CN1840696A - 水稻广谱抗稻瘟病基因的分子鉴别及转育技术 - Google Patents

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CN1840696A CN 200610004058 CN200610004058A CN1840696A CN 1840696 A CN1840696 A CN 1840696A CN 200610004058 CN200610004058 CN 200610004058 CN 200610004058 A CN200610004058 A CN 200610004058A CN 1840696 A CN1840696 A CN 1840696A
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朱旭东
邓一文
陈红旗
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Abstract

本发明属于利用分子生物学方法鉴别水稻广谱抗稻瘟病基因的技术领域。它涉及可用于鉴别水稻广谱抗稻瘟病基因的核苷酸序列分子标记和以此分子标记所获得的抗病基因及其抗病品种；一种水稻广谱抗稻瘟病基因的分子标记，其特征在于所述的分子标记长度为10～30个核苷酸，其中分子标记的序列与SEQ ID No：1中第1－70798位所示的序列相同；本发明是利用我国自有的稻利资源，在多年、多点病区自然或诱导发病的基础上，以国内稻瘟菌不同菌株为主、国外菌株为辅通过人工接种，从水稻种质资源中筛选出“谷梅4号”；(2)利用分子标记技术，对谷梅4号与感病品种杂交构建的分离群体，进行基因的定位，并获得了Pi－gm(t)基因及其与之连锁的分子标记；(3)Pi－gm(t)基因及其与之连锁的分子标记，在水稻抗稻瘟病育种可以提高育种效率、延长品种在生产上的利用价值。

Description

水稻广谱抗稻瘟病基因的分子鉴别及转育技术
技术领域
本发明属于利用分子生物学方法鉴别水稻广谱抗稻瘟病基因的技术领域。它涉及可用于鉴别水稻广谱抗稻瘟病基因的核苷酸序列分子标记和以此分子标记所获得的抗病基因及其抗病品种。
背景技术
水稻是一种重要的经济作物，关系到国计民生；稻瘟病是我国水稻生产中最常见、破坏性最大的真菌病害之一，也是全球水稻主要产稻国发生该病后极易导致水稻严重减产的重大病害。1975～1990年因稻瘟病的危害引起全球稻谷损失达1.57亿吨。据中国农业部植保总站的不完全统计，1987～1997年为害严重的浙、粤、赣、川、湘、鄂、云、辽等8省的年发生面积达380万公顷以上，每年产量损失徘徊在20～70万吨。
由于稻瘟病具有遗传背景和种群变化复杂等原因，致使抗病育种难以适应新种群的快速变化，而导致育成的品种仅在生产上种植3～5年后就失去其控病的利用价值，转而依赖杀菌类药剂防治稻瘟病的扩展和蔓延，继而造成土壤及水源等生态环境污染的恶性循环。传统的抗病育种依赖于抗性鉴定和植株表型选择，要求具有丰富的经验和长达数年甚至十几年的时间。由于受稻瘟病发病条件的限制，以及缺乏对抗病基因有效的追踪方法，常规育种中很难选育出同时具有多个抗病基因的持久抗病品种。
水稻伴随着稻瘟病在共同演化的过程中，形成了不同的抗病机制和丰富的抗病基因。目前已经从水稻中克隆了若干抗稻瘟病基因如Pi-ta和Pi-b等，但这些被克隆的基因对稻瘟病抗性不具广谱性，携带这类基因的种质在中国早已失去品种抗病性改良的利用价值。从丰富的国内外稻种资源中发掘新的有广谱、持久抗稻瘟病的种质，利用现代分子技术开发检测效率高的分子标记，培育广谱、持久抗稻瘟病品种是提高抗病品种使用年限、降低生产成本、减少环境污染、已经是发展持久农业的最有效途径。
发明内容
本发明利用现代分子标记技术进行分析并在抗病基因附近或基因本身有效选择核苷酸序列分子标记即水稻广谱抗稻瘟病基因的分子鉴别，在转移抗病基因过程中加以利用，提高选择效率和效果；本发明是基于在发掘中国稻种资源“谷梅4号”的基础上，广泛筛选我国不同生态稻区具有代表性的菌株进行人工接种。
本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的：一种水稻广谱抗稻瘟病基因的分子标记，其特征在于所述的分子标记长度为10～30个核苷酸，其中分子标记的序列与SEQ ID No：1中第1-70798位所示的序列相同。
作为优选：所述的分子标记长度为15～25个核苷酸。
作为优选：所述的分子标记选自：SEQ ID No：2、3、4、5、6、7。
在本发明中还提供了根据上述分子标记设计的衍生标记辅助选择开发的带抗病位点的品种、根据上述分子标记设计的衍生标记获得的新抗病基因或位点；以及根据上述的分子标记设计的衍生标记衍生鉴定的抗病品种。
“谷梅4号”是我国上世纪60年代发掘的地方品种，经多年病区种植表现持久、广谱的抗瘟性。在与法国的合作研究中，利用来自不同国家和地区的29个强致病力菌株接种我国当前田间应用的大部分抗性品种和已知的广谱抗瘟基因Pi-1、以及一些著名的抗源，如Tetep、Moroberekan，其中谷梅4号的抗瘟性表现特别突出，其可以抵抗所有菌株的侵染，明显好于一些著名的抗源。
本发明是在发掘中国稻种资源“谷梅4号”的基础上，广泛筛选我国不同生态稻区具有代表性的菌株人工接种，证实“谷梅4号”具有广谱抗病性，利用现代分子标记技术分析了在抗病基因附近或基因本身有效选择标记，在转移抗病基因过程中加以利用，提高选择效率和效果。
抗稻瘟病基因Pi-gm(t)具有对不同生理小种产生广谱抗病性。对谷梅4号进行遗传分析结果表明其对多个菌株的抗性来自同一个位点Pi-gm(t)，并与Pi-2和Pi-9等位。通过图位克隆的方法把该抗病位点Pi-gm(t)或Pi-2或Pi-9定位在第六染色体靠近着丝粒大约70kb区域SEQ ID No：1，即该区域存在一个含有6个抗病基因的基因簇，本发明将是利用这个SEQ ID No：1的70798b的抗病位点的分子标记，将抗病基因Pi-gm(t)或Pi-2或Pi-9用于抗病分子育种。
本发明具有以下优点：
本发明是利用我国自有的稻种资源，在多年、多点病区自然或诱导发病的基础上，以国内稻瘟菌不同菌株为主、国外菌株为辅通过人工接种，从水稻种质资源中筛选出“谷梅4号”；(2)利用分子标记技术，对谷梅4号与感病品种杂交构建的分离群体，进行基因的定位，并获得了Pi-gm(t)基因及其与之连锁的分子标记；(3)Pi-gm(t)基因及其与之连锁的分子标记，在水稻抗稻瘟病育种可以提高育种效率、延长品种在生产上的利用价值。
附图说明
附图1标记C0428在以感病亲本Maratelli为轮回亲本与谷梅4构建的BC2F2选育中抗(R)、感(S)个体DNA的PCR产物经内切酶EcoR72切后的电泳图。
附图2标记C5483在以感病亲本Maratelli为轮回亲本与谷梅4构建的BC2F2选育中抗、感个体DNA的PCR产物经内切酶EcoR I切后的电泳图。
附图3标记S29742在以双恢选22(SHX22)与谷梅4构建的F6重组自交育种材料中选育中抗、感个体DNA的PCR产物电泳图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作近一步的描述，但本发明并不限于下述实施例
以下所有实例，除特别指明的外，均利用常规分子生物学方法：1)JosephSambrook，David W.Russell eds.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001；2)Carl W.Dieffenbach andGabriela S.Devksler eds.PCR Primer：A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory Press，1995。下面对专利做更详细的实例说明。
实施例1
“谷梅4号”的获得
我国自有的稻种资源，在多年、多点病区自然或诱导发病的基础上，以国内稻瘟菌不同菌株为主、国外菌株为辅通过人工接种，从水稻种质资源中筛选出“谷梅4号”；
(2)对谷梅4号与感病品种杂交构建的分离群体，进行基因的定位，在第六染色体靠近着丝粒大约70kb区域，其序列如SEQ ID No：1所示；
SEQ ID No：1全长为70798bp。
实施例2
谷梅4号的抗病基因Pi-gm(t)或Pi-2或Pi-9进行了精细定位在70kb区域SEQ ID No：1，鉴定了6个分别位于该抗病基因簇SEQ ID No：1两端和中间的6个基于PCR的分子标记SEQ ID No：2、3、4、5、6、7。
                              表1：各分子标记的基本信息
  分子标记   序列   编号
  SEQ ID No：2   5’-GGGAGGAGGAATGGTAGGAA-3’(1-19)   C5483-R
  SEQ ID No：3   5’-CCCAAGACAAGCAGCCTAA-3’(450-468)   C5483-F
  SEQ ID No：4   5’-CAGTGAAACGAACGCTATG-3’(13576-13594)   S29742-F
  SEQ ID No：5   5’-CAACATCATCCCTTCCTATT-3’(14010-14029)   S29742-R
  SEQ ID No：6   5’-AAGGTTCTCGTGGTTTCA-3’(55062-55079)   C0428-F
  SEQ ID No：7   5’-CTGCTATAAACAATGGGGA-3’(55725-55743)   C0428-R
其中，SEQ ID No：2、3、6、7需要酶切。
实施例3
利用分子标记设计的衍生标记辅助选择开发的带抗病位点的品种；如图1、图2、图3所示利用这些分子标记可以快速鉴定抗病位点是否存在，对于抗病位点存在的植株可以继续进行目标性状的改良，这样就可以缩短育种年限，与现在的常规育种相比，加快了育种进程，节省了大量的人力、物力、财力。
实施例4
分子标记设计的衍生标记衍生标记获得的新抗病基因或位点，通过利用这些标记鉴定的其他抗病品种，从而可以更快的获得新的Pi-gm(t)等位基因。
实施例5
分子标记设计的衍生标记衍生鉴定的抗病品种，利用这些标记可以快速鉴定含有抗病基因Pi-gm(t)或Pi-2或Pi-9及其等位基因的抗病品种。
本发明中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
                              序列表
<110>中国水稻研究所、中国科学院上海植物生理生态研究所
<120>水稻广谱抗稻瘟病基因分子鉴别技术
<130>0571327
<160>21
<170>patentIn version3.1
<210>1
<211>70798
<212>DNA
<213>水稻
<400>1
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<221>misc_feature
<222>(1)...(19)
<223>标记物
<400>7
ctgctataaacaatgggga

Claims (6)

1、一种水稻广谱抗稻瘟病基因的分子标记，其特征在于所述的分子标记长度为10～30个核苷酸，其中分子标记的序列与SEQ ID No：1中第1-70000位所示的序列相同。
2、根据权利要求1所述的水稻广谱抗稻瘟病基因的分子标记，其特征在于所述的分子标记长度为15～25个核苷酸。
3、根据权利要求1或2所述的水稻广谱抗稻瘟病基因的分子标记，其特征在于所述的分子标记选自：SEQ ID No：2、3、4、5、6、7。
4.一种如权利要求1所述的分子标记设计的衍生标记辅助选择开发的带抗病位点的品种。
5.一种如权利要求1所述的分子标记设计的衍生标记衍生标记获得的新抗病基因或位点。
6.一种如权利要求1所述的分子标记设计的衍生标记衍生鉴定的抗病品种。
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