CN1856710B - 测定促凝血磷脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及测定样本中促凝血磷脂含量的方法，所述方法包括以如下顺序进行的步骤(i)-(iii)：(i)形成所述样本和基质血浆的混合物，所述基质血浆被处理为不含有或基本上不含有促凝血磷脂，从而至少足以降低所述基质血浆的凝结能力，其中用磷脂酶的处理使所述基质血浆不含有或基本上不含有促凝血磷脂；(ii)在促凝血磷脂为所述混合物的限速组分的条件下，将所述混合物与活化血浆凝结的试剂接触；以及(iii)测定所述混合物的凝结时间。
Description
技术领域
本发明涉及血液凝结测定，更特别地，本发明涉及血栓，血小板活化和潜在血栓形成危险因子标记的改进方法。
发明背景
促凝血磷脂，包括诸如磷脂酰丝氨酸的阴离子磷脂，在血液凝结机理中具有重要的作用。在通过VIIIa和IXa因子将X因子转化成Xa因子的内源性凝血途径，以及在通过Xa因子将凝血酶原裂解成凝血酶的常规途径中都需要促凝血磷脂。它们形成了部分组织因子活化复合物。在抗血栓的机理中，其涉及经由凝血酶/血栓调节蛋白复合物引起的蛋白C活化以及经由活化蛋白C引起的Va因子分解。
在健康个体的血液中，促凝血磷脂的水平通常都较低，其可作为源自各种细胞，主要是血小板的微粒，但是当血小板变得活化，例如，在响应损伤以及在活化凝血、补体或免疫机理时其水平会有所增加。在冻融或由胶原/凝血酶或诸如离子载体的膜破裂剂活化后，血小板在体外可表达最大的促凝血活性。在形成血栓、栓塞、脓毒、弥散性血管内凝血和梗塞的过程中，血小板在体内发生异常活化。相反地，在诸如血管性血友病的某些出血障碍中会发生血小板不充分活化，并且具有多种血小板异常。
通常可通过诸如鲁塞尔氏蝰蛇毒实验(Russell′s Viper Venom Test，即下文的″RVVT″)的凝结分析来测定患者血浆样本中的促凝血磷脂，尽管这样的分析更常规地用于诊断狼疮抗凝物。在RVVT中使用的毒液包含可特异性活化因子V和因子X的金属蛋白酶。在加入毒液和钙离子后，所述患者样本中发生了近乎完全依赖于促凝血磷脂的凝结。根据所述实验混合物形成纤维蛋白并凝结从而停止试管中的流动或增加光学混浊度或封闭洞或孔所需要的时间，可以测定所述患者样本中促凝血磷脂的量。在这里和随后的描述中，可使用在与主要的凝固酶，凝血酶作用时发出易测定有色产物的显色底物，作为终点指示剂代替所述凝固时间或形成纤维蛋白凝块所需要的时间。
当患者被怀疑缺乏因子，例如因子X，V，II或纤维蛋白素原缺乏或正在接受抗凝血剂时，通常将所述患者的样本与正常人的无血小板血浆样本混合，其目的是为了补充患者样本中那些缺乏的凝血因子。这种正常人的无血小板血浆通常被称为“基质血浆”。用于这些分析的所述基质血浆理想上是无血小板的，否则凝结将不完全地依赖于所述患者样本中含有的促凝血磷脂。
在RVVT和其它凝结分析中，通常通过高速离心分离和/或过滤制备基质血浆。这种操作的主要缺点在于其难以控制促凝血磷脂从所述基质血浆中的排除。新鲜血浆是关键的但却通常难以获得。一旦血浆被冷冻，其中的血小板就会被活化并释放出促凝血磷脂。因此，由RVVT和其它凝结分析所提供的对所述患者样本中的促凝血磷脂进行测定的灵敏度，以及这些分析的特异性调节能力是有限的。另一个缺点在于这些方法无法除去某些可能具有中性浮力或太小以致于无法滤出的细胞微粒。
现有促凝血磷脂测定方法的另一个缺点在于其对于诸如抗体的凝结抑制剂的敏感性。这些抗体通常产生于诸如″抗磷脂综合症″的自身免疫性疾病中，并且引起大多数使用含磷脂试剂的凝结实验的延长，因此在目前促凝血磷脂的实验中给出假阴性结果。
发明概述
考虑到促凝血磷脂在形成血栓的发病机理中的作用及其作为血小板或细胞活化标记的能力，需要改进的方法来测定样本中促凝血磷脂的存在及其含量。
因此，根据本发明的第一方面，提供了测定样本中促凝血磷脂的含量的方法，所述方法包括以如下顺序进行的步骤(i)-(iii)：(i)形成所述样本和基质血浆的混合物，所述基质血浆被处理为不含有或基本上不含有促凝血磷脂，从而至少足以降低所述基质血浆的凝结能力，其中用磷脂酶处理使所述基质血浆不含有或基本上不含有促凝血磷脂；(ii)在促凝血磷脂为所述混合物的限速组分的条件下，将所述混合物与活化血浆凝结的试剂接触；以及(iii)测定所述混合物的凝结时间。
根据本发明的第二方面，提供了测定样本中活化血小板及细胞衍生微粒含量的方法，所述方法包含以如下顺序进行的步骤(i)-(iii)：(i)形成所述样本和基质血浆的混合物，所述基质血浆被处理为不含有或基本上不含有促凝血磷脂，从而至少足以降低所述基质血浆的凝结能力；(ii)在允许促凝血磷脂凝结所述混合物的条件下，将所述混合物与活化血浆凝结的试剂相接触；和(iii)测定所述混合物的凝结时间。
根据本发明的第三方面，提供了测定患者是否有最近的血栓形成发作的方法，所述方法包括以如下顺序进行的步骤(i)-(iii)：(i)形成所述样本和基质血浆的混合物，所述基质血浆被处理为不含有或基本上不含有促凝血磷脂，从而至少足以降低所述基质血浆的凝结能力；(ii)在允许促凝血磷脂凝结所述混合物的条件下，将所述混合物与活化血浆凝结的试剂接触；及(iii)测定所述混合物的凝结时间。
血栓形成发作可以是例如深部静脉血栓形成、栓塞或梗塞。至于″最近的″意思是指在所述时间期限内，可在血液循环内测定出来自血栓形成发作的促凝血磷脂。如果没有发生更多的血小板活化，则从这样事件进行的估计可高达12小时。
根据本发明的第四方面，提供了生产基质血浆的方法，所述基质血浆可用于测定样本中的促凝血磷脂水平，所述方法包括用磷脂酶处理所述基质血浆，从而使促凝血磷脂降解至至少足以降低所述基质血浆的凝结能力。
根据本发明的第五方面，提供了通过第四方面的所述方法生产的基质血浆。这包括以下概念：将含有未知量促凝血磷脂的实验血浆单独与磷脂酶孵育，并且比较在这样的孵育前后磷脂-敏感性实验的结果。无需加入任何无磷脂的基质血浆，所述实验的明显延长就已证实了促凝血磷脂的存在。
根据本发明的第六方面，提供了测定样本中促凝血磷脂水平的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)基质血浆，所述基质血浆用磷脂酶进行处理从而使磷脂降解至至少足以降低所述基质血浆的凝结能力；(ii)以磷脂依赖的方式活化血浆凝结的试剂，及(iii)含有已知水平的促凝血磷脂的参考制剂。
含有已知水平的促凝血磷脂的参考制剂可作为校准试剂用于构建参考图。
发明的公开
本发明旨在克服上述缺点，并在一个实施方案中提供了测定是否样本中含有高于所述方法灵敏度低限的可测定促凝血磷脂的方法，同时在第二个实施方案中提供了测定其含量的方法。所述方法包括形成所述样本和基质血浆的混合物，所述基质血浆不含有或基本上不含有促凝血磷脂，从而不足以在磷脂依赖性凝结实验中降低所述基质血浆的凝结能力。用磷脂酶处理所述基质血浆可以使其不含有或基本上不含有促凝血磷脂。
所述的磷脂依赖性凝结实验可以是由鲁塞尔氏蝰蛇毒(Russells vipervenom)或源自这种毒液的X因子活化剂引发的实验，或者是由源自东部拟眼镜蛇(Pseudonaja Textilis)毒液的磷脂依赖的凝血酶原活化剂引发的实验，或者是更优选地由人，动物或重组来源的Xa因子引发的实验。
所述血浆可以为人血浆或非人类血浆，优选为非人类血浆，且更优选为动物血浆。
例如，通过用能降解血浆中的磷脂的酶进行处理，所述血浆可以不含有或基本上不含有促凝血磷脂。
例如为了将马血浆的Xa因子活化凝结时间从50秒延长到120秒，需要在37℃用2×10-5％黑颈喷毒眼镜蛇毒液孵育1小时。下文的实施例1中描述了多种血浆预处理的详细方案。在所述促凝血磷脂的浓度会影响凝结时间的情况下，随后将所述混合物与活化血浆凝结的试剂相接触。通过测定所述混合物何时发生凝结来测定所述血浆是否含有促凝血磷脂。
如本说明书所述，本发明人发现在测定样本中促凝血磷脂的凝结实验，优选为基于Xa因子的实验中的灵敏度，可通过使用作为基质血浆的组合物的得到改善，所述组合物中的促凝血磷脂用磷脂酶处理得以降解。更特别地，相对于含有未处理的贫血小板血浆或正常处理的离心血浆的混合物的凝结时间，在含有磷脂酶处理的基质血浆的混合物中观察到了凝结时间的增加(实施例2)。由于实验血浆具有相同的量，因此在全部混合物中提供了相同量的加入的促凝血磷脂，进而发现在含有未处理的和离心基质血浆的混合物中，所述凝结时间的降低是由于在所述基质血浆和所述样本中测定出的促凝血磷脂引起的。凝结时间有所增加的含有所述处理基质血浆的混合物具有改善的灵敏度，因为所述混合物中只有促凝血磷脂起作用，所以在所述分析中测定出的促凝血磷脂来源自所述样本。
所述结果是令人惊讶的，因为当许多酶加入到血浆时其通常不能够发挥活性。这是因为血浆是异种分子的复杂混合物，其能抑制酶的活性。例如，血浆含有与磷脂强烈结合的蛋白，例如脱辅基脂蛋白(apolipoproteina)、膜连蛋白(annexins)和β-2-糖蛋白1，这些蛋白可干扰底物对磷脂酶的利用率。此外，磷脂酶通常需要钙来发挥其酶活性，而这样的活性却被为凝血实验收集的血浆中正常使用的柠檬酸盐抗凝血剂大大地降低。而且，血浆还含有能够抑制特定酶活性的抑制剂分子。例如，结合并抑制胰蛋白酶的抗胰蛋白酶、抑制凝血酶的抗凝血酶以及抑制纤溶酶活性的抗纤溶酶。在人血浆中大多数磷脂酶的主要抑制剂可能是膜连蛋白V。
一般地，所述基质血浆是用磷脂酶处理过的血浆。这种磷脂酶的例子是碱性的磷脂酶A2。所述的磷脂酶可以是合成生产的，例如通过重组DNA技术合成，或者可以来自有机体。例如，所述磷脂酶可来自蛇毒。作为本发明的示例，对所述的基质血浆的处理而言，来自莫桑比克喷毒眼镜蛇(Naja mossambica)和黑颈喷毒眼镜蛇(N nigricollis)毒液的磷脂酶尤其有效。其它类型有效的毒液可来自蝮蛇(Agkistrodon halys)，蝰蛇类(Vipera)，尤其是极北蝰(berus)和圆斑蝰(Russelli)，南美响尾蛇(Crotalusdurissus)，Enhydrina schistosa，太攀蛇(Oxyuranus scutellatus)和意大利蜂(Apis mellifera)。使毒液磷脂酶在血浆中有效的主要特性可能在于其可通过高等电点pH表现的碱性特征。大多数源自毒液的有效磷脂酶都具有结构同源性。
其它能提供处理所述基质血浆的磷脂酶的有机体包括(Streptomycesviolaceoruber)，弧菌(Vibrio)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
由此可知诸如磷脂酰丝氨酸的阴离子磷脂在血栓形成中是重要的，一般地，在所述基质血浆中降解促凝血磷脂的酶应该是能在血浆中降解磷脂酰丝氨酸的酶。如上所述，使用由此处理的基质血浆改进了促凝血磷脂测定，例如RVVT或基于Xa因子的实验的凝结分析中磷脂酰丝氨酸测定的特异性。
应当理解的是不需要将用于本发明所述方法中的基质血浆处理成降解了其中的全部磷脂。但是所述基质血浆通常是经过处理的，因此当其被诸如鲁塞尔氏蝰蛇毒(Russell′s Viper Venom)的促凝血磷脂依赖的凝结活化剂活化时，通过所述酶对所述基质血浆中促凝血磷脂的降解，使其不足以降低所述基质血浆的凝结能力。通常，当所述的酶已基本上降解了所述基质血浆中所有的促凝血磷脂，主要是磷脂的磷脂酰丝氨酸组分时，所述基质血浆被所述试剂活化时的凝结能力就会降低。大约在37℃，用1×10-5％全黑颈喷毒眼镜蛇毒(基本上含有较少的纯化酶)处理所述基质血浆大约1小时通常就足以使所述酶基本上降解贫血小板基质血浆中的几乎所有促凝血磷脂。消耗个体血浆的实际条件主要依赖于所述个体血浆中游离的促凝血磷脂的初始含量，其反过来依赖于血小板或其它细胞碎片的污染程度(例如，参见实施例1)。因此与那些磷脂含量已经较低的血浆相比，血小板含量较高的血浆需要较长的孵育时间或较高浓度的磷脂酶。优选从磷脂含量本来就较低的血浆开始。在大多数贫血小板血浆中，这样的磷脂酶处理只能降解所述总含量为0.1％的磷脂中的0.001％的磷脂。通常，游离的磷脂酰丝氨酸∶总磷脂的比例大约为1∶100,000。诸如Xa因子活化凝血时间(即下文的″XACT″)的磷脂敏感性实验通常能测定出患者血浆中100-1000ng/mL的磷脂。应该理解对较短的孵育时间应使用较高浓度的磷脂酶而较长的孵育时间则需要较低浓度的磷脂酶。因此，在正常的猪血浆中，400ng/mL的黑颈喷毒眼镜蛇毒(NNV)要在37℃孵育40分钟才能使X因子活化凝血时间从48秒延长到100秒，而200ng/mL的NNV则需要90分钟才能达到100秒的最佳的XACT结果(更多细节见于实施例1)。应当理解为当用所述酶处理降解了所述基质血浆中所有的促凝血磷脂时，本发明所述的方法对促凝血磷脂将是最敏感的。
因为用于本发明的毒液的活性本质上是渐进的，因此所需要的是一旦所述磷脂水平已充分地消耗则停止毒液与血浆的相互作用。这可以通过稀释抗血清以及稀释直接针对所用毒液的抗体来完成。当以0.01-1％浓度进行使用时，可商业利用的针对诸如眼镜蛇的特殊类型毒液的抗蛇毒素是有效的。
所述基质血浆可以是任何组合物，其校正了所述患者样本中缺乏的因子。例如，当所述患者样本中缺乏因子V时，所述基质血浆将含有过量的因子V从而能够影响所述患者血浆样本的凝结。基质血浆的另一例子是包含功能水平的足够弥补所述混合样本中任何缺损的所有因子的血浆，所述因子选自：因子XII、前激肽释放酶、高分子量激肽原、因子XI、因子VIII、因子IX、因子X、因子V、凝血酶原和纤维蛋白原。这样的基质血浆可用于高岭土或表面活化的凝结时间实验。当以组织因子作为活化剂进行实验时，为了相同的目的所述基质血浆必须包含因子VII，X，V，II和I(纤维蛋白原)。
当采用的是诸如鲁塞尔氏蝰蛇毒实验(Russell′s Viper Venom Test)的实验时，只需要凝结因子X以及在凝血级联反应中出现的编号低的因子，即因子X、因子V、因子II和人纤维蛋白原。编号高于因子X的因子对于正常结果而言并不需要。如果使用基于Xa因子的实验，对正常结果而言，在所述***中因子X甚至是不必要的，只需要因子V、II和I(纤维蛋白原)。源自眼镜蛇科毒液的磷脂依赖凝血酶原活化剂不需要高于因子II(凝血酶原)的因子来诱导凝结。因此，如果使用基于太攀毒的实验时，要达到正常结果只需要提供凝血酶原和纤维蛋白原。只有在提供凝结终点标记时，纤维蛋白原或因子I才是必需的。还可应用发色的三肽底物测定凝血酶产生的最大率，所述三肽底物可被凝血酶转化成可被分光光度测定的有色终产物。
所述基质血浆通常得自柠檬酸盐血。合适的血浆是那些公知的在促进人血浆样本的凝结方面有效的血浆，因为其提供了不定地存在于所述试样中的因子。这样的血浆的例子包括大多数的哺乳动物血浆。那些用于本发明所述方法的示例性血浆包括得自猪、马、牛、绵羊、山羊、骆驼、猴、狗、猫、狐狸、象、美洲驼羊、兔、水貂、浣熊、袋鼠、人及其组合的血浆。
用于提供所述基质血浆的血浆可以得自正在对促凝血磷脂的存在和/或含量进行测试的个体。在此情况中，可用已知量的磷脂酶(例如100ng/mL的黑颈喷毒眼镜蛇毒液)孵育血浆样本前后的因子Xa活化凝结时间测定所述血浆样本。第一结果和第二结果之间的差异与有多少被磷脂酶处理破坏的促凝血磷脂成比例。
但是，因为某些人体内产生的抗体对与促凝血磷脂，例如β2糖蛋白1和凝血酶原结合的人蛋白具有血清活性，(例如狼疮抑制剂抗体)，因此在本发明所述方法中作为基质血浆使用的人血浆具有对这类抑制剂的某些不必要的敏感性。因此应该对这样的样本进行分析确定这些抗体的存在。当动物血浆用于提供所述基质血浆时，本发明的优点在于与基于人血浆的方法相比，所述方法对直接针对人凝结因子或狼疮辅助因子的抗体具有更低的敏感性。在患者中这样的抗体可能会意外出现，这导致了现有凝结实验方法的杂乱性和不可靠性。
应当理解，为改变检测样本的凝结性时，尤其当待测个体被给药抗凝血剂时，所述基质血浆还可以必要地包括至少一个用于控制抗凝血剂的抑制凝结能力的试剂。因为肝素是广泛使用的抗凝血剂，所以那些最可能使用的试剂是能够控制肝素的抑制凝结能力的试剂。这些试剂包括鱼精蛋白硫酸盐和1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物或鱼精蛋白硫酸盐。然而，其它试剂包括针对水蛭素及其类似物的抗体或其它抗凝剂拮抗剂。
通常以液体或重组形式使用所述基质血浆。但是，为了用于“现场即时”装置，其可作为部分干组合物存在，所述干组合物通过所使用的血样或血浆本身被重组。
在所述实验中用于活化所述混合物凝结的试剂必须活化凝结，使所述凝结随后以促凝血磷脂依赖的方式继续进行。这样的试剂的例子是那些能够将因子X转化为因子Xa的试剂，或是能够将凝血酶原转化为凝血酶的试剂。因此，用于本发明所述方法的试剂可以为鲁塞尔氏蝰蛇毒、或来自蝰蛇家族相关毒液的因子X活化剂、或因子Xa、或其它源自诸如澳大利亚东部拟眼镜蛇或太攀蛇家族蛇毒的磷脂依赖的凝血酶原活化剂。源自除人之外的哺乳动物的试剂尤其有用，例如源自牛的因子Xa(见实施例4)。可使用可提高凝结机理的试剂，例如接触活化剂、组织因子、因子IXa、因子XIa和因子VIIa，但是这些试剂使所述***对磷脂的特异性降低并且更容易受到患者血浆可变性的干扰。
凝结活化剂也可以是源自基于新DNA序列重组前体的酶。可以通过缺失所述抗体识别的共同表位，使这样的前凝血剂对抑制性抗体不敏感。这些试剂通常以液体形式使用但是也可以以干燥的形式提供于“现场即时”装置中进行应用，在这种情况中，其通过所用的血浆样本或血液样本被重组。
虽然可以预见本发明所述的方法将最广泛地应用于来源自人类患者的血浆或血样，但是还应该理解所述方法也可用于测定多种动物中的促凝血磷脂。本实施方案将用于动物实验性研究，从而在体内或体外评价材料表面与动物血液的生物适合性及实验性药物的作用。所述适于促凝血磷脂检测的样本可以是血液、血浆、血清或任何其它液体。如果所述试剂被诸如柠檬酸盐或EDTA的钙结合剂抗凝结，则其水平应该与那些在其它凝结实验中使用的试剂的水平相类似。
在本发明上述的第一方面中，提供了测定样本中促凝血磷脂量的方法。
所述测量时通过与含有已知量促凝血磷脂的参考血浆的比较完成的，并且可从适当构建的校准曲线中内插未知值。
因为促凝血磷脂通常位于活化的血小板及血小板微粒上，因此可知根据本发明第一方面测定富含血小板血浆中的促凝血磷脂的含量可使本领域技术人员能够定量所述样本中活化血小板和血小板微粒的含量。
因此，根据本发明第一方面的方法，在上述的第二方面中，本发明提供了测定样本中活化血小板和细胞衍生微粒含量的方法。
如上所述，异常的血小板或细胞活化作用可由血栓形成发作、栓塞、组织损伤、免疫过程(包括补体活化)、脓毒、弥散性血管内凝血或梗塞产生。在极端情况中，或由于免疫过程时，其可导致血小板减少。较有利的是其能测定个体是否有临床疾病状态，所述临床疾病状态涉及血小板活化，例如血栓症、中风或心肌梗塞。发明者认为通过测定促凝血磷脂的含量来测定活化血小板或血小板微粒含量的方法将能够诊断那些患有上述疾病状态的个体。
因此根据本发明第二方面的方法，在上述第三方面中，本发明提供了评定患者最近是否有诸如深部静脉血栓形成、栓塞、梗塞的血栓形成发作的方法。
在上述第四方面中，本发明提供了生产用于测定个体是否含有促凝血磷脂的基质血浆的方法。所述方法包括用酶处理所述基质血浆，从而使促凝血磷脂降解至足以降低所述基质血浆的凝结能力。
使用本发明第四方面方法中的酶，本领域技术人员能够提供含有定量促凝血磷脂的基质血浆的板。通过对所述平板，即含有所预期量的促凝血磷脂的基质血浆的选择使用，使得本领域技术人员能够控制本发明第一方面和第二方面方法的灵敏度。所述选择为特殊的仪器提供合理的或最佳的基线凝结时间。因为蛇毒能以非常低的浓度使用，并且可随后通过例如有效针对磷脂酶的抗血清和抗体的使用来控制其活性，所以蛇毒对在本发明第四方面方法中提供的所使用的酶尤其有用。但是，应当理解的是能够控制磷脂酶的试剂可源自重组DNA技术或源自其它有机体或可使用抑制化合物。因此，本发明第四方面方法的另一步骤包括将所述基质血浆与至少一种试剂相接触，从而控制所述酶降解促凝血磷脂的能力。
在另一实施方案中，第四方面的方法也包括将所述基质血浆与至少一种诸如1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物或鱼精蛋白硫酸盐的试剂混合，所述试剂用于控制诸如肝素的抗凝血治疗剂的抑制凝结能力。
在上述的第五方面，本发明提供了通过第四方面的方法生产基质血浆。
在上述第六方面中，本发明提供了用于测定个体是否含有促凝血磷脂的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)基质血浆，所述基质血浆用磷脂酶进行处理使磷脂降解至至少足以降低所述基质血浆的凝结能力；(ii)以磷脂依赖的方式活化血浆凝结的试剂，及(iii)含有已知水平的促凝血磷脂的参考制剂，其中所述含有已知水平的促凝血磷脂的参考制剂可作为校准试剂用于构建参考图。
附图的简要描述
本发明还结合附图进行进一步说明：
图1所示为如实施例1所述的，对源自多种有或没有黑颈喷毒眼镜蛇毒液的正常血浆进行孵育的效果示意图；
图2所示为黑颈喷毒眼镜蛇毒液对血小板灵敏度的预处理效果；及
图3所示为各种血小板磷脂测定的灵敏度。
用于完成本发明的最佳方式和其它方式
以下将参考实施例对本发明进行描述，所述实施例不应该解释为对本发明的范围进行限制。
实施例1
黑颈喷毒眼镜蛇毒液对天然动物血浆的渐进作用
目的：为了证明典型的毒液磷脂酶在降低多种含血小板血浆中促凝血磷脂含量的渐进作用和选择性作用，从而改善那些基质血浆在促凝血磷脂凝结实验中的灵敏度。
方法：通过对志愿者干净的静脉穿刺，通过对刚处死的马(马)心脏穿刺，通过对屠宰场的猪动脉放血以及同样地对公牛(牛)动脉放血，收集体积为3.2％枸橼酸钠抗凝血剂十分之一的终体积血样。将所述样本以3000rpm离心20分钟，并将具有高易变性血小板计数(人的样本大约为5×109/L，但是没有对所述动物血浆进行测定)的上清液贫血小板血浆冷冻于-30℃。
随后在37℃对解冻的贫血小板血浆不做处理或将其与如图1所示浓度的黑颈喷毒眼镜蛇毒液(NNV)混合后孵育。在1或2小时间隔时移出样本，并采用在所述XACT实验中使用的因子Xa/钙试剂进行测试。
结果：如图1所示，未加入NNV的所有血浆的XACT结果是合理稳定的。但是有NNV存在的XACT结果延长了所述孵育期。
可能因为有过量的游离促凝血磷脂，牛和猪的血浆产生了最短的初始结果，但是在用4×10-5％和8×10-5％NNV孵育2小时后，两者的结果增加了一倍。在用2×10-5％NNV孵育1小时后，所述马血浆的XACT从50秒延长到120秒。
评论：这些由于NNV孵育而导致的XACT结果的升高，并未伴随着在活化部分凝血激酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)或其它凝结实验方面的显著变化。这证实NNV的主要作用并不是由于这些凝结实验中所涉及的凝血因子的降解，而是因为这些实验对磷脂的损失不敏感。
实施例2
黑颈喷毒眼镜蛇毒液对人血浆的预处理
目的：为了显示与离心法的比较，在基于因子Xa凝结实验中用痕量的黑颈喷毒眼镜蛇毒液对正常的人的血浆进行处理，其产生的产物(基质血浆)对血小板具有更好的灵敏度。
方法：在“无”血小板的正常的人血浆中制备实验血浆，其含有不同水平的冷冻-解冻的正常富含血小板的血浆(PRR最初含量为250×109血小板/L)。通过高速离心以及通过0.22微米注射器式滤器的过滤获得了无血小板血浆(PFP)。
在进行基于Xa因子凝结实验之前，将这些实验血浆与等体积的3种不同基质血浆混合。所述三种不同基质血浆为：
1.正常的″贫″血小板人血浆(PPP)。
2.以15,000rpm离心10分钟后的所述相同PPP。
3.在37℃下用1×10-5％黑颈喷毒眼镜蛇毒液处理(即下文所述的″NNV处理″)20分钟后的所述相同PPP。
在0.015M氯化钙，0.1M氯化钠、0.02M HEPES的pH 7.0缓冲液中所述因子Xa试剂包含0.001U/mL牛因子Xa，并可以在37℃，在ST4(Diagnostica Stago，巴黎，法国)凝结器中，将0.05ml血浆混合物与0.1ml所述试剂混合。
结果：表1显示了由两种不同方法制备的1∶1的含有多种血小板计数的检测血浆与基质混合的正常血浆(PNP)的混合物的因子Xa凝结时间结果，所述凝结时间以秒计算。
表1
实验血浆 基质血浆
| 血小板计数(109/L) | 初始的PNP | 离心的PNP | NNV处理后的PNP |
| 25 | 48.2 | 45.9 | 50.8 |
| 5 | 58.9 | 66.2 | 73.9 |
| 1 | 64.1 | 85.7 | 96.4 |
| ＜0.2(PFP) | 67.7 | 95.4 | 117 |
评论：这些实验说明与那些经高速离心获得的血浆相比，用NNV处理的血浆在凝结时间结果方面达到了更大的提高。这导致了对血小板的灵敏度的改善。
实施例3
黑颈喷毒眼镜蛇毒液的预处理对血小板灵敏度的作用
目的：为了证实黑颈喷毒眼镜蛇毒液在提高基于牛血浆的鲁塞尔氏蝰蛇毒凝结实验***的灵敏度方面的作用。
方法：在正常的牛血浆和在20℃中用5×1-5％黑颈喷毒眼镜蛇毒液预处理50分钟预处理的牛血浆中，制备了一系列冷冻-解冻的、然而却是正常的人的富含血小板的血浆(具有250×109/L的初始血小板计数)的稀释物。这些血浆样本与等体积的各种鲁塞尔氏蝰蛇毒及含钙试剂混合，并且在37℃下ACL300凝结-计时仪器中(Instrumentation Laboratory，SpA，米兰，意大利)将这些血浆样本以凝血酶时间方式(应用等体积的血浆和试剂的TT方式)计时凝结终点。在含有0.025M氯化钙的所述试剂中鲁塞尔氏蝰蛇毒的浓度在10-5％-10-6％内变化，在加入2×104％黑颈喷毒眼镜蛇毒液后也对前一种试剂进行测试。
结果：图2中概述了所得结果。显而易见，使用1×10-5％RVV的实验***对血小板的灵敏度非常低，其血小板水平的平台值低于1×109/L。通过将RVV浓度减少十倍至1×10-5％延长了RVV凝结时间，但是由所述响应曲线的倾斜度所示的对血小板的灵敏度却没有改善。包括20×10-5％NNV的所述RVV试剂(RVV＝10-5％)略微提高了灵敏度。
在所述牛血浆用于稀释所述血小板浓度之前，用5×10-5％NNV预孵育所述牛血浆时可观察到对血小板最高的灵敏度。在此情况中，在0.1-1.0之间的血小板计数仍可以被精确地定量。
实施例4
各种凝结活化剂的比较
目的：在分析促凝血磷脂的实验***中比较4种不同的磷脂依赖的凝结活化剂的灵敏度。
方法：如下所示在无小板的正常人血浆中制备富含血小板血浆的稀释物。用4种不同的凝结实验***测试这些样本。所有实验都在37℃在ST4(Stago)凝结器中完成。所述试剂和方法如下：
1.高岭土凝结实验(KCT)是用0.05mL的1％高岭土水悬液预孵育0.05mL血浆样本3分钟，然后用0.05mL的0.025M氯化钙再钙化完成的。在ST4(Stago)凝结器中测定从加入氯化钙到凝结发生的时间。
2.鲁塞尔氏蝰蛇毒实验(RVV)是将0.05mL样本与0.05mL含有2×10-6％RVV的0.025M氯化钙试剂混合，然后计时至凝结终点完成的。
3.基于因子Xa的凝结实验(FXa-CT)是将0.05mL样本与0.05mL含有0.001U/mL牛因子Xa的0.025M氯化钙的试剂混合，然后计时至凝结终点完成的。
4.Textarin(TM-Pentapharm，巴塞尔，瑞士)凝结实验(TX-CT)是将0.05mL样本与0.05mL含有2U/mL去脂的商用Textarin试剂的0.025M氯化钙的试剂混合，然后计时至凝结终点完成的。
结果：所得结果如图3所示。所述RVVT实验和KCT实验说明了对血小板的相似灵敏度。所述基于活化因子X的凝结实验(XACT)说明了对血小板的最高灵敏度。对血小板具有最低灵敏度的实验是基于去脂Textarin的实验。但这可能是因为从具有其它目的，即测定狼疮抑制剂的所述商用试剂中不充分地去除磷脂造成的。
评论：所述Textarin试剂是典型的磷脂依赖的凝血酶原活化剂，其得自东部拟眼镜蛇毒液，东部拟眼镜蛇是几种已知含有这种前凝血剂的澳大利亚毒蛇之一。
实施例5
所述方法的典型用途和特异性研究
目的：为了说明所述方法对所有公知的凝结因子中的缺失是不敏感的。也为了测定在各种可商业利用的血浆缺乏的、个别凝结因子中的游离促凝血磷脂。
方法：使用促凝血磷脂的新实验法在特殊因子分析中对市场化的各种冷冻干燥的个别凝结因子缺乏的血浆进行了测试。由此用1mL水对来自多个供应商(Dade/Behring，IL/Beckman-Coulter和Diagnostica Stago)的每个小瓶进行重组。在Stago ST4凝结器中所述实验使用了25μl NNV处理的基质血浆(lot 3004)和25μl每种因子缺乏的血浆以及50μl因子Xa试剂。
表2
| 实验血浆 | FXa-凝结时间(秒) |
| 冷冻的“贫血小板”血浆 | 53.7 |
| “无”血小板的正常血浆 | 102 |
| 凝血酶原(FII)缺乏 | 88.8 |
| 因子V缺乏血浆 | 100 |
| 因子VII缺乏 | 96.5 |
| 因子VIII缺乏 | 70.0 |
| 因子IX缺乏 | 71.6 |
| 因子X缺乏 | 73.7 |
| 因子XI缺乏 | 88.3 |
| 因子XII缺乏 | 96.7 |
评论：与无血小板的正常血浆相比，所述混合的冷冻的贫血小板血浆给出了相对较短的FXa凝结时间，这是因为其含有约5％的正常血小板计数(大约10×109血小板/L)。
这些结果说明在检测样本中任何个别血浆凝结因子的全部缺乏并不会延长所述FXa实验。还说明本发明所用的因子VIII、IX及X缺乏的血浆含有本实验可检测到的促凝血磷脂可检测量。
工业应用性
应该理解本发明所述的方法在临床实验室科学中将有广泛的应用。
以上仅描述本发明的一些实施方案，本领域所属技术人员可在不脱离本发明的范围内对其进行显而易见的修改。
Claims (20)
1.测定人类样本中促凝血磷脂含量的方法，所述方法包括以如下顺序进行的步骤(i)-(iii)：
(i)形成所述人类样本和非人类基质血浆的混合物，所述基质血浆被处理为不含有促凝血磷脂，从而至少足以降低所述基质血浆的凝结能力，其中用磷脂酶的处理使所述基质血浆不含有促凝血磷脂；
(ii)在促凝血磷脂为所述混合物限速组分的条件下，将所述混合物与因子Xa接触；以及
(iii)测定所述混合物的凝结时间。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述样本选自血液、血浆和血清。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述的血液为抗凝血。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述测定是在与含有已知量的促凝血磷脂的参考血浆或溶液的比较下完成的，并且可以根据适当构建的校准曲线内插未知值。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述基质血浆得自柠檬酸盐血。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述基质血浆得自脊椎动物，所述脊椎动物选自猪、马、牛、绵羊、山羊、骆驼、猴、狗、猫、狐狸、象、美洲驼羊、兔、水貂、浣熊、袋鼠及其组合。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述基质血浆得自猪。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述磷脂酶得自莫桑比克喷毒眼镜蛇，黑颈喷毒眼镜蛇，蝮蛇，极北蝰，圆斑蝰，南美响尾蛇，钩鼻海蛇(Enhydrina schistosa)，太攀蛇和意大利蜜蜂的毒液。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述磷脂酶得自紫红链霉菌、弧菌、产气荚膜梭菌或蜡样芽胞杆菌。
10.测定人类样本中活化的血小板及细胞衍生微粒含量的方法，所述方法包括以如下顺序进行的步骤(i)-(iii)：
(i)形成所述人类样本和非人类基质血浆的混合物，所述基质血浆被处理为不合有促凝血磷脂，从而至少足以降低所述基质血浆的凝结能力；
(ii)在允许促凝血磷脂凝结所述混合物的条件下，将所述混合物与因子Xa接触；以及
(iii)测定所述混合物的凝结时间。
11.如权利要求10所述的方法，其中用磷脂酶处理所述基质血浆使其不合有促凝血磷脂。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述磷脂酶得自莫桑比克喷毒眼镜蛇，黑颈喷毒眼镜蛇，蝮蛇，极北蝰，圆斑蝰，南美响尾蛇，钩鼻海蛇(Enhydrina schistosa)，太攀蛇和意大利蜜蜂的毒液。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述磷脂酶得自紫红链霉菌、弧菌、产气荚膜梭菌或蜡样芽胞杆菌。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述基质血浆是从因子V和凝血酶原形成的。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述因子V和凝血酶原不含有磷脂。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述因子V及凝血酶原源自动物或人。
17.如权利要求10所述的方法，其还包括将所述基质血浆与至少一种试剂接触的步骤，所述试剂能够控制治疗性抗凝剂抑制凝结的能力，并且所述试剂是1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物或鱼精蛋白硫酸盐。
18.如权利要求17所述的方法，其中控制所述治疗性抗凝剂抑制凝结的能力的试剂是1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物。
19.如权利要求10-18中任一权利要求所述的方法，其中所述基质血浆得自猪、马、牛、绵羊、山羊、骆驼、猴、狗、猫、狐狸、象、美洲驼羊、兔、水貂、浣熊、袋鼠及其组合。
20.测定人类样本中促凝血磷脂水平的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)非人类基质血浆，所述基质血浆用磷脂酶进行处理从而使磷脂降解至至少足以降低所述基质血浆的凝结能力；
(ii)因子Xa；及
(iii)含有已知水平的促凝血磷脂的参考制剂。
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