KR20060113662A - 전구응고제 인지질의 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (i) 기질 혈장의 응고능을 적어도 감소시키기에 충분한 전구응고제 인지질을 없앴거나 또는 실질적으로 없앤 기질 혈장과 샘플의 혼합물을 형성하는 단계로서, 여기서 상기 기질 혈장은 포스포리파제 처리에 의해 전구응고제 인지질이 없앴거나 또는 실질적으로 없앤 것인 단계; (ii) 전구응고제 인지질이 혼합물의 속도 제한 성분인 조건에서 혈장의 응고를 활성화시키기 위한 시약과 혼합물을 접촉시키는 단계; 및 (iii) 혼합물의 응고 시간을 측정하는 단계의 순서로 실시되는 단계 (i) 내지 (iii)을 포함하는, 샘플내의 전구응고제 인지질의 양을 결정하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 혈액 응고 시험에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 혈전증 및 혈소판 활성화의 마커 및 잠재적인 혈전증 위험 인자를 위한 개량된 방법에 관한 것이다.
예를 들어, 포스파티딜 세린과 같은 음이온성 인지질을 비롯한 전구응고제 인지질은 혈액 응고 기작에서 중요한 역할을 한다. 전구응고제 인지질은 인자 VIIIa 및 IXa에 의해 인자 X를 Xa로 전환시키는 고유 응고 경로에 필요하며, 또한 인자 Xa에 의한 프로트롬빈의 트롬빈으로의 절단을 위한 일반 경로에 필요하다. 이들은 조직 인자 활성자 복합체의 일부를 형성한다. 항혈전증 기작에서 이들은 트롬빈/트롬보모듈린 복합체에 의한 단백질 C의 활성화 및 활성화된 단백질 C에 의한 인자 Va의 파괴에 관여한다.
낮은 수준의 전구응고제 인지질은 일반적으로 아마도 다양한 세포, 주로 혈소판으로부터 유래된 미세 입자로서, 건강한 개체의 혈액에 존재하지만, 이들 수준은 예를 들어 상처 및 혈액 응집의 활성화, 보체 또는 면역 기작에 대한 반응에서 혈소판이 활성화될 때 증가한다. 생체외 혈소판은 동결 해동 또는 콜라겐/트롬빈 또는 이오노포어와 같은 막 파괴 제제에 의한 활성화 후 최대 전구응고제 활성을 발현한다. 생체 내에서 혈소판의 비정상적 활성화는 혈전증 에피소드, 색전증, 패혈증, 파종성 혈관내 응고증 및 경색 동안 발생한다. 역으로 혈소판의 부적절한 활성화는 본 빌레브란드 질병과 같은 일부 출혈 질환에서 그리고 다양한 혈소판 비정상에서 발생한다.
전구응고제 인지질은 응고 분석, 예를 들어, 러셀의 살모사 독액 시험(이하에서 "RVVT")에 의한 환자의 혈액 혈장 샘플에서 검출될 수 있으나, 그러한 분석은 루푸스 응고방지제를 진단하는데 일반적으로 이용된다. RVVT에 이용되는 독액은 인자 V 및 X를 특이적으로 활성화시키는 메탈로프로테아제를 함유한다. 독액 및 칼슘 이온의 첨가 후, 응고는 환자의 샘플내의 전구응고제 인지질에 거의 절대적으로 의존하면서 진행된다. 환자의 샘플내의 전구응고제 인지질의 양은 시험 혼합물이 피브린을 형성하고 응고하여 튜브에서 유동을 멈추거나 광학적 탁도가 증가하거나 구멍 또는 천공을 차단하는데 필요한 시간에 따라 결정된다. 응고 시간, 즉 피브린 응고가 형성되는데 필요한 시간은 주요 응고 효소, 트롬빈에 의해 작용될 때 쉽게-검출 가능한 착색된 생성물을 생성하는 발색 기질에 의해 본 개시 및 후속 개시에서 종말점 지시자로 대체될 수 있다.
환자가 불충분한 인자 X, V, II 또는 피브리노겐과 같은 인자 결핍을 갖는 것으로 의심되거나, 또는 응고방지제를 받고 있는 경우, 환자의 샘플을 일반적으로 샘플에 결핍된 이들 인자를 공급할 목적을 위해 정상의 인간 혈소판이 없는 혈장의 샘플과 혼합한다. 이 정상의 인간 혈소판이 없는 혈장은 일반적으로 '기질 혈장'으 로 알려져 있다. 이들 분석에 이용되는 기질 혈장은 이상적으로는 혈소판이 없으며, 그렇지 않으면 응고는 환자의 샘플내에 함유된 전구응고제 인지질에 절대적으로 의존하지 않을 것이다.
RVVT 및 다른 응고 분석에서, 기질 혈장은 대개 고속 원심분리 및/또는 여과에 의해 준비된다. 이 과정의 주된 단점은 기질 혈장으로부터 전구응고제 인지질의 고갈을 조절하기 어렵다는 것이다. 신선한 혈장이 필수적이며, 이것은 종종 얻기에 불편하다. 일단 혈장이 동결되면, 그 안에 함유된 혈소판이 활성화되며, 전구응고제 인지질을 방출한다. 따라서, 환자의 샘플에서 전구응고제 인지질의 검출을 위한 다른 응고 분석 및 RVVT에 의해 제공되는 민감성, 및 이들 분석의 특이성을 조절하는 능력은 제한된다. 추가의 단점은 이들 과정이 중성 부력을 가질 수 있거나, 여과되기에 너무 작을 수 있는 일부 세포 미세 입자를 제거하지 않는다는 것이다.
전구응고제 인지질 결정을 위한 현재 방법들의 다른 단점은 항체와 같은 응고 억제자에 대한 그들의 민감성이다. 이들 항체는 자가면역 질병, 예, "항인지질 신드롬"에서 자주 발생하며, 인지질-함유 시약을 이용하는 대부분의 응고 시험의 연장을 야기하며 따라서 전구응고제 인지질을 위한 현재 시험에서 잘못된 음성 결과를 제공한다.
발명의 개요
혈전 에피소드의 발병에서 전구응고제 인지질의 역할 및 혈소판 또는 세포 활성화의 마커로서 그들의 잠재성의 관점에서, 샘플내의 전구응고제 인지질의 존재 및 양을 검출하기 위해 개량된 방법이 필요하다.
따라서, 본 발명의 제1 양태에 따르면, (i) 기질 혈장의 응고능을 적어도 감소시키기에 충분한 전구응고제 인지질을 없앴거나 또는 실질적으로 없앤 기질 혈장과 샘플의 혼합물을 형성하는 단계로서, 여기서 상기 기질 혈장은 포스포리파제 처리에 의해 전구응고제 인지질을 없앴거나 또는 실질적으로 없앤 것인 단계; (ii) 전구응고제 인지질이 혼합물의 속도 제한 성분인 조건에서 혈장의 응고를 활성화시키기 위한 시약과 혼합물을 접촉시키는 단계; 및 (iii) 혼합물의 응고 시간을 측정하는 단계의 순서로 실시되는 단계 (i) 내지 (iii)을 포함하는, 샘플내의 전구응고제 인지질의 양을 결정하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제2 양태에 따르면, (i) 기질 혈장의 응고능을 적어도 감소시키기에 충분한 전구응고제 인지질을 없앴거나 또는 실질적으로 없앤 기질 혈장과 샘플의 혼합물을 형성하는 단계; (ii) 전구응고제 인지질이 혼합물을 응고시키도록 하는 조건에서 혈장의 응고를 활성화시키기 위한 시약과 혼합물을 접촉시키는 단계; 및 (iii) 혼합물의 응고 시간을 측정하는 단계의 순서로 실시되는 단계 (i) 내지 (iii)을 포함하는, 샘플내의 활성화된 혈소판 및 세포 유래 미세 입자의 양을 결정하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제3 양태에 따르면, (i) 기질 혈장의 응고능을 적어도 감소시키기에 충분한 전구응고제 인지질을 없앴거나 또는 실질적으로 없앤 기질 혈장과 샘플의 혼합물을 형성하는 단계; (ii) 전구응고제 인지질이 혼합물을 응고시키도록 하는 조건에서 혈장의 응고를 활성화시키기 위한 시약과 혼합물을 접촉시키는 단계; 및 (iii) 혼합물의 응고 시간을 측정하는 단계의 순서로 실시되는 단계 (i) 내지 (iii)을 포함하는, 환자가 최근에 혈전증 에피소드를 겪었는지를 평가하는 방법이 제공된다.
예를 들어, 혈전증 에피소드는 심부정맥 혈전증, 색전증 또는 경색일 수 있다. "최근"이란 혈전증 사건에서 유래된 전구응고제 인지질이 순환계에서 검출될 수 있는 시간 한계 이내를 의미한다. 추정치는 추가의 혈소판 활성화가 일어나지 않는다면 그러한 사건으로부터 최대 12시간일 것이다.
본 발명의 제4 양태에 따르면, 기질 혈장의 응고능을 적어도 감소시키기에 충분한 전구응고제 인지질을 분해하기 위한 포스포리파제로 기질 혈장을 처리하는 것을 포함하는, 샘플내의 전구응고제 인지질의 수준을 결정하는데 사용하기 위한 기질 혈장을 생성하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제5 양태에 따르면, 상기 제4 방법에 의해 생성된 기질 혈장이 제공된다. 이것은 미지의 양의 전구응고제 인지질만을 함유하는 시험 혈장을 포스포리파제와 항온 처리하고, 그러한 항온 처리 전 및 후의 인지질-민감성 시험의 결과를 비교하는 개념을 포함한다. 시험의 상당한 지연은 인지질 없는 기질 혈장을 첨가할 필요 없이 전구응고제 인지질이 존재하였음을 확인한다.
본 발명의 제6 양태에 따르면, (i) 기질 혈장의 응고능을 적어도 감소시키기에 충분한 인지질을 분해하기 위한 포스포리파제로 처리된 기질 혈장; (ii) 인지질-의존 방식으로 혈장의 응고를 활성화시키기 위한 시약; 및 (iii) 공지된 수준의 전구응고제 인지질을 함유하는 기준 제제를 포함하는, 샘플내의 전구응고제 인지질의 수준을 결정하기 위한 키트가 제공된다.
공지된 수준의 전구응고제 인지질을 함유하는 기준 제제는 기준 그래프를 구성하기 위한 보정 제제로서 이용될 수 있다.
발명의 개시
본 발명은 상기에서 확인한 단점을 해결하고자 하며, 일구체예에서는 샘플이 본 방법의 보다 낮은 민감성 한계를 넘는 검출 가능한 전구응고제 인지질을 함유하는지를 결정하기 위한 방법을 제공하며, 제2 구체예에서는 얼마나 많은지를 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 인지질-의존성 응고 시험에서 기질 혈장의 응고능을 적어도 감소시키기에 충분한 전구응고제 인지질을 없앴거나 또는 실질적으로 없앤 기질 혈장과 샘플의 혼합물을 형성하는 것을 포함한다. 기질 혈장은 포스포리파제를 이용한 처리에 의해 전구응고제 인지질을 없앴거나 또는 실질적으로 없앨 수 있다.
인지질-의존성 응고 시험은 러셀 살모사 독액 또는 그 독액으로부터의 인자 X 활성자 또는 슈도나자 텍스티리스(Pseudonaja Textilis) 독액으로부터의 인지질 의존성 프로트롬빈 활성자 또는 더욱 바람직하게는 인간, 동물 또는 재조합 기원의 인자 Xa에 의해 개시되는 것일 수 있다.
혈장은 인간 혈장 또는 비인간 혈장일 수 있으며, 바람직하게는 비인간 혈장, 그리고 더욱 바람직하게는 동물 혈장이다.
혈장은 예를 들어, 혈장내의 인지질을 분해하는 효소로 처리함으로써 전구응고제 인지질을 없앴거나 또는 실질적으로 없앨 수 있다.
예를 들어, 말 혈장의 인자 Xa 활성화된 응고 시간을 50 초에서 120 초로 연장시키기 위해서는 2 x 10-5 % 나자 니그리콜리스(Naja nigricollis) 독액과 37℃에서 1 시간 항온 처리하는 것이 필요하다. 다양한 혈장 전처리 프로토콜의 상세 사항은 하기 실시예 1에 나타낸다. 이어서 혼합물을 전구응고제 인지질의 농도가 응고 시간에 영향을 미치는 조건에서 혈장의 응고를 활성화시키기 위한 시약과 접촉시킨다. 샘플이 전구응고제 인지질을 포함하는지 여부에 대한 결정은 혼합물의 응고가 언제 발생하는 지를 결정함에 의해 이루어진다.
여기서 개시된 대로, 본 발명자들은 샘플내의 전구응고제 인지질을 검출하기 위한 응고 시험, 바람직하게는 인자 Xa-계 시험의 민감성이 기질 혈장으로서 전구응고제 인지질이 포스포리파제를 이용한 처리에 의해 분해된 조성물을 이용함으로써 개선됨을 발견하였다. 보다 구체적으로, 포스포리파제로 처리된 기질 혈장을 포함하는 혼합물은 미처리 혈소판 부족 혈장 또는 정상 처리된 원심분리 혈장을 포함하는 혼합물의 응고 시간에 비하여 증가된 응고 시간을 갖는 것으로 관찰되었다.(실시예 2). 동일한 양의 시험 혈장 및 이에 따른 동일한 양의 첨가된 전구응고제 인지질이 모든 혼합물에 제공되므로, 미처리 및 원심분리 기질 혈장을 포함하는 혼합물에서 응고 시간 감소는 기질 혈장과 샘플 둘다로부터의 전구응고제 인지질의 검출에 의해 야기되었음이 명백하다. 응고 시간 증가를 가짐에 있어서, 처리된 기질 혈장을 포함하는 혼합물은 전구응고제 인지질만이 혼합물에 기여하였으며, 따라서 분석에서 검출되는 것이 샘플에서 유래한 것이므로 민감성 개선을 갖는다.
많은 효소들이 일반적으로 혈장에 첨가될 때 활성을 가질 수 없으므로, 상기 결과는 놀랍다. 이것은 혈장이 효소 활성을 방지할 수 있는 이질성 분자의 복잡한 혼합물이기 때문이다. 예를 들어, 혈장은 아포지질단백질과 같은 인지질, 아넥신 및 베타-2-당단백질 1에 강하게 결합하는 단백질을 함유하며, 이들은 포스포리파제를 위한 기질의 이용성을 방해할 수도 있다. 추가로, 포스포리파제는 대개 그들의 효소 활성에 대해 칼슘을 필요로 하며 이것은 혈액 응고 시험을 위해 수집된 혈장에서 일반적으로 사용되는 시트레이트 응고방지제에 의해 크게 감소된다. 추가로, 혈장은 또한 특이적 효소의 활성을 억제할 수 있는 억제자 분자를 포함한다. 예를 들어, 트립신에 결합하여 억제하는 안티트립신, 트롬빈을 억제하는 안티트롬빈 및 플라스민 활성을 억제하는 안티플라스민. 아마도 인간 혈장에서 대부분의 포스포리파제의 주요 억제자는 아넥신 V이다.
일반적으로 기질 혈장은 포스포리파제로 처리된 것이다. 그러한 포스포리파제의 예는 염기성 포스포리파제 A2이다. 포스포리파제는 예를 들어 재조합 DNA 기법에 의해 합성적으로 생성되거나, 또는 유기체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 포스포리파제는 뱀 독액으로부터 유래될 수 있다. 여기서 예시된 대로, 나자 모삼비카(Naja mossambica) 및 엔 니그리콜리스의 독액으로부터 유래된 포스포리파제는 기질 혈장을 처리하는데 특히 유용하다. 유용한 다른 타입의 독액은 아그키스트로 돈 할리스(Agkistrodon halys), 비페라(Vipera) 종, 특히 베루스(Berus) 및 루셀리(Russelli), 크로탈루스 두리서스(Crotalus durissus), 엔히드리나 쉬스토사(Enhysrina schistosa), 옥시루아누스 스쿠텔라투스(Oxyuranus scutellatus) 및 아피스 메리페라(Apis melifera)로부터 유래된다. 혈장에서 이들을 효과적으로 만드는 독액 포스포리파제의 주요 특징은 아마도 높은 등전 pH에 의해 나타난 대로 그들의 염기성 특성이다. 효과적인 독액-유래 포스포리파제의 대부분은 구조적 상동성을 공유한다.
기질 혈장을 처리하는데 사용하기 위한 포스포리파제를 제공할 수 있는 다른 유기체는 스트렙토마이세스 비올라세오루버(Streptomyces violaceoruber), 비브리오(Vibrio) 종, 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 포함한다.
포스파티딜 세린과 같은 음이온성 인지질이 혈전증에서 중요하므로, 일반적으로 기질 혈장에서 전구응고제 인지질을 분해하는 효소는 혈장내의 포스파티딜 세린을 분해할 수 있는 것이어야 한다. 전술한 대로, 그렇게 처리된 기질 혈장의 사용은 RVVT 또는 인자 Xa-계 시험과 같은 전구응고제 인지질의 검출을 위한 응고 분석에서 포스파티딜 세린의 검출을 위한 특이성을 개선한다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 기질 혈장은 그 안의 모든 인지질을 분해하도록 처리될 필요는 없음을 이해해야 한다. 그러나, 기질 혈장은 일반적으로 응고의 전구응고제 인지질-의존성 활성자, 예를 들어 러셀의 살모사 독액에 의해 활성화될 때, 그것의 응고능이 효소에 의해 기질 혈장내의 전구응고제 인지질의 분해에 의해 적어도 감소되도록 처리된다. 일반적으로, 그러한 시약에 의해 활성화될 때 기질 혈장의 응고능은 기질 혈장내의 전구응고제 인지질, 주로 인지질의 포스파티딜 세린 성분의 실질적으로 모두가 효소에 의해 분해될 때 감소된다. 기질 혈장을 전체 엔 니그리콜리스 독액(실질적으로 정제된 효소를 덜 함유함) 1 x 10-5%로 약 37℃에서 약 1 시간 동안 처리하는 것은 효소에 의해 혈소판 부족 기질 혈장내의 전구응고제 인지질의 실질적인 전부를 분해하기에 충분하다. 개별 혈장을 고갈시키기 위한 실제 조건은 그들의 자유 전구응고제 인지질의 초기 함량에 강하게 의존하며, 이것은 다시 혈소판 또는 다른 세포 분해물에 의한 오염 정도에 의존한다(실시예 1 참고). 따라서, 고농도의 혈소판을 함유하는 혈장은 인지질이 적은 것보다 더 긴 항온 처리 시간 또는 더 높은 농도의 포스포리파제를 필요로 한다. 이미 인지질이 적은 혈장으로 시작하는 것이 바람직하다. 이 포스포리파제 처리는 대부분의 혈소판 부족 혈장내의 전체 0.1% 인지질의 약 0.001%만을 분해한다. 일반적으로, 자유 포스파티딜 세린:전체 인지질의 비율은 약 1:100,000이다. 인자 Xa-활성화된 응고 시간(이하에서 "XACT")과 같은 인지질-민감성 시험은 환자 혈장에서 100-1000 ng/ml을 검출한다. 더 높은 농도의 포스포리파제에서 더 짧은 항온 처리 시간을 이용할 수 있으며, 더 낮은 농도의 포스포리파제에서 더 긴 항온 처리 시간이 필요함을 이해할 것이다. 따라서, 정상 돼지 혈장내의 엔 니그리콜리스 독액(NNV) 400 ng/ml은 인자 X 활성화된 응고 시간을 48 초에서 100 초로 연장시키기 위해 37℃에서 40 분을 필요로 하는 한편, 200 ng/ml NNV는 유사한 100 초 최적 XACT 결과를 이루는데 90 분을 필요로 한다(상세 사항을 위해서는 실시예 1 참고). 본 발명의 방법이 기질 혈장내의 모든 전구응고제 인지질이 효소를 이용한 처리에 의해 분해될 때 전구응고제 인지질에 대해 가장 민감할 것임이 이해될 것이다.
본 발명에서 유용한 독액의 활성이 특성상 진행성이므로, 인지질 수준이 적절히 고갈되면 그들의 혈장과의 상호작용을 중지시키는 것이 바람직하다. 이것은 이용되는 독액에 대해 형성된 희석 항혈청 및 항체로 이루어질 수 있다. 이용되는 특정 부류의 독액, 예, 코브라의 독액에 대한 시판되는 항독액은 0.01 내지 1%의 농도에서 효과적이다.
기질 혈장은 환자의 샘플이 결핍될 수 있는 인자 또는 인자들을 교정하는 임의 조성물일 수 있다. 예를 들어, 환자의 샘플이 인자 V가 결핍된 경우, 기질 혈장은 과다한 인자 V를 함유하여 환자의 혈장 샘플의 응고에 영향을 줄 수 있을 것이다. 기질 혈장의 다른 예는 혼합된 샘플내의 임의의 결함을 보상하기에 충분한 기능적 수준으로 인자 XII, 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐, 인자 XI, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 V, 프로트롬빈, 및 피브리노겐으로 구성된 군으로부터 선택되는 모든 인자를 함유하는 것이다. 그러한 기질 혈장은 카올린 또는 표면 활성화 응고 시간 시험에서 이용될 것이다. 조직 인자를 이용하는 시험이 활성자로서 이용될 때 기질 혈장은 동일한 목적을 위해 인자 VII, X, V, II 및 I(피브리노겐)을 함유해야만 한다.
러셀의 살모사 독액 시험과 같은 시험이 이용될 때, 이것은 응고 캐스캐이드에서 응고 인자 X 및 그 아래, 즉 인자 X, 인자 V, 인자 II 및 피브리노겐만이 존재할 것을 필요로 한다. 인자 X 위의 인자들은 정상 결과를 위해서는 존재할 필요가 없다. 만일 인자 Xa-계 시험이 이용되면, 정상 결과를 위해 인자 X조차도 그 시스템에서 필요하지 않으며, 단지 인자 V, II 및 I(피브리노겐)만이 필요하다. 코브라과 독액으로부터의 인지질-의존성 프로트롬빈 활성자는 응고를 유도하기 위하여 인자 II(프로트롬빈) 위의 인자들을 요구하지 않는다. 따라서, 만일 타이판 독액-계 시험이 이용된다면, 프로트롬빈과 피브리노겐만이 정상 결과를 위해 제공될 필요가 있을 것이다. 피브리노겐 또는 인자 I은 응고 종말점을 위한 마커를 제공하기 위해서만 필요하다. 트롬빈 생성의 최대 속도는 트롬빈에 의해, 분광학적으로 검출될 수 있는 착색된 말단 생성물로 전환되는 발색성 트리펩티드 기질을 이용하여 검출될 수 있다.
일반적으로 기질 혈장은 구연산 첨가 혈액(citrated blood)으로부터 유래된다. 적합한 혈장은 인간 혈장 샘플의 응고를 촉진하는데 효과적인 것으로 알려진 것들이며, 이는 이들이 시험 샘플에 가변적으로 존재하는 인자를 제공하기 때문이다. 그러한 혈장의 예는 대부분의 포유류 혈장을 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 것으로 여기서 예시되는 것들은 돼지, 말, 소, 양, 염소, 낙타, 원숭이, 개, 고양이, 여우, 코끼리, 라마, 토끼, 밍크, 라쿤, 캥거루, 인간 및 이의 혼합으로부터 유래된 혈장을 포함한다.
기질 혈장을 제공하기 위한 혈장은 전구응고제 인지질의 존재 및/또는 양에 대해 시험중인 개체로부터 유래될 수 있다. 이 경우에, 혈장 시료는 공지된 양의 포스포리파제(예, 100 ng/ml의 엔 니그리콜리스 독액)와 항온 처리 전 및 후 인자 Xa 활성화된 응고 시간으로 시험될 수 있다. 첫번째 및 두번째 결과 사이의 차이는 얼마나 많은 전구응고제 인지질이 포스포리파제 처리에 의해 파괴되었는지에 비례한다.
그러나, 베타 2 당단백질 1 및 프로트롬빈과 같은 전구응고제 인지질에 결합하는 인간 단백질에 대해 혈청학적 활성을 갖는 항체가 일부 인간에서 생성되므로(예, 루푸스 억제자 항체), 본 발명의 방법에서 기질 혈장으로서 인간 혈장의 사용은 그러한 억제자에 대한 원치않는 민감성을 가지고 실시된다. 결과적으로 그러한 시료는 이들 항체의 존재에 대해 분석되어야 한다. 동물 혈장이 기질 혈장을 제공하기 위해 이용되는 경우, 본 발명의 잇점은 본 방법이 인간 혈장에 기초한 방법보다 인간 응고 인자 또는 루푸스 보조인자에 대해 형성된 항체에 훨씬 덜 민감하다는 것이다. 그러한 항체는 기존의 응고 시험 방법으로부터 혼란과 비신뢰성을 야기하면서 환자들 사이에서 예상치 않게 발생할 수 있다.
시험 시료가 응고성을 변화시켰을 때, 특히 시험될 개인이 응고방지제로 투여된 경우, 응고방지제의 응고 억제능을 조절하기 위하여 기질 혈장이 적어도 하나의 제제를 추가로 포함하는 것이 필요하다. 가장 유용할 것 같은 제제는 헤파린의 응고 억제능을 조절할 수 있는 것들이며, 이는 헤파린이 응고방지제로 널리 이용되기 때문이다. 이들 제제는 프로타민 설페이트 및 폴리브렌 또는 프로타민 설페이트를 포함한다. 그러나, 다른 제제는 히루딘 및 그 유사체에 대한 항체 또는 다른 응고방지제 길항제를 포함한다.
기질 혈장은 일반적으로 액체 또는 재구성된 형태로 이용될 것이다. 그러나, "포인트 오브 케어(point of care)" 장치에 사용하기 위하여 이것은 혈액 또는 혈장 자체의 적용된 시료에 의해 재구성된 건조 조성물의 일부로 존재할 수 있다.
시험에서 혼합물의 응고를 활성화시키기 위한 시료는 전구응고제 인지질-의존 방식으로 후속적으로 진행하도록 응고를 활성화시켜야 한다. 그러한 시약의 예는 인자 X를 인자 Xa로 전환할 수 있거나, 또는 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환할 수 있는 것들이다. 따라서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 시약은 러셀의 살모사 독액 또는 살모사과의 관련 독액으로부터의 인자 X 활성자 또는 오스트레일리아 코브라 슈도나자 또는 옥시우라누스 스쿠텔라투스 패밀리와 같은 코브라과 독액에서 유래된 인자 Xa 또는 다른 인지질-의존성 프로트롬빈 활성자일 수 있다. 인간 외의 포유류로부터 유래된 시약이 특히 유용하며, 예를 들어 소 기원의 인자 Xa가 있다(실시예 4 참고). 접촉 활성자, 조직 인자, 인자 IXa, 인자 XIa 및 인자 VIIa와 같은 응고 기작을 상승시키는 작용을 하는 시약을 이용할 수 있으나, 이들은 이 시스템을 인지질에 대해 덜 특이적이도록 하며, 환자 혈장 변수에 의한 간섭에 보다 반응성이도록 한다.
응고 활성자는 또한 신규 DNA 서열에 기초한 재조합 전구체로부터의 효소일 수 있다. 그러한 전구응고제는 그러한 항체에 의해 인식되는 일반적인 에피토프의 고갈에 의해 항체를 억제하는 것에 비민감성이 된다. 이들 시약은 정상적으로는 액체 형태로 사용될 것이나 또한 "포인트 오브 케어" 장치에서의 적용을 위한 건조 형태로 제공될 수 있으며, 이 경우 이들은 혈장의 적용 시료 또는 혈액 시료에 의해 재구성될 것이다.
본 발명의 방법이 인간 환자로부터 유래된 혈장 또는 혈액 샘플과 관련하여 널리 적용될 것으로 예상되는 한편, 상기 방법이 일정 범위의 동물에서 전구응고제 인지질을 검출하기 위해 이용될 수 있다. 이 구체예는 동물 혈액을 가진 물질의 표면의 생물 융화성 및 실험 약물의 효과의 생체내 또는 생체외 평가를 위한 동물 실험 연구에 유용할 것이다. 전구응고제 인지질을 위해 시험될 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 임의의 다른 유체일 수 있다. 시트레이트 또는 EDTA와 같은 칼슘-결합 제제에 의해 응고방지되면, 그러한 제제의 수준은 다른 응고 시험에 이용되는 것과 유사해야 할 것이다.
전술한 본 발명의 제1 양태에서, 샘플내의 전구응고제 인지질의 양을 결정하는 방법이 제공된다.
공지된 양의 전구응고제 인지질을 함유하는 기준 혈장과의 비교에 의해 측정이 이루어지며, 미지의 값은 적절하게 구성된 보정 곡선으로부터 내삽될 수 있다.
전구응고제 인지질은 일반적으로 활성화된 혈소판 및 혈소판 미세 입자에 위치하므로, 본 발명의 제1 양태에 따라 혈소판 풍부 혈장내의 전구응고제 인지질의 양을 측정하는 것은 샘플내의 활성화된 혈소판 및 혈소판 미세 입자의 양을 정량하는 것을 가능하게 한다.
따라서, 전술한 제2 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태에 따른 방법인, 샘플내의 활성화된 혈소판 및 세포 유래 미세 입자의 양을 결정하는 방법을 제공한다.
전술한 대로, 비정상 혈소판 또는 세포 활성화는 혈전증 에피소드, 색전증, 조직 외상, 면역 과정(보체 활성화 포함), 패혈증, 파종성 혈관내 응고증 또는 경색으로부터 생길 수 있다. 극한 경우 또는 면역학적 과정으로 인해 혈소판 감소증을 일으킬 수도 있다. 개인이 혈소판 활성화에 관련된 임상적 상태, 예를 들어, 혈전증, 발작 또는 심근경색을 갖는지를 결정할 수 있음은 유익할 것이다. 본 발명자들은 전구응고제 인지질의 양을 결정함으로써, 활성화된 혈소판 또는 혈소판 미세 입자의 양을 결정하는 방법이 이들 상태를 가진 개체의 진단을 허용할 것임을 인식한다.
따라서 전술한 제3 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제2 양태에 따른 방법인, 환자가 심부정맥 혈전증, 색전증, 경색과 같은 혈전증 에피소드를 최근에 겪었는지 여부를 평가하는 방법을 제공한다.
전술한 제4 양태에서, 본 발명은 개체가 전구응고제 인지질을 포함하는지를 결정하는데 이용하기 위한 기질 혈장을 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 기질 혈장의 응고능을 적어도 감소시키기에 충분한 전구응고제 인지질을 분해하기 위한 효소로 기질 혈장을 처리하는 것을 포함한다.
본 발명의 제4 양태의 방법에서 효소를 사용하면, 한정된 양의 전구응고제 인지질을 포함하는 기질 혈장 패널을 제공할 수 있다. 이것은 원하는 양의 전구응고제 인지질을 포함하는 기질 혈장을 사용을 위해 패널로부터 선택함으로써 본 발명의 제1 및 제2 양태의 방법의 민감성을 조절할 수 있도록 한다. 이 옵션은 특정 기구를 위한 합리적이거나 최적화된 기준 응고 시간을 제공한다. 뱀 독액은 매우 낮은 농도로 사용될 수 있으며, 그들의 활성이 예를 들어, 포스포리파제에 대해 효과적인 항혈청 및 항체의 사용에 의해 후속적으로 조절될 수 있으므로, 본 발명의 제4 양태에 사용하기 위한 효소를 제공하는데 특히 유용하다. 그러나, 재조합 DNA 기법으로부터 또는 다른 유기체 또는 억제 화합물로부터 유래된 포스포리파제 효소를 조절할 수 있는 제제가 이용될 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 제4 양태의 방법의 추가 단계는 효소의 전구응고제 인지질 분해능을 조절하기 위한 1 이상의 제제를 기질 혈장과 접촉시키는 것을 포함한다.
또한, 다른 구체예에서, 제4 양태의 방법은 헤파린과 같은 치료 응고방지제의 응고 억제능을 조절하기 위한 폴리브렌 또는 프로타민 설페이트와 같은 1 이상의 제제를 기질 혈장과 혼합하는 추가의 단계를 포함한다.
전술한 제5 양태에서, 본 발명은 제4 양태의 방법에 의해 생성된 기질 혈장을 제공한다.
전술한 제6 양태에서, 본 발명은 (i) 기질 혈장의 응고능을 적어도 감소시키기에 충분한 인지질을 분해하기 위한 효소로 처리된 기질 혈장, (ii) 인지질-의존 방식으로 혈장의 응고를 활성화시키기 위한 시약, 및 (iii) 공지된 수준의 전구응고제 인지질을 함유하는 기준 제제를 포함하며, 공지된 수준의 전구응고제 인지질을 함유하는 기준 제제가 기준 그래프를 구성하기 위한 보정 제제로 이용될 수 있는, 개체가 전구응고제 인지질을 포함하는지 여부를 결정하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명을 추가로 도면을 참고로 설명한다.
도 1은 실시예 1에 개시된 바와 같은 엔 니그리콜리스 독액이 있거나 또는 없이 다양한 종으로부터의 정상 혈장을 항온 처리하는 효과를 나타낸다.
도 2는 혈소판 민감성에 대한 엔 니그리콜리스 독액을 이용한 전처리의 효과 를 나타낸다.
도 3은 혈소판 인지질을 위한 다양한 시험의 민감성을 나타낸다.
본 발명을 하기 실시예를 참조로 하여 설명하지만, 이것이 본 발명의 범위를 제한하하는 것으로 이해해서는 않된다.
실시예
1
미정제 동물 혈장에 대한 엔
니그리콜리스
독액의 진행성 효과
목적: 다양한 종으로부터의 혈소판-함유 혈장으로부터의 전구응고제 인지질을 감소시키고, 따라서 전구응고제 인지질을 위한 응고 시험에서 이들 기질 혈장의 민감성을 개선하는데 있어서 일반적인 독액 포스포리파제의 진행적 및 선택적 효과를 입증하는 것.
방법: 인간 지원자로부터 깨끗한 정맥주사에 의해, 새로 주사한 말(말)로부터의 심장 천공에 의해, 도살장의 돼지로부터 그리고 유사하게 소(소과)로부터의 동맥 출혈에 의해 3.2% 트리소듐 시트레이트 응고방지제의 최종 부피의 1/10내로 혈액 샘플을 수집하였다. 샘플을 20 분 동안 3000 rpm에서 원심분리하고 꽤 가변적인 혈소판 계수(인간 샘플을 위해서는 약 5 x 109 /l, 그러나 동물 혈장에 대해서는 측정안됨)를 가진 상등액 혈소판 부족 혈장을 -30℃에서 동결시켰다.
이어서 엔 니그리콜리스 독액(NNV) 처리 없이 또는 도 1에 나타난 농도의 엔 니그리콜리스 독액과 혼합한 후 37℃에서 항온 처리하였다. 시료를 1 또는 2 시간 간격으로 제거하여 XACT 시험에 대하여 인자 Xa/칼슘 시약으로 시험하였다.
결과: 이들을 도 1에 나타낸다. NNV 첨가없는 모든 혈장에서의 XACT 결과는 합리적으로 안정하다. 하지만 NNV가 있으면 XACT 결과는 항온 처리 기간에 걸쳐 지연되었다.
소 및 돼지 혈장은 아마도 과다한 자유 전구응고제 인지질로 인해 가장 짧은 초기 결과를 제공하지만, 이들은 둘다 4 x 10-5% 및 8 x 10-5% NNV와 2 시간 동안 항온 처리 후 배가되었다. 말 혈장에서의 XACT는 2 x 10-5 % NNV와 1 시간 후 50 초에서 120 초로 지연되었다.
코멘트: NNV와의 항온 처리로 인한 XACT 결과에서 이들 증가는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT), 프로트롬빈 시간(PT) 또는 다른 응고 시험에서 상당한 변화를 수반하지 않았다. 이것은 NNV의 주요 효과가 이들 응고 시험에 관련된 응고 인자의 분해에 기인하지 않으며 오히려 이들 시험이 민감하지 않은 인지질의 손실로 인한 것임을 확인한다.
실시예
2
엔
니그리콜리스
독액을 이용한 인간 혈장의 전처리
목적: 미량의 엔 니그리콜리스 독액으로 정상 인간 혈장을 처리하면 원심분리보다 인자 Xa-계 응고 시험에서 혈소판에 대해 더 나은 민감성을 갖는 생성물(기질 혈장)이 생성됨을 보여줌.
방법: 혈소판이 없는 정상 인간 혈장내에 다양한 수준의 동결-해동된 정상 혈소판 풍부 혈장(처음에는 250 x 109 혈소판/l를 갖는 PRP)을 함유하는 시험 혈장을 준비하였다. 혈소판이 없는 혈장(PFP)은 고속 원심분리와 0.22 미크론 시린지 필터를 통한 여과에 의해 얻어졌다.
이들 시험 혈장을 인자 Xa-계 응고 시험에서 시험하기 전에 동일한 부피의 3가지의 상이한 기질 혈장과 혼합하였다. 3가지 상이한 기질 혈장은 하기와 같았다:
1. 정상 혈소판 "부족" 인간 혈장(PPP).
2. 15,000 g에서 10 분간 원심분리된 동일한 PPP.
3. 37℃에서 20 분 동안 1 x 10-5% 엔 니그리콜리스 독액으로 처리된 동일한 PPP(이하에서는 "NNV 처리"라 함).
인자 Xa 시약은 0.015 M 칼슘 클로라이드, 0.1 M 소듐 클로라이드, 0.02 M HEPES pH 7.0 완충액내에 0.001 U/ml 소 인자 Xa를 함유하였으며 37℃의 ST4(프랑스, 파리에 소재하는 디아그노스티카 스타고) 응고 기계에서 0.1 ml 시약과 0.05 ml 혈장 혼합물의 일정 분액에 이용하였다.
결과: 표 1은 두 가지 상이한 방법에 의해 전처리된 기질 수집된 정상 혈장(PNP)와 다양한 혈소판 카운트를 함유한 시험 혈장의 1:1 혼합물에서 초로 나타낸 인자 Xa 응고 시간 결과를 나타낸다.
| 시험 혈장 기질 혈장 | |||
| 혈소판 계수(109/l) | 초기 PNP | 원심분리된 PNP | NNV 처리 후 PNP |
| 25 | 48.2 | 45.9 | 50.8 |
| 5 | 58.9 | 66.2 | 73.9 |
| 1 | 64.1 | 85.7 | 96.4 |
| <0.2(PFP) | 67.7 | 95.4 | 117 |
코멘트: 이들 실험은 NNV 처리가 고속 원심분리에 의해 얻어진 것에 비해 응고 시간 결과에 있어서 더 큰 증가를 이루었음을 보여준다. 이것은 혈소판에 대한 민감성의 개선을 야기하였다.
실시예
3
혈소판 민감성에 대한 엔
니그리콜리스
독액을 이용한 전처리의 효과
목적: 소 혈장에 기초한 러셀 살모사 독액 응고 시험 시스템의 민감성을 증가시키는데 있어서 엔 니그리콜리스 독액의 효과를 입증함.
방법: 동결 해동되거나 그렇지 않으면 정상 인간 혈소판 풍부 혈장의 연속 희석물(초기 혈소판 계수 250 x 109/l)을 정상 소 혈장에서 만들고 또한 5 x 10-5% 엔 니그리콜리스 독액으로 20℃에서 50 분 동안 전처리된 소 혈장에서 만들었다. 이들 혈장 샘플을 동일 부피의 다양한 러셀의 살모사 독액 및 칼슘-함유 시약과 혼합하고 ACL300 응고-타이밍 기구(이태리, 밀란에 소재한 인스트루멘테이션 래보래토리 에스피에이)에서 트롬빈 시간 모드로(TT 모드는 동 부피의 혈장 및 시약을 이용함) 37℃에서의 응고 종말점까지 시간을 재었다. 0.025 M 칼슘 클로라이드를 가진 시약에서 러셀의 살모사 독액 농도는 10-5%에서 10-6%로 변했으며 이전 시약은 또한 2 x 10-4% 엔 니그리콜리스 독액의 첨가 후 시험되었다.
결과: 얻어진 결과는 도 2에 요약된다. 1 x 10-5 % RVV를 이용하는 시험 시스템의 혈소판에 대한 민감성이 꽤 낮았으며, 1 x 109/l 미만 혈소판 수준에서 평평해졌다. RVV 응고 시간은 RVV 농도를 10-6%로 10 배 감소시킴으로써 지연되었으나, 반응성 곡선의 구배에 의해 나타난 혈소판에 대한 민감성은 개선되지 않았다. RVV 시약(RVV=10-5%)에 20 x 10-5% NNV를 포함시키면 민감성을 약간 증가시켰다.
혈소판에 대한 최고 민감성은 소 혈장이 혈소판 농축물을 희석시키기 위해 이용되기 전에 5 x 10-5% NNV로 예비 항온 처리시켰을 때 관찰되었다. 이 경우에 0.1과 1.0 사이의 혈소판 계수는 여전히 정확하게 정량될 수 있다.
실시예
4
다양한
응고
활성자의 비교
목적: 전구응고제 인지질을 분석하기 위한 시험 시스템에서 4가지 상이한 인지질-의존성 응고 활성자의 민감성 비교함.
방법: 혈소판 풍부 혈장의 희석물을 하기에 나타난 대로 혈소판이 없는 정상 인간 혈장에서 제조하였다. 이들 샘플을 4가지 상이한 응고 시험 시스템으로 시험하였다. 모든 시험은 ST4에서 37℃에서 실시하였다. 시약과 방법은 하기와 같았다.
1. 카올린 응고 시험(KCT)은 물중의 1% 카올린 현탁액 0.05 ml로 3 분 동안 예비 항온 처리되고, 이이서 0.025 M 칼슘 클로라이드 0.05 ml로 재칼슘화된 혈장 샘플 0.05 ml을 이용하여 실시하였다. 칼슘 클로라이드의 첨가에서부터 응고가 발생할 때까지의 시간은 ST4(스타고) 응고 기계에서 결정하였다.
2. 러셀의 살모사 독액 시험(RVV)을 0.025 M 칼슘 클로라이드중에 2 x 10-6% RVV를 함유하는 시약 0.05 ml과 0.05 ml 샘플을 혼합하고, 응고 종말점까지 시간을 재어 실시하였다.
3. 인자 Xa-계 응고 시험(FXa-CT)를 0.025 M 칼슘 클로라이드중에 0.001 U/ml 소 인자 Xa를 함유하는 시약 0.05 ml과 샘플 0.05 ml을 혼합하고 응고 종말점까지 시간을 재어 실시하였다.
4. 텍스타린(스위스 바젤에 소재하는 TM-펜타팜) 응고 시험(TX-CT)을 0.025 M 칼슘 클로라이드중에 탈지질화된 시판되는 텍스타린 시약 2 U/ml을 함유하는 시약 0.05 ml과 샘플 0.05 ml을 혼합하고 응고 종말점까지 시간을 재어 실시하였다.
결과: 얻어진 결과는 도 3에 나타난다. RVVT 및 KCT 시험은 혈소판에 대해 유사한 민감성을 나타냈다. 활성화된 인자 X(XACT)에 기초한 응고 시험은 혈소판에 대해 가장 높은 민감성을 나타냈다. 혈소판에 대해 가장 낮은 민감성을 갖는 시험은 탈지질화된 텍스타린에 기초한 것이었다. 그러나, 이것은 다른 목적을 위해 고안된 이 시판 시약으로부터 인지질이 제대로 제거되지 않았기 때문 즉 루푸스 억제자의 검출 때문일 가능성도 있다.
코멘트: 텍스타린 시약은 전구응고제를 함유하는 것으로 알려진 몇몇 오스트레일리아 코브라과 중 하나인 슈도나자 텍스틸리스의 독액에서 유래된 전형적인 인지질-의존성 프로트롬빈 활성자이다.
실시예
5
방법과 특이성 연구의 일반적인 사용
목적: 본 방법이 모든 공지의 응고 인자에서의 결함에 민감하지 않음을 입증. 또한 개별 응고 인자가 결핍된 다양한 시판 혈장에서 자유 전구응고제 인지질 검출.
방법: 특정 인자 분석에의 사용을 위해 판매되는 다양한 동결 건조 개별 응고 인자 결핍 혈장을 전구응고제 인지질을 위한 새로운 시험을 이용하여 시험하였다. 따라서, 다양한 공급자로부터의 바이알(데이드/베링, IL/베크만-카울터 및 다이아그노스티카 스타고)을 각각 물 1ml로 새로 재구성하였다. 시험은 스타고 ST4 응고 기계에서 각 인자 결핍 혈장 25 ㎕와 인자 Xa 시약 50 ㎕를 가진 NNV-처리된 기질 혈장(lot 3004) 25 ㎕를 이용하였다.
결과: 이들을 표 2에 나타낸다.
| 시험 혈장 | FXa-응고 시간(sec) |
| 동결 "혈소판-부족" 혈장 | 53.7 |
| 혈소판 "없는" 정상 혈장 | 102 |
| 프로트롬빈(FII) 결핍 | 88.8 |
| 인자 V 결핍 혈장 | 100 |
| 인자 VII 결핍 | 96.5 |
| 인자 VIII 결핍 | 70.0 |
| 인자 IX 결핍 | 71.6 |
| 인자 X 결핍 | 73.7 |
| 인자 XI 결핍 | 88.3 |
| 인자 XII 결핍 | 96.7 |
코멘트: 수집된 동결 혈소판-부족 혈장은 혈소판이 없는 정상 혈장과 비교할 때 상대적으로 짧은 FXa 응고 시간을 나타냈으며 이는 약 5%의 정상 혈소판 계수를 함유하기 때문이었다(약 10 x 109 혈소판/l).
이들 결과는 시험 샘플내의 임의의 개별 혈장 응고 인자의 전체 결핍이 FXa 시험을 지연시키지 않음을 보여준다. 또한 여기서 이용된 인자 VIII, IX 및 X 결핍 혈장은 이 시험으로 검출가능한 전구응고제 인지질의 양을 함유한다.
본 발명의 방법이 임상 실험 과학에서 광범위한 적용을 가능할 것임이 명백할 것이다.
전술한 내용은 본 발명의 단지 일부 구체예만을 개시하며 당업자에게 명백한 변형이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 만들어질 수 있다.
Claims (43)
- (i) 기질 혈장의 응고능을 적어도 감소시키기에 충분한 전구응고제 인지질을 없앴거나 또는 실질적으로 없앤 기질 혈장과 샘플의 혼합물을 형성하는 단계로서, 여기서 상기 기질 혈장은 포스포리파제 처리에 의해 전구응고제 인지질을 없앴거나 또는 실질적으로 없앤 것인 단계;(ii) 전구응고제 인지질이 혼합물의 속도 제한 성분인 조건에서 혈장의 응고를 활성화시키기 위한 시약과 혼합물을 접촉시키는 단계; 및(iii) 혼합물의 응고 시간을 측정하는 단계의 순서로 실시되는 단계 (i) 내지 (iii)을 포함하는, 샘플내의 전구응고제 인지질의 양을 결정하는 방법.
- 제1항에 있어서, 샘플이 혈액, 혈장 및 혈청으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 혈액은 응고방지된 혈액인 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 측정은 공지된 양의 전구응고제 인지질을 함유하는 기준 혈장 또는 용액과의 비교에서 이루어지고, 미지의 값은 적절하게 구성된 보정 곡선으로부터 내삽될 수 있는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 기질 혈장이 구연산 첨가 혈액에서 유래되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 기질 혈장이 돼지, 말, 소, 양, 염소, 낙타, 원숭이, 개, 고양이, 여우, 코끼리, 라마, 토끼, 밍크, 라쿤, 캥거루, 인간 및 이의 혼합으로 구성되는 척추 동물 군으로부터 선택되는 구성원으로부터 얻어지는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 기질 혈장이 비인간 공급원으로부터 얻어지는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 기질 혈장이 돼지로부터 얻어지는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 포스포리파제는 나자 모삼비카, 나자 니그리콜리스, 아그키스트로돈 할리스, 비페라 베루스, 비페라 루셀리, 크로탈루스 두리서스, 엔히드리나 쉬스토스, 옥시우라누스 스쿠텔라투스 및 아피스 멜리페라로 구성된 군으로부터 선택되는 독액으로부터 얻어지는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 포스포리파제가 스트렙토마이세스 비올라세오루버, 비브리오 종, 클로스트리듐 퍼프린젠스 또는 바실러스 세레우스로 구성된 선택군 중 하나 로부터 얻어지는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 혈장의 응고를 활성화시키기 위한 시약이 인자 Xa인 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 혈장의 응고를 활성화시키기 위한 시약이 인자 X를 인자 Xa로 전환시킬 수 있는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 시약이 러셀의 살모사 독액인 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 시약이 살모사과의 독액으로부터의 인자 X 활성자인 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 혈장의 응고를 활성화시키기 위한 시약이 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시킬 수 있는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환이 인지질-의존 방식인 것인 방법.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 시약이 코브라과 독액에서 유래된 인지질-의 존성 프로트롬빈 활성자인 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 코브라과 독액이 오스트레일리아 코브라 슈도나자 또는 옥시우라누스 스쿠텔라투스 과로부터 유래하는 것인 방법.
- (i) 기질 혈장의 응고능을 적어도 감소시키기에 충분한 전구응고제 인지질을 없앴거나 또는 실질적으로 없앤 기질 혈장과 샘플의 혼합물을 형성하는 단계;(ii) 전구응고제 인지질이 상기 혼합물을 응고시키도록 하는 조건에서 혈장의 응고를 활성화시키기 위한 시약과 혼합물을 접촉시키는 단계; 및(iii) 혼합물의 응고 시간을 측정하는 단계의 순서로 실시되는 단계 (i) 내지 (iii)을 포함하는, 샘플내의 활성화된 혈소판 및 세포 유래 미세 입자의 양을 결정하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 방법이 환자가 최근에 혈전증 에피소드를 겪었는지를 결정하는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 방법이 환자가 혈소판 활성화에 관련되는 임상적 질환을 가졌었는지를 결정하는 것인 방법.
- 제20항에 있어서, 혈전증 에피소드가 파종성 혈관내 응고증, 심부정맥 혈전 증, 색전증, 조직 외상, 패혈증 및 경색으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 기질 혈장은 포스포리파제 처리에 의해 전구응고제 인지질을 없앴거나 또는 실질적으로 없앤 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 포스포리파제는 나자 모삼비카, 나자 니그리콜리스, 아그키스트로돈 할리스, 비페라 베루스, 비페라 루셀리, 크로탈루스 두리서스, 엔히르드리나 쉬스토스, 옥시우라누스 스쿠텔라투스 및 아피스 멜리페라로 구성된 군으로부터 선택되는 독액으로부터 얻어지는 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 포스포리파제가 스트렙토마이세스 비올라세오루버, 비브리오 종, 클로스트리듐 퍼프린젠스 또는 바실러스 세레우스로 구성된 선택군 중 하나로부터 얻어지는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 혈장의 응고를 활성화시키는 시약이 인자 Xa인 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 혈장의 응고를 활성화시키기 위한 시약이 인자 X를 인자 Xa로 전환시킬 수 있는 것인 방법.
- 제27항에 있어서, 시약이 러셀의 살모사 독액인 것인 방법.
- 제27항에 있어서, 시약이 살모사과의 독액으로부터의 인자 X 활성자인 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 혈장의 응고를 활성화시키기 위한 시약이 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시킬 수 있는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환이 인지질-의존 방식인 것인 방법.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, 시약이 코브라과 독액에서 유래된 인지질-의존성 프로트롬빈 활성자인 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 코브라 독액이 오스트레일리아 코브라 슈도나자 또는 옥시우라누스 스쿠텔라투스 과로부터 유래되는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 기질 혈장이 인자 V 및 프로트롬빈으로부터 형성된 것인 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 인자 V 및 프로트롬빈은 인지질이 없는 것인 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 인자 V 및 프로트롬빈이 동물 또는 인간 기원인 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 방법의 기질 혈장이 효소의 전구응고제 인지질 분해능을 조절하기 위한 1 이상의 제제와 접촉되는 것인 방법.
- 제37항에 있어서, 치료 응고방지제의 응고 억제능을 조절하기 위한 1 이상의 제제와 기질 혈장을 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제38항에 있어서, 치료 응고방지제의 응고 억제능을 조절하기 위한 제제가 폴리브렌 또는 프로타민 설페이트인 것인 방법.
- 제19항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질 혈장이 돼지, 말, 소, 양, 염소, 낙타, 원숭이, 개, 고양이, 여우, 코끼리, 라마, 토끼, 밍크, 라쿤, 캥거루, 인간 및 이의 혼합으로 구성된 군으로부터 선택되는 구성원으로부터 얻어지는 것인 방법.
- 기질 혈장의 응고능을 적어도 감소시키기에 충분한 전구응고제 인지질을 분 해하기 위한 포스포리파제로 기질 혈장을 처리하는 것을 포함하는, 샘플내의 전구응고제 인지질의 수준을 결정하는데 사용하기 위한 기질 혈장의 생성 방법.
- 제41항의 방법에 의해 생성된 기질 혈장.
- (i) 기질 혈장의 응고능을 적어도 감소시키기에 충분한 인지질을 분해하기 위한 포스포리파제로 처리된 기질 혈장,(ii) 인지질-의존 방식으로 혈장의 응고를 활성화시키기 위한 시약, 및(iii) 공지된 수준의 전구응고제 인지질을 함유하는 기준 제제를 포함하는, 샘플내의 전구응고제 인지질의 수준을 결정하기 위한 키트.
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