看出，多基因质粒(PJV7630)的结果与使用单基因质粒(ICP27)的初始实验结果相一致。关于这一点，4和6天的给药时间间隔可产生以ELISPOT量度的最佳应答(见图3C)，这种情况可以维持3周，但应答水平此时已经下降了大约3倍(见图3D)。
实施例5
本实验的目的是测定在使用基因佐剂和成组NOI给药方案来增强针对相对较弱的抗原(如HIV-1 gp120)的体液和细胞介导的免疫(CMI)应答时，是否存在协同作用。
方法
该实验包括对小鼠进行至少两次gp120抗原给药，其中每次“给药”由1到4次XR1成组给药组成。参见后文图5A的示意图。另外，给药之间的间歇期为1周。使用LT A+B基因佐剂(pPJV2012)。图10中提供了pPJV2012的质粒图。pPJV2012质粒通过将编码LTA和LTB亚基蛋白的LT基因分别克隆进入质粒pPJV-2004和pPJV-2005来制备，如WO 03/004055所述。然后将编码LTA和LTB亚基蛋白的基因从源质粒上切下，***单质粒中，生成pPJV2012质粒。
结果
图5B显示从NOI给药时间间隔为7天的动物组获得的数据。每次成组给药中XR1给药次数不同，是否存在LT A+B基因佐剂(pPJV2012)的情况也不同。所得数据表明，是否存在基因佐剂对细胞应答(IFN-γ产生)的影响最强。图5B清楚地表明，当NOI给药为两次成组给药时，LT增强的应答最为强烈。这些结果表明，成组给药方案对由基因LT佐剂获得的总体细胞应答有极大的贡献。
图5C表明，与CMI应答不同，成组给药显示出对总抗体应答强度的影响最大。如图5C所示，使用每组4次给药，具有以及没有基因佐剂载体诱发出非常强的gp120特异性效价(高出前面遇到过的5～10倍)。更重要的是，存在基因佐剂影响了IgG1到IgG2a亚类的平衡，而非诱发强抗体效价所必需(未显示)。
小结
该结果说明，当编码弱抗原的NOI与编码佐剂的NOI同时给药时，经两次NOI给药，可获得就干扰素γ释放而言最强的CMI应答。与之相比，在给药时间间隔约为48小时的一组四次NOI给药中，不管有没有佐剂，均可获得强体液免疫应答。
实施例6
本实验的目的是确定使用pPJV7630免疫家猪可产生细胞免疫应答，该应答由IFN-γ ELISPOT和DTH应答确定。
方法
为进行此实验，使用XR1设备给予家猪pPJV7630或者安慰剂(只有金)。每次免疫给予家猪两倍剂量，一周时间内进行一组4次免疫。因此，此组免疫中每只猪给予总共8倍剂量的疫苗。第一组免疫结束后28天开始第二组免疫。
结果
图6A显示第一组免疫后从动物中获得的IFN-γ ELISPOT数据。数值是8只免疫动物和8只对照动物的平均值。该数据显示成组免疫方案能够提高家猪中的细胞免疫应答，而这被认为是测量免疫原性较难获得的模型。对照组猪均显示背景水平的ELISPOT。
图6B显示以pPJV7630免疫的猪(4只)中，在抗原给药部位出现的红斑的平均面积(对照动物未包括在图中)。免疫后7天给予抗原，猪已经接受了两组免疫。抗原给药后48小时出现红斑说明它是DTH反应。结果表明，DTH应答为抗原特异性答应，这是因为空质粒(N)或者无关抗原(sAg)乙型肝炎表面抗原质粒不诱导DTH反应，而表达疫苗抗原(0、4、22、27)的质粒显示良好的DTH应答。在只给予安慰剂的猪中(数据未显示)，未发现针对任何抗原的DTH反应，证明图6B中的应答是pPJV7630免疫的结果。在蛋白提取物的注射部位，对ICP22和ICP4蛋白来说具有几个较好的DTH数据，但对于对照PBS溶液以及ICP0和ICP27蛋白来说则没有。因为只有5μg蛋白提取物可用于注射，最高达100μg可用于诱发DTH应答，所以低应答可能与给药剂量有关。
小结
在家猪模型中，发现成组免疫能够诱导针对疫苗抗原的细胞免疫应答。一般认为家猪并不是提高免疫应答的良好模型，但成组免疫能够提高细胞免疫应答。
实施例7
进行家猪实验来验证针对由pPJV1671表达的ha蛋白的抗体应答受剂量和装置的影响情况，详细内容列于下表1中。(XR粒子加速设备在上文中叙述。)
表1
  组(动物编号)   疫苗   注射针数
  1(1～8)   pPJV1671 枪#490.5mg Au/针   2
  2(9～16)   pPJV1671 XR-2 11/161.5mg Au/针   2
  3   pPJV1671 XR-2 11/16   1
  (17～24)   1.5mg Au/针
  4(25～32)   pPJV1671 XR-2 11/161.0mg Au/针   1
  5(38～40)   pPJV1671 XR-2 11/16成组免疫*1.5mg Au/针   2×4
  6(41～48)   pPJV1671 XR-2 11/161.5mg Au/针   8
  7(49～56)   阴性对照
*每隔一天2针(第1、3、5和8天)
动物使用疫苗进行首次免疫以及在第4周时进行加强免疫。在加强免疫后2周的不同时间点采血，将抗体效价列于下图中。两组动物，每次免疫时共给予8倍剂量，成组或者一次给予。成组免疫的动物血清抗体水平较高。
抗体效价
使用200血凝反应单位/孔的溶于磷酸盐缓冲液的肌氨酰裂解纯化的Sw/IN病毒，通过ELISA以标准方法测量抗体效价。猪抗体使用羊抗猪免疫球蛋白G碱性磷酸酶缀合物直接测定。
质粒pPJV1671
如图8所示，质粒pPJV1671是编码流感A/巴拿马/2007/99(H3N2)的血凝素(HA)抗原的人DNA疫苗载体。使用从CDC获得的A/巴拿马/2007/99病毒样本作为模板RNA来源，以标准的反转录酶/聚合酶链反应(RT-PCR)克隆技术来获得HA编码序列。采用以下步骤开发最终的pPJV1671 HA DNA疫苗载体。
●RT-PCR制备A/巴拿马/2007/99(H3N2)的RNA片段#4的dsDNA片段。
●使用标准的基于pUC19的载体在大肠杆菌中增殖RNA片段#4DNA克隆。
●对在RNA片段4克隆内的H3巴拿马HA编码序列进行序列分析。
●进行第二次PCR反应，形成含H3巴拿马编码序列(无ATG密码子)的DNA片段，其末端和pPJV7563 DNA疫苗载体相容(Nhe I和Bsp 120I)，。
将H3巴拿马HA编码序列***pPJV7563，生成与Kozak共有序列一致的最终pPJV1671 H3巴拿马HA DNA疫苗载体。使用载体提供的ATG密码子(通过在Nhe I位点***)导致在HA基因编码序列的氨基末端产生2氨基酸的微小***物，如图9所示。
小结
该研究表明成组免疫可显著提高家猪模型中的抗体应答。
质粒pPJV7563
构建pPJV7563
图11提供了pPJV7563质粒图。图12提供了pPJV7563质粒的碱基组成。质粒pPJV7563中各组件及其位置如下：
1-44转座子903序列
45-860来自转座子903的卡那霉素抗性编码序列
861-896转座子903序列
897-902 Sal1位点
903-1587 CMV启动子
1588-1718来自CMV立即早期基因的非翻译前导序列
1719-1724 BamH1和BglII限制酶的融合体
1725-1857大鼠胰岛素内含子A
1858-1863 BamH1位点
1864-1984 HBV表面抗原5′-非翻译前导序列
1985-1993合成起始密码子/Nhe1克隆位点
1994-2011合成克隆位点
2012-2544 HBV增强子
2545-2555残余载体序列。NCBI数据库中无命中条目
2556-2686兔β-珠蛋白多腺苷酸化区
2687-3759 pUCl9载体序列
pPJV7563质粒如下制备：
图13的描述，构建PJV7563的流程图：
将pWRG7074中的牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpA)替换成兔β-球蛋白多腺苷酸化信号(RBGpA)，生成pWRG7284。通过将所有的CMV序列替换成来自含CMV启动子和外显子1/2融合体的PCR片段的pWRG7128，将CMV的内含子A从pWRG7284中去除。这样生成pWRG7293。
将CMV和HBV序列从pWRG7284中去除，替换为来自pWRG7293的CMV和5’-HBV序列以及来自pWRG7128的3′-HBV序列。在该步骤中去除SIV nef基因，生成pPJV7382。pPJV7382通过加入大鼠胰岛素内含子A(RIA)进一步改造，生成pPJV7389。将pPJV7389中的卡那霉素抗性(KanR)基因替换为缩短的形式，去掉该基因两端的非必需序列，生成pPJV7496。对来自pPJV7496的RIA中的Nhe1位点进行加工处理，生成pPJV7530。
去除pPJV7530中的3′-UTR的5′区的HBV序列，替换为来自pPJV7468的HBV 5′-UTR、流感M2基因以及3′-UTR的5′区，生成PJV7549。PJV已经证明，在编码多种抗原的载体中保留来自WRG7128的HBVenh和HBV 5′UTR区可重现地提高抗原表达和免疫原性。现在它们已经成为PJV的DNA疫苗载体的常规组件。然后从pPJV7549中去掉M2基因，替换为形成聚合接头的寡核苷酸。该操作生成pPJV7563，一种能够接受其他编码序列的表达载体。
构建质粒pWRG7074，即PJV7563的亲本载体
制备标准的质粒骨架pWRG7074。该骨架用作前体质粒，从它可制备出pWRG7128，即用于几种临床试验的HBsAg表达载体。在这部分中，衍生制备该骨架的过程在文字叙述部分记载，并在图15和16中显示，其中图15和16分别为“衍生制备质粒PJV7074和PJV7128的流程图”和“关键质粒特征图”。简单地说，通过将含有人CMV立即早期启动子和牛生长激素多腺苷酸化序列的单个片段***标准的、较好鉴定的pUC19细菌质粒载体中，来生成pWRG7074。采用几步后续操作，将氨苄西林替换为卡那霉素(KanR)抗性标记，并且改变一些限制位点。作为CMV启动子和bGH poly A区来源的DNA片段是从质粒pJW4303中获得的，该质粒由当时在斯坦福大学工作的JimMullins赠送。
下面给出有关构建质粒WRG7074和WRG7128的详细叙述。除非另有说明，所有克隆均在PowderJect Vaccines，Inc.，Madison，WI(旧称Agracetus，Inc.，Auragen，Inc.或者Geneva，Inc.Middleton，WI)进行。构建步骤使用斜体字。项目符号提供与具体序列有关的说明信息。
步骤1：通过HindIII-BamHI消化，去掉包含TPA信号肽编码序列的pJW4303(图谱，图10.2)的HindIII-BamHI微小片段。将该微小片段替换为HindIII-Not1-BamH1接头，生成JW4303-Not1。
包含来自pJW4303的CMV启动子和bGH poly A区的片段是SalI-Xho I片段，PJV已经验证其长度为2131bp。已经得到了来自pJW4303的SalI-Xho I片段的核苷酸序列。以下项目可在图10.2中识别。
●位于该片段第1位核苷酸的Sal I位点
●位于第7位核苷酸的CMVIE启动子片段的起点。它对应于GenBank序列编号M60321(人巨细胞病毒立即早期蛋白基因5′端)的第451位核苷酸。
●位于第1648位核苷酸的CMVIE启动子片段的终点。它对应于GenBank序列编号M60321(人巨细胞病毒立即早期蛋白基因5′端)的第2097位核苷酸。应该注意，得到的CMVIE启动子区和上述的GenBank序列之间观察到几个核苷酸不同。这可能是由于不同的CMV病毒分离株之间的天然多态性所导致。
●位于第1661位核苷酸的人组织型纤维蛋白溶酶原激活剂的信号肽编码序列的ATG翻译起始密码子。TPA信号肽编码序列来自如Lu et al.(J.Virol.70：3978，1996)所述的合成DNA。Luet al.的出版文献简要地叙述了构建pJW4303的方法，但该叙述存在一些错误，与推导出的序列有一些矛盾。
●分别位于第1649和1724位核苷酸的编码序列***位点HindIII和Nhe I。注意SIV nef同源区显示为bGHpA区的一部分。
●位于SIV nef同源区起点的第1741位核苷酸的Bam HI限制性酶切位点。它对应于GenBank序列编号M33262(猿猴免疫缺陷病毒，分离株239，完全的原病毒基因组和侧翼序列)的第9444位核苷酸。
●位于SIV nef同源区终点的第1849位核苷酸的Bgl II限制性酶切位点。它对应于GenBank序列编号M33262(猿猴免疫缺陷病毒，分离株239，完全的原病毒基因组和侧翼序列)的第9552位核苷酸。
●1999年发现，该载体中存在与猿猴免疫缺陷病毒nef基因序列同源的109个碱基对的序列。如图10.1所示，该序列在构建pWRG7128时被去掉。然而，它仍保留在pWRG7074中。该序列存在于pWG4303，衍生出pWRG7077和pWRG7074。SIVnef同源性发现于第77和184位核苷酸之间。因此，将SIV nef片段***bHG poly A区附近是一种显而易见的人工构建方法，它在PJV接受源DNA之前即存在。
●位于第1873位核苷酸的牛生长激素poly A区同源起点。它对应于GenBank序列编号M57764(牛生长激素基因，完全编码序列)的第2326位核苷酸。
●位于附着点(attachment)4的第2096位核苷酸的牛生长激素poly A区同源终点。它对应于GenBank序列编号M57764(牛生长激素基因，完全编码序列)的第2550位核苷酸。
●位于片段终点(第2131位核苷酸)的Xho I限制位点。
步骤2：将来自pJW4303-NotI(SalI-XhoI片段)的CMV启动子和bGH poly A片段***pUC19的Sal I位点，生成质粒pWRG7012(下图)。
pWRG7012中包含两个BamHI位点和两个HindIII位点。在以后的步骤中去除这两种位点中的一个(见下文)。
步骤3：去除pWRG7012的EcoR1-Xbal区，以去掉pUC19的多克隆位点大片段，产生pWRG7013(图10.2)。
PWRG7013保留有两个HindIII位点但只有一个BamHI位点。
步骤4：从pWRG7012中去除位于CMV启动子5′的HindIII位点，以便更加容易地利用位于内含子和下游***物之间的HindIII位点。这样生成pWRG7014(图10.2)。
PWRG7014保留有两个BamHI位点但只有一个HindIII位点。
步骤5：为了制备只包含有1个HindIIl位点和1个BamHI位点的质粒，将来自pWRG7013的HindIII-EcoR1片段置于被去除HindIII-EcoR1的pWRG7014中，生成pWRG7020，即WRG7077的氨苄西林的抗性形式(图10.2)。
步骤6：去除pUC19中位于Eam1105 1-Pst1侧翼的氨苄西林抗性基因。经聚合酶处理，使包含复制起点的片段产生平端。分离pUC4K中位于Pst1侧翼的氨苄西林抗性基因。该片段经聚合酶处理产生平端，连接于复制片段起点。这样生成pWRG7072，即一种可以接受来自pWRG7031(步骤8)的CMV-HBsAg-bGH-pA盒的KanR载体。
步骤7：去除pWRG7020中的聚合接头的Hd3-BamH1序列，使用聚合酶使载体产生平端。分离出pAM6中含有位于BamH1侧翼的1.4KB HBsAg的片段。该片段通过聚合酶处理产生平端，并与载体连接。这样生成pWRG7031，一种氨苄西林抗性的HBsAg表达质粒。
步骤8：去除pWRG7072中的Pvu2-Sph1序列。使用EcoR1切割pWRG7031，使用聚合酶在该位点产生平端，使用Sph1进一步切割该质粒，分离出包含CMV、HBV和牛来源序列的片段。将该片段与已制备好的pWRG7072连接，生成pWRG7074。
步骤9：使用Bgl2切割pWRG7074，使用聚合酶产生平端，并使用BstX1进一步切割，生成载体片段。使用Nco1切割pWRG7074，使用绿豆核酸酶产生平端，并使用BstX1进一步切割，生成含有3′-增强子的***片段。将这两个片段连接，生成pWRG7128，一种HBsAg表达质粒，但缺少pWRG7074中含有的HbxAg和SIV NEF序列的5′-编码区。
步骤10：构建pWRG7077：使用Sap1切割pWRG7072，使用聚合酶产生平端，并使用Sph1进一步切割，生成包含复制起点和卡那霉素抗性基因的片段。在WRG7020的EcoR1位点处切割并产生平端，然后使用Sph1部分切割，生成包含CMV启动子、内含子A和BGH多腺苷酸化区的片段。将这些片段连接在一起，生成pWRG7077。最终载体pWRG7077包含了来自源质粒pJW4303的原始的CMV内含子A-bGH-pA区，除了有一点改变，即如步骤1所述将TPA信号肽编码序列替换为合有Not I限制位点的接头。
实施例8
我们从来自ATCC的HPV 16基因组克隆中，通过PCR制备E6和E7拷贝。由于全长质粒包含完整的病毒基因组，所以在BSL-2条件下保存。我们通过分别去除p53和Rb的结合区来使E6和E7脱毒(Sleboset al.，Virol.1995， 208，111-120；以及
Figure A20048003645900591
et al.，Virol.2001， 281，231-238)。将PCR片段克隆进入PJV7563中，将该基因置于不带内含子A的CMV启动子的调控之下。
使用不含Qiagen内毒素的Mega试剂盒制备质粒，并使用标准的亚精胺CaCl2法以2μg DNA/mg金的浓度包被于金粒子上。使用0.05mg/ml PVP制备药筒(cartridge)。以单一给药方式免疫B6小鼠，使用XR研究设备以500psi给予至刮去毛的腹部。
TC-1细胞来自Johns Hopkins School of Medicine。将细胞置于培养基中以最少的传代次数增殖，然后将小瓶冷冻并保存于液N2中备用。在PBS中制备注射细胞。麻醉的小鼠在刮去毛的右侧面皮下注射50到100μl中2×104到2×105个细胞。从第7天开始，在星期一、星期三和星期五测量肿瘤。测量互相垂直的两个直径量度，相乘得到正方形的面积。还监控动物的健康状况。如果肿瘤生长得大于120mm2，如果肿瘤出现坏死，或者小鼠即将死去，则对小鼠施行安乐死。
为进行ELISPOT测定，最后一次免疫后一周处死小鼠。无菌环境下取出脾脏，制备单细胞悬液。在BD (-IFN ELISPOT试剂盒中，根据厂商说明书，将细胞以1×106或者5×105个细胞/孔的浓度置于板上。加入对E7 CD4和CD8以及E6 CD8有特异性的肽，终浓度为10μM。培养基孔含有等量的DMSO，也含有肽。通过将肽存在下诱导的斑点数减去培养基中的斑点，得到特异性斑点。
结果
以E6或者E7DNA免疫B6小鼠可诱导大量的(-IFN分泌细胞(图23)。在E6的情况下，仅仅已知CD8特异性表位。在E7的情况下，已经识别了CD4和CD8特异性表位，已经在PMED免疫后观察到强应答。试验了在E6或者E7疫苗中加入大肠杆菌热不稳定性毒素(LT)或者霍乱毒素(CT)DNA。LT可将针对E7肽的(-IFN ELISPOT应答提高大约2倍(图23)，但是没有观察到哪种毒素可以增强肿瘤保护。
有趣的是，只注射TC-1细胞即可诱导针对E6和E7的(-IFN应答(图24)。其水平比时间间隔为三天、以三倍剂量进行成组PMED免疫中观察到的结果要低。将TC-1注射与PMED免疫相结合会导致居于中间的结果。
在未处理的B6小鼠中注射5×104个TC-1细胞总是导致快速出现肿瘤。以单剂量这样少的E6或者E7 DNA进行预防处理可提供明显的保护防止出现肿瘤(图25)。如果从肿瘤注射后3天开始，以三倍剂量的一组使用E6或者E7进行治疗性免疫，也是有效的(图26)。给药剂量再少，效果会变差(数据未显示)。同时给予E6和E7质粒并不比给予任意一种更加有效，但目前为止只进行了一次实验。
在一项实验中，经过E6接种免受首次TC-1攻击的动物(图26)未经进一步处理而在50天后进行两次攻击。如图27所示，所有动物均完全免受该第二次攻击，而所有年龄匹配的未处理的对照动物则产生肿瘤并被施行安乐死。
我们尝试治疗较大肿瘤，取得了不同程度的成功。例如，如图28所示，使用一组三倍剂量的E6 DNA，在20mm2时开始治疗导致5只小鼠中的全部5只的肿瘤均消退，而如果在35mm2时开始治疗，则只引起肿瘤生长略微延缓，然后迅速恶化。
上述数据表明，当将脱毒的E6和E7 DNA给予B6小鼠时，它们可引发针对各自肽表位的强T细胞应答。而且，这些应答在很大程度上与疫苗抑制TC-1肿瘤细胞生长的能力有关。该处理不管作为预防还是治疗均有效。
实施例9
使用ICP27单基因质粒，以2天的时间间隔对小鼠注射1～8针，并使各组最后一次给药在同一天进行。最后一次给药后两周，测量CD8ELISPOT。结果如图29所示，说明需要至少3次给药以获得接近最佳效果，此时再进行给药，效果提高很少或者没有提高。
为了验证成组给药在***中的累积作用，小鼠注射1、2、3或4针pPJV7630(各次注射之间时间间隔4天)，8天后取***细胞检查。结果如图30所示。注射次数增加，***大小也明显增大。当注射超过1针时，疫苗给药完成后8天测量***重量和细胞数目，结果比未免疫小鼠均有提高，注射3次的数值最大。
实施例10
进行实验研究加强接种的效果。对进行了初次给药的小鼠和进行了初次和加强给药的小鼠进行比较。两组小鼠在同一时间进行初次给药，使用相同的疫苗接种。第二组在初次给药后28天进行加强给药。
图31显示对以一组(P)或者相隔28天的两组(P/B)进行pPJV7630给药的动物进行的IFN-γ ELISPOT测定结果。使用pPJV7630构建体表达的4种立即早期抗原的每一种的肽文库，对脾细胞进行测试。最后一次疫苗给药后2周进行测定。发现进行加强给药可导致所激发的应答显著增加。
实施例11
使用XR1设备对家猪进行PJV7630给药。每次免疫给予家猪两倍剂量，一周内进行一组共4次免疫。因此，每只猪在一组免疫中给予总共8倍剂量的疫苗。两组加强免疫均在前一组结束后21天开始。在给药(PB)开始前，以及每次加强免疫(B1和B2)后10天取血液样品。如所述进行IFN-γ ELISPOT测定，数值为10只动物的平均值±SEM。图32显示所获得的结果，以及加强接种的效果。
实施例12
使用XR-1单次注射pPJV7630进行PMED免疫后2、3和4天取皮肤样品，冷冻，碾碎，测定上清液中细胞因子水平。使用CBA试剂盒评价炎性细胞因子，发现IL-6、TNF-α和MCP-1(单核细胞趋化蛋白)有较大提高。它们在第2天水平最高，并随时间而下降。在任何时间点均未发现IL-10、IL-12或者IFN-γ的水平提高。增强的细胞因子通常发现于伤口愈合过程中。
为了验证成组给药在皮肤和***中的累积作用，小鼠注射1、2、3或4针pPJV7630(各次注射之间时间间隔4天)，4和8天后取***细胞检查。注射次数增加，***大小也明显增大。当注射超过1针时，疫苗给药完成后8天测量***重量和细胞数目，结果比未免疫小鼠均有提高(见图30)。
还将***细胞进行染色以显示MHC-II阳性(抗原呈递细胞)、CD80阳性(活化标记)和双阳性细胞，并通过流式细胞仪分析(下表)。一般而言，单阳性细胞和双阳性细胞数目随注射次数的增加而增加。
第4天-***群体(％总细胞)
  MHC-II   CD80   MHC-II/CD80
未处理 13 0.9 1.7
  1针   13.1   0.9   1.5
  2针   18.1   1.6   2.2
  3针   17.8   2.2   3.1
 4针   21.3   2.5   4.1
第8天-***群体(％总细胞)
  MHC-II   CD80   MHC-II/CD80
  未处理   17   0.3   1.4
  1针   16.3   0.3   1
  2针   23   0.4   1.5
  3针   23   0.8   2.9
  4针   18   0.8   1.2
对***群体进行分析表明，成组免疫可导致***中抗原呈递细胞数目增加大约5～10倍。
总之，在PMED后数天，在注射部位的不同区域可发现急性物理变化。我们发现PMED后2天皮肤中的炎性细胞因子达到最高值。同时，在成组给药过程中，在***中发现了细胞，特别是活化的抗原呈递细胞的累积作用，说明皮肤的应答性提高。
实施例13
使用Balb/c小鼠进行所述实验。刮净腹部某一区域的毛，使用粒子介导的免疫治疗给药(PMID)进行DNA的初次免疫。每只动物接受总共3μg DNA。可以在第0天或者第4天通过常规“脉冲”免疫(3×1μg DNA)给药，也可以每隔一天(0、2和4)给予1μg DNA来进行“成组”免疫。第一次DNA给药后10天处死小鼠并采集脾脏。通过拨开脾细胞，溶解红细胞来收集脾细胞。将脾细胞洗涤并计数。使用专门的ELIspot板(包被有干扰素-γ捕捉抗体并封闭)。将脾细胞移至这些板上并在特异性肽的存在下在37℃/5％ CO2下培育过夜。溶解脾细胞，使用标准方法使板显影，以显示存在的干扰素-γ分泌细胞的数目。
结果
结果(图33所示)显示，与使用常规“脉冲”方法接受等量DNA的动物相比，从接受“成组”免疫的动物中分离的干扰素-γ斑点形成细胞的数目显著增加。(*表示差异显著)
通过“成组”方法，使用表达来自HIV的Gag和RT抗原的构建体免疫小鼠，产生的细胞免疫应答比使用常规“脉冲”方法以等量DNA免疫的动物显著提高。
实施例14
使用Balb/c小鼠进行所述实验。刮净腹部某一区域的毛，使用粒子介导的免疫治疗给药(PMID)进行DNA的初次免疫。每只动物总共接受1μg DNA。可以在第0天通过常规“脉冲”免疫(2×0.5μg DNA)给药，也可以在第0和7天每天给予0.5μg DNA来进行“改进的成组”免疫。所有小鼠在初次免疫后83天通过“脉冲”法以1.0μg DNA进行加强免疫。加强免疫后7天(第90天)处死小鼠并采集脾脏。通过拨开脾细胞，溶解红细胞来收集脾细胞。将脾细胞洗涤并计数。使用专门的ELIspot板(包被有干扰素-γ捕捉抗体并封闭)。将脾细胞移至这些板上并在特异性肽的存在下在37℃/5％ CO2下培育过夜。溶解脾细胞，使用标准方法使板显影，以显示存在的干扰素-γ分泌细胞的数目。
结果
结果(图34所示)显示，与使用常规“脉冲”方法接受等量DNA的动物相比，从使用“改进的成组”免疫方法免疫的动物中分离的干扰素-γ斑点形成细胞的数目增加。因此，通过“改进的成组”方法，使用表达来自HIV的Gag和RT抗原的构建体免疫小鼠，产生的细胞免疫应答比使用常规“脉冲”方法以等量DNA免疫的动物有所提高。
实施例15
所用质粒表达HIV抗原RT、Nef和Gag。制备用于PMID的药筒的方法已有记载(Eisenbraun et al DNA and Cell Biology，1993第12卷第9号第791-797页；Pertner et al)。简单地说，将质粒DNA包被于2μm金粒子(DeGussa Corp.，South Plainfield，N.J.，USA)上，装于Tefzel试管中，然后切成1.27cm长，作为药筒，4℃下干燥保存备用。在通常的接种中，每只药筒包含包被有约1μg DNA的0.5mg金。
4只小型猪实验组在腹部接受PMID初次免疫(在第1天开始)，随后进行PMID加强免疫(在第57天开始)。对照动物不进行免疫。免疫可通过脉冲给药(即一次给予4药筒)或者成组给药(即相隔48小时的3次给药中，每次给予2药筒)进行。初次或者加强免疫后14天，采集外周血样品，制备外周血单核细胞(PBMC)。
将猪血收集到在PBS中2∶1稀释的肝素中，置于50ml Falcon管中的Histopaque(Sigma)层之上。将该管以1200g离心30分钟，从界面处收集猪淋巴细胞。使用氯化铵溶解缓冲液溶解残余的红细胞。细胞计数，并以2×106/ml重新悬浮于完全RPMI培养基中。
为了进行Elispot测定，将板使用8μg/ml(溶于PBS的)(纯化的鼠抗猪IFN-γ，Biosource ASC4934)包被。板在4℃下过夜包被。使用前，以PBS洗板3次，使用完全RPMI培养基封闭2小时。将PBMC以2×105细胞/孔的浓度加入板中。各孔的总体积为200μl。加入重组Gag、Nef或RT蛋白(自制)，终浓度为5μg/ml。将板置于保湿37℃培养箱中培养16小时。
使用水洗涤1次(浸泡1分钟确保细胞溶解)，使用PBS洗涤3次，以便将细胞从板上除去。加入溶于PBS的0.5μg/ml的与生物素结合的抗猪IFN-γ。将板在室温下摇动中培养2小时。然后以PBS将板洗涤3次，加入1/1000稀释的链霉亲和素碱性磷酸酶(Caltag)。以PBS洗涤3次，使用BCICP底物(Biorad)培育15～45分钟，显示出斑点。用水洗去底物，使板风干。使用AID Elispot计数器(CadamaBiomedical，UK)为斑点计数。
结果
结果如图35所示。初次免疫后，经成组免疫的小型猪PBMC中，产生IFN-γ的斑点数比接受脉冲免疫的小型猪显著增多(分别为311±96和45±31，平均值±SEM；p＜0.05，Student’s t检验)。而且，脉冲加强免疫后，经成组初次免疫的动物中，产生IFN-γ的斑点数比接受脉冲初次免疫的动物显著增多(分别为431±60和186±66，平均值±SEM；p＜0.05，Student’s t检验)。总之，这些结果表明成组初次免疫具有比常规脉冲初次免疫更大的优点，并且该优点可保持到后来的免疫应答的加强阶段。
在图中，组1为对照，未经免疫；组2为脉冲初次免疫脉冲加强免疫组；组3为脉冲初次免疫、成组加强免疫组。
实施例16
使用C57BL/6小鼠进行所述实验。刮净腹部某一区域的毛，使用粒子介导的免疫治疗给药(PMID)进行DNA的初次免疫。每只动物可以在第0天接受常规“脉冲”免疫(1μg DNA卵清蛋白)，或者，每隔一天(0、2)——组2X或第0、2和4天——组3X的每天给予1μgDNA来进行“成组”免疫。第一次DNA给药后10天处死小鼠并采集脾脏。通过拨开脾细胞，溶解红细胞来收集脾细胞。将脾细胞洗涤并计数。使用专门的ELIspot板(包被有干扰素-γ或者IL2捕捉抗体并封闭)。将脾细胞移至这些板上并在特异性肽的存在下在37℃/5％ CO2下培育过夜。使用预先确定的卵清蛋白特异性CD4和CD8肽。溶解脾细胞，使用标准方法使板显影，以显示存在的干扰素-γ或IL2分泌细胞的数目。
结果
结果(图36和37所示)显示，与使用常规“脉冲”方法接受等量DNA的动物相比，从接受“成组”免疫的动物中分离的IFN-γ和IL2斑点形成细胞的数目显著增加。图36中的每个柱代表个体小鼠的应答。
通过“成组”方法，使用表达卵清蛋白的构建体免疫小鼠，产生的细胞免疫应答比使用常规“脉冲”方法以等量DNA免疫的动物显著提高。
实施例17
使用C57BL/6小鼠进行所述实验。刮净腹部某一区域的毛，使用粒子介导的免疫治疗给药(PMID)进行DNA的初次免疫。每只动物总共接受3μg DNA。可以在第0天通过常规“脉冲”免疫(3×1μg DNA)给药，也可以每隔一天(0、2和4)每天给予1μg DNA来进行“成组”免疫。
已经以脉冲或成组免疫方法进行初次免疫的动物，在29天后以1μg DNA的单次脉冲免疫进行加强。如上所述，在加强免疫后(第38天)取出脾脏，使用ELISPOT测定抗原特异性细胞的频率。此外，使用肽或IL2体外扩增5天后，以基于铕的CTL测定来测量CD8 T细胞杀伤抗原特异性靶标的能力。
结果
图38所示的结果表明，以成组方式进行初次免疫的动物比以相同剂量的DNA但以脉冲方式免疫的小鼠显示出更强的回忆应答。这通过在ELISPOT测定中IFNg和IL2产生细胞的频率增加来表现出来。以成组方式进行初次免疫的动物比以脉冲方式免疫继之以脉冲DNA强化免疫的动物也显示出更强的CTL应答。
通过“成组”方法，使用表达卵清蛋白的构建体免疫小鼠，产生的回忆免疫应答比使用常规“脉冲”方法以等量DNA免疫的动物显著提高。
在以上说明书中提及的所有出版物通过援引的方式纳入本文。对于本领域技术人员来说，可以对本发明所述的方法和体系进行各种修改和变化，而不背离本发明的范围和精神。尽管已经对与特别优选的实施方案有关的内容进行了叙述，但应该理解，如权利要求书所述的本发明不应该不适当地限制于这些具体的实施方案。实际上，本发明具体实施方式的各种修改对于分子生物学或者相关领域的技术人员来说是显而易见的，应该涵盖于本发明范围之内。

Claims (28)

1.一种在哺乳动物宿主受试者中诱发针对T细胞表位的T细胞应答的方法，所述方法包括：
(i)第一次免疫，包括对受试者进行相隔1到14天的至少两次给药，其中每次给药包括给予编码T细胞表位的所研究核酸(NOI)，并且任选地，
(ii)第二次免疫，包括给予受试者至少一次(a)编码T细胞表位的NOI，或者(b)包含T细胞表位的蛋白，其中
-第一次免疫的第一次给药与
-第二次免疫的第一次给药
之间的时间间隔为21到365天。
2.根据权利要求1的方法，其中第一次和/或第二次免疫的给药之间相隔2到12天。
3.根据权利要求1或2的方法，其中在第一次和/或第二次免疫中，NOI或蛋白的给药次数为2到10次。
4.根据前述任一权利要求的方法，其中第一次和/或第二次免疫的2、3、4或者更多次给药之间相隔2到6天。
5.根据前述任一权利要求的方法，其中第一次免疫的第一次给药与第二次免疫的第一次给药之间的时间间隔为50到250天。
6.根据前述任一权利要求的方法，进一步包括第三次免疫，所述第三次免疫包括给予受试者至少一次(a)编码T细胞表位的NOI，或者(b)包含T细胞表位的蛋白，其中
-第二次免疫的第一次给药与
-第三次免疫的第一次给药
之间的时间间隔为10到365天。
7.根据权利要求6的方法，其中在第三次免疫中：
-NOI或蛋白的给药次数为2到5次，和/或
-给药间隔2到6天，和/或
-第二次免疫的第一次给药与第三次免疫的第一次给药之间的时间间隔为50到250天。
8.根据前述任一权利要求的方法，其中所述NOI包括在调控序列控制之下的DNA序列，所述调控序列能够在受试者细胞中指导所述DNA序列的表达。
9.根据前述任一权利要求的方法，其中所述T细胞表位为CD4+辅助T淋巴细胞表位和/或CD8+T淋巴细胞(CTL)表位。
10.根据前述任一权利要求的方法，其中一次或多次所述NOI给药包括给予0.1到2μg的NOI。
11.根据前述任一权利要求的方法，其中一次或多次所述给药包括向皮肤给药。
12.根据前述任一权利要求的方法，其中在至少一次NOI或蛋白给药中，将NOI或蛋白包被于粒子上，或者掺入粒子中。
13.根据权利要求12的方法，其中通过粒子加速设备将粒子给予至受试者。
14.根据前述任一权利要求的方法，其中在至少一次NOI或蛋白给药中，所述NOI或蛋白以以下形式给药：
(i)包括制药上可接受的载体、赋形剂或者稀释剂的药物组合物；或者
(ii)包括免疫学上可接受的载体、赋形剂或者稀释剂的疫苗组合物；或者
(iii)包括免疫学上可接受的载体、赋形剂或者稀释剂的免疫治疗组合物。
15.根据权利要求1～13之一的方法，其中所述NOI或蛋白与佐剂或者能够在受试者细胞中表达佐剂的多核苷酸同时给药；或者，根据权利要求14的方法，其中所述组合物进一步包括佐剂或者能够在受试者细胞中表达佐剂的多核苷酸。
16.根据权利要求15的方法，其中所述佐剂为无毒性形式的大肠杆菌热不稳定性肠毒素(LT)或者霍乱弧菌霍乱毒素(CT)。
17.根据权利要求15的方法，其中所述佐剂为LT肠毒素的B亚基(LTB)，或者CT霍乱毒素的B亚基(CTB)。
18.根据前述任一权利要求的方法，其中所述T细胞表位来自病原体或者癌细胞。
19.根据前述任一权利要求的方法，其中所述T细胞表位来自HSV、HIV或HPV。
20.根据前述任一权利要求的方法，其中所述方法用于预防或治疗受试者中的疾病。
21.根据前述任一权利要求的方法，其中所述NOI编码至少两种HSV、HIV或HPV抗原。
22.根据权利要求21的方法，其中所述NOI编码一种HIV-1 gag蛋白或者包含它的一个gag表位的片段，以及第二种HIV抗原或者编码所述的第二种HIV抗原的一个表位的片段。
23.根据权利要求22的方法，其中所述第二种抗原选自Nef、RT或者包含Nef或RT的一个表位的片段。
24.根据权利要求22的方法，其中所述NOI编码选自以下抗原的组合：
-Gag(p17，p24)，Nef截短形式
-Gag(p17，p24)(密码子优化)，Nef(截短形式)
-Gag(p17，p24)，RT，Nef(截短形式)
-Gag(p17，p24)，密码子优化的RT，Nef(截短形式)
-Gag(p17，p24)，密码子优化的RT，密码子优化的Nef截短形式；
和/或失活的密码子优化的RT、截短的Nef以及密码子优化的gag基因的p17/p24部分，任选地与爱荷华长度HCMV启动子+外显子1下游有效连接，以及与兔珠蛋白多腺苷酸化信号的上游有效连接。
25.根据前述任一权利要求的方法，其中给予每一种均编码同一表位的至少两种不同的NOI，和/或给予包含同一表位的至少两种不同的蛋白。
26.一种测试诱发T细胞应答的方法的有效性的检测方法，其中所述诱发T细胞应答的方法包括：
(i)第一次免疫，包括对受试者进行相隔1到14天的至少两次给药，其中每次给药包括给予编码T细胞表位的所研究核酸(NOI)，并且任选地，
(ii)第二次免疫，包括给予受试者至少一次(a)编码T细胞表位的NOI，或者(b)包含T细胞表位的蛋白，其中
-第一次免疫的第一次给药与
-第二次免疫的第一次给药
之间的时间间隔为21到365天，
其中所述检测方法包括在哺乳动物受试者中施行所述的诱发T细胞应答的方法，然后检测受试者中对所述表位具有特异性的活化或者记忆T细胞的水平。
27.根据权利要求26的检测方法，包括检测
(i)第一次免疫的给药是否都落在第一次免疫的第一次给药和活化T细胞水平下降至基础水平之间的时间段内，和/或
(ii)第二次免疫的第一次给药是否发生于活化T细胞水平下降至基础水平之后。
28.一种进行前述任一权利要求的方法或检测方法的试剂盒，其中所述试剂盒包括：
(i)前述任一权利要求中限定的NOI，或者根据权利要求14的组合物；以及
(ii)根据前述任一权利要求中限定的方法或检测方法进行NOI或组合物给药的说明书。
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