JP2003131141A - 回転式輪帯全反射照明機構 - Google Patents

回転式輪帯全反射照明機構

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JP2003131141A JP2001325773A JP2001325773A JP2003131141A JP 2003131141 A JP2003131141 A JP 2003131141A JP 2001325773 A JP2001325773 A JP 2001325773A JP 2001325773 A JP2001325773 A JP 2001325773A JP 2003131141 A JP2003131141 A JP 2003131141A
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一彦 木下
Hagumu Shio
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Abstract

(57)【要約】 【課題】視野周辺に至るまで偏光のない照明が可能であ
り、あらゆる方向の蛍光情報が得られる回転式輪帯全反
射照明機構を提供する。 【解決手段】 顕微鏡対物レンズの辺縁部にレーザ光を
導入し物体を照明するケーラー式照明系において、前記
レーザ光による照明方向を顕微鏡対物レンズ56の軸心
を中心に回転可能としたことを特徴とする回転式輪帯全
反射照明機構。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、顕微鏡対物レンズ
周辺部にレーザビームを入射させる照明系において、こ
のレーザビームの照明方向を回転可能にした回転式輪帯
全反射照明機構に関するものであり、さらに具体的には
全反射光を用いて蛍光を発光させる照明系に好適な回転
式輪帯全反射照明機構に関するものである。
【0002】
【従来の技術】従来のエバネッセント照明を利用した全
反射の原理を簡単に説明しておくと、図5は顕微鏡対物
レンズの辺縁部にレーザビームを入射させ全反射光を用
いて蛍光を発光させる全反射照明(エバネセント照明:
通常内角61°外角68°)の原理図である。
【0003】図において11は対物レンズ、12は油浸
オイル、13はガラス、14は溶液であり、対物レンズ
11の辺縁部にレーザビームを入射するとガラス・水溶
液部で全反射し、表面近傍150nmの深さに光がしみ出
す(この光の場をエバネッセント場という)。このエバ
ネッセント場を蛍光照明に使うと背景光を著しく減少さ
せコントラストの高い蛍光ー分子像が得られる。しかし
ながら、エバネッセント場を利用した1方向から照明す
る全反射照明では偏った蛍光情報しか得られないという
問題がある。
【0004】また、図6は従来技術の他の一例で、中央
を遮光した輪帯全反射照明を行った照明光学系である。
図6において20は試料面、21は対物レンズ、22は
対物レンズ瞳面、23は反射鏡、24は凸レンズ、25
は視野絞り面(物体面と共役面)、26は中央遮光絞り
(対物レンズ瞳面22と共役)であり、この照明方式は
試料面20にレーザビームを集光させる方式(クリチカ
ル照明)を採用しており、試料面20を平行ビームで照
明する図1とは異なる。本照明系では輪帯全反射照明を
行うため、対物レンズ瞳面22と共役面に中央遮光絞り
26が設置されており、従来技術はこの照明方式を用い
ている。
【0005】しかしながら、この照明方式は試料面20
にレーザビームを集光させるため視野の中央と周辺では
明るさが異なり、均一な蛍光情報が得られないばかり
か、視野の拡大が困難であった。また視野拡大のため拡
散板を挿入すると明るさが大幅に低下する欠点があっ
た。
【0006】ところで、一般の顕微鏡照明は明るく照明
ムラがないケーラー照明が理想の照明となっている。図
7にケーラー照明を用いた物体面の焦光状況を示す。図
において、レーザビームは対物レンズ焦点位置(前側焦
点面)Fに図示のごとく集光させなければ、物体面にお
いては平行な光束で照明されない。平行性の優れたレー
ザビームを使用した場合、物体面中央光軸上は1o,2
o,3o,4oの4方向からの光線が集光し明るくな
る。しかしながら、視野周辺最上端部S点は1bと3b
の光線しか集光せず周辺は暗くなるだけでなく偏光をも
っているため、偏光方向を含めた均質照明をすることが
難しく、正しい蛍光情報が得られないという問題があ
る。
【0007】近年、微小なプローブ(蛍光色素ー分子)
を用いてタンパク質の特定向きを知ることはダイナミッ
クな動きをここにとらえることができ、今後ますます重
要な課題となっている。しかし、この課題を解決するに
は前述した1方向から照明する全反射照明(エバネッセ
ント照明)では偏った蛍光情報しか得られず、また、ケ
ーラー照明方式の輪帯全反射照明が理想の照明といえる
が、前記した問題があるため、採用例はみられない。
【0008】さらに、全反射照明の照明角度は試料を囲
む媒質の屈折率変化(異なる媒質への対応、試料の温度
変化)によって異なり厳密に対応しないと不要な背景光
を招き、一分子蛍光色素の観察は困難となる。また使用
する対物レンズの倍率(焦点距離)が替わるとこれに対
応するには照明系レンズや輪帯絞りの大きさの異なるも
のにその都度交換する厄介な問題があった。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明では、
レーザビームを対物レンズの辺縁部に沿って移動(回
転)させることにより、視野周辺に至るまで偏光のない
照明が可能であり、あらゆる方向の蛍光情報が得られる
回転式輪帯全反射照明機構を提供し、上記問題点を解決
することを目的とする。本発明に係る回転可能な全反射
照明機構によれば、蛍光輝度の最大方向の情報から試料
や蛍光色素の励起効率の高い方向を知ることができる。
また、アナライザー(検光子)等の偏光素子と組み合わ
せれば蛍光色素ー分子を用いたタンパク質の特定向きを
知ることができダイナミックな動きを個々にとらえるこ
とができる。さらに、反射鏡の傾き微調整機構により、
使用する対物レンズの焦点距離に厳密に対応することが
できるだけでなく、試料を囲む媒質の屈折率変化(異な
る媒質への対応、試料の温度変化)に綿密に対応可能で
ある。
【0010】
【課題を解決するための手段】このため本発明が採用し
た解決手段は、顕微鏡対物レンズの辺縁部にレーザビー
ムを導入し物体を照明するケーラー式照明系において、
前記レーザビームによる照明方向を顕微鏡対物レンズの
軸心を中心に傾斜したまま回転可能としたことを特徴と
する回転式輪帯全反射照明機構である。また、前記照明
系は顕微鏡対物レンズの辺縁部にレーザビームを導入し
全反射させ蛍光を発光させる照明系であることを特徴と
する回転式輪帯全反射照明機構である。また、前記レー
ザビームによる照明方向を回転させるとともに使用する
対物レンズに最適全反射角を与えるために、反射鏡の傾
きを微調整できる機構を備えた反射鏡と、その反射鏡を
回転させるための回転手段を備えていることを特徴とす
る回転式輪帯全反射照明装置である。また、前記回転手
段の回転中心は、反射鏡の回転中心軸から僅かに離れた
位置に配置されていることを特徴とする回転式輪帯全反
射照明装置である。また、前記反射鏡の回転による振動
が顕微鏡に悪影響を及ぼさぬ様、反射鏡を含む回転手段
は回転中心軸に形状重量ともに対象な構造を形成してい
ることを特徴とする回転式輪帯全反射照明装置である。
【0011】
【実施の形態】以下、本発明に係る実施形態としての光
学系について説明すると、図1は本光学系全体の図、図
2は反射鏡の一部断面図、図3は図2中A−A矢視破断
図、図4(イ)(ロ)は反射鏡の傾きを変えた状態の光
学系図である。図1において、51はレーザファイバー
光源、52はコレクターレンズ、53は凸レンズ56の
前側焦点面(コレクターレンズ52の後側焦点面とも一
致)、54はモータ、55は反射鏡、56は凸レンズ、
57はダイクロックミラー、58は対物レンズ前側焦点
面、59は対物レンズ、60は物体面(試料面)であ
る。
【0012】ここで、前記反射鏡55の構成を図2、図
3を参照して詳細に説明すると、図2、図3において、
61は反射鏡体、62は反射鏡体他保持金物、63は本
体金物であり、これらはいずれも円形形状をしている。
反射鏡体61は反射鏡保持金物62に接着などにより固
定されている。反射鏡体保持金物62の外周の対称位置
2カ所(回転軸となる直線上)には図3に示すようにピ
ボット溝62aが設けてあり、本体金物63の外周2カ
所に形成したねじ穴63aに取り付けたピボットねじ6
6、ロックナット67によってピボットねじ66軸上に
おいて回転可能状態で本体金物63に取り付けられてい
る。
【0013】本体金物63には、反射鏡体61の傾き微
調整を行うために微調整ねじ64が前記ピボットねじ軸
を挟んむ対称位置2カ所に設けられており、微調整ねじ
64の押し戻しによってピボットねじ66を軸にして反
射鏡体の傾き微調整を行い、最後は微調整ねじ64をロ
ックナット65により締め付けて固定できる構造となっ
ている。
【0014】また本体金物は、その中心から僅かに離れ
た位置で回転手段としてのモータ54の回転軸54aに
固定されている。これは、光学系において反射鏡55は
物体面60(試料面)と共役な関係にあり、反射鏡表面
のわずかなゴミなどが物体面60(試料面)に結像しな
いようモータ54の回転中心軸はわずかにシフトさせて
設置されている。さらに反射鏡の回転による振動が顕微
鏡に悪影響を及ぼさぬ様に図2、図3に示す如く、前記
反射鏡を含む回転体が回転中心軸に形状重量ともに対象
な構造となるように形成されている。
【0015】上記構成からなる光学系において、 レー
ザファイバー光源51はコレクターレンズ52により平
行な光束となるが、反射鏡55が傾いたまま回転する機
構となっているため輪光束となり、凸レンズ56周辺部
に入射した光は凸レンズ56の後側焦点面58(対物レ
ンズ59の前側焦点面)に集光する。
【0016】ここで、反射鏡55が+αの傾いていると
図4(イ)に示すように、光軸に平行なレーザビームは
2倍のα傾きをもって凸レンズ56の縁端部に入射し光
軸に平行な光となり対物レンズ59の対物レンズ前側焦
点面を輪帯状に照明する。反射鏡55が−αの傾いてい
ると図4(ロ)に示すように光軸に平行なレーザビーム
は(イ)とは反対に凸レンズ56の反対側縁端部に入射
し光軸に平行な光となり対物レンズ59の対物レンズ前
側焦点面を輪帯状に照明する。
【0017】こうして集光した光は対物レンズ59(コ
ンデンサーの役割)によって再び平行な光束となり物体
面60(試料面)を照明する。上記のように反射鏡の傾
き微調整機構と反射鏡の回転機構により、使用する対物
レンズの焦点距離に厳密に対応することができるだけで
なく、試料を囲む媒質の屈折率変化(異なる媒質への対
応、試料の温度変化)に綿密に対応可能となる。また、
反射鏡をモータによって360°回転させることで、試
料面を周囲360°方向から照射することができ、1方
向から照明する従来のエバネッセント照明の全反射照明
の問題点、さらには従来のケーラー顕微鏡の持つ問題点
を確実に解決することができる。また、レーザビームは
干渉性が非常に優れているため、照明光学系の干渉縞が
発生する。蛍光観察の場合は励起光(照明光)がダイク
ロックミラーやフィルターで除かれる筈であるが、優れ
た可干渉性が励起光(照明光)班となり均質な蛍光像を
得ることができないという問題がある。しかし、上記の
構成からなる本光学系では、回転する反射鏡が試料面と
光学的共役面に配置されており、この干渉縞が発生して
も光軸に傾斜した反射鏡の回転により干渉縞は回転移動
し平均化され、結果的には除去されたと同じ効果が得ら
れるようになっている。
【0018】なお、全反射照明を行うため物体面(試料
面)は61°から68°以内の光が送られるよう反射鏡
55の傾き角αを調整すればよい。また、レーザファイ
バー光源51となるファイバーはコアー径の小さいもの
が望ましい。
【0019】以上本発明の実施形態について説明してき
たが、反射鏡の回転機構、あるいは反射鏡の傾きの微調
整機構等は前述したものに限定することなく、同様の機
能を達成できるものであれば他の機構を採用することが
できる。また本発明はその精神または主要な特徴から逸
脱することなく、他のいかなる形でも実施できる。その
ため、前述の実施形態はあらゆる点で単なる例示にすぎ
ず限定的に解釈してはならない。
【0020】
【発明の効果】本発明に係る回転可能な全反射照明機構
によれば、視野周辺部まで均一な照明が可能となり、あ
らゆる方向の均一な蛍光情報が得られる。また、蛍光輝
度の最大方向の情報から試料や蛍光色素の励起効率の高
い方向を知ることができる。また、アナライザー(検光
子)等の偏光素子と組み合わせれば蛍光色素ー分子を用
いたタンパク質の特定向きを知ることができダイナミッ
クな動きを個々にとらえることができる。さらに、反射
鏡の傾き微調整機構により、使用する対物レンズの焦点
距離に厳密に対応することができるだけでなく、試料を
囲む媒質の屈折率変化(異なる媒質への対応、試料の温
度変化)に綿密に対応可能である。レーザビーム特有の
可干渉によって生じた照明系の干渉縞は回転する反射鏡
により短時間内に平均化され、結果的に除去されたと同
じ効果が得られる。等々の優れた効果を奏することがで
きる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本実施形態に係る回転式輪帯全反射照明機構を
備えた光学系の構成図である。
【図2】反射鏡傾き微調整機構の断面図である。
【図3】図2中A−A矢視破断図である。
【図4】反射鏡傾き微調整機構において反射鏡の傾きを
変えた状態の光学系の説明図である。
【図5】エバネッセント場を利用した全反射照明の原理
図である。
【図6】従来の中央遮光輪帯全反射照明の光学系図であ
る。
【図7】ケーラー照明を用いた物体面の焦光状態を示す
図である。
【符号の説明】
51 レーザファイバー光源 52 コレクターレンズ 53 凸レンズ56の前側焦点面 54 モータ 55 反射鏡 56 凸レンズ 57 ダイクロックミラー 58 対物レンズ前側焦点面 59 対物レンズ 60 物体面 61 反射鏡体 62 鏡体保持金物 63 本体金物 64 微調整ねじ 65 ロックナット 66 ピボットねじ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Fターム(参考) 2G043 AA03 BA16 EA01 FA01 FA02 GA02 GA06 GB03 GB19 HA01 HA02 HA05 HA07 HA08 HA15 JA02 KA02 KA09 MA11 2H041 AA12 AB14 AC01 AZ02 AZ03 2H052 AA09 AB03 AC02 AC15 AC17 AC26 AC34 AD31

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】顕微鏡対物レンズの辺縁部にレーザビーム
    を導入し物体を照明するケーラー式照明系において、前
    記レーザビームによる照明方向を顕微鏡対物レンズの軸
    心を中心に傾斜したまま回転可能としたことを特徴とす
    る回転式輪帯全反射照明機構。
  2. 【請求項2】前記照明系は顕微鏡対物レンズの辺縁部に
    レーザビームを導入し全反射させ蛍光を発光させる照明
    系であることを特徴とする請求項1に記載の回転式輪帯
    全反射照明機構。
  3. 【請求項3】前記レーザビームによる照明方向を回転さ
    せるとともに使用する対物レンズに最適全反射角を与え
    るために、反射鏡の傾きを微調整できる機構を備えた反
    射鏡と、その反射鏡を回転させるための回転手段を備え
    ていることを特徴とする請求項1または請求項2に記載
    の回転式輪帯全反射照明装置
  4. 【請求項4】前記回転手段の回転中心は、反射鏡の回転
    中心軸から僅かに離れた位置に配置されていることを特
    徴とする請求項3に記載の回転式輪帯全反射照明装置
  5. 【請求項5】前記反射鏡の回転による振動が顕微鏡に悪
    影響を及ぼさぬ様、反射鏡を含む回転手段は回転中心軸
    に形状重量ともに対象な構造を形成していることを特徴
    とする請求項請求項3または請求項4に記載の回転式輪
    帯全反射照明装置。
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