CN1856725A - 具有瞬逝照明的电子光栅显微镜 - Google Patents
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Abstract
一种电子光栅显微镜，具有瞬逝地照明被布置在载物台(13)上的样品(15)的光源(1)。点探测器(35，36)接收从所述样品(15)的像素发出的探测光(51)，其中在所述探测光的光程中布置一射线偏转装置(29)，利用它可以移动样品内的像素位置。
Description
本发明涉及一种电子光栅显微镜。
在电子光栅显微镜中，样品利用光射线被照明，以便观察从样品发出的作为反射光或荧光的探测光。照明光射束的焦点借助于可控的射线偏转装置、一般是通过翻转两个反射镜而在样品平面上移动，其中偏转轴大多是相互垂直的，使得一个反射镜在x方向上偏转，另一在y方向上偏转。反射镜的翻转例如借助于电流计-调节元件来实现。来自于物体的探测光的功率根据扫描射线的位置被测量。通常，所述的调节元件装有用于测定当前反射镜位置的传感器。特别在共焦的电子光栅显微镜中，物体利用光射线的焦点被三维地扫描。
共焦的电子光栅显微镜通常包括一个光源、一个聚焦镜组、一个射线分配器、一个用于射线控制的射线偏转装置、一个显微镜镜组、一个探测光阑、以及多个用于检测探测光或荧光的探测器，其中所述聚焦镜组被用来把光源的光聚焦到一个孔眼光阑(所谓的激励光阑)上。照明光通过一个射线分配器被耦合输入。来自于物体的荧光或反射光通过射线偏转装置返回到射线分配器，并经过该射线分配器，以便随后聚焦到后面设有探测器的探测光阑上。该探测装置被称为Descan(解扫描)装置。非直接来源于焦点区的探测光采取另一条光路径并且不经过该探测光阑，这样便获得一种点信息，该点信息通过利用照明光射束的焦点顺序地扫描物体而导致一个三维图形。大多通过逐层的图像数据处理来获得三维图像。
US 2002/0097489A1公开了一种瞬逝地照明样品的显微镜。该显微镜包括一个白光源，其光线通过孔隙光阑穿越显微镜物镜而被耦合输入到支撑样品的载物台中以进行瞬逝照明。照明光在载物台中通过全内反射被传播，其中样品的照明仅仅在从载物台伸出来的瞬逝区的范围内进行。这种显微镜以概念TIRFM(全内反射荧光显微镜)而公知。
TIRF显微镜的z分辨率因为只有约100nm被伸入到样品中的瞬逝区而非常良好。
本发明的任务在于，提供一种电子光栅显微镜，用它既可以利用瞬逝照明的优点也可以利用电子光栅显微镜的优点。
该任务通过以下的电子光栅显微镜来解决，其具有瞬逝地照明被布置在载物台上的样品的光源，具有接收从所述样品的像素发出的探测光的点探测器，以及具有被布置在所述探测光的光程中的用于移动样品内的像素位置的射线偏转装置。
本发明具有以下优点：既可以两维地或三维地扫描样品，也可以在z方向上实现明显提高的分辨率。
借助于被布置在探测光的光程中的射线偏转装置来实现在横向
(xy方向)上扫描样品。为了在轴向(z方向)扫描样品，可以调整样品和物镜的相对间距。为此，可以把样品布置在高度可调的台子上，或者采用在z方向可调的物镜。
所述照明光优选地可以通过所述电子光栅显微镜的物镜被耦合输入到所述样品的盖玻片中。在另一变型方案中，所述照明光通过所述电子光栅显微镜的聚光器被耦合输入到所述载物台中。在一完全不同的变型方案中，所述的耦合输入既不通过物镜也不通过聚光器实现，而是直接地例如通过棱镜被耦合输入到载物台中。
所述照明光优选地经过物镜光瞳的外边缘区，以确保在盖玻中达到全反射的临界角。优选地，所述照明光被成形为照明光射束，所述照明光射束在所述物镜光瞳的平面上具有一个焦点。该照明光射束可以在样品的检查期间保持位置固定。在一特别优选的变型方案中，所述照明光射束可利用另一射线偏转装置而回转地通过物镜光瞳的外部区。由此以非常有利的方式实现非常均匀和等同的照明。
所述物镜优选地具有大于1.3、尤其优选为1.35与1.42之间的数值孔径。
在一优选扩展形式中，在所述照明光的光程中，优选在所述物镜光瞳的平面内布置一色选弓形光阑。所述色选弓形光阑在外边缘区具有不同于内部区的光特性。优选地，所述色选弓形光阑在外边缘区对所述照明光的波长是透明的，而其在内部区只对大于所述照明光的波长的光是透明的。这种扩展变型方案尤其对于以下荧光应用是非常优选的：探测光的波长根据特性位于照明光波长之上。
在另一变型方案中，所述色选弓形光阑在内部区只对小于所述照明光的波长的光是透明的。该变型方案尤其适用于样品的多光子激发。在此，所述照明光优选地是脉冲式的红外光。
借助于色选弓形光阑避免了位于外边缘区之外的照明光通过物镜到达样品并直接照射该样品。
在一种非常特别优选的扩展变型方案中，所述照明光具有多个波长。在该变型方案中，例如多个不同的样品色料可以同时被激发。
所述点探测器优选地在对应于物镜焦平面的平面上包括一探测孔眼光阑。通过该孔眼光阑的位置和通过所述射线偏转装置的位置，确定了点探测器能从其接收探测光的像素的空间位置。
在一优选变型方案中，所述点探测器包括一多波段探测器和一分光计。由此能够从样品中获得光谱点信息。尤其在结合多色照明的情况下，该实施方案变型是非常有利的。
本发明的电子光栅显微镜另外还可以被构造为共焦的电子光栅显微镜，其中既可以通过色选弓形光阑的内部区对样品进行共焦检查，同时又可以通过色选弓形光阑的外部区进行TIRF照明。
为了在物镜光瞳的平面上产生照明光射束的焦点，照明光的光程中布置了一成像镜组、优选地是Bertrandt透镜。
在一种非常特别优选的扩展方案中，所述探测光的光路包括多个探测通道，其中在每个探测通道中可以设立一个带通滤光器。
在附图中示意地示出了本发明的主题，下面借助于该图来讲述它，其中作用相同的元件设有相同的附图标记。在此：
图1示出了本发明的一种子光栅显微镜，
图2示出了色选的弓形光阑，
图3示出了本发明的另一电子光栅显微镜，以及
图4示出了本发明的又一电子光栅显微镜。
图1示出了本发明的一种电子光栅显微镜，其具有被构造为氩离子激光器3的光源1。光源1产生一个照明光射束5，该照明光射束由射线分配器7反射到物镜9。照明光射束5经过物镜光瞳11的外边缘区(通过双箭头24表示)，并被耦合输入到样品15的盖玻片13中以用于瞬逝照明。在照明光射束5的光程中有一个被构造为Bertrandt透镜17的成像镜组19，该成像镜组在物镜光瞳11的平面上产生一个焦点。此外，在照明光射束5的光程中还有另一射线偏转装置21，其包含一个没有被示出的万向悬挂扫描镜。借助于该另一射线偏转装置，照明光射束的焦点连续回转地移动通过物镜光瞳11的外边缘区，由此实现一个特别均匀的瞬逝照明。在物镜光瞳11的平面内，布置了如图2所示的色选弓形光阑23。该色选弓形光阑23具有一个对照明光透明的外边缘区25。另外，该色选弓形光阑23还具有一个内部区27，其对大于照明光波长的光是透明的。从样品出来的探测光51穿过物镜和该色选弓形光阑的内部区到达射线分配器7，穿过该射线分配器，并经含有万向悬挂扫描镜31的射线偏转装置29到达点探测器33。所述点探测器33包括一个探测孔眼光阑35，其空间位置与所述万向悬挂扫描镜31的位置尤其确定了在样品中的像素(Rasterpunkt)的位置，其中点探测器33从该像素接收探测光51。点探测器33包括一个多波段探测器36，它可以同时地接收多个可调的波长带内的探测光51。氩离子激光器3的照明光射束包含有多个波长的照明光，由此可以实现样品的多色激发。
图3示出了本发明的另一种电子光栅显微镜，其中在样品的TIRF检查的同时可以实现样品的共焦检查。该电子光栅显微镜包括另一光源37，该光源被构造为脉冲式的钛-蓝宝石激光器(Titan-Saphirlaser)39，并且发出另一照明光射束41。该另一照明光射束41通过第二射线分配器43和途经射线偏转装置29、以及通过射线分配器7和第三射线分配器45到达物镜9，并通过弓形光阑23的内部区27直接照穿样品15。在样品15内，与利用照明光射束5的TIRF照明无关地通过所述另一照明光射束41引起样品的双光子激发。通过样品的双光子激发所产生的另一探测光53借助于一个被构造为CCD元件49的非-解扫描-探测器47被检测。该另一探测光53经过物镜的内部区、通过第三射线分配器45上的反射到达所述的非-解扫描-探测器47。在该电子光栅显微镜中，在物镜光瞳内装有另一色选弓形光阑，其在外边缘区对光源1的照明光射束5是透明的，并且在内部区被构造成对该光进行反射。由此确保了没有照明光被直接入射到样品上。射线分配器7、45和43被构造使得照明光射束5和钛-蓝宝石激光器39两者的光不会都到达点探测器33或非-解扫描-探测器47。
在图4中示出了本发明的电子光栅显微镜的又一种可以想见的变型方案。在该情形下，光源1由一个发出照明光射束5的钛-蓝宝石激光器55构成，所述照明光射束5作为TIRF照明被引到通过色选弓形光阑23的外边缘区25。瞬逝照明在样品15内引起多光子激发。由此产生的荧光通过整个弓形光阑23经第三射线分配器45到达被构造为CCD元件49的非-解扫描-探测器47。紧接着通过用光源37进行共焦照明和用点探测器33进行探测来拍摄样品的一幅三维图像，其中所述光源37由氩离子激光器57组成，所述点探测器33被构造为多波段探测器36。
参照特殊实施方案讲述了本发明。但显然可以进行变化或变换，而不会脱离以下权利要求书的保护范围。
附图标记清单：
1 光源
3 氩离子激光器
5 照明光射束
7 射线分配器
9 物镜
11 物镜光瞳
13 盖玻片
15 样品
17 Bertrandt透镜
19 成像镜组
21 射线偏转装置
23 弓形光阑
24 双箭头
25 外边缘区
27 内部区
29 射线偏转装置
31 扫描镜
33 点探测器
35 探测孔眼光阑
36 多波段探测器
37 光源
39 钛-蓝宝石激光器
41 照明光射束
43 第二射线分配器
45 第三射线分配器
47 非-解扫描-探测器
49 CCD元件
51 探测光
53 探测光
55 钛-蓝宝石激光器
57 氩离子激光器
Claims (19)
1.电子光栅显微镜，具有瞬逝地照明被布置在载物台上的样品的光源，具有接收从所述样品的像素发出的探测光的点探测器，以及具有被布置在所述探测光的光程中的用于移动样品内的像素位置的射线偏转装置。
2.如权利要求1所述的电子光栅显微镜，其特征在于，
所述照明光可以被耦合输入到所述载物台中或所述样品的盖玻片中。
3.如权利要求2所述的电子光栅显微镜，其特征在于，
所述电子光栅显微镜具有一聚光器，所述照明光通过该聚光器可被耦合输入到所述载物台中。
4.如权利要求2所述的电子光栅显微镜，其特征在于，
所述电子光栅显微镜具有一物镜，所述照明光通过该物镜可被耦合输入到所述盖玻片中。
5.如权利要求4所述的电子光栅显微镜，其特征在于，
所述物镜具有一物镜光瞳，所述照明光经过该物镜光瞳的外边缘区。
6.如权利要求5所述的电子光栅显微镜，其特征在于，
所述照明光以照明光射束经过。
7.如权利要求5所述的电子光栅显微镜，其特征在于，
所述照明光射束在所述物镜光瞳的平面上具有一个焦点。
8.如权利要求6或7之一所述的电子光栅显微镜，其特征在于，
在所述照明光的光程中设有另一射线偏转装置，利用该另一射线偏转装置可改变所述照明光射束的空间位置。
9.如权利要求8所述的电子光栅显微镜，其特征在于，
所述另一射线偏转装置回转地通过所述物镜光瞳的所述外边缘区偏转所述照明光射束。
10.如权利要求4-9之一所述的电子光栅显微镜，其特征在于，
所述物镜具有大于1.3、优选为1.35与1.42之间的数值孔径。
11.如权利要求1-10之一所述的电子光栅显微镜，其特征在于，
在所述照明光的光程中，优选在所述物镜光瞳的平面内布置一色选弓形光阑。
12.如权利要求11所述的电子光栅显微镜，其特征在于，
所述色选弓形光阑在外边缘区对所述照明光的波长是透明的。
13.如权利要求12所述的电子光栅显微镜，其特征在于，
所述色选弓形光阑在内部区只对大于所述照明光的波长的光是透明的。
14.如权利要求12所述的电子光栅显微镜，其特征在于，
所述色选弓形光阑在内部区只对小于所述照明光的波长的光是透明的。
15.如权利要求14所述的电子光栅显微镜，其特征在于，
所述照明光优选地是脉冲式的红外光。
16.如权利要求1-15之一所述的电子光栅显微镜，其特征在于，
所述照明光具有多个波长。
17.如权利要求1-16之一所述的电子光栅显微镜，其特征在于，
所述点探测器包括一多波段探测器和一分光计。
18.如权利要求1-16之一所述的电子光栅显微镜，其特征在于，
所述点探测器包括一探测孔眼光阑。
19.如权利要求1-18之一所述的电子光栅显微镜，其特征在于，
所述电子光栅显微镜被构造为共焦的电子光栅显微镜。
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