CN1861637A - 淮山药多糖制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种采用淮山药为原料提得总多糖的制备方法及其用途。其特征是将淮山药除去表皮后切片晾干，按每克淮山药干重加30－100倍水，沸水浴浸提4－10h。提取液过滤，滤液离心，上清液加入多量乙醇静置，醇析。析出沉淀离心，得多糖粗品，水复溶、醇析，过滤，无水醇洗涤得到总多糖。其制剂可作为降血糖、提高机体体液免疫和细胞免疫力、抗氧化、抗衰老的健康食品。淮山药产量巨大，目前基本上都是作为食品使用，没有深加工产品，附加值低。本发明利用的植物原料来源广泛，又兼为药食两用品种，安全性好，生产工艺简便高效，保健和辅助治疗效果确切。是进一步提高淮山药产品质量及附加值的有效途径。
Description
技术领域
本发明涉及淮山药多糖制备方法及其用途。
背景技术
山药的最早记录见于《山海经》中，《神农本草经》列薯蓣为上品。除薯蓣之名外，本草中还有诸署、署豫、薯药、署预等名称。在苏颂《图经本草》、唐慎微《证类本草》、李时珍《本草纲目》、吴其浚《植物名实图考》等书中均有记述。自古以来即被国人利用为上品之补虚保健食品，传统名方如六味丸、八味丸、参苓白术散及四神汤中均有山药，历代利用山药组配方剂达三百余方，在中药中占有十分重要的地位，是营养价值很高的药食同源食品。如《饮膳正要》中的山药面，常服可补虚羸，益元气。对健身延年、为极佳的补虚养生品。
淮山药来源于薯蓣科薯蓣属Dioscorea L薯蓣组Sect.Enantiophyllum植物薯蓣Dioscoreaopposita Thunb.、参薯D.alata L.、褐苞薯蓣D.persimilis Prain et Burkill或山薯D.fordii Prain etBurkill的块茎，薯蓣组中多数种类植物的块茎均可食用，且具有相似的营养和药用价值。山药广泛分布于各地，既可食用，又可药用。南北朝刘敬叔的《异苑》云：“薯蓣一名山芋，根既可入药又复可食。”古代本草记载已有最佳产地，如《本草经集注》认为南康间(今江西)最大而美；《唐本草》认为蜀道(今四川)者良。《图经本草》认为北都(今山西太原)、四明(今浙江四明山)者最佳。自明朝后渐出现药用山药和食用山药之分，根据《救荒本草》和《植物名实图考》记载，药用山药分布较北。有人认为，产于淮河一带的山药药效最好，就以“淮山药”来专指产于淮河的山药。
山药为历次《中国药典》收载的品种，山药味甘性平，补脾胃之气，又能补胃之阴，用于治疗脾胃虚弱证，如食少、倦怠、便溏、久泻、小儿营养不良、妇女脾虚带下等，常与人参(或党参)白术配伍使用，如名方参苓白术散。山药能补益肺，肾，用于肺肾阴虚病证。如肺虚久咳，或肺肾两虚久咳久喘，常配麦冬、五味子等同用。山药治疗肾虚遗精，尿频等病，常与熟地黄、山萸肉、菟丝子等同用。山药治疗消渴症(糖尿病)可以单独大剂量水煎代茶饮，也可配知母，天花粉、地黄等同用，鲜山药捣烂外敷可消散结核、初起痈肿。白术和山药都可以补脾健脾，但白术性燥，山药性润。湿困中焦，白术适宜；肺肾阴亏，则山药最宜。淮山药产量巨大，目前基本上都是作为原料药材或食品使用，没有深加工产品，附加值低。本发明用淮山药为原料，经加工制备方法提得多糖，进一步提高了淮山药产品质量及附加值。
发明内容
本发明所用淮山药，系指淮河流域人工栽培的淮山药Dioscorea opposita L.。
本发明的目的是提供一种淮山药多糖制备方法。
本发明的目的可以通过以下措施来达到：
一种提取淮山药多糖的方法，其特征为：采用热水浸提，提取工艺条件为：浸提温度70-90℃，浸提时间4-10h，淮山药干原料与加水量的重量比为1∶30-1∶100。
本发明的另一目的是提供一种淮山药多糖在治疗降血糖、糖尿病药中以及在提高机体免疫力、抗衰老和抗氧化药中的应用。
本发明淮山药多糖制备方法的特征是将新鲜的淮山药块茎轻轻刮去表面的泥土，削去表皮，横切成约2～3mm薄片，迅速置于日光下晾干，以防淮山药褐化；将晾干的淮山药片粉碎，装密封袋置于干燥皿中备用。按每克干重加30-100倍的蒸馏水量，于70-90℃沸水浴浸提4-10h。提取液过滤，将滤液于3000r·min-1离心5min，取上清液加入多量乙醇静置，醇析。析出沉淀离心，得多糖粗品，水复溶、醇析，过滤，无水醇洗涤得到总多糖。经ICR种小鼠动物进行降糖实验，ICR种小鼠淋巴细胞增殖能力的作用的实验，增强小鼠碳廓清能力的作用的实验，致衰老模型小鼠血清和脑中SOD活力和MDA含量的实验表明，本发明得到的总多糖可作为降血糖、提高机体体液免疫和细胞免疫力、抗氧化、抗衰老的健康食品。淮山药产量巨大，由于相关研究基础不足，基本上都是作为药材或食品使用，没有深加工产品，附加值低。
本发明的有益效果是：
本发明利用的植物原料来源广泛，又兼为药食两用品种，安全性好，生产工艺简便高效，保健和辅助治疗效果确切。是进一步提高淮山药产品及附加值的有效途径。
具体实施方式
实施例1
将新鲜的淮山药块茎并轻轻刮去表面的泥土，削去表皮，横切成约2-3mm薄片，迅速置于日光下晾干，以防淮山药褐化；将晾干的淮山药片100克粉碎，装密封袋置于干燥皿中备用。按每克干重加3000克的蒸馏水量，于70℃沸水浴浸提4h。提取液过滤，将滤液于3000r·min-1离心5min，取上清液加入多量乙醇静置，醇析。析出沉淀离心，得多糖粗品，水复溶、醇析，过滤，无水醇洗涤得到总多糖。
ICR种小鼠18-22g，雄性。分笼饲养于20±2℃明暗各12小时的动物实验室内，实验动物自由饮水和进食。正常喂养2天，禁食20hr后，按90mg/kg IV注射四氧嘧啶溶液，30sce内注射完毕，72hr后测定空腹血糖。选用血糖值大于11.1mmol/ml的动物进行降糖实验。
动物按血糖值随机分成6组，每组10只：正常组、模型对照组、阳性组(二甲双胍100mg/kg)、淮山药粗多糖低剂量组(200mg/kg)、淮山药粗多糖中剂量组(400mg/kg)、淮山药粗多糖高剂量组(800mg/kg)。各给药组按10ml/kg体积灌胃给药(IG)，正常组和模型组给予等量蒸馏水。连续IG14天后，于最后一次给药后禁食5hr经眼眶取血，测定血糖。结果如下：
| Groups | Dose(mg/kg) | Glu(mmol/l) | 变化率(％) |
| 模型对照组 | - | 25.91±4.19* | |
| 二甲双胍组 | 100 | 20.07±5.03 | -22.53 |
| 山药多糖组 | 200 | 22.21±7.05 | -14.29 |
| 山药多糖组 | 400 | 20.94±6.03* | -19.17 |
| 山药多糖组 | 800 | 20.19±4.18** | -22.08 |
**P＜0.01 *P＜0.05 vs模型对照组
淮山药多糖中剂量与高剂量组与模型组相比血糖分别下降了19.17％与22.08％，具有显著性差异(p＜0.05或这＜0.01)，表明淮山药粗多糖对本四氧嘧啶型糖尿病小鼠具有降血糖作用。
实施例2
将新鲜的淮山药块茎并轻轻刮去表面的泥土，削去表皮，横切成约2-3mm薄片，迅速置于日光下晾干，以防淮山药褐化；将晾干的淮山药片200克粉碎，装密封袋置于干燥皿中备用。按每克干重加20000克的蒸馏水量，于90℃沸水浴浸提10h。提取液过滤，将滤液于3000r·min-1离心5min，取上清液加入多量乙醇静置，醇析。析出沉淀离心，得多糖粗品。
淮山药粗多糖，用蒸馏水配制成混悬液。
ICR种小鼠18-22g，雄性；豚鼠。食用全价颗粒饲料，自由摄食饮水。
YAC-1细胞。
健康绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动，以脱纤维，用阿氏液保存于4℃冰箱保存备用。用时生理盐水2000r/min离心10min洗涤三遍。采集豚鼠血，分离出血清(至少5只豚鼠的混合血清)，前将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，经常振荡，离心取上清，分装小瓶，-70℃保存。用时以生理盐水按1∶10稀释。
小鼠随机分为对照组(给予蒸馏水)及山药多糖200mg/kg.、400mg/kg和800mg/kg 3个剂量组，每组10只。灌胃体积0.1ml/10g bw，1次/d，连续8d。
1640培养液用微孔滤膜过滤除菌，加入10％小牛血清、1％谷氨酰胺(200/ml)、青霉素(100/ml)、链霉素(100L/ml)及2-巯基乙醇(5μmol/ml)，用无菌HCl(1mol/L)或无菌NaOH(1mol/L)调PH至7.0～7.2，制成完全培养液；用7.2～7.4的PBS缓冲液作溶剂，现用现配MTT溶液(5mg/ml)；以3.5％的无菌NaHCO3将无菌Hanks液PH调至7.2～7.4；用双蒸水配制成100μg/ml的ConA液，过滤除菌后，-20℃保存；在96ml异丙醇中加入4ml HCl(1mol/L)制成酸性异丙醇溶液。各组动物连续灌胃至第8d，每鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单个细胞悬液，200目过滤，用Hanks液多次洗涤、离心后悬浮于2ml完全培养液中，用台酚兰染色记数活细胞，调整细胞浓度为2×106个/ml，分两孔放入培养孔中，每孔1ml，一孔加50μl Con A液，另一孔作为对照，置5％CO2，37℃培养72hr，培养结束前4hr，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的1640培养液，同时加入50μl MTT液，继续培养4h。培养结束，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，移入1ml比色杯中，于分光光度计，570nm处测定光密度。
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 增殖能力 |
| 正常对照组 | - | 0.014±0.0059 |
| 山药多糖 | 200 | 0.014±0.012 |
| 山药多糖 | 400 | 0.063±0.049* |
| 山药多糖 | 800 | 0.077±0.041** |
*P＜0.05 *p＜0.01 与正常对照组比较
以上结果表明淮山药粗多糖400、800mg/kg·bg/d剂量时，具有增强小鼠淋巴细胞增殖能力的作用。
实施例3
将新鲜的淮山药块茎并轻轻刮去表面的泥土，削去表皮，横切成约2-3mm薄片，迅速置于日光下晾干，以防淮山药褐化；将晾干的淮山药片150克粉碎，装密封袋置于干燥皿中备用。按每克干重加7500克的蒸馏水量，于80℃沸水浴浸提6h。提取液过滤，将滤液于3000r·min-1离心5min，取上清液加入多量乙醇静置，醇析。析出沉淀离心，得多糖粗品。
淮山药粗多糖，用蒸馏水配制成混悬液。
各组动物连续灌胃至3d时，每鼠腹腔注射2％(v/v)绵羊红细胞悬液0.2mL。5d(期间不停止灌胃)后，小鼠经眼眶取血于离心管中，放置1h，3500r/min离心15min，收集血清，血清用生理盐水缓冲液稀释320倍。将稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10％(v/v)SRBC0.5mL，补体1mL(用生理盐水按1∶10稀释)，另设不加血清的对照管(以生理盐水代替)。置37℃恒温水浴中保温30min后，冰浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液1mL，都氏试剂3mL于试管内，同时取10％(v/v)SRBC 0.25mL加都氏试剂至4mL，于另一支试管内，作为SRBC的半数溶血值。充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，按下列公式计算：
各小鼠的半数溶血值(HC50)＝样品管光密度/SRBC半数溶血时的光密度×稀释倍数结果如下：
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 增殖能力 |
| 正常对照组 | - | 0.014±0.0059 |
| 山药多糖 | 200 | 0.014±0.012 |
| 山药多糖 | 400 | 0.063±0.049* |
| 山药多糖 | 800 | 0.077±0.041** |
**P＜0.05 与正常对照组比较
淮山药总多糖具有促进抗体生成作用。
实施例4
将新鲜的淮山药块茎轻轻刮去表面的泥土，削去表皮，横切成约2-3mm薄片，迅速置于日光下晾干，以防淮山药褐化；将晾干的淮山药片100克粉碎，装密封袋置于干燥皿中备用。按每克干重加7000可的蒸馏水量，于75℃沸水浴浸提8h。提取液过滤，将滤液于3000r·min-1离心5min，取上清液加入多量乙醇静置，醇析。析出沉淀离心，得多糖粗品。
淮山药粗多糖，用蒸馏水配制成混悬液。
将印度墨汁用生理盐水稀释4倍制成注射用墨汁，称取1.0g Na2CO3加蒸馏水至1000mL配置成0.1％Na2CO3溶液。各组动物连续灌胃至8d时，每鼠尾静脉注入注射用墨汁(0.1mL/10g·bw)，注入后立即计时，于注入后0.5min、6min分别从内眦静脉丛取血20μL，加到2mL Na2CO3溶液中，用分光光度仪计在600nm波长处测光密度值，以Na2CO3溶液作为空白对照。颈椎脱臼处死小鼠，取肝脏、脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。按下列公式计算廓清指数K：
廓清指数K＝(logOD0.5-logOD6)/(t6-t0.5)
结果如下：
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 廓清指数 |
| 正常对照组 | - | 0.076±0.016 |
| 山药多糖 | 200 | 0.082±0.012 |
| 山药多糖 | 400 | 0.091±0.022 |
| 山药多糖 | 800 | 0.098±0.011** |
**P＜0.01与正常对照组比较：淮山药粗多糖具有增强小鼠碳廓清能力的作用。
实例4证明本发明所得淮山药总多糖可用于提高机体免疫力。
实施例5
将新鲜的淮山药块茎并轻轻刮去表面的泥土，削去表皮，横切成约2-3mm薄片，迅速置于日光下晾干，以防淮山药褐化；将晾干的淮山药片200克粉碎，装密封袋置于干燥皿中备用。按每克干重加16000克的蒸馏水量，于85℃沸水浴浸提9h。提取液过滤，将滤液于3000r·min-1离心5min，取上清液加入多量乙醇静置，醇析。析出沉淀离心，得多糖粗品。
淮山药粗多糖，用蒸馏水配制成混悬液。
ICR种小鼠18-22g，雄性。
ICR小鼠根据体重随机分组，每组10只，共分成以下5组：正常对照组、模型组、阳性对照组(绞股兰总皂苷100mg/kg)、山药多糖低剂量组(100mg/kg)和高剂量组(200mg/kg)。其中正常对照组每天颈背部皮下注射生理盐水0.1ml/10g，其余各组每天颈背部皮下注射D-半乳糖200mg/kg。皮下注射同时各给药组每天按0.1ml/10g灌胃给予不同药物，模型组、正常组每天灌胃给予等量生理盐水。在实验过程中每周各鼠称重记录一次，观察外观形态。第30天时灌胃两个小时后，小鼠眼眶取血，3500r/min离心15min，取上层血清备用，处死小鼠，取脑组织。按试剂盒方法测定血与脑组织中MDA、SOD。
血清中的MDA与SOD含量
| 组别 | 剂量mg/kg | MDA(nmol/ml) | SOD(U/ml) |
| 正常对照组 | - | 3.23±1.69** | 64.77±5.23** |
| 模型对照组 | - | 5.45±1.51 | 36.15±6.26 |
| 山药多糖 | 100 | 4.50±0.99 | 49.73±13.16** |
| 山药多糖 | 200 | 4.05±1.18* | 52.60±10.40** |
**P＜0.01 *P＜0.05 VS MOD
脑组织中的MDA与SOD含量
| 组别 | 剂量mg/kg | MDA(nmol/g) | SOD(U/g) |
| 正常对照组 | - | 45.41±23.42* | 141.33±9.25** |
| 模型对照组 | - | 76.24±34.79 | 97.49±24.21 |
| 淮山药粗多糖 | 100 | 48.77±13.24* | 123.88±30.85* |
| 淮山药粗多糖 | 200 | 45.61±15.09* | 129.76±16.20** |
ΔΔP＜0.01 VS Nor，**P＜0.01 *P＜0.05VS MOD
淮山药多糖能显著增高D-半乳糖致衰老模型小鼠血清和脑中SOD活力，降低MDA含量，具有抗氧化、抗衰老作用。
Claims (4)
1.一种提取淮山药多糖的方法，其特征为：采用热水浸提，提取工艺条件为：浸提温度70-90℃，浸提时间4-10h，淮山药干原料与加水量的重量比为1∶30-1∶100。
2.如权利要求1所述方法提取的淮山药总多糖，其组成为D-半乳糖、D-甘露糖、葡萄糖、D-***糖组成的杂多糖，分子量为45970Dal～45990Dal。
3.如权利要求1所述淮山药多糖，其制剂在治疗降血糖、糖尿病药中的应用。
4.如权利要求1所述淮山药多糖，其制剂在提高机体免疫力、抗衰老和抗氧化药中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |