CN1883619A - 一种紫花地丁多糖药物组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种紫花地丁多糖药物组合物，由紫花地丁经提取纯化制得，其中多糖成分占固形物的50％以上。我们还提供了该药物组合物的制备方法，及其在制药中的用途。体外抑制病毒试验证明，本发明药物组合物具有病毒抑制效果，尤其是对乙肝病毒和HIV病毒的复制有很好的抑制功能，通过药理试验，证明该药物组合物还具有增强免疫力的效果，可以进一步开发为新型药物。
Description
技术领域：
本发明涉及一种紫花地丁的药用有效部位，特别是一种含有高度纯化紫花地丁多糖的药物组合物及其制备方法。
背景技术：
紫花地丁为堇菜科植物紫花地丁Viola yedoensis Makino的干燥全草。春、秋二季采收，除去杂质，晒干。味苦、辛，性寒。归心、肝经。清热解毒，凉血消肿。全草含多糖、皂苷、黄酮类、蜡、蜡酸及不饱和酸的酯类。现代研究表明紫花地丁的多糖成分在细胞培养基上有抑制艾滋病毒的作用，同时其多糖成分可增强人体免疫力。但是现有技术并没有阐明紫花地丁多糖起效的有效部位，没有在医药领域应用中进行深入的研究和评价，也没能提供出可产业化的紫花地丁多糖药物组合物的制备方法，这都严重影响了紫花地丁在药物中的应用。
众所周知，乙肝和艾滋病同样都是威胁人类健康甚至是生命的疾病，目前用于抗病毒的药物不是效果不明显就是治疗费用太高，不适合我国国情。这就要求我们开发出疗效确切、成本低廉的抗病毒药物，中药文化博大精深，清热解毒的中药品种众多，从中开发治疗疑难杂症、危急重症的特效药物是我国中药现代化的一个重要方向。紫花地丁传统就用于清热解毒，我们通过大量的实验提取纯化出紫花地丁的多糖有效部位，并意外的发现它的多种医药用途，这不是普通技术人员不通过创造性的劳动就能够实现的，更不是显而易见的，该药物组合物的成功开发和应用具有重大意义。
发明内容：
本发明的目的之一是提供一种紫花地丁多糖的药物组合物，本发明的另一个目的是提供一种紫花地丁多糖药物组合物的制备方法。
为了达到上述目的，本发明采取了如下的技术手段：
我们提供了一种紫花地丁多糖药物组合物，由紫花地丁经提取纯化制得，其中多糖成分占固形物的50％以上。
实验发现多糖成分不低于80％时效果更佳。
进一步研究发现，紫花地丁多糖的主要起效成分是平均分子量为11000±2000的多糖组分，其中分子量5000-20000的多糖组分不低于80％。我们用高效液相色谱测定该组合物，GPC凝胶色谱中有一个最主要的多糖色谱峰，平均分子量在11000±2000之间。
通过进一步的纯化，紫花地丁多糖药物组合物多糖含量可以达90％以上。
GPC色谱测定该多糖平均分子量11000±2000之间，分子量分布1.10-1.20，Mz/Mw 1.20-1.30。
我们提供了该紫花地丁多糖药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
1)紫花地丁药材用常规的水提取再用乙醇沉淀的方式得到粗多糖，或者先用有机溶剂脱脂再用水提取的方式得到粗多糖；
2)粗多糖的水溶液过截流分子量2万-20万的超滤柱，收集超滤液；
3)超滤液再过截流分子量小于5000的超滤柱，收集超滤母液，第三步收集的超滤母液浓缩后干燥即得紫花地丁多糖药物组合物。
第一次超滤优选使用5万或10万的超滤柱。更优选5万的超滤柱。
第二次超滤优选使用5000或3000的超滤柱。
为了得到纯度更好的紫花地丁多糖组合物，我们可以采用第一次超滤后超滤液过大孔吸附树脂的方法，除去疏水性杂质。
使用的树脂包括D101、D380、D280、ADS-7、ADS-8、HPD-300或SA-1型号。树脂优选强极性大孔吸附树脂，包括ADS-7或SA-1树脂。
我们制备的紫花地丁多糖可以按下面的步骤实现：
1)紫花地丁药材用常规的水提取再用乙醇沉淀的方式得到粗多糖，或者先用有机溶剂脱脂再用水提取的方式得到粗多糖；
2)粗多糖溶液过5万的超滤柱，收集超滤液；
3)超滤液过SA-1树脂，收集流出液和水洗液合并；
4)第三步所得溶液过5000的超滤柱，得超滤母液，超滤母液烘干得紫花地丁多糖药物组合物。
我们叙述的紫花地丁多糖也可以按下面的步骤实现：
1)紫花地丁药材用常规的水提取再用乙醇沉淀的方式得到粗多糖，或者先用有机溶剂脱脂再用水提取的方式得到粗多糖；
2)粗多糖溶液过5万的超滤柱，收集超滤液；
3)超滤液过ADS-7树脂，收集流出液和水洗液合并；
4)第三步所得溶液过5000的超滤柱，得超滤母液，超滤母液烘干得紫花地丁多糖药物组合物。
我们还提供了紫花地丁多糖药物组合物在制备抗病毒方面药物中的应用，包括乙肝病毒或艾滋病毒。
我们还提供了紫花地丁多糖药物组合物在制备增强免疫药物中的应用。
我们还提供了紫花地丁多糖药物组合物在制备抗肿瘤辅助用药物中的应用。
本发明成功的提取筛选出了紫花地丁的有效成分，并且对该有效成份进行了进一步的纯化，得到了紫花地丁多糖药物组合物。通过大量的试验筛选，提供了该药物组合物的制备方法。体外抑制病毒试验证明，本发明药物组合物具有病毒抑制效果，尤其是对乙肝病毒和HIV病毒的复制有很好的抑制功能。通过药理试验，证明该药物组合物还具有增强免疫力的效果。我们提供的该药物组合物制备方法工艺稳定，重现性好。通过现代分析手段和指纹图谱技术确立了质量标准，并且质量可控，稳定性好，可以进一步开发为新型药物。
下面用具体实施例进一步说明本发明，但是并不能用于唯一限定本发明。
具体实施例：
实施例1：紫花地丁多糖药物组合物的制备
取500g紫花地丁加水煎煮两次，每次5000ml煎煮两个小时，合并两次提取液浓缩至相对密度1.20-1.25(50℃)，充分搅拌下加入等量的乙醇静置过夜，收集沉淀，沉淀再溶解后用大孔吸附树脂(ADS-7大孔吸附树脂)去除酯溶性成分，流出液和1倍床体积水洗脱液合并，用截流分子量5000的超滤膜超滤，超滤液浓缩至尽烘干得紫花地丁多糖药物组合物。
样品编号：ZT-1
实施例2：紫花地丁多糖药物组合物的制备
取500g紫花地丁加水煎煮两次，每次5000ml煎煮两个小时，合并两次提取液浓缩至相对密度1.20-1.25(50℃)，充分搅拌下加入等量的乙醇静置过夜，收集沉淀，沉淀再溶解后冷藏过夜，过滤，续滤液过5万的超滤柱超滤，超滤液用大孔吸附树脂(ADS-7大孔吸附树脂)去除酯溶性成分，流出液和1倍床体积水洗脱液合并，用截流分子量5000的超滤柱超滤，超滤液浓缩至尽烘干得紫花地丁多糖药物组合物；
样品编号：ZT-2
实施例3：紫花地丁多糖药物组合物的制备
取500g紫花地丁加水煎煮两次，每次5000ml煎煮两个小时，合并两次提取液浓缩至相对密度1.20-1.25(50℃)，充分搅拌下加入等量的乙醇静置过夜，收集沉淀，沉淀再溶解后冷藏过夜，过滤，续滤液浓缩后再醇沉一次，沉淀用水溶解后冷藏过夜后过滤，续滤液过5万的超滤柱超滤，超滤液用大孔吸附树脂(ADS-7大孔吸附树脂)去除酯溶性成分，流出液和1倍床体积水洗脱液合并，用截流分子量3000的超滤柱超滤，超滤液浓缩至尽烘干得紫花地丁多糖药物组合物；
样品编号：ZT-3
实施例4：注射用紫花地丁冻干粉的制备
取紫花地丁多糖药物组合物4g，加入250ml注射用水充分溶解，冷藏过夜后过滤，续滤液加入32g的甘露醇，充分溶解后补加注射用水至400ml，调节pH值至6-7，加入活性炭除热源后过0.22微米微孔滤膜，分装于7ml西林瓶中，每只4ml，加塞，冻干，压盖即得。样品编号：HQDD-1
实施例5：注射用紫花地丁冻干粉的制备
取紫花地丁多糖药物组合物2g，加入250ml注射用水充分溶解，冷藏过夜后过滤，续滤液加入32g的甘露醇，充分溶解后补加注射用水至400ml，调节pH值至6-7，加入活性炭除热源后过0.22微米微孔滤膜，分装于7ml西林瓶中，每只4ml，加塞，冻干，压盖即得。样品编号：HQDD-2
实施例6：注射用紫花地丁冻干粉的制备
取紫花地丁多糖药物组合物4g，加入250ml注射用水充分溶解，冷藏过夜后过滤，续滤液加入24g的甘露醇，充分溶解后补加注射用水至400ml，调节pH值至6-7，加入活性炭除热源后过0.22微米微孔滤膜，分装于7ml西林瓶中，每只4ml，加塞，冻干，压盖即得。样品编号：HQDD-3
实施例7：紫花地丁多糖软胶囊的制备
取紫花地丁多糖药物组合物4g，加入大豆油，蜂蜡，混匀，制成软胶囊100粒，即得。样品编号：ZHR-1。
实施例8：紫花地丁片的制备
紫花地丁多糖药物组合物4g，加入适量微晶纤维素，交联聚乙烯吡咯烷酮，粉碎，适量乙醇软化，过60目筛后制粒，50℃干燥，过60目筛整粒，加入适量羧甲基淀粉钠，阿斯帕坦，硬脂酸镁均匀混合，压制成100片，即得。
实施例9：紫花地丁总多糖对小鼠非特异性免疫功能的影响
实验药物：紫花地丁总多糖，生理盐水，香茹多糖。
实验动物：雌性健康Balb/c小鼠，体重18～22g
实验方法：取雌性健康小鼠50只，随机分为5组，生理盐水空白对照组，低剂量紫花地丁多糖组，中剂量紫花地丁多糖组，高剂量紫花地丁多糖组，香茹多糖对照组每组10只。分别给小鼠静脉注射各组药物，连续注射7d。第8天处死小鼠称重，解剖，取脾脏，胸腺准确称重。结果用脏器指数(mg/10g)＝胸腺或脾重量(mg)/小鼠体重*10g。结果见表1：
表1紫花地丁总多糖对小鼠免疫器官，脾指数，胸腺指数的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 脾指数(mg/10g) | 胸腺指数(mg/10g) |
| 生理盐水空白对组低剂量紫花地丁总多糖中剂量紫花地丁总多糖高剂量紫花地丁总多糖香茹多糖 | -5101510 | 74.25±16.4879.44±14.5890.45±16.89119.47±22.51**110.56±22.62** | 18.55±8.0121.02±7.9524.65±9.0528.53±10.41**27.26±10.53** |
注：与空白组对比**P＜0.01
实施例10：不同分子量紫花地丁多糖体外对小鼠脾细胞增殖反应影响
实验药物：低分子量紫花地丁多糖(＜5,000分子量)，中等分子量紫花地丁多糖(5,000-20,000)，高分子量紫花地丁多糖(＞20,000分子量)，刀豆蛋白(ConA)，生理盐水。
实验动物：雌性健康Balb/c小鼠，体重18～22g。
实验方法：脱颈处死小鼠后，无菌取小鼠脾脏，加Hank′s液磨碎，过滤(200目)，洗涤，悬浮于10％NBS-RPIM-1640营养液中，配制成细胞浓度为(1×1010·L-1)脾细胞悬液。在96孔培养板中，每孔加入100μl脾细胞悬液。实验分为9组，每组10孔。1组：空白组(10％NBS-RPIM-1640营养液，100μl)。2组：紫花地丁多糖(低分子量)100mg/L，100μl。3组：紫花地丁多糖(中分子量)100mg/L，100μl。4组：紫花地丁多糖(高分子量)100mg/L，100μl。5组：ConA(5mg·L-1)诱导脾细胞增殖对照组(50μlConA+50μl 10％NBS-RPIM-1640营养液)。分别加入各组药液于培养板中，置37℃，饱和湿度，5％CO2的条件下培养48h，终止前6h，每孔加入[3H]-TdR 20μl(7.4Bq/孔)。培养结束后，用多头细胞收集器将细胞收集于49型玻璃纤维滤纸上，80℃烘干，置闪烁杯中加入闪烁液1ml(0.5％PPO和0.05％POPOP的二甲苯溶液)，BeckmanL5-6500型液闪计数仪上读取如[3H]-TdR dpm值，以反应脾细胞增殖程度。结果见表2。
表2不同分子量紫花地丁多糖体外对小鼠脾细胞增殖反应影响
| 组别 | 剂量(mg·L-1) | [3H]-TdR uptake(dpm) |
| 1组(空白组)2组紫花地丁多糖(低)3组紫花地丁多糖(中)4组紫花地丁多糖(高)5组(ConA) | -1001001005 | 464.0±41.0808.0±48.0**1574.0±38.0**957.0±34.0**1042.0±55.0 |
注：与1组空白组对比**P＜0.01
与5组(ConA)对比△△P＜0.01
实施例11：不同分子量紫花地丁多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
实验药物：低分子量紫花地丁多糖(＜5,000分子量)，中等分子量
紫花地丁多糖(5,000-20,000)，高分子量紫花地丁多糖(＞20,000分子量)。
实验动物：雌性健康Balb/c小鼠，体重18～22g。
实验方法：取50只雌性健康Balb/c小鼠，随机分为5组，生理盐水空白对照组，低分子量紫花地丁多糖组，中等分子量紫花地丁多糖组，高分子量紫花地丁多糖组，每组10只。分别给小鼠静脉注射各组药物，连续注射7d。第8天脱颈处死小鼠，迅速剪开腹腔皮肤，无菌注射Hank′s溶液3ml于腹腔中，轻揉腹部，抽取腹腔液，1000r/min离心10min，取上清液。用PH7.4磷酸缓冲液定容至5ml，加入0.5％鸡红细胞0.4m1，于37℃，5％CO2养箱孵育30min。取适量离心推片，用瑞氏液染色1分钟，再加等量蒸馏水，轻轻混合，经5分钟后用蒸馏水冲洗，待干，油镜下观察镜检，计算吞噬百分数＝(吞噬CRBC的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数)×100％和吞噬指数＝(被吞噬的CRBC数/计数的巨噬细胞数)。结果见表5。
表5不同分子量紫花地丁多糖对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 吞噬率(％) | 吞噬指数 |
| 空白组紫花地丁多糖(低)紫花地丁多糖(中)紫花地丁多糖(高) | -101010 | 39.3±4.747.5±5.6*72.3±8.9**58.4±7.6** | 0.51±0.130.76±0.11*1.10±0.15**0.84±0.13** |
注：与空白组对比*P＜0.05，**P＜0.01
Claims (18)
1、一种紫花地丁多糖药物组合物，由紫花地丁经提取纯化制得，其中多糖成分占固形物的50％以上。
2、如权力要求1所述的紫花地丁多糖药物组合物，其特征是多糖成分不低于80％。
3、如权力要求1或2所述的紫花地丁多糖药物组合物，其特征是平均分子量为11000±2000之间，其中分子量5000-20000的多糖组分不低于80％。
4、如权力要求3所述的紫花地丁多糖，其特征是该组合物在GPC凝胶色谱中有一个最主要的多糖色谱峰，平均分子量在11000±2000之间。
5、如权力要求4所述的紫花地丁多糖药物组合物，其特征是多糖含量达90％以上。
6、一种色谱纯的紫花地丁多糖，GPC色谱测定该多糖平均分子量在11000±2000之间，5000-20000的多糖组分不低于80％，分子量分布1.10-1.20，Mz/Mw 1.20-1.30。
7、一种紫花地丁多糖药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
1)紫花地丁药材用常规的水提取再用乙醇沉淀的方式得到粗多糖，或者先用有机溶剂脱脂再用水提取的方式得到粗多糖；
2)粗多糖的水溶液过截流分子量2万-20万的超滤柱，收集超滤液；
3)超滤液再过截流分子量小于5000的超滤柱，收集超滤母液；
4)第三步收集的超滤母液浓缩后干燥即得紫花地丁多糖药物组合物。
8、如权力要求7所述的紫花地丁多糖药物组合物的制备方法，其特征是第一次超滤使用5万或10万的超滤柱。
9、如权力要求8所述的紫花地丁多糖的制备方法，其特征是第二次超滤使用5000或3000的超滤柱。
10、如权力要求7所述的紫花地丁多糖药物组合物的制备方法，其特征是在第一次超滤后超滤液过大孔吸附树脂。
11、如权力要求10所述的紫花地丁多糖药物组合物的制备方法，其特征是树脂包括D101、D380、D280、ADS-7、ADS-8、HPD-300或SA-1型号。
12、如权力要求10所述的紫花地丁多糖药物组合物的制备方法，其特征是树脂是强极性大孔吸附树脂。
13、如权力要求12所述的紫花地丁多糖药物组合物的制备方法，其特征是树脂为ADS-7或SA-1树脂。
14、如权力要求13所述的紫花地丁多糖药物组合物的制备方法，其特征是实现步骤为：
1)紫花地丁药材用常规的水提取再用乙醇沉淀的方式得到粗多糖，或者先用有机溶剂脱脂再用水提取的方式得到粗多糖；
2)粗多糖溶液过5万的超滤柱，收集超滤液；
3)超滤液过SA-1树脂，收集流出液和水洗液合并；
4)第三步所得溶液过5000的超滤柱，得超滤母液；
5)超滤母液烘干得紫花地丁多糖药物组合物。
15、如权力要求13所述的紫花地丁多糖药物组合物的制备方法，其特征是实现步骤为：
1)紫花地丁药材用常规的水提取再用乙醇沉淀的方式得到粗多糖，或者先用有机溶剂脱脂再用水提取的方式得到粗多糖；
2)粗多糖溶液过5万的超滤柱，收集超滤液；
3)超滤液过ADS-7树脂，收集流出液和水洗液合并；
4)第三步所得溶液过5000的超滤柱，得超滤母液；
5)超滤母液烘干得紫花地丁多糖药物组合物。
16、如权力要求1-6任一种紫花地丁多糖药物组合物在制备抗病毒方面药物中的应用，包括乙肝病毒或艾滋病毒。
17、如权力要求1-6任一种紫花地丁多糖药物组合物在制备增强免疫药物中的应用。
18、如权力要求1-6任一种紫花地丁多糖药物组合物在制备抗肿瘤辅助用药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |