DK171086B1 - Fremgangsmåde til fotometrisk bestemmelse af protein C- og/eller protein S-aktivitet - Google Patents
Fremgangsmåde til fotometrisk bestemmelse af protein C- og/eller protein S-aktivitet Download PDFInfo
- Publication number
- DK171086B1 DK171086B1 DK118187A DK118187A DK171086B1 DK 171086 B1 DK171086 B1 DK 171086B1 DK 118187 A DK118187 A DK 118187A DK 118187 A DK118187 A DK 118187A DK 171086 B1 DK171086 B1 DK 171086B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- protein
- activator
- plasma
- standard
- added
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/4609—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates from reptiles
- G01N2333/4613—Snake venom
- G01N2333/462—Snake venom from Agkistrodon sp., e.g. acutase, ACTE
- G01N2333/4626—Snake venom from Agkistrodon sp., e.g. acutase, ACTE from Agkistrodon contortrix contortrix (copperhead snake); Protac (R)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
- G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
- G01N2333/96461—Protein C (3.4.21.69)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
DK 171086 B1
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fotometrisk bestemmelse af protein C- og/eller protein S-aktivitet, især i plasma.
Protein C er et tokædet vitamin K-afhængigt glycoprotein i 5 plasma. Dets syntese foregår i leveren. Der dannes ferst et koaguleringsfysiologisk indifferent forstadium (decarboxy-pro-tein C). Carboxylering af γ-glutaminsyrerester i proteinet ved hjælp af en vitamin K-afhængig carboxylase fører til protein C. Protein C er selv et proenzym og omdannes ved hjælp af 10 thrombin til aktivereret protein C. Sidstnævnte virker gennem den proteo1yti ske inaktivering af de aktiverede koagulationsfaktorer V og VIII som et ant ikoagu1 erende middel. Den anti-koagulerende virkning af det aktivere protein C forstærkes ved hjælp af en cofaktor, protein S. Protein S er et enkædet og 15 ligeledes vitamin K-afhængigt glykoprotein i plasma. Aktivt protein C og protein S danner et ækvimolært kompleks. Formindskede protein-C- og ligeledes protein S-spejl beskrives hos patienter med leversygdomme, forbrugs-koagulopati (DIC) og efter warfar i nterapi. En medfødt mangel på protein C eller på 20 protein S fører til venøse thromboembo1 i ske risici. Protein C og ligeledes protein S spiller således en vigtig rolle såvel ved den fysiologiske hæmostase som ved mange sygdomme, især ved thrombose.
25 Ved en forsøgsfremgangsmåde, der hidtil har kunnet fås i handelen bestemmes protein C-mængden i plasma ved hjælp af enzymmærkede antistoffer. Denne fremgangsmåde har dog den ulempe, at de til bestemmelsen anvendte antistoffer også reagerer med det ovenfor omtalte decarboxy-protein C. Da decarboxyprotei-30 nets koncentration i plasma under en behandling med antikoagu-lerende midler hyppigt stiger stærkt, har denne fremgangsmåde en stor fejlkilde, som under visse omstændigheder kan føre til en falsk eller utiltrækkelig behandling.
35 Ulempen ved anvendelsen af immunologiske bestemmelsesfremgangsmåder i plasma for protein C ligger deri, at de ingen information giver om protein C-molekylets biologiske aktivi tet. Tilstedeværelsen af unormalt protein C med stærkt redu- DK 171086 B1 2 ceret biologisk aktivitet (en genetisk variant) kan ikke påvises ved sådanne fremgangsmåder.
R. B. Francis og H. J. Patch (Thromobosis Research 32, 605- 5 613, 1983) beskriver en fremgangsmåde til bestemmelse af akti veret protein C fra human plasma ved bestemmelse af den partielle thromboplast intid (PTT-forsøg). Herved aktiveres protein C, der er fraskilt fra plasma ved adsorption til bariumcitrat ved tilsætning af thrombin, og derefter inhiberes sidstnævnte 10 med et underskud af ant i thrombin III og heparin. Heparin på sin side neutraliseres med en eksakt mængde protaminsul fat, hvilken mængde skal bestemmes påny hver gang. Derefter bestemmes protein C via den partielle thromboplast intid. Indikatorreaktion er her den af thrombin bevirkede spaltning af 15 fibrinogen og dannelse af et fibrin-koage1 .
R. M. Bertina et el. (Throm. Haemostas 51, (1) 1-5, (1984)) beskriver en spektrofotometri sk fremgangsmåde til bestemmelse af protein C-aktivitet. Denne fremgangsmåde omfatter tre uaf-20 hæng i ge trin: 1. Isolering af protein C ved hjælp af en Al(OH)3-adsorpti on.
2. Aktivering af det fra plasma fraskilte protein C med thrombin såvel som efterfølgende inhibering af sidstnævnte med æk- 2 5 vimolære mængder antithrombin III og heparin. 1 Måling af den proteo1yti ske aktivitet af isoleret aktiveret protein C med et kromogent substrat (S2366=H pyro-G1u-Pro-Arg-pNA) .
30
Denne fremgangsmåde er utilfredsstillende med hensyn til specificiteten for protein C, da dette substrat også spaltes af andre koagu1 er ingsproteaser. Fremgangsmåden kan således angive falske positive resultater.
3 5 I en yderligere fotometrisk bestemmelsesmetode anvendes protein C-aktivatoren Protac® (fremstilles af Pentapharm, Schweiz), som udvindes fra giften fra slangen Agkistrodon contortrix con- DK 171086 B1 3 tortrix såvel som et kromogent protein C-substrat (2 AcOH.H-Pro-Pro-Arg-pNA) . Ved denne fremgangsmåde kan der gives afkald på prøveforberedelsen. Med denne fremgangsmåde kan der imidlertid ikke skelnes mellem carboxyleret og ikke-carboxyleret 5 protein C. Det er imidlertid kendt, at kun carboxyleret protein C er virksomt in vivo. Derfor kan man med denne fremgangsmåde ikke opnå information om protein C-molekylets biologiske aktivitet.
10 Ved en yderligere kendt fremgangsmåde til bestemmelsen af protein C anvendes der ligeledes som protein C-aktivator Protac®. Protein C-bestemme1 sen foregår der efter tilsætning af aktivatorer for det endogene koaguleringssystem over en Clotting- test. Med denne fremgangsmåde er det ganske vist muligt at 1 5 skelne mellem carboxyleret og ikke-carboxyleret protein C, men denne fremgangsmåde har den ulempe, at påvisningen må foregå via koage 1 danne 1 sen (Clotting). Dermed er bestemmelsen bundet til bestemte påvisningsfremgangsmåder (f.eks. fasthæft-ningsmetode eller magnetfeltmetode), som ydermere har vist sig 2 0 modtagelige for forstyrrelser og kan ikke automatiseres.
Ifølge et ældre forslag fra den sammme ansøger foregår PC-be-stemmelsen ved, at der først dannes aktiveret protein C under indvirkning af thrombin, hvorefter dette thrombin inaktiveres, 25 og til sidst bestemmes under koaguleringskaskaden nyt dannet thrombin ved hjælp af et syntetisk thrombinsubstrat. Derved måles i virkeligheden nedsættelsen af thrombindannelseshastig-heden i sammenligning med en forsøgsgennemførelse uden protein C .
30
Protein S-mængden i plasma kan bestemmes i et immunoradi ometrisk forsøg, som f.eks. beskrevet af Bertina et al., (Thromb. Haemostas, 53, (2), 268-272 (1985)). Denne fremgangsmåde har dog den ulempe, at de til bestemmelsen anvendte antistoffer også reagerer med ikke-funkti one 11 protein S, dvs. f.eks. med 3 5 decarboxy-protein S eller med protein S, der er kompleksbundet med C^-bindende protein. Dette medfører under visse omstændigheder falske positive protein S-værdier og dermed utilstrækkelig behandling.
DK 171086 B1 4 I samme artikel beskriver forfatterne Bertina et al. også en mulighed, hvorpå funktionelt protein S fra human plasma kan bestemmes: Tilblandes et humant plasma aktiveret protein C, og _ bestemmes derefter den partielle thrombop 1 astintid (PTT) for 5 denne blanding, så er PTT så meget længere, desto større koncentrationen af funktionelt protein S er. Indikatorreaktion er også her den ved thrombin bevirkede spaltning af fibrinogen og dandelse af et fibrin-koagel. Fremgangsmåden er således bundet til bestemte påvisningsfremgangsmåder, som er modtagelige for forstyrrelser og i almindelighed ikke kan automatiseres. Den har den yderligere ulempe, at der må tilsættes renset aktiveret protein C, og at protein C og protein S i plasma ikke kan bestemmes samtidigt.
15
Den foreliggende opfindelses formål er at anvise en fremgangsmåde til fotometrisk bestemmelse af biologisk virksomt protein C og/eller protein S, hvilken fremgangsmåde er enklere at gennemføre som er de omtalte metoder og kan automatiseres.
20 Formålet opnås ved, at der til bestemmelse af protein C og/eller protein S samtidigt anvendes en aktivator for protein C fra slangegift, en aktivator for koagulationsystemet og et kromogent thrombinsubstrat, og virkningen af protein C og protein S på koagulationsfaktorerne VIII og V bestemmes ud fra 25 spaltningen af det kromogene thrombinsubstrat.
Det har overraskende vist sig, at protein C-aktivator fra slangegift i modsætning til andre protein C-aktivatorer ikke spalter thrombinsubstrat.
30
Dette var overraskende, fordi f.eks. Protac® i sin virkning er en thrombi η 1 ignende aktivator for protein C. Som følge heraf kunne det forventes, at det kromogene thrombinsubstrat også omsættes af slangegiftaktivatoren eller blandingen af aktivatorer med protein C, da thrombin og de ellers kendte protein 3 5 C-aktivatorer (f.eks. plasmin, trypsin) omsætter kromogene thrombi nsubstrater. Når der anvendes sådanne protein C-aktivatorer, måtte aktivatoren efter aktiveringen af protein C der- DK 171086 B1 5 for inaktiveres. Først til sidst kunne aktivatorerne for koaguleringssystemet og det kromogene thrombi nsubstrat tilsættes. Ved anvendelse af en protein C-aktivator fra slangegift viser g det sig imidlertid, at der på overraskende måde kan gives afkald på dette inaktiveringstrin. Det er endda muligt at tilsætte aktivatorerne for koagulationssystemet og det kromogene thrombi nsubstrat allerede ved begyndelsen af bestemmelsen.
Som protein C-aktivator kan der inden for opfindelsens rammer anvendes opløsninger af slangegift, f.eks. fra Agkistrodon con- tortrix contortrix, A.c. mokasen, A.c. picti gaster, A. pisci- vours, A.p. leucostoma, A. bilineatus, Bothrops moojeni, B.
pradoi, Cerastes cerastses, Vipera lebetrina eller V. russel- lii. Fortrinsvis anvendes imidlertid den fra slangegiften fra 1 5
Agkistrodon contortrix contortrix isolerede protein C-aktivator.
Fortrinsvis anvendes gifte eller g iftbestandde1e , som også i plasma kun aktiverer protein C, hvorved de ønskede giftbe-20 standdele let kan skilles fra giften fra en slange.
Hertil kan anvendes de alment sædvanlige fremgangsmåder som anionbytningskromatografi, affinitetskromatografi med protein C eller/og ultrafiltrering.
25
Aktivatoren anvendes i en koncentration fra 0,05 til 5 U/ml, fortrinsvis fra 0,5 til 1 U/ml aktivatoropløsning. Herved er en enhed (U) protein C-aktivator defineret som den mængde, som fuldstændigt aktiverer den i 1 ml normalt humant citratplasma indeholdte mængde protein C ved 37eC, pH-værdi 7 til 8, i en 3 0 reaktionsblanding af en volumendel plasma og 4 til 8 volumendele vandig protein C-aktivatoropløsning.
Da aktiveret protein C (APC) inaktiverer koagulationsfaktorerne V og VIII proteo1yti sk, hvor protein S fungerer som cofak-35 tor, modificeres koagulationssystemet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fortrinsvis ved tilsætning af aktivatorer for koagulationsfaktorer eller/og af selve koagulationsfaktorerne på en sådan måde, at inaktiveringen af faktoren V eller fakto- 6 DK 171086 B1 ren VIII giver sig udslag i en mest muligt udpræget formindskelse af thrombindannelsen. Ifølge en første udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnås dette hensigtsmæssigt ved, at man tilsætter en aktivator for faktor XII 5 f.eks. ellagsure under tilsætning af cephalin. Ifølge en anden udførelsesform for denne foretrukne variant tilsætter man en aktivator for faktor VII, f.eks. thromboplastin, og faktor V. Ifølge en tredje udførelsesform tilsætter man som aktivator for faktor II faktor Xa under tilsætning af cephalin. Sædvanligvis indeholder de hertil anvendte pufferere også yderligere calcium ioner.
Disse foretrukne udførelsesformer for opfindelsen tager hensyn til kendsgerningen, at koncentrationerne af koagu1 er ingspara-15 metrene faktorerne XII, XI,· VIII, X, V og II påvirker throm-bindannelsestiden således, at jo højere koncentrationen af disse faktorer er, desto tidligere opnås en bestemt thrombin-tærske 1 værd i .
20 Thrombindannelsen bestemmes inden for rammerne af opfindelsen på i og for sig kendte måder. Egnede herfor er den partielle thrombop1 ast intidsmetode ((PTT)-metode ) . Ved gennemførelse af denne tilsættes hensigtsmæssigt en aktivator for faktor XII. Thrombindannelsen kan også bestemmes ved hjælp af prothrombin-25 tidsmetoden. I dette tilfælde tilsætter man hensigtsmæssigt en aktivator for faktor VII og faktor Va.
Som kromogent thrombi nsubstrat kan der inden for opfindelsens rammer anvendes ethvert for thrombinbestemmelsen egnet kromo- ^ gent substrat. Fortrinsvis anvendes imidlertid inden for op findeisens rammer H-D-Phe-Pip-Arg-pNA eller Tos-Gly-Pro-Arg- pNA, hvor pNA betegner para-nitroani1 in. pNA udgør den kromo- gene bestanddel af substratet, og fraspaltes af det dannede thrombin, således at det kan bestemmes fotometrisk på kendt måde.
Som koagulationssystem kan der f.eks. anvendes en blanding af faktorerne II til XII eller substratplasma (f.eks. protein C-eller protein S-mange1 piasma).
35 DK 171086 B1 7
Inden for opfindelsens rammer kan ethvert plasma anvendes, og fortrinsvis anvendes citratplasma.
Fremgangsmåden kan gennemføres ved neutrale eller svagt alka-5 liske pH-værdier, fortrinsvis mellem pH-værdi 6 og 9. Som puffer kan anvendes de i dette pH-område virksomme, fysiologisk uskadelige puffere som f.eks. Tris/HCl. Yderligere kan de for koagulationsforsøg sædvanlige stabilisatorer og konserveringsmidler, såsom kvagseruma1 bum in, merthiolat og lignende, lige-ledes tilsættes.
Ved hjælp af fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan protein C og protein S bestemmes sammen eller protein C eller protein S kan hver bestemmes alene.
15 Når protein C og protein S skal bestemmes sammen, kan patientplasmaet anvendes direkte til bestemmelsen. Når protein C skal bestemmes alene, må der udover reagenset også tilsættes protein S. Dette sker fordelagtigt i form af et protein C-mangel-2Q plasma, som indeholder protein S. Mængden af det tilsatte protein S må således i det mindste være så stor som den formodede protein C-koncentrat i on. Når protein S skal bestemmes alene, må der udover reagenset også tilsættes protein C. Dette sker fordelagtigt i form af et protein S-mangelplasma. Også her må 25 der i det mindste tilsættes den samme mængde protein C, som den formodede protein S-koncentrat i on udgør.
Protein S- eller protein C-mangelplasma kan fremstilles ved immunoadsorptionskromatografi som f.eks. beskrevet i R. M.
Bertina et al., Thromb. Haemostas (Stuttgart) 51, 1-5 (1984) 3 0 eller i R. M. Bertina et al. Thrombosis and Haemostasis 53, 268-272 (1985).
De følgende eksempler belyser opfindelsen yderligere i forbindelse med den vedføjede tegning (fig. 1). I fig. 1 ses: en ka-35 1 i brer ingskurve for protein C-aktivitetsbestemme1 se. Forholdet mellem den partielle thromboplast intid med eller uden aktivator (forhold) er vist mod den procentvise koncentration af protein C i plasmaet.
DK 171086 B1 8
Eksempel 1
Fremstilling af et højt oprenset protein C-aktivatorpræparat ud fra A. contortrix-gift.
5 1 g A. contortrix-gift opløses i 100 ml vand. Denne opløsnings pH-vardi indstilles med 0-phosphorsyre 0,3 mol/1 til 3,0, og den sure giftopløsning hensattes i 10 minutter i et vandbad ved 70 ± 2eC. Derefter afkøles opløsningen til 20eC, pH-værdi-10 en indstilles med natronlud (1 mol/1) til 7,2, den uklare opløsning centrifugeres, og overstanden fortyndes med destilleret vand til et volumen på 100 ml for således at opnå en i forvejen renset g iftfrakt i on.
15 Den i forvejen rensede giftfraktion sattes på en med 0,015 mol/1 natriumphosphatpuffer, pH-vardi 6,8, akvilibreret søjle med DEAE-Sephadex® A-50 med format 2,6 x 90 cm og elueres med en linear gradient, blandet ud fra 0,015 mol/1 natriumphosphatpuffer, pH-vardi 6,8, og 0,4 mol/1 natriumch1 or id i 0,015 mol/1 2Q natriumphosphatpuffer, pH-vardi 6,8 og der opsamles fraktioner på hver 20 ml. Den protein C-akti verende virkning af de enkelte fraktioner bestemmes ved, at man til 0,1 ml humant citratplasma sætter 0,1 ml prøve (1:350 i vand fortyndet fraktion) og 0,1 ml prøve e 1 1 agsyrereagens (Actin ®) og 0,1 ml 0,025 25 mol/1 calc iumchloridopløsning, straks sætter et stopur igang og bestemmer tiden indtil koagulering. De protein C-aktivator-holdige prøver bevirker en forlængelse af koagulationstiden på fra 34 sekunder op til 200 sekunder alt efter akt ivatorind-ho 1 d.
30
De protein C-akti verende fraktioner forenes, koncentreres ved ultrafiltrering til 1/10 af e1uatvolurnet, optages i 0,05 mol/1 natriumacetatpuffer, pH-værdi 5,0 og sættes på en med 0,01 mol/1 natriumacetatpuffer, pH-værdi 5,0, ækvilibreret søjle af CM-Se- phadex® C-50, og elueres med en lineær gradient, blandet af 3 5 0,05 mol/1 natriumacetatpuffer, pH-værdi 5,0 og 0,4 mol/1 natri umchlorid i 0,05 mol/1 natriumacetatpuffer, pH-værdi 5,0, og der opsamles fraktioner på hver 20 ml, som ifølge den oven DK 171086 B1 9 for beskrevne metode afprøves for protein C-akti verende virkning.
De protein C-aktiverende fraktioner blandes sammen, koncentre-5 res ved ultrafiltrering til 1/25 af deres volumen, indstilles med 1¾ eddikesyre i destilleret vand til 25 ml og sættes på en med 1% eddikesyre i vand ækvilibreret søjle af Sephadex® G-100 og elueres med 1% eddikesyre, og fraktioner på hver 20 ml opsamles, som atter ifølge den indledningsvis beskrevne metode 10 prøves for protein C-aktiverende virkning.
De protein C-aktiverende fraktioner forenes og lyofiliseres. Der opnås et saltfrit akt ivatorpræparat, som ved polyacryla-mid-gel-e1ektroforesen udviser en enkelt zone og en protein C-15 aktiverende aktivitet på 35 U pr. mg.
En enhed (U) protein C-aktivator er den mængde, som fuldstændigt aktiverer den mængde protein C, som er i 1 ml normalt humant citratplasma.
2 0
Eksempel 2 Måling af aktiveret protein C ved hjælp af forlængelse af den partielle thrombop1 ast intid (ved tilstedeværelse af protein C-aktivator ifølge eksempel 1).
25 25 μΐ fortyndet plasmaprøve (1+4 med 0,9% natriumchloridop-løsning) + 25 μΐ protein C-defekt normalplasma og 500 μΐ reagens bestående af cephalin og ellagsyre i 10 mmol/1 Tris/HCl, pH-værdi 7,6, inkuberes i en plastkuvette ved 37eC. Efter nøj-20 agtigt 1 minut tilsættes enten 1. 20 μΐ protein C-aktivator ifølge eksempel 1 (koncentration: flaskeindhold * 3 U i 3 ml 0,9% NaCl-opløsning) eller 2. 20 μΐ 0,9% NaCl-opløsning, og der blandes og inkuberes vi - 35 dere.
Efter nøjagtig 4 minutter tilsættes 150 μΐ begyndelsesreagens bestående af 1,1 mmol/1 Chromozym® TH · (Tos-G1y-Arg-pNA) og 10 DK 171086 B1 100 mmo1/1 calciumacetat, og ved 405 nm i et fotometer bestemmes tiden, indtil en defineret mængde substrat af nyt dannet thrombin er omsat til Tos-Gly-Pro-Arg og para-nitroani1 in 5 (pNA). Den mængde omsat substrat, der måltes, defineres ved en tærske 1extinkti onsværd i (f.eks. ΔΕ = 0,2).
Under de anførte betingelser stiger den partielle thrombopla-stintid proportionalt med koncentrationen af protein C i plasmaprøven, når blandingen tilsættes aktivatoren Protac. Da den 10 partielle thrombop1 ast intid blandt andet afhænger af plasmaets faktorindhold, er det hensigtsmæssigt og at måle en blindværdi med 0,9% NaC1-op 1øsning. Forholdet mellem PTT-tid med aktivor og PTT-tid uden aktivator er et mål for protein C-indholdet.
Ved hjælp af en kalibreringskurve, der er opnået med plasma-1 5 prøver med forskellig kendt protein C-koncentrat i on, kan protein C-koncentrationen i den ukendte plasmaprøve bestemmes. I tabellen er der anført tre eksempler på plasmaprøver med u-kendte protein C-koncentrati oner .
20 25 30 35
Claims (7)
1. Fremgangsmåde til fotometrisk bestemmelse af protein C- og/ 5 eller protein S-aktivitet, især i plasma, kendetegnet ved, at man inkuberer en prøve, der indeholder det protein C og/eller det protein S, som skal bestemmes, med en protein C-aktivator fra slangegift under dannelse af aktiveret protein C og/eller protein S, og ved hjælp af et kromogent 10 thrombi nsubstrat bestemmes formindskelsen af den ved hjælp af koagulationsfaktorer og deres aktivatorer formidlede dannelse af thrombin ud fra prothrombin.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 15 man som protein C-aktivator anvender en opløsning af gift fra slangen Agkistrodon contortrix contortrix eller af bestanddele deraf.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 2Q man som protein C-aktivator anvender gift fra slangen A. C. mokasen, A. C. pictigaster, A. piscivours, A. p. leucostoma, A. bilineatus, Bothrops moojeni, B. pradoi, Cerastes cerastes, Vipera lebetrina eller V. russellii.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 3, kendeteg- 2 5 net ved, at man som kromogent thrombi nsubstrat anvender H-D-Phe-Pip-Arg-pNA eller Tos-G 1y-Pro-Arg-pNA.
5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 4, ken detegnet ved, at man tilsætter en aktivator for faktor
30 XII.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at man tilsætter cephalin og ellagsyre.
7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 4, k e n - 3 5 detegnet ved, at man tilsætter en aktivator for faktor VII . 1 Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at man tilsætter faktor V samt som faktor VII-aktivator thrombo-
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19863607559 DE3607559A1 (de) | 1986-03-07 | 1986-03-07 | Verfahren zur photometrischen bestimmung der protein c- und/oder protein s-aktivitaet |
| DE3607559 | 1986-03-07 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK118187D0 DK118187D0 (da) | 1987-03-06 |
| DK118187A DK118187A (da) | 1987-09-08 |
| DK171086B1 true DK171086B1 (da) | 1996-05-28 |
Family
ID=6295772
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK118187A DK171086B1 (da) | 1986-03-07 | 1987-03-06 | Fremgangsmåde til fotometrisk bestemmelse af protein C- og/eller protein S-aktivitet |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5001069A (da) |
| EP (1) | EP0236985B1 (da) |
| JP (1) | JPS62212569A (da) |
| AT (1) | ATE78519T1 (da) |
| AU (1) | AU577975B2 (da) |
| CA (1) | CA1299075C (da) |
| DE (2) | DE3607559A1 (da) |
| DK (1) | DK171086B1 (da) |
| ES (1) | ES2043612T3 (da) |
| NO (1) | NO168389C (da) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5051357A (en) * | 1989-07-14 | 1991-09-24 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Method and assay using inactivation of factors Va and VIIIa by activated Protein C to diagnose thrombic disease or assay for Protein C and kit therefor |
| SE464135B (sv) * | 1989-07-14 | 1991-03-11 | Kabivitrum Ab | Foerfarande foer bestaemning av funktionell aktivitet av fritt protein s eller protein c i ett plasmaprov |
| DE4006634A1 (de) * | 1990-03-03 | 1991-09-05 | Behringwerke Ag | Funktioneller test zur bestimmung der protein s-aktivitaet |
| US5716795A (en) * | 1991-10-04 | 1998-02-10 | Matschiner; John T. | Thrombomodulin-based coagulometric assay of the protein C system |
| WO1993007491A1 (en) * | 1991-10-04 | 1993-04-15 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | A soluble thrombomodulin-based one-stage assay for vitamin k-dependent coagulation-inhibiting proteins |
| SE470274B (sv) * | 1991-11-13 | 1993-12-20 | Bjoern Dahlbaeck | Användning av en in vitro-metod för diagnos av blodkoagulationssjukdomar |
| US5308756A (en) * | 1991-11-20 | 1994-05-03 | Baxter Diagnostics Inc. | Protein S chromogenic assay |
| FR2689640B1 (fr) * | 1992-04-06 | 1997-08-08 | Bio Merieux | Procede pour la determination d'une activite proteine c et/ou proteine s dans un echantillon plasmatique. |
| HUT72191A (en) | 1993-01-29 | 1996-03-28 | Dahlbaeck | Novel anticoagulant cofactor activity |
| DE4427785A1 (de) * | 1994-08-08 | 1996-02-15 | Behringwerke Ag | Verfahren zum Nachweis von Störungen des Protein C/Protein S-Systems |
| DE69520725T3 (de) * | 1994-12-23 | 2005-11-17 | Diagnostic Reagents Ltd., Thame | Verfahren zur Diagnose von Blutgerinnungsstörungen |
| US5780255A (en) * | 1995-06-09 | 1998-07-14 | Instrumentation Laboratory, S.P.A. | Protein C pathway screening test |
| US20030143759A1 (en) * | 1995-10-20 | 2003-07-31 | Bjorn Dahlback | Assays for determining anticoagulant cofactor activity |
| US6379975B1 (en) | 1996-11-27 | 2002-04-30 | T.A.C. Thrombosis And Coagulation Aktiebolag | Methods and reagents for determining protein S |
| AUPP159698A0 (en) | 1998-02-02 | 1998-02-26 | Life Therapeutics Limited | Improved blood coagulation test |
| PT947585E (pt) * | 1998-03-19 | 2001-11-30 | Instrumentation Lab Spa | Metodo in vitro melhorado, kits e reagentes para a peaquisa de defeitos de coagulacao sanguinea |
| US6855509B2 (en) * | 2000-12-19 | 2005-02-15 | Instrumentation Laboratory Company | Protein S functional assay and kit therefor |
| US6902904B2 (en) * | 2001-08-27 | 2005-06-07 | Pharmanetics Incorporated | Coagulation assay reagents containing lanthanides |
| EP1485121A4 (en) * | 2002-03-08 | 2007-11-07 | Lilly Co Eli | ACTIVE C PROTEIN FORMULATIONS |
| JP5839256B2 (ja) | 2011-03-14 | 2016-01-06 | 学校法人九州文化学園 | 総プロテインｓ異常症の検出方法において用いる試薬 |
| CN103018188A (zh) * | 2012-12-28 | 2013-04-03 | 中国医学科学院输血研究所 | 一种检测人蛋白c活性的方法 |
| CN110714051B (zh) * | 2019-11-20 | 2023-04-07 | 迈克生物股份有限公司 | 蛋白c活性测定试剂盒 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2757992A1 (de) * | 1977-12-24 | 1979-06-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur prothrombin-bestimmung |
| US4289498A (en) * | 1979-01-08 | 1981-09-15 | Ortho Diagnostics, Inc. | One-stage prothrombin assay and compositions useful therein |
| JPS5856695A (ja) * | 1981-09-28 | 1983-04-04 | Nitto Boseki Co Ltd | 新規なトロンビン測定用基質 |
| CA1213198A (en) * | 1982-09-29 | 1986-10-28 | James E. Hughes | Diagnostic activated partial thromboplastin reagent |
| DE3330699A1 (de) * | 1983-08-25 | 1985-03-07 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur gleichzeitigen bestimmung von fibrinogen und fibrinogen-spaltprodukten im plasma |
| EP0182929A1 (de) * | 1984-11-26 | 1986-06-04 | American Hospital Supply Corporation | Koaktivator zur Aktivierung von Protein C |
| US4849403A (en) * | 1985-05-29 | 1989-07-18 | Pentapharm Ag | Protein C activator, methods of preparation and use thereof |
| DE3536903A1 (de) * | 1985-10-16 | 1987-04-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur photometrischen bestimmung von protein c |
-
1986
- 1986-03-07 DE DE19863607559 patent/DE3607559A1/de not_active Withdrawn
-
1987
- 1987-03-03 JP JP62046934A patent/JPS62212569A/ja active Granted
- 1987-03-05 CA CA000531286A patent/CA1299075C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-06 NO NO870945A patent/NO168389C/no unknown
- 1987-03-06 EP EP87103255A patent/EP0236985B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-06 DK DK118187A patent/DK171086B1/da active
- 1987-03-06 AU AU69785/87A patent/AU577975B2/en not_active Ceased
- 1987-03-06 AT AT87103255T patent/ATE78519T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-03-06 DE DE8787103255T patent/DE3780485D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-06 ES ES87103255T patent/ES2043612T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-10-04 US US07/256,100 patent/US5001069A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK118187D0 (da) | 1987-03-06 |
| JPH0476629B2 (da) | 1992-12-04 |
| ES2043612T3 (es) | 1994-01-01 |
| NO870945D0 (no) | 1987-03-06 |
| EP0236985B1 (de) | 1992-07-22 |
| CA1299075C (en) | 1992-04-21 |
| AU577975B2 (en) | 1988-10-06 |
| EP0236985A3 (en) | 1989-03-15 |
| EP0236985A2 (de) | 1987-09-16 |
| NO870945L (no) | 1987-09-08 |
| ATE78519T1 (de) | 1992-08-15 |
| NO168389B (no) | 1991-11-04 |
| DE3780485D1 (de) | 1992-08-27 |
| NO168389C (no) | 1992-02-12 |
| JPS62212569A (ja) | 1987-09-18 |
| DE3607559A1 (de) | 1987-09-10 |
| AU6978587A (en) | 1987-09-10 |
| DK118187A (da) | 1987-09-08 |
| US5001069A (en) | 1991-03-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK171086B1 (da) | Fremgangsmåde til fotometrisk bestemmelse af protein C- og/eller protein S-aktivitet | |
| Martinoli et al. | Fast functional protein C assay using protac® a novel protein C activator | |
| Bertina et al. | Protein C deficiency in a Dutch family with thrombotic disease | |
| Marciniak et al. | Impaired catalytic function of activated protein C: a new in vitro manifestation of lupus anticoagulant | |
| Stocker et al. | Characterization of the protein C activator Protac® from the venom of the southern copperhead (Agkistrodon contortrix) snake | |
| Sala et al. | A functional assay of protein C in human plasma | |
| d'Angelo et al. | Relationship between protein C antigen and anticoagulant activity during oral anticoagulation and in selected disease states. | |
| Kisiel et al. | Characterization of a protein C activator from Agkistrodon contortrix contortrix venom. | |
| Bergström et al. | Determination of vitamin K sensitive coagulation factors in plasma. Studies on three methods using synthetic chromogenic substrates | |
| Francis Jr et al. | Rapid Amidoiytic Assay of Protein C in Whole Plasma Using an Activator from the Venom of Agkistrodon Contortrix | |
| KR19990083444A (ko) | 응고인자ⅶ을활성화시키기위한프로테아제 | |
| US5439802A (en) | Method for determining the functional activity of free protein S or protein C in a plasma sample | |
| JP2003517610A (ja) | 血液学的アッセイ及び試薬 | |
| Budzynski et al. | Fibrinogenolytic afibrinogenemia after envenomation by western diamondback rattlesnake (Crotalus atrox) | |
| Odegaard et al. | Protein C: an automated activity assay | |
| NO166303B (no) | Fremgangsmaate ved kvantitativ bestemmelse av protein c ogaktivatorpreparat til gjennomfoering av fremgangsmaaten. | |
| JP3687864B2 (ja) | 活性化状態の活性化タンパク質ｃに対する安定性が増大された凝固ｖ因子を特異的に検出する方法 | |
| FI64466C (fi) | Foerfarande och reagens foer bestaemning av protrombin | |
| Braunstein et al. | Characterization of the defect in activation of factor IX Chapel Hill by human factor XIa. | |
| Lyttleton | The antithrombin activity of heparin | |
| JPH0889293A (ja) | プロテインｃ／プロテインｓ系の障害を検出する方法 | |
| Hedner et al. | Inhibition of activated haceman factor (factor XIIa) by an inhibitor of the plasminogen activation (PA inhibitor) | |
| Girolami et al. | Chromogenic Substrate (S-2238) Prothrombin Assay in Prothrombin Deficiencies and Abnormalities. Lack of Identity with Clotting Assays in Congenital Dysprothrombinemias. | |
| Bezeaud et al. | Prothrombin Salakta: an abnormal prothrombin characterized by a defect in the active site of thrombin | |
| DK157939B (da) | Reagens til optisk bestemmelse af blodkoagulationsforholdet |