CN1283650C - 一种从槲寄生中提取总黄酮苷的方法及其药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从槲寄生中提取总黄酮苷的制备工艺，以槲寄生为原料，经醇或水提取，过滤，大孔吸附树脂柱纯化，用醇洗脱至无色后，用50%-95%醇洗脱后收集洗脱液，回收醇，至无醇味，减压下或常压下浓缩成浸膏状或干粉，用60%-95%醇溶解，滤过，除去沉淀物并回收滤液，减压回收醇后得到所需的槲寄生总黄酮。本发明还公开了槲寄生总黄酮苷为基本活性成分用于制备抗心脑血管硬化和栓塞、抗心律失常及降低血压的药物，用于治疗和预防心脑血管硬化和栓塞、心律失常及高血压等病理条件的药用用途。
Description
技术领域：
本发明公开一种从槲寄生中提取总黄酮苷的方法及其药物组合物，具体是以槲寄生中提取的槲寄生总黄酮苷为基本活性成分的药物组合物，还涉及到该槲寄生总黄酮苷的制备方法以及槲寄生总黄酮的医药新用途的应用，属于中药有效成分提取方法及其医药新用途技术领域。
背景技术：
槲寄生Viscum coloratum(komar.)Nakai.在植物分类学上属于桑寄生科植物槲寄生属植物。半寄生常绿小灌木，主产区在东北，主要寄生在榆、桦、柳、枫、杨等树上。槲寄生在中医学中通过组方用于治疗风湿痹痛、腰膝酸软、胎动不安等疾病。用中药槲寄生为原料，大量制备槲寄生总黄酮苷(含量达50％以上w/w)，并制成用于心脑血管硬化或栓塞、心律失常和高血压疾病的预防和治疗至今尚未见报道。
发明内容：
本发明提供一种从槲寄生中制备槲寄生总黄酮苷的方法。
本发明进一步提供了槲寄生总黄酮苷的药物组合物在用于制备抗心脑血管硬化和栓塞及抗心律失常、降低血压药物。
本发明公开了以槲寄生总黄酮苷为活性成分的，用于制备治疗和预防心脑血管栓塞和心脑血管硬化、心律失常、高血压等作用等病理条件的药物。
本发明还公开了一种以槲寄生总黄酮苷为基本活性成分，制备含有一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物及其药物组合物。
本发明上述的药物组合物中的基本活性成分槲寄生总黄酮苷的含量至少为50％(w/w)。
本发明的制备工艺包括以下步骤：以槲寄生为原料，用0％至95％醇液提取1-10次，最好使用70％醇液提取，也可以采用水提取，50％-95％醇液沉淀的提取方法，或水提取碱沉淀方法也可，最好提取3次，提取液合并，滤过，滤液经过大孔吸附树脂柱纯化，用0％-10％醇液洗脱至无色后，用50％-95％醇液洗脱后收集洗脱液，最佳用70％醇液洗脱，回收醇液，至无醇液味，减压下或常压下浓缩成浸膏状或干粉，用60％-95％醇液溶解，最好用80％醇液溶解，滤过，除去沉淀物并回收滤液，减压回收醇液后得到所需的槲寄生总黄酮苷。化学分析表明，所得终产物槲寄生总黄酮苷含量大约为50％以上。
上述制备方法中所述的醇液包括乙醇、甲醇、丁醇液等其它醇类化学溶媒。
根据本发明的药物组合物，其中除含有至少50％(w/w)的槲寄生总黄酮苷外，还可含有在槲寄生总黄酮苷分离纯化过程中残留的槲寄生植物本身的少量三萜、蛋白质、肽、氨基酸、多糖，以及微量元素等化学成分。本领域技术人员可以理解到，这些杂质成分基本上不会给本发明药物组合物中槲寄生总黄酮苷的药理学活性带来不利影响，相反，在某些情况下甚至可以与总黄酮苷发挥协同或辅助作用，并且其中还可能存在新的，目前尚不清楚的相关活性成分。
另外，应特别指出的是，可根据需要在本发明的药物组合物中加入一种或多种天然或合成的其它与槲寄生总黄酮苷具有协同或辅助作用的活性成分.这些可能被加入的天然或合成的辅助活性成分是本领域技术人员已知的和可以想到的。
可以将槲寄生总黄酮苷与一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂按适当比例混合，制成适用于临床上使用的不同剂型的药物组合物.例如可将所说的组合物配制成可供静脉内，肌肉内、腹腔内、皮下、脑脊髓腔内等注射给药的注射剂，或者制成适于口服给药的片剂、颗粒剂、滴丸、冲剂、液体制剂、粉末剂。丸剂、胶囊剂和悬浮剂，以及适于局部给药的喷雾剂、气雾剂、霜剂、软膏和栓剂。
本发明组合药物优选含有1％-99％的槲寄生总黄酮苷和99％-1％的赋形剂。
本发明组合药物优选含有40％-60％的槲寄生总黄酮苷和60％-40％的赋形剂。
为了制备适于胃肠道外途径药的溶液剂，例如可使用蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠溶液或葡萄糖溶液，或者低浓度(例如1-100mM)磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为载体或赋形剂。可以在这些胃肠道外给药的制剂中加入一种或多种其他辅助成分或添加剂，例如可使用抗坏血酸作为抗氧化剂，使用苯甲酸钠或尼泊金甲酪作为防腐剂，使用二甲基亚砜作为吸收促进剂。
为了制备适于口服给药的片剂、粉末剂，悬浮剂或胶囊剂，可以使用蔗糖、半乳糖、玉米淀粉、明胶、脂质、微晶纤维素、滑石粉等作为载体或赋形剂。在这些适于口服给药的制剂中，还可含有其他适当的添加剂，例如增溶剂、崩解剂、润滑剂、吸收促进剂、防腐剂、矫味剂、稀释剂、吸附剂、赋形剂、分散剂、表面活性剂、味味剂或着色剂等。
最好将本发明的药物组合物制成给药途径是静脉内或肌肉内注射适于这些给药途径的注射液，例如注射剂、冻干粉针剂等。这些制剂的单位剂量一般包含10-300mg槲寄生总黄酮苷例如对于某些心律失常的病人，可将本发明药物组合物的注射液制剂加在等渗葡萄糖溶液或等渗氯化钠溶液中，持续地滴注给药。静脉内给药的剂量一般为每天20-100mg。本发明药物组合物的另一个优选给药途径是各种适于口服绐药的剂型，例如片剂、粉末剂、胶囊剂，或口服液或乳剂。这些口服制剂的单位剂量一般包含20-1000mg槲寄生总黄酮苷。
下列实验表明了本发明药物及组合物的药理作用：
槲寄生总黄酮苷的药理试验作用研究
实验材料：
动物：昆明种小鼠、体重18～22g，30～35g雌雄各半，大鼠、Wistar体重200～250g，均购自农牧大学动物室，合格证编号分别为10-5112、10-5113。
试剂：三氯甲 烷沈阳试剂一厂 批号：900201
氯化钡 开源化学试剂厂 批号：881004
水合氯醛 沈阳化学试剂三厂 批号：97902
戊巴比妥钠 上海化学试剂分装厂 批号：84-06-12
异丙肾上腺素 上海禾丰制药有限公司 批号：010701
仪器：二道生理记录仪，成都仪器厂Ki Ku Sui南朝鲜制造
药物：槲寄生总黄酮苷 本实验室提供
葛根素葡萄糖注射液 江西东亚药业有限责任公司 批号220104 0641
盐酸维拉帕米注射液(异博定) 上海禾丰制药有限公司 批号981101
1)对氯仿诱发小鼠室颤的影响
取小鼠60只，随机分七组，每组10只，分别为对照组：静脉注射iv 10ml/kg生理盐水；葛根素组：iv 20mg葛根素注射液；异博定组：iv 0.5mg/kg盐酸维拉帕米注射液，槲寄生总黄酮苷高、中、低剂量组，分别iv 12、6、3mg/kg心律安。给药后2-3分钟内，将小鼠逐个放入含4ml氯仿棉球的倒置500ml烧杯内，每换一只小鼠，需加入0.4ml氯仿，让小鼠吸入氯仿直至呼吸停止。立即取出，二导联心电图，在示波器上观察小鼠心脏是否发生室颤[1]。计算室颤发生率，结果甲卡方统计，见表1.
表1 槲寄生黄酮苷对氯仿诱发小鼠室颤的影响
| 组别(mg/kg) | 动物数(只) | 室颤动物数(只) | 室颤率％ | P |
| 对照组 -葛根素 20异博定 0.5槲寄生黄酮苷12槲寄生黄酮苷6槲寄生黄酮苷3 | 101010101010 | 931024 | 90301002040 | ＜0.05＜0.01＜0.001＜0.01＞0.05 |
槲寄生黄酮苷12、6mg/kg、能显著减少氯仿诱发的小鼠室颤发生率。
2)槲寄生总黄酮苷对氯化钡诱发的大鼠心律失常的影响
取大鼠48只，随机分6组，分组给药剂量见表2，大鼠用水合氯醛麻醉(10％水合氯醛0.3ml/100体重)后部固定于手术台口，分离股静脉插管，固定备氯化钡用，iv 0.2％Bacl2、2mg/kg、出现心律失常后，立即分别与尾静脉注射给药，观察1小时内心律恢复正常的持续时间。及到60分钟正常心律动物数[2]。结果见表2。
表2 槲寄生总黄酮苷对Bacl2诱发的大鼠心律失常的影响
| 组别(mg/kg) | 60分钟内维持正常心率的时间 | 恢复正常心律动物数比 |
| 对照组 -槲寄生黄酮苷 1052.5葛根素 20异博定 0.5 | 1.25±3.5357.5±7.07***48.0±13.9***31.8±21.1***27.8±11.4***8.2±9.3 | 07/8***4/8***2/8*00 |
槲寄生总黄酮苷10、5、2.5mg/kg对Bacl2诱发的大鼠心律失常有治疗作用。
3)对窒息性缺氧小鼠心率消失时间的影响
取小鼠40只，随机分4组，分组iv 10ml/kg生理盐水、12、6、3mg/kg槲寄生黄酮，每日1次，连续3日，末次给药后，用戊巴比妥钠5mg/kg麻醉，分离气管，将小鼠通过二导开关与二道生理记录仪相联，通过示波器观察小鼠心电图，结扎气管，观察小鼠心电消失时间[3]。结果见表3。
表3 槲寄生黄酮对窒息性缺氧小鼠心率消失时间的影响
| 组别(mg/kg) | 动物数(只) | 心率消失时间(秒) | P |
| 对照组 -槲寄生黄酮苷12槲寄生黄酮苷6槲寄生黄酮苷3 | 10101010 | 384.7±101.2523.2±107.2502.9±96.9465.3±99.5 | ＜0.05＜0.05＞0.05 |
槲寄生黄酮苷12、6mg/kg，能明显延长窒息性缺氧小鼠心率的消失时间。
4)对异丙肾上腺素所致缺氧小鼠存活时间的影响
取小鼠30只，随机分组，对照组iv 10ml/kg生理盐水、槲寄生黄酮高、低剂量组，分别iv12、6mg/kg槲寄生黄酮，立即皮下注射异丙肾上腺素(5mg/10g)，15分钟后，将小鼠放入250ml三角锥形瓶中，瓶内含2g钠石灰，4g锯末，盖上胶塞，观察小鼠死亡时间。结果见表4。
表4 对异丙肾上腺素所至缺氧小鼠存活时间的影响
| 组别(mg/kg) | 存活时间(分) | P |
| 对照组 -槲寄生黄酮苷126 | 7.5±0.6212.7±2.819.87±2.04 | ＜0.01＜0.05 |
槲寄生黄酮苷12、6mg/kg能明显延长异丙肾上腺素所致缺氧小鼠存活时间。
5)对正常大鼠血压和心率的影响
取大鼠用25％乌拉坦麻醉0.4ml/100g体重，固定大鼠解剖台上，分离右侧颈点动脉，与压力换能器相联，三肢皮下***针状电板，II导联记录心电图，稳定20分钟，记录正常血压和心电图，尾静脉给生理盐水或20、10mg/kg槲寄生黄酮、记录给药后1、5、15、30分钟血压和心电图，并计算出收缩压，舒张压和心率，结果见表5、6。
表5 槲寄生黄酮苷对正常大鼠血压的影响(mmHg)
| 组别(mg/kg) | 给药前血压 | 给药后不同时间(分)血压差值 | |||
| 1’ | 5’ | 15’ | 30’ | ||
| 对照组 舒张压— 收缩压槲寄生黄 舒张压酮苷20 收缩压槲寄生黄 舒张压酮苷10 收缩压 | 83.9±14.7113.6±19.282.8±15.7112.6±19.482.7±13.9118.7±17.6 | 0±3.60.8±3.4-13.9±14.0**-16.4±13.4**-6.5±9.3-7.7±9.8 | -0.3±3.7-0.8±2.7-16.3±15.6-20.5±19.2*-3.0±7.0-1.7±8.8 | -0.3±2.51.3±2.5-4.3±12.4-9.7±10.6-2.0±10.7-4.1±9.7 | 2.8±3.32.8±4.71.5±13.6-1.2±14.9-2.5±9.8-2.8±10.4 |
表6 槲寄生黄酮苷对正常大鼠心率的影响(次/分)
| 组别mg/kg | 给药前血压 | 给药后不同时间(分)血压差值 | |||
| 1’ | 5’ | 15’ | 30’ | ||
| 对照组槲寄生黄酮 20苷槲寄生黄酮 10苷 | 372.5±19.8371.2±18.5371.5±16.6 | 369.1±20.2369.6±13.8367.4±15.9 | 368.8±22.4350.8±13.9*359.3±13.7 | 366.5±17.2368.9±18.3368.2±13.6 | 372.3±18.6364.6±20.3367.4±16.1 |
槲寄生黄酮苷20mg/kg组能明显降低大鼠血压，5分钟为高峰期，持续时间为1-15分内，在5分钟点上减慢大鼠心率，槲寄生黄酮10mg/kg组对大鼠血压和心率无明显影响。
6)对正常小鼠缺氧存活时间的影响
取小鼠30只，随机分3组，对照组iv 10ml/kg生理盐水，槲寄生黄酮高、低剂量组，分别iv 12、6mg/kg槲寄生黄酮，30分钟后将小鼠放入300ml锥形瓶中(内含2g钠石灰、5g锯末)，盖上胶塞，观察小鼠死亡时间。结果见表7。
表7 槲寄生黄酮苷对正常小鼠缺氧存活时间的影响
| 组别(mg/kg) | 动物数(只) | 存活时间(分) | P |
| 对照 -槲寄生黄酮苷 12槲寄生黄酮苷 6 | 101010 | 23.6±3.027.5±4.626.2±3.8 | ＜0.05＞0.05 |
槲寄生黄酮苷12mg/kg能明显延长小鼠缺氧存活时间。
结论：槲寄生总黄酮苷12、6mg/kg、能显著减少氯仿诱发的小鼠室颤发生率。槲寄生总黄酮苷10、5、2.5mg/kg对Bacl2诱发的大鼠心律失常有治疗作用。槲寄生黄酮苷12、6mg/kg，能明显延长窒息性缺氧小鼠心率的消失时间。
槲寄生黄酮苷12、6mg/kg能明显延长异丙肾上腺素所致缺氧小鼠存活时间。槲寄生黄酮苷20mg/kg组能明显降低大鼠血压，5分钟为高峰期，持续时间为1-15分内，在5分钟点上减慢大鼠心率，槲寄生黄酮苷10mg/kg组对大鼠血压和心率无明显影响。槲寄生黄酮苷12mg/kg能明显延长小鼠缺氧存活时间。
槲寄生总黄酮苷具有抗心律失常，降低耗氧量、降低血压作用，为临床应用槲寄生总黄酮苷提供药理学依据。
具体实施方式：
下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领城普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。
实施例1：槲寄生总黄酮苷的制备
取干燥的槲寄生1kg加8kg的水，加热煮沸三次，每次40分钟。收集并合并所得的水提取液，提取液用2％的药用活性炭脱色，或经过离子树脂脱色，过滤，将滤液加于预先用酸和碱处理的大孔吸附树脂(例AB-8中国天津南开大学化学)柱，用去离子水洗柱直到洗出液无颜色，后用70％乙醇液(约500ml)洗脱。收集洗脱物，并减压回收，干燥，将所得浓缩物用80％乙醇液溶解，放置，并滤过，滤液减压浓缩干燥，得到黄色粉末状槲寄生总黄酮苷。
实施例2：
取槲寄生1kg加6kg的水，加热煮沸三次，每次40分钟。收集并合并所得的水提取物，浓缩，加乙醇液至醇液浓度为70％，或用85％乙醇液提取，提取液或醇液沉液可用2％的药用活性炭脱色，或经过离子树脂脱色，或不经过脱色直接过滤，回收乙醇液至无醇液味，将药液加于预先用酸和碱处理的大孔吸附树脂(例AB-8中国天津南开大学化学)柱，用去离子水洗柱直到洗出液无颜色，后用70％乙醇液(约500ml)洗脱。收集流出的洗脱物并于减压下回流浓缩之，得到黄色粉末状槲寄生总黄酮苷。
实施例3
取槲寄生总黄酮苷100g，用75％乙醇液溶解制成5％的总黄酮溶液，用活性炭脱色，滤过，减压浓缩干燥，加注射用水制成5％的水溶液，用微孔滤膜(φ0.20μm)滤过至澄明，灭菌，无菌分装于西林瓶中，每瓶1ml，置冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例4
取槲寄生总黄酮苷100g，用75％乙醇液溶解制成5％的总黄酮溶液，用活性炭脱色，滤过，减压浓缩干燥，加注射用水制成5％的水溶液，用微孔滤膜(φ0.20μm)滤过至澄明，灭菌，无菌分装，每瓶1ml，封口，即得。
实施例5
取槲寄生总黄酮苷1kg，药用淀粉0.5kg，用80％乙醇液湿法制粒，整粒，装1#胶囊，每粒0.2g。
其它项目应符合中华人民共和国药典2000版胶囊项目有关要求。
实施例6
取槲寄生总黄酮苷1kg，药用淀粉0.5kg，糊精1kg，50乙醇液适量制粒，整粒，干燥，压片。每片0.3g。
其它项目应符合中华人民共和国药典2000版片剂项目有关要求。
Claims (1)
1、一种从槲寄生中提取总黄酮苷的制备工艺，包括以下步骤：
a)以槲寄生为原料，用0％至95％乙醇提取1-10次，当水提取时，用60～95％乙醇沉淀，合并提取液，滤过；
b)滤液经过大孔吸附树脂柱纯化，用0％-10％乙醇洗脱至无色后，用50％-95％乙醇洗脱后收集洗脱液，回收醇液，至无醇味，浓缩成浸膏状；
c)用60％-95％乙醇溶解，滤过，除去沉淀物并回收滤液，减压回收乙醇后得槲寄生总黄酮苷。
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