ES2333872T3 - Metodo para detectar fosfolipido procoagulante. - Google Patents
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Abstract
Un método para determinar la cantidad de fosfolípido procoagulante en una muestra humana, comprendiendo dicho método las etapas (i) a (iii) realizadas en el siguiente orden: (i) formar una mezcla de la muestra humana y un plasma de sustrato no humano que se ha liberado o liberado sustancialmente de suficiente fosfolípido procoagulante para al menos reducir la capacidad del plasma de sustrato para coagular, en la que dicho plasma de sustrato se ha liberado o liberado sustancialmente de fosfolípido procoagulante por tratamiento con una fosfolipasa; (ii) poner en contacto la mezcla con factor Xa en condiciones en las que el fosfolípido procoagulante es el componente limitante de velocidad de la mezcla; y (iii) determinar el tiempo de coagulación de la mezcla.
Description
Método para detectar fosfolípido
procoagulante.
Esta invención se refiere a ensayos de
coagulación sanguínea y, más particularmente, se refiere a un método
mejorado para un marcador de trombosis y activación de plaquetas y
un factor de riesgo trombótico potencial.
Los fosfolípidos procoagulantes, incluyendo, por
ejemplo, fosfolípidos aniónicos tales como fosfatidil serina,
tienen un papel importante en el mecanismo de coagulación sanguínea.
Los fosfolípidos procoagulantes son necesarios en la ruta de
coagulación intrínseca para la conversión del factor X en Xa por los
factores VIIIa y IXa, y también en la ruta común para escisión de
protrombina en trombina por factor Xa. Forman parte del complejo
activador de factor tisular. En mecanismos antitrombóticos están
implicados en la activación de proteína C por el complejo de
trombina/trombomodulina y en la destrucción del factor Va por
proteína C activada.
Típicamente están presentes bajos niveles de
fosfolípidos procoagulantes en la sangre de individuos sanos,
probablemente como micropartículas derivadas de una diversidad de
células, principalmente plaquetas, pero estos niveles aumentan
cuando las plaquetas se activan, por ejemplo, en respuesta a una
lesión y a la activación de la coagulación sanguínea, del
complemento o de mecanismos inmunológicos. Las plaquetas in
vitro expresan una actividad procoagulante máxima después de la
congelación y descongelación o de la activación por
colágeno/trombina o agentes de alteración de la membrana tales como
ionóforos. La activación anormal de plaquetas in vivo se
produce durante episodios trombóticos, embolia, septicemia,
coagulación intravascular diseminada e infarto. Por el contrario,
se produce una activación inadecuada de plaquetas en ciertos
trastornos sanguíneos tales como enfermedad de von Willebrand y con
diversas anomalías de plaquetas.
Pueden detectarse tradicionalmente fosfolípidos
procoagulantes en una muestra de plasma sanguíneo de paciente
mediante un ensayo de coagulación, por ejemplo, el ensayo de veneno
de víbora de Russell (en lo sucesivo "RVVT"), aunque dichos
ensayos se usan más convenientemente para diagnosticar el lupus
anticoagulante. El veneno usado en el RVVT contiene metaloproteasas
que activan específicamente los factores V y X. Después de la
adición de veneno e iones de calcio, la coagulación se desarrolla
con una dependencia casi absoluta de fosfolípido procoagulante en
la muestra del paciente. La cantidad de fosfolípido procoagulante en
la muestra del paciente se determina de acuerdo con el tiempo
necesario para la mezcla de ensayo para formar fibrina y coagularse
y, por lo tanto, cesar de fluir en un tubo o aumentar la turbidez
óptica o bloquear un orificio o apertura. El tiempo de coagulación
o tiempo necesario para que se forme un coágulo de fibrina puede
sustituirse como un indicador de punto final en esta y en
descripciones posteriores mediante un sustrato cromogénico que da
un producto coloreado fácilmente detectable cuando actúa sobre él la
enzima de coagulación principal, trombina.
Cuando se sospecha que un paciente tiene una
deficiencia de un factor tal como Factor X, V, II o fibrinógeno
insuficiente, o está recibiendo anticoagulantes, la muestra del
paciente se mezcla típicamente con una muestra de plasma humano
normal sin plaquetas con el fin de suministrar los factores en los
que es deficiente la muestra. Este plasma humano normal sin
plaquetas se conoce típicamente como "plasma de sustrato". El
plasma de sustrato usado en estos ensayos es idealmente sin
plaquetas ya que de otro modo la coagulación no dependería
absolutamente del fosfolípido procoagulante contenido en la muestra
del paciente.
En el RVVT y otros ensayos de coagulación, el
plasma de sustrato se prepara habitualmente por centrifugación a
alta velocidad y/o filtración. Una desventaja principal de este
procedimiento es que es difícil controlar la reducción de
fosfolípido procoagulante del plasma de sustrato. El plasma fresco
es esencial y con frecuencia esto es poco práctico de obtener. Una
vez que el plasma se ha congelado, las plaquetas contenidas en el
mismo se activan y liberan el fosfolípido procoagulante. Por
consiguiente, se limita la sensibilidad proporcionada por el RVVT y
otros ensayos de coagulación para la detección de fosfolípido
procoagulante en la muestra del paciente y la capacidad para
regular la especificidad de estos ensayos. Una desventaja adicional
es que estos procesos no eliminan algunas micropartículas de
plaquetas que pueden tener una flotabilidad neutra o pueden ser
demasiado pequeñas para eliminarse por filtración.
Otra desventaja de los métodos actuales para la
determinación de fosfolípido procoagulante es su sensibilidad a
inhibidores de la coagulación, tales como anticuerpos. Estos
anticuerpos aparecen frecuentemente en enfermedades autoinmunes,
por ejemplo, "síndrome antifosfolipídico" y causan la
prolongación de la mayoría de ensayos de coagulación que emplean
reactivos que contienen fosfolípidos y, por lo tanto, dan resultados
falsos negativos en los ensayos actuales para fosfolípidos
procoagulantes.
Boffa M. C., 1980 (Thrombosis research 17,
páginas 567-572, 1980) describe un método para
evaluar la actividad procoagulante relacionada con fosfolípidos en
una muestra de plasma de un paciente. Dicho método consiste
simplemente en añadir sucesivamente a plasma centrifugado a alta
velocidad (es decir, a un plasma con fosfolípido reducido preparado
por centrifugación), una muestra de plasma de paciente a analizar y
fosfolipasa de berus. Después de la adición de cloruro cálcico, se
registra el tiempo de coagulación y se compara con el de los
controles.
Boffa M. C., 1974 (Thrombosis research 4, Número
de Suplemento 1, páginas 89-90, 1974) describe un
método para determinar la actividad procoagulante de fosfolípidos
en una muestra de sangre o plasma de un paciente, usando una
fosfolipasa A2 como inhibidor de fosfolípidos específicos de veneno.
Dicho método consiste en las siguientes etapas: (i) un plasma
"normal" se trata con una fosfolipasa A2 aislada del veneno de
Vipera berus; (ii) la muestra de plasma o sangre a analizar
se añade al plasma tratado; (iii) el tiempo de recalcificación de
la mezcla se registra y se compara con el de los controles.
En vista del papel de fosfolípidos
procoagulantes en la patogénesis de episodios trombóticos y su
potencial como marcadores de la activación de plaquetas, existe la
necesidad de un método mejorado para detectar la presencia de y la
cantidad de fosfolípido procoagulante en una muestra.
Por lo tanto, la presente solicitud describe un
método para determinar la cantidad de fosfolípido procoagulante en
una muestra, comprendiendo el método las etapas (i) a (iii)
realizadas en el siguiente orden: (i) formar una mezcla de la
muestra y un plasma de sustrato que se ha hecho liberado o liberado
sustancialmente de suficiente fosfolípido procoagulante para al
menos reducir la capacidad del plasma de sustrato para coagular,
donde dicho plasma de sustrato se ha liberado o liberado
sustancialmente de fosfolípido procoagulante por tratamiento con
una fosfolipasa; (ii) poner en contacto la mezcla con un reactivo
para activar la coagulación del plasma en condiciones en las que el
fosfolípido procoagulante es el componente limitante de velocidad de
la mezcla, y (iii) determinar el tiempo de coagulación de la
mezcla.
De acuerdo con un primer aspecto de esta
invención se proporciona un método para determinar la cantidad de
fosfolípido procoagulante en una muestra humana, comprendiendo el
método las etapas (i) a (iii) realizadas en el siguiente orden: (i)
formar una mezcla de la muestra humana y un plasma de sustrato no
humano que se ha liberado o liberado sustancialmente de suficiente
fosfolípido procoagulante para al menos reducir la capacidad del
plasma de sustrato para coagular, donde dicho plasma de sustrato se
ha liberado o liberado sustancialmente de fosfolípido procoagulante
por tratamiento con una fosfolipasa; (ii) poner en contacto la
mezcla con factor Xa en condiciones en las que el fosfolípido
procoagulante es el componente limitante de velocidad de la mezcla;
y (iii) determinar el tiempo de coagulación de la mezcla.
La aplicación también describe un método de
determinación de la cantidad de plaquetas activadas y
micropartículas de plaquetas en una muestra, comprendiendo el
método las etapas (i) a (iii) realizadas en el orden siguiente: (i)
formar una mezcla de la muestra y un plasma de sustrato que se ha
liberado o liberado sustancialmente de suficiente fosfolípido
procoagulante para al menos reducir la capacidad del plasma de
sustrato para coagular; (ii) poner en contacto la mezcla con un
reactivo para activar la coagulación del plasma en condiciones para
permitir que el fosfolípido procoagulante coagule la mezcla; y (iii)
determinar el tiempo de coagulación de la mezcla.
De acuerdo con un segundo aspecto de esta
invención se proporciona un método para determinar la cantidad de
plaquetas activadas y micropartículas de plaquetas en una muestra
humana, comprendiendo el método las etapas (i) a (iv) realizadas en
el siguiente orden: (i) formar una mezcla de la muestra humana y un
plasma de sustrato no humano que se ha liberado o liberado
sustancialmente de suficiente fosfolípido procoagulante para al
menos reducir la capacidad del plasma de sustrato para coagular,
donde dicho plasma de sustrato se ha liberado o liberado
sustancialmente de fosfolípido procoagulante por tratamiento con una
fosfolipasa; (ii) poner en contacto la mezcla con factor Xa en
condiciones para permitir que el fosfolípido procoagulante coagule
la mezcla; (iii) determinar el tiempo de coagulación de la mezcla;
y (iv) cuantificar la cantidad de plaquetas activadas y
micropartículas de plaquetas en la
muestra.
muestra.
La solicitud también describe un método de
evaluación de si un paciente ha tenido un episodio trombótico
reciente, comprendiendo el método las etapas (i) a (iii) realizadas
en el orden siguiente: (i) formar una mezcla de la muestra y un
plasma de sustrato que se ha liberado o liberado sustancialmente de
suficiente fosfolípido procoagulante para al menos reducir la
capacidad del plasma de sustrato para coagular; (ii) poner en
contacto la mezcla con un reactivo para activar la coagulación del
plasma en condiciones para permitir que el fosfolípido
procoagulante coagule la mezcla; y (iii) determinar el tiempo de
coagulación de la mezcla.
Por ejemplo un episodio trombótico, puede ser
trombosis venosa profunda, embolia o infarto. Por "reciente"
se entiende dentro del límite temporal que puede detectarse el
fosfolípido procoagulante derivado del acontecimiento trombótico en
la circulación. Una estimación sería de hasta 12 horas desde dicho
acontecimiento si no se produce una activación de plaquetas
adicional.
La solicitud también describe un método de
producción de un plasma de sustrato para usar en la determinación
del nivel de fosfolípido procoagulante en una muestra, comprendiendo
dicho método tratar el plasma de sustrato con una enzima para
degradar suficiente fosfolípido procoagulante para al menos reducir
la capacidad del plasma de sustrato para coagular.
La solicitud también describe un plasma de
sustrato producido por el método mencionado anteriormente de
producción de un plasma de sustrato. Esto incluye el concepto de
incubar un plasma de ensayo que contiene una cantidad desconocida
de fosfolípido procoagulante en solitario con fosfolipasa y comparar
el resultado de un ensayo sensible a fosfolípido antes y después de
dicha incubación. Una prolongación significativa del ensayo confirma
que el fosfolípido procoagulante ha estado presente sin necesidad
de adición de plasma de sustrato sin fosfolípido.
La solicitud también describe un kit para
determinar el nivel de fosfolípido procoagulante en una muestra,
comprendiendo dicho kit: (i) un plasma de sustrato que se ha tratado
con fosfolipasa para degradar suficiente fosfolípido para al menos
reducir la capacidad del plasma de sustrato para coagular; (ii) un
reactivo para activar la coagulación de plasma de una forma
dependiente de fosfolípido; y (iii) preparaciones de referencia que
contienen niveles conocidos de fosfolípido procoagulante.
De acuerdo con otro aspecto de esta invención se
proporciona un kit para determinar el nivel de fosfolípido
procoagulante en una muestra humana, comprendiendo dicho kit: (i) un
plasma de sustrato no humano que se ha tratado con una fosfolipasa
para degradar suficiente fosfolípido para al menos reducir la
capacidad del plasma de sustrato para coagular; (ii) factor Xa y;
(iii) preparaciones de referencia que contienen niveles conocidos
de fosfolípido procoagulante.
Las preparaciones de referencia que contienen
niveles conocidos de fosfolípidos procoagulante pueden usarse como
agentes de calibración para construir una gráfica de referencia.
La solicitud busca abordar las desventajas
identificadas anteriormente y en una realización describe un método
para determinar si una muestra contiene fosfolípido procoagulante
detectable por encima del límite de sensibilidad inferior del
método y, en una segunda realización, cuánto. El método comprende
formar una mezcla de la muestra humana y un plasma de sustrato no
humano que se ha liberado o liberado sustancialmente de suficiente
fosfolípido procoagulante para al menos reducir la capacidad del
plasma de sustrato para coagular en un ensayo de coagulación
dependiente de fosfolípido. El plasma de sustrato puede liberarse o
liberarse sustancialmente de fosfolípido procoagulante por
tratamiento con una fosfolipasa.
El ensayo de coagulación dependiente de
fosfolípido puede ser uno que se inicie por veneno de víbora de
Russell o el activador de factor X de ese veneno o el
activador de protrombina dependiente de fosfolípido de veneno de
Pseudonaja textilis o, más preferiblemente, factor Xa de
origen humano, animal o recombinante.
El plasma puede ser plasma no humano y
preferiblemente es plasma no humano y, más preferiblemente, plasma
animal.
El plasma puede liberarse o liberarse
sustancialmente de fosfolípido procoagulante, por ejemplo, por
tratamiento con una enzima que degrade el fosfolípido en
plasma.
Por ejemplo, prolongar el tiempo de coagulación
activado por factor Xa de plasma de caballo de 50 a 120 s requiere
1 hora de incubación a 37ºC con veneno de Naja nigricollis al
2 x 10^{-5}%. Se muestran detalles de diversos protocolos de
pretratamiento de plasma en el Ejemplo 1 a continuación. La mezcla
se pone en contacto después con un reactivo para activar la
coagulación del plasma en condiciones en las que la concentración
de fosfolípido procoagulante influye en el tiempo de coagulación. Se
realiza una determinación de si la muestra comprende fosfolípido
procoagulante por determinación de cuándo se ha producido la
coagulación de la mezcla.
Como se describe en este documento, el inventor
ha descubierto que la sensibilidad de un ensayo de coagulación para
detectar fosfolípido procoagulante en una muestra, tal como
preferiblemente con un ensayo basado en factor Xa, se mejora usando
como plasma de sustrato una composición en la que el fosfolípido
procoagulante se ha degradado por tratamiento con fosfolipasa. Más
específicamente, se observó que una mezcla que comprende un plasma
de sustrato tratado con fosfolipasa tenía un tiempo de coagulación
aumentado, respecto al tiempo de coagulación de una mezcla que
comprende plasma no tratado pobre en plaquetas o plasma centrifugado
tratado normalmente. (Ejemplo 2). Como las mismas cantidades de
plasma de ensayo y, por tanto, las mismas cantidades de fosfolípido
procoagulante añadido se proporcionaron en todas las mezclas, se
deduce que la disminución del tiempo de coagulación en la mezcla
que comprende plasmas de sustrato no tratados y centrifugados estaba
causada por la detección de fosfolípido procoagulante tanto del
plasma de sustrato como de la muestra. La mezcla que comprende el
plasma de sustrato tratado, al tener un tiempo de coagulación
aumentado, tiene una sensibilidad mejorada ya que el único
fosfolípido procoagulante aportado a la mezcla y, por tanto, que se
detecta en el ensayo procede de la muestra.
Los resultados son sorprendentes debido a que
típicamente muchas enzimas no son capaces de tener actividad cuando
se añaden a plasma. Esto se debe a que el plasma es una mezcla
compleja de moléculas heterogéneas que pueden impedir la actividad
enzimática. Por ejemplo, el plasma contiene proteínas que se unen
fuertemente a fosfolípidos tales como apolipoproteínas, anexinas y
beta-2-glicoproteína 1 y éstas
pueden interferir con la disponibilidad de sustrato para una
fosfolipasa. Además, las fosfolipasas requieren habitualmente calcio
para su actividad enzimática y esto se reduce enormemente por el
anticoagulante citrato que se usa normalmente en el plasma recogido
para ensayos de coagulación sanguínea. Además, el plasma también
comprende moléculas inhibidoras capaces de inhibir la actividad de
enzimas específicas. Por ejemplo, la antitripsina que se une e
inhibe la tripsina, la antitrombina que inhibe la trombina y
antiplasminas que inhiben la actividad de plasmina. Probablemente,
el inhibidor principal de la mayoría de fosfolipasas en plasma
humano es la anexina V.
Típicamente el plasma de sustrato es uno que se
ha tratado con una fosfolipasa. Un ejemplo de dicha fosfolipasa es
una fosfolipasa básica A2. La fosfolipasa puede producirse
sintéticamente, por ejemplo, mediante tecnología de ADN
recombinante, o puede obtenerse de un organismo. Por ejemplo, la
fosfolipasa puede proceder de veneno de serpiente. Como se
ejemplifica en este documento, las fosfolipasas procedentes del
veneno de Naja mossambica y N. nigricollis son
particularmente útiles para tratar el plasma de sustrato. Otros
tipos de veneno que son útiles proceden de Agkistrodon
halys, especies de Vipera, especialmente berus y
russelli, Crotalus durissus, Enhydrina schistosa, Oxyuranus
scutellatus y Apis melifera. La característica principal de las
fosfolipasas de veneno que las hace eficaces en plasmas es
probablemente su carácter básico como se muestra por un alto pH
isoeléctrico. La mayoría de las fosfolipasas derivadas de veneno
eficaces comparten homología estructural.
Otros organismos que pueden proporcionar una
fosfolipasa para el uso en el tratamiento del plasma de sustrato
incluyen Streptomyces violaceoruber, especies de Vibrio,
Clostridium perfringens, Bacillus cereus.
Se deduce que puesto que los fosfolípidos
aniónicos, tales como fosfatidil serina, son importantes en la
trombosis, típicamente la enzima para degradar el fosfolípido
procoagulante en el plasma de sustrato debería ser una capaz de
degradar la fosfatidil serina en plasma. Como se ha indicado
anteriormente, el uso de un plasma de sustrato tratado en
consecuencia mejora la especificidad para la detección de fosfatidil
serina en un ensayo de coagulación para la detección de fosfolípido
procoagulante, tal como RVVT o ensayo basado en factor Xa.
Debe entenderse que no es necesario tratar el
plasma de sustrato para usar en el método de la invención para
degradar todo el fosfolípido del mismo. Sin embargo, el plasma de
sustrato se trata típicamente para que su capacidad para coagular,
cuando se activa por un activador de la coagulación dependiente de
fosfolípido procoagulante, por ejemplo, veneno de víbora de
Russell, esté al menos reducida por la degradación de
fosfolípido procoagulante en el plasma de sustrato mediante la
enzima. Típicamente, la capacidad del plasma de sustrato para
coagular cuando se activa por dicho reactivo se reduce cuando
sustancialmente todo el fosfolípido procoagulante, principalmente
el componente de fosfatidil serina del fosfolípido en el plasma de
sustrato, se ha degradado por la enzima. El tratamiento del plasma
de sustrato con 1 x 10^{-5} % de veneno de N. nigricollis
completo (que contiene sustancialmente menos cantidad de la enzima
purificada) durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 37ºC
es típicamente suficiente para degradar sustancialmente todo el
fosfolípido procoagulante en un plasma de sustrato pobre en
plaquetas mediante la enzima. Las condiciones actuales para
empobrecer plasmas individuales depende enormemente de su contenido
inicial de fosfolípido procoagulante libre y esto depende a su vez
del grado de contaminación por plaquetas u otros residuos celulares
(por ejemplo, véase el Ejemplo 1). Por lo tanto, los plasmas que
contienen altos niveles de plaquetas requieren un mayor tiempo de
incubación o una mayor concentración de fosfolipasa que los que ya
tienen un contenido de fosfolípido reducido. Es preferible comenzar
con plasmas que ya tengan un contenido de fosfolípido reducido. Este
tratamiento con fosfolipasa degrada sólo aproximadamente el 0,001%
del 0,1% de fosfolípido total en la mayoría de plasmas pobres en
plaquetas. Típicamente la proporción de fosfatidil serina
libre:fosfolípido total es de aproximadamente 1:100.000. Un ensayo
sensible a fosfolípido tal como el tiempo de coagulación activado
por factor Xa (en lo sucesivo "XACT") detecta de forma
rutinaria 100-1000 ng/ml en plasmas de pacientes. Se
entenderá que podría usarse un tiempo de incubación más corto con
una mayor concentración de fosfolipasa y que sería necesario un
tiempo de incubación más prolongado con una menor concentración de
fosfolipasa. Por lo tanto, 400 ng/ml de veneno de N.
nigricollis (NNV) en plasma porcino normal requieren 40 minutos
a 37ºC para prolongar el tiempo de coagulación activado por factor
X de 48 s a 100 s, mientras que 200 ng/ml de NNV requieren 90
minutos para conseguir un resultado de XACT óptimo de 100 s similar
(véase el Ejemplo 1 para más detalles). También se entenderá que el
método de la invención será más sensible para fosfolípido
procoagulante cuando todo el fosfolípido procoagulante en el plasma
de sustrato se haya degradado por tratamiento con la enzima.
Debido a que la actividad de venenos útiles en
esta invención es progresiva en la naturaleza es deseable
interrumpir su interacción con el plasma una vez que se haya
reducido adecuadamente el nivel de fosfolípido. Esto puede
realizarse con antisueros diluidos y anticuerpos dirigidos contra el
veneno que se esté usando. Los antivenenos disponibles en el
mercado contra la clase particular de veneno, por ejemplo, de cobra,
que se esté usando son eficaces a concentraciones del 0,01 al
1%.
El plasma de sustrato puede ser cualquier
composición que corrija para un factor o factores en los que es
deficiente la muestra del paciente. Por ejemplo, cuando la muestra
del paciente es deficiente en factor V, el plasma o sustrato
debería contener factor V en exceso para ser capaz de lograr la
coagulación de la muestra de plasma del paciente. Otro ejemplo de
plasma de sustrato es uno que contiene todos los factores
seleccionados del grupo que consiste en: factor XII, precalicreína,
quininógeno de alto peso molecular, factor XI, factor VIII, factor
IX, factor X, factor V, protrombina y fibrinógeno a niveles
funcionales suficientes para compensar cualquier defecto en la
muestra mezclada. Dicho plasma de sustrato se usaría en un ensayo de
tiempo de coagulación activado por caolín o por superficie. Cuando
se usa un ensayo que emplea factor tisular como activador el plasma
de sustrato debe contener los factores VII, X, V, II y I
(fibrinógeno) con el mismo fin.
Cuando se va a usar un ensayo tal como el ensayo
de veneno de víbora de Russell, sólo requiere que estén
presentes los factores de coagulación X y siguientes en la cascada
de coagulación, es decir, factores X, factor V, factor II y
fibrinógeno. No es necesario que estén presentes los factores
anteriores al factor X para un resultado normal. Si se va a usar un
ensayo basado en factor Xa, ni siquiera el factor X es necesario en
el sistema para un resultado normal, sólo se requieren entonces los
factores V, II y I (fibrinógeno). Los activadores de protrombina
dependientes de fosfolípidos de venenos de elápidos no requieren
factores anteriores al factor II (protrombina) para inducir la
coagulación. Por lo tanto, si se fuera a usar un ensayo basado en
veneno de Taipán, sólo es necesario proporcionar protrombina y
fibrinógeno para un resultado normal. El fibrinógeno o el factor I
son necesarios solamente para proporcionar un marcador de punto
final de la coagulación. La velocidad máxima de generación de
trombina puede detectarse alternativamente usando sustratos
tripeptídicos cromogénicos que se convierten por trombina en
productos finales coloreados que pueden detectarse
espectrofotométricamente.
Típicamente el plasma de sustrato procede de
sangre tratada con citrato. Los plasmas adecuados son los que se
sabe que son eficaces para promover la coagulación de una muestra de
plasma humano debido a que proporcionan un factor presente de forma
variable en la muestra de ensayo. Los ejemplos de dichos plasmas
incluyen la mayoría de plasmas de mamífero. Los que se ejemplifican
en este documento como útiles en el método de la invención incluyen
plasma obtenido de cerdo, caballo, vaca, oveja, cabra, camello,
mono, perro, gato, zorro, elefante, llama, conejo, visón, mapache,
canguro y mezclas de los mismos.
La diferencia entre el primer y segundo
resultado es proporcional a cuánto fosfolípido procoagulante se
destruyó mediante el tratamiento con fosfolipasa.
Sin embargo, puesto que se generan anticuerpos
en algunos seres humanos que tienen actividad serológica frente a
proteínas humanas que se unen a fosfolípidos procoagulantes, tales
como beta 2 glicoproteína 1 y protrombina (por ejemplo, anticuerpos
inhibidores de lupus), el uso de plasma humano como plasma de
sustrato en el método descrito en este documento lleva consigo
cierta sensibilidad no deseada a dichos inhibidores. Por
consiguiente, dichos muestras deberían ensayarse para determinar la
presencia de estos anticuerpos. Cuando se usa plasma animal para
proporcionar el plasma de sustrato, una ventaja de la invención es
que el método es mucho menos sensible a anticuerpos dirigidos
contra factores de coagulación humanos o cofactores de lupus que un
método basado en plasma humano. Dichos anticuerpos pueden aparecer
inesperadamente entre los pacientes, causando confusión y poca
fiabilidad de los métodos de ensayo de la coagulación
existentes.
Se entenderá que cuando una muestra de ensayo
tiene una coagulabilidad alterada, particularmente cuando al
individuo que se va a ensayar se le ha administrado un
anticoagulante, puede ser necesario para el plasma de sustrato que
comprenda además al menos un agente para controlar la capacidad del
anticoagulante para inhibir la coagulación. Los agentes que son más
probablemente útiles son los capaces de controlar la capacidad de
la heparina para inhibir la coagulación, debido a que la heparina se
usa ampliamente como anticoagulante. Estos agentes incluyen sulfato
de protamina y polibreno o sulfato de protamina. Sin embargo, otros
agentes incluyen anticuerpos contra hirudina y sus análogos u otros
antagonistas anticoagulantes.
El plasma de sustrato se usaría normalmente en
forma líquida o reconstituida. Sin embargo, para el uso en un
dispositivo de "punto de cuidado", podría estar presente como
parte de una composición seca reconstituida mediante el propio
muestra de sangre o plasma aplicado.
El reactivo para activar la coagulación de la
mezcla en el ensayo debe activar la coagulación para que se
desarrolle posteriormente de una forma dependiente de fosfolípido
procoagulante. Los ejemplos de dichos reactivos son los capaces de
convertir el factor X en factor Xa o capaces de convertir la
protrombina en trombina. Por consiguiente, el reactivo para usar en
el método descrito en este documento puede ser veneno de víbora de
Russell o activador del factor X de un veneno relacionado de
la familia Viperidae, o factor Xa u otro activador de protrombina
dependiente de fosfolípido obtenido de venenos de elápidos tales
como la cobra australiana Pseudonaja o la familia de
Oxyuranus scutellatus. Los reactivos obtenidos de mamíferos
distintos de seres humanos son particularmente útiles, por ejemplo,
factor Xa de origen bovino (véase el Ejemplo 4). Pueden usarse
reactivos que actúan más arriba en el mecanismo de la coagulación
tales como activadores de contacto, factor tisular, factor IXa,
factor XIa, factor VIIa, pero éstos hacen al sistema menos
específico para fosfolípido y más vulnerable a la interferencia por
variables del plasma del paciente.
Los activadores de la coagulación también pueden
ser enzimas de precursores recombinantes basadas en nuevas
secuencias de ADN. Dichos procoagulantes podrían volverse
insensibles para inhibir anticuerpos por deleción de epítopos
comunes reconocidos por dichos anticuerpos. Estos reactivos se
usarían normalmente en forma líquida pero también podrían
proporcionarse en forma seca para aplicación en un dispositivo de
"punto de cuidado" en cuyo caso se reconstituirían mediante
una muestra de plasma o muestra de sangre aplicada.
Aunque se prevé que el método descrito en este
documento se aplicaría más ampliamente en relación con una muestra
de sangre o plasma obtenida de un paciente humano. La muestra a
ensayar para fosfolípido procoagulante puede ser sangre, plasma,
suero o cualquier otro fluido. Si se ha anticoagulado mediante
agentes de unión a calcio tales como citrato o EDTA, los niveles de
dichos agentes deberían ser similares a los usados en otros ensayos
de coagulación.
En el primer aspecto de la invención mencionado
anteriormente, se proporciona un método de determinación de la
cantidad de fosfolípido procoagulante en una muestra.
La medición se realiza en comparación con
plasmas de referencia que contienen cantidades conocidas de
fosfolípido procoagulante y los valores desconocidos pueden
interpolarse a partir de una curva de calibración construida
apropiadamente.
Puesto que los fosfolípidos procoagulantes se
localizan típicamente en plaquetas activadas y micropartículas de
plaquetas, se deduce que la medición de la cantidad de fosfolípido
procoagulante en plasma rico en plaquetas de acuerdo con el primer
aspecto de la invención permitiría cuantificar la cantidad de
plaquetas activadas y micropartículas de plaquetas en la
muestra.
Por lo tanto, en el segundo aspecto mencionado
anteriormente, la invención proporciona un método de determinación
de la cantidad de plaquetas activadas y micropartículas derivadas de
células en una muestra, estando el método de acuerdo con el primer
aspecto de la invención.
Como se ha indicado anteriormente, una
activación de plaquetas o celular anormal puede dar como resultado
episodios trombóticos, embolia, traumatismo tisular, procesos
inmunes (incluyendo activación del complemento), septicemia,
coagulación intravascular diseminada o infarto. En casos extremos, o
cuando se debe a procesos inmunológicos, puede dar como resultado
trombocitopenia. Sería ventajoso ser capaz de determinar si un
individuo tiene una afección clínica que implica activación de
plaquetas, por ejemplo, trombosis, apoplejía o infarto de
miocardio. El inventor reconoce que un método para determinar la
cantidad de plaquetas activadas o micropartículas de plaquetas por
determinación de la cantidad de fosfolípido procoagulante permitiría
el diagnóstico de los individuos con estas afecciones.
En otro aspecto, la invención proporciona un
método de evaluación de si un paciente ha tenido recientemente un
episodio trombótico tal como trombosis venosa profunda, embolia,
infarto, estando el método de acuerdo con el segundo aspecto de la
invención.
La solicitud también describe un método para
producir un plasma de sustrato para usar en la determinación de si
un individuo comprende fosfolípido procoagulante. El método
comprende tratar un plasma de sustrato con una enzima para degradar
suficiente fosfolípido procoagulante para al menos reducir la
capacidad del plasma de sustrato para coagular.
Usando una enzima en el método mencionado
anteriormente para producir un plasma de sustrato, se puede
proporcionar un panel de plasmas de sustrato que comprenden
cantidades definidas de fosfolípido procoagulante. Esto permite
controlar la sensibilidad de los métodos del primer y segundo
aspecto de la invención, seleccionando para el uso del panel un
plasma de sustrato que comprenda la cantidad deseada de fosfolípido
procoagulante. Esta opción proporciona un tiempo de coagulación
basal razonable u optimizado para un instrumento particular. Los
venenos de serpiente son particularmente útiles para proporcionar
una enzima para el uso en el método mencionado anteriormente para
producir un plasma de sustrato debido a que pueden usarse a
concentraciones muy bajas y su actividad puede controlarse
posteriormente, por ejemplo, mediante el uso de antisueros y
anticuerpos eficaces contra fosfolipasas. Sin embargo, se entenderá
que podrían usarse agentes capaces de controlar enzimas fosfolipasas
obtenidos a partir de tecnología de ADN recombinante o de otros
organismos o compuestos inhibidores. Por lo tanto, una etapa
adicional de este método comprende poner en contacto el plasma de
sustrato con al menos un agente para controlar la capacidad de la
enzima para degradar fosfolípido procoagulante.
Además, en otra realización, el método
mencionado anteriormente para producir un plasma sustrato comprende
la etapa adicional de mezclar el plasma de sustrato con al menos un
agente tal como polibreno o sulfato de protamina para controlar la
capacidad de un anticoagulante terapéutico tal como heparina para
inhibir la coagulación.
La aplicación también describe un plasma de
sustrato producido por el método mencionado anteriormente para
producir un plasma de sustrato.
La aplicación también describe un kit para
determinar si un individuo comprende fosfolípido procoagulante,
comprendiendo el kit: (i) un plasma de sustrato que se ha tratado
con una enzima para degradar suficiente fosfolípido para al menos
reducir la capacidad del plasma de sustrato para coagular; y (ii) un
reactivo para activar la coagulación del plasma de una forma
dependiente de fosfolípido (iii) preparaciones de referencia que
contienen niveles conocidos de fosfolípido procoagulante, pudiendo
usarse las preparaciones de referencia que contienen niveles
conocidos de fosfolípido procoagulante como agentes de calibración
para construir una gráfica de referencia.
La invención se describe además con referencia a
los dibujos en los que:
La Figura 1 es una representación del efecto de
incubar plasmas normales de diversas especies con o sin veneno de
N. nigricollis como se describe en el Ejemplo 1;
la Figura 2 es una representación del efecto del
pretratamiento con veneno de N. nigricollis sobre la
sensibilidad de plaquetas; y
la Figura 3 es una representación de la
sensibilidad de diversos ensayos para fosfolípido de plaquetas.
La presente invención se describirá ahora con
referencia a los siguientes ejemplos.
Objetivo: demostrar el efecto progresivo
y selectivo de una fosfolipasa de veneno típica para reducir el
fosfolípido procoagulante de plasmas que contienen plaquetas de
diversas especies, mejorando de este modo la sensibilidad de esos
plasmas de sustrato en ensayos de coagulación para fosfolípido
procoagulante.
Método: Se recogieron muestras de sangre
en un décimo de su volumen final de anticoagulante citrato trisódico
al 3,2% por punción venosa limpia de un voluntario humano, por
punción cardiaca de un caballo recién disparado (equino), por
extracción de sangre arterial de un cerdo en un matadero y de forma
similar de un buey (bovino). Las muestras se centrifugaron a 3.000
rpm durante 20 minutos y se congelaron los plasmas sobrenadantes
pobres en plaquetas con un recuento de plaquetas bastante variable
(de aproximadamente 5 x 10^{9}/l para la muestra humana, pero no
medido para los plasmas animales) a -30ºC.
Posteriormente se incubaron muestras
descongeladas pobres en plaquetas a 37ºC sin tratamiento o después
de mezcla con veneno de N. nigricollis (NNV) las
concentraciones que se muestran en la Figura 1. Se retiraron
muestras a intervalos de 1 ó 2 horas y se ensayaron con un reactivo
de factor Xa/calcio para el ensayo de XACT.
Resultados: Estos se muestra en la Figura
1. Los resultados de XACT en todos los plasmas sin adiciones de NNV
eran razonablemente estables. Sin embargo, con NNV presente los
resultados de XACT se prolongaron por encima del periodo de
incubación. Los plasmas bovino y porcino dieron los resultados
iniciales más cortos, probablemente debido a un exceso de
fosfolípido procoagulante libre, pero ambos se duplicaron después de
la incubación durante 2 horas con NNV al 4 x 10^{-5}% y 8 x
10^{-5}%. El XACT en plasma de caballo se prolongó de 50 a 120 s
después de 1 hora con NNV al 2 x 10^{-5}%.
Comentarios: Estos aumentos en los
resultados de XACT debidos a la incubación con NNV no se acompañaron
de cambios significativos en el tiempo de tromboplastina parcial
activada (APTT), tiempo de protrombina (PT) u otros ensayos de
coagulación. Esto confirma que el efecto principal del NNV no se
debía a la degradación de los factores de coagulación implicados en
estos ensayos de coagulación, sino a la pérdida de fosfolípido para
el que estos ensayos no son sensibles.
\vskip1.000000\baselineskip
Objetivo: Demostrar que el tratamiento de
un plasma humano normal con una traza de veneno de N.
nigricollis proporciona un producto (plasma de sustrato) con
mejor sensibilidad a plaquetas en un ensayo de coagulación basado
en factor Xa que la centrifugación.
Método: Se prepararon plasmas de ensayo
que contenían niveles variables de plasma normal rico en plaquetas
congelado-descongelado (PRP inicialmente con 250 x
10^{9} plaquetas/l) en plasma humano normal "sin" plaquetas.
El plasma sin plaquetas (PFP) se obtuvo por centrifugación a alta
velocidad y filtración a través de un filtro de jeringa de 0,22
micrómetros.
Estos plasmas de ensayo se mezclaron con un
volumen equivalente de 3 plasmas de sustrato diferentes antes de
ensayarse en un ensayo de coagulación basado en factor Xa. Los 3
plasmas de sustrato diferentes eran:
- 1.
- Plasma humano normal "pobre" en plaquetas (PPP).
- 2.
- El mismo PPP centrifugado a 15.000 g durante 10 min.
- 3.
- El mismo PPP tratado con veneno de N. nigricollis al 1 x 10^{-5}% durante 20 minutos a 37ºC (en lo sucesivo el "tratamiento con NNV").
El reactivo de factor Xa contenía Factor Xa
bovino 0,001 U/ml en cloruro de calcio 0,015 M, cloruro de sodio
0,1 M, tampón HEPES 0,02 M pH 7,0 y se usó en una proporción de 0,05
ml de mezcla de plasma con 0,1 ml de reactivo en una máquina de
coagulación ST4 (Diagnostica Stago, París, Francia) a 37ºC.
Resultados: La Tabla 1 muestra los
resultados del tiempo de coagulación de Factor Xa en segundos en
mezclas 1:1 de plasmas de ensayo que contienen diversos recuentos
de plaquetas y plasma normal combinado de sustrato (PNP) pretratado
por los dos métodos diferentes.
Comentario: Estos experimentos demuestran
que el tratamiento con NNV conseguía un aumento mayor en los
resultados de tiempo de coagulación que los obtenidos con
centrifugación a alta velocidad. Esto da como resultado una mejora
en la sensibilidad a plaquetas.
\vskip1.000000\baselineskip
Objetivo: Demostrar el efecto de veneno
de N. nigricollis para aumentar la sensibilidad de un sistema
de ensayo de coagulación de veneno de víbora de Russell basado en
plasma bovino.
Método: Se realizan una serie de
diluciones de un plasma rico en plaquetas humano
congelado-descongelado aunque de otro modo normal
(con un recuento de plaquetas inicial de 250 x 10^{9}/l) en plasma
bovino normal y también en plasma bovino pretratado durante 50 min
a 20ºC con veneno de N. nigricollis al 5 x 10^{-5}%. Estas
muestras de plasma se mezclaron con un volumen equivalente de
diversos venenos de víbora de Russell y reactivos que
contienen calcio y se midió el tiempo hasta un punto final de
coagulación a 37ºC en el modo de tiempo de trombina (el modo TT usa
volúmenes equivalentes de plasma y reactivo) en un instrumento de
medición del tiempo de coagulación ACL300 (Instrumentation
Laboratory SpA, Milán, Italia). La concentración de veneno de
víbora de Russell en el reactivo con cloruro de cálcico 0,025
M variaba del 10^{-5}% al 10^{-6}% y el primer reactivo también
se ensayó después de la adición de veneno de N. nigricollis
al 2 x 10^{-4}%.
Resultados: Los resultados obtenidos se
resumen en la Figura 2. Es evidente que la sensibilidad de un
sistema de ensayo usando RVV al 1 x 10^{-5}% a plaquetas era
bastante reducida, estancándose a niveles de plaquetas inferiores a
1 x 10^{9}/l. Los tiempos de coagulación de RVV se prolongaron por
reducción de la concentración de RVV diez veces hasta el
10^{-6}%, pero no se mejoró la sensibilidad a plaquetas como se
muestra por el gradiente de la curva de sensibilidad. La inclusión
de NNV al 20 x 10^{-5}% en el reactivo RVV (RVV = 10^{-5}%)
aumentaba ligeramente la sensibilidad.
La mayor sensibilidad a plaquetas se observó
cuando el plasma bovino se había preincubado con NNV al 5 x
10^{-5}% antes de usarse para diluir el concentrado de plaquetas.
En este caso, todavía podían cuantificarse con precisión recuentos
de plaquetas entre 0,1 y 1,0.
\vskip1.000000\baselineskip
Objetivo: Comparar las sensibilidades de
4 activadores de la coagulación dependientes de fosfolípido en un
sistema de ensayo para ensayar el fosfolípido procoagulante.
Método: Se prepararon diluciones de un
plasma rico en plaquetas en plasma humano normal sin plaquetas como
se muestra a continuación. Estas muestras se ensayaron con 4
sistemas de ensayos de coagulación diferentes. Todos los ensayos se
realizaron a 37ºC en un ST4. Los reactivos y métodos eran los
siguientes.
- 1.
- Se realizaron ensayos de coagulación con caolín (KCT) usando muestras de plasma de 0,05 ml preincubadas con 0,05 ml de una suspensión de caolín al 1% en agua durante 3 min y después recalcificados con 0,05 ml de cloruro de calcio 0,025 M. El tiempo desde la adición del cloruro de calcio hasta que se producía la coagulación se determinó en una máquina de coagulación ST4 (Stago).
- 2.
- Los ensayos de Veneno de Víbora de Russell (RVV) se realizaron mezclando muestras de 0,05 ml con 0,05 ml de un reactivo que contenía RVV al 2 x 10^{-6}% en cloruro de calcio 0,025 M y midiendo el tiempo hasta un punto final de coagulación.
- 3.
- Se realizaron ensayos de coagulación basados en factor Xa (FXa-CT) mezclando muestras de 0,05 ml con 0,05 ml de un reactivo que contenía factor Xa bovino 0,001 U/ml en cloruro de calcio 0,025 M y midiendo el tiempo hasta un punto final de coagulación.
- 4.
- Se realizaron ensayos de coagulación con Textarina (TM-Pentapharm, Basel, Suiza) (TX-CT) mezclando muestras de 0,05 ml con 0,05 ml de un reactivo que contenía 2 U/m de reactivo de Textarina comercial deslipidado en cloruro de calcio 0,025 M y midiendo el tiempo hasta un punto final de coagulación.
Resultados: Los resultados obtenidos se
muestran en la Figura 3. Los ensayos de RVVT y KCT mostraban
sensibilidades similares a plaquetas. El ensayo de coagulación
basado en factor X activado (XACT) mostraba la mayor sensibilidad a
plaquetas. El ensayo con la menor sensibilidad a plaquetas era el
basado en Textarina deslipidada. Sin embargo, es posible que esto
pueda haberse debido a una eliminación inadecuada de fosfolípido de
este reactivo comercial destinado para un fin alternativo, es
decir, detección de inhibidores de lupus.
Comentarios: El reactivo de Textarina es
un activador de protrombina dependiente de fosfolípido típico
derivado del veneno de Pseudonaja textilis, uno de varios
elápidos australianos que se sabe que contienen dichos
procoagulantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Objetivo: Para ilustrar que el método es
insensible a deficiencias de todos los factores de coagulación
conocidos. También para detectar fosfolípido procoagulante libre en
diversos plasmas disponibles en el mercado deficientes en factores
de coagulación individuales.
Método: Se ensayaron diversos plasmas
deficientes en factores de coagulación individuales secados por
congelación comercializados para su uso en ensayos de factores
específicos usando el nuevo ensayo para fosfolípido procoagulante.
Por lo tanto, cada uno de los viales de diversos proveedores
(DadeBehring, IL/Beckman-Coulter y Diagnostica
Stago) se reconstituyeron en el momento con 1 ml de agua. Los
ensayos usaban 25 \mul de plasma de sustrato tratado con NNV
(lote 3004) con 25 \mul de cada plasma deficiente en factor y 50
\mul de reactivo de factor Xa en una máquina de coagulación Stago
ST4.
Resultados: Estos se muestran en la Tabla
2.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Comentario: El plasma pobre en plaquetas
congelado combinado daba un tiempo de coagulación de FXa
relativamente corto en comparación con el plasma normal sin
plaquetas debido a que contenía aproximadamente el 5% del recuento
de plaquetas normal (aproximadamente 10 x 10^{9} plaquetas/l).
Estos resultados demuestran que la deficiencia
total de cualquier factor de coagulación de plasma individual en
una muestra de ensayo no prolonga el ensayo de FXa. También
demuestra que los plasmas deficientes en factor VIII, IX y X usados
en este documento contienen cantidades apreciables de fosfolípido
procoagulante detectable con este ensayo.
Debería estar claro que los métodos de la
presente invención encontrarán una amplia aplicación en la ciencia
del laboratorio clínico.
Claims (22)
1. Un método para determinar la cantidad de
fosfolípido procoagulante en una muestra humana, comprendiendo
dicho método las etapas (i) a (iii) realizadas en el siguiente
orden:
- (i)
- formar una mezcla de la muestra humana y un plasma de sustrato no humano que se ha liberado o liberado sustancialmente de suficiente fosfolípido procoagulante para al menos reducir la capacidad del plasma de sustrato para coagular, en la que dicho plasma de sustrato se ha liberado o liberado sustancialmente de fosfolípido procoagulante por tratamiento con una fosfolipasa;
- (ii)
- poner en contacto la mezcla con factor Xa en condiciones en las que el fosfolípido procoagulante es el componente limitante de velocidad de la mezcla; y
- (iii)
- determinar el tiempo de coagulación de la mezcla.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en
sangre, plasma y suero.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que dicha sangre es sangre anticoagulada.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la medición se realiza en comparación con plasmas de
referencia o soluciones que contienen cantidades conocidas de
fosfolípido procoagulante y los valores desconocidos pueden
interpolarse a partir de una curva de calibración construida
apropiadamente.
5. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho plasma de sustrato procede de sangre tratada con citrato.
6. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho plasma de sustrato se obtiene de un miembro seleccionado del
grupo de animales vertebrados que consiste en cerdo, caballo, vaca,
oveja, cabra, camello, mono, perro, gato, zorro, elefante, llama,
conejo, visón, mapache, canguro y mezclas de los mismos.
7. El método de la reivindicación 6, en el que
dicho plasma de sustrato se obtiene de cerdos.
8. El método de la reivindicación 1, en el que
la fosfolipasa se obtiene del veneno seleccionado del grupo que
consiste en Naja mossambica, Naja nigricollis, Agkistrodon halys,
Vipera berus, Vipera russeli, Crotalus durissus, Enhyrdrina
schistose, Oxyuranus scutellatus y Apis mellifera.
9. El método de la reivindicación 1, en el que
la fosfolipasa se obtiene de uno de un grupo seleccionado que
consiste en Streptomyces violaceoruber, especies de
Vibrio, Clostridium perfringens o Bacillus cereus.
10. El método de la reivindicación 1, en el que
el factor Xa procede de un mamífero distinto de un ser humano.
11. Un método para determinar la cantidad de
plaquetas activadas y micropartículas de plaquetas en una muestra
humana, comprendiendo dicho método las etapas (i) a (iv) realizadas
en el siguiente orden:
- (i)
- formar una mezcla de la muestra humana y un plasma de sustrato no humano que se ha liberado o liberado sustancialmente de suficiente fosfolípido procoagulante para al menos reducir la capacidad del plasma de sustrato para coagular, en la que dicho plasma de sustrato se ha liberado o liberado sustancialmente de fosfolípido procoagulante por tratamiento con una fosfolipasa;
- (ii)
- poner en contacto la mezcla con factor Xa en condiciones para permitir que el fosfolípido procoagulante coagule la mezcla;
- (iii)
- determinar el tiempo de coagulación de la mezcla; y
- (iv)
- cuantificar la cantidad de plaquetas activadas y micropartículas de plaquetas en la muestra.
12. Un método de acuerdo con la reivindicación
11, en el que dicho método determina si un paciente ha tenido un
episodio trombótico reciente.
13. Un método de acuerdo con la reivindicación
11, en el que dicho método determina si un paciente ha tenido un
trastorno clínico que implica activación de plaquetas.
14. El método de acuerdo con la reivindicación
12, en el que el episodio trombótico se selecciona del grupo que
consiste en coagulación intravascular diseminada, trombosis venosa
profunda, embolia, traumatismo tisular, septicemia e infarto.
\newpage
15. El método de la reivindicación 11, en el que
la fosfolipasa se obtiene de veneno seleccionado del grupo que
consiste en Naja mossambica, Naja nigricollis, Agkistrodon halys,
Vipera berus, Vipera russeli, Crotalus durissus, Enhyrdrina
schistose, Oxyuranus scutellatus y Apis mellifera.
16. El método de la reivindicación 11, en el que
la fosfolipasa se obtiene de uno de un grupo seleccionado que
consiste en Streptomyces violaceoruber, especies de
Vibrio, Clostridium perfringens o Bacillus
cereus.
17. El método de la reivindicación 11, en el que
el factor Xa procede de un mamífero distinto de un ser humano.
18. El método de la reivindicación 11, en el que
el plasma de sustrato se ha formado a partir de factores V y
protrombina.
19. El método de la reivindicación 18, en el que
dichos factores V y protrombina están libres de fosfolípidos.
20. El método de la reivindicación 18, en el que
dichos factores V y protrombina son de origen animal o humano.
21. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 20, en el que dicho plasma de sustrato se
obtiene de un miembro seleccionado del grupo que consiste en cerdo,
caballo, vaca, oveja, cabra, camello, mono, perro, gato, zorro,
elefante, llama, conejo, visón, mapache, canguro y mezclas de los
mismos.
22. Un kit para determinar el nivel de
fosfolípido procoagulante en una muestra humana, comprendiendo dicho
kit:
- (i)
- un plasma de sustrato no humano que se ha tratado con una fosfolipasa para degradar suficiente fosfolípido para al menos reducir la capacidad del plasma de sustrato para coagular;
- (ii)
- factor Xa; y
- (iii)
- preparaciones de referencia que contienen niveles conocidos de fosfolípido procoagulante.
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