CN1648253A - 与水稻抗稻瘟病基因连锁的分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明与水稻抗稻瘟病基因连锁的分子标记，专用于水稻抗稻瘟病基因的筛选。用SDS法提取黑壳子粳、苏御糯及其F₁、F₂分离群体的单株DNA。采用350对SSR分子标记对上述2个亲本及其F₁进行PCR扩增产物多态性筛选，然后依次对F₂抗感池、F₂群体的各个体筛选抗稻瘟病基因连锁标记。找到第11染色体上长臂末端的SSR标记RM144H_240+260、RM7654 H₁₂₀、RM7212H₁₂₀、RM5923H₁₅₀与抗病基因Pi－hkl(t)连锁；第12染色体上的SSR标记RM277 H₇₀、RM511H₈₀₊₉₀、RM2972H₉₀标记与抗病基因Pi－hk2(t)连锁。本发明可以准确地靶定抗病基因，大大提高抗稻瘟病育种的选择效率。

Description

与水稻抗稻瘟病基因连锁的分子标记

一、技术领域

本发明公开了与水稻抗稻瘟病基因Pi-hk1(t)、Pi-hk2(t)连锁的分子标记，用于提高水稻对稻瘟病抗性的分子育种，专用于水稻抗稻瘟病基因的筛选。

二、技术背景

水稻是21世纪全球人类增长赖以生存的至关重要的粮食作物。水稻病害掠夺了相当部分的稻谷产量，其中稻瘟病危害损失占70％以上，而且这种危害绝不仅仅在发展中国家，世界水稻生产国家或地区均有发生。在稻瘟病流行年份，造成的产量损失，一般在10-20％，严重的可达50％以上，局部田块甚至颗粒无收，而且导致稻米品质下降[凌忠专.水稻抗稻瘟病育种.福建科学技术出版社，1990]。我国稻瘟病年均发生面积在400万公顷左右，严重年份在800万公顷左右，每年因稻瘟病危害损失稻谷2～10亿公斤[孙国昌.水稻与稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)群体互作及病菌群体遗传结构研究.博士毕业论文，2002]。

世界各国经过数十年的实践证明，培育和种植抗病品种是最经济有效的防治稻瘟病措施。但是，许多抗病品种往往推广种植数年就丧失抗性，其主要原因是由于大面积种植的抗病品种单一、且品种抗病基因相对单一，使得稻瘟病菌群体中的毒性小种逐渐成为优势小种，造成病害流行。因此选育持久抗病品种成为育种工作者一贯追求的目标。研究表明，持久抗性与抗病多基因密切有关。许多具有持久抗病性的种质，如Moroberekan、Tetep、IR64、LAC23、PKT、IR64等都具有多个抗病基因。持久抗性品种是以不同的抗病基因聚合(pyramid)对付稻瘟病菌群体中复杂多变的优势小种，并且被克服的主效抗病基因对毒性小种仍然残留部分抗性成为微效抗性基因，其它某个(或某些)抗病基因则对新的小种表现为抗病而成为主效基因[Tabien R E，et al.Mapping QTLs for field resistance to rice blast pathogenand evaluating of their individual and combined utility in improved varieties.Theor Appl Genet，2002，105：313-324]。

按照传统育种的方法，选育抗稻瘟病品种需要接种大量的不同小种的稻瘟病菌株鉴定抗性，保留广谱抗性的株系(品系)，因此工作量大，而且鉴定受季节限制、鉴定结果受环境条件等外界因素影响。更重要的是这种表型鉴定很难聚合抗病基因。因为不同的抗病基因具有不同的抗谱(对一个或一个以上而不是全部的小种具有抗性)，且抗谱相互覆盖；不同的小种、甚至相同小种的不同菌株存在不同的致病谱(对一个或一个以上而不是全部的抗病基因具有毒性)，且致病谱相互覆盖。因此很难利用不同小种的菌株鉴别抗病基因和聚合抗病基因，这就为复杂多样的稻瘟病菌群体中潜在毒性小种的流行提供可乘之机。

DNA分子标记为筛选抗病多基因品种提供了高效、快捷的方法，而且免除了大规模的后代抗性鉴定与加快选育进程。因此国内外都非常重视开展抗稻瘟病基因的分子标记筛选，用于标记辅助选择，聚合抗稻瘟病基因，以培育广谱、高抗、持久的抗病品种。目前利用DNA分子标记定位的抗稻瘟病基因大约有40多个(包括一些复等位基因和QTLs)，这些基因大多以基因蔟形式存在于少数几条染色体的特定区域，这一特点为分子标记辅助选择创造了便捷条件。一些抗稻瘟病基因连锁的分子标记(尤其是早期定位所用的分子标记)大多是利用RFLP标记。如Yu et al(1991)第一个利用分子标记RFLP定位了抗稻瘟病基因Pi-2(t)和Pi-4(t)[Yu Z H，et al. Tagging genes for blast resistance in rice via linkage to RFLP markers.Theor ApplGenet，1991，81：471-476]。由于这类标记需要复杂的操作程序、昂贵的生化试剂和大量的样本DNA，不便用于育种程序。基于PCR的分子标记用于分子标记辅助选择则更为方便可行，因此国内外一些实验室开始开发抗病基因的这类连锁标记，包括AFLP、SSR、STS、RGA、EST、SNP、CAPS等。如Fjellstrom等将Pi-b、Pi-ta的SSR连锁标记RM208、RM224用于辅助选择育种[Fjellstrom R et al.Development of DNA markers suitable for marker assisted selection of three Pi genes conferringresistance to multiple Pyricularia grisea pathotypes.Crop science，2004，44(5)：1790-1798]；如Wu等将Moroberekan的抗稻瘟病主效QTLs的SSR标记用于回交育种[Wu J L，Sinha P K，Variar M et al.Association between molecular markers and blast resistance in anadvanced backcross population of rice.Theor Appl Genet，2004，108：1024-1032]；利用连锁的分子标记RM24将广谱抗病基因Pi-2基因导入珍汕97B等[陈志伟等，抗稻瘟病基因Pi-2紧密连锁的SSR标记的筛选与应用。分子植物育种，2004，2(3)：321-325]。分子标记辅助选择的一个重要的难点在于分子标记的多态性。无论抗感品种杂交的抗性转育还是抗抗品种杂交的抗性聚合，都需要分子标记在品种间存在多态性，因此分子标记辅助选择存在品种的局限性，尤其是遗传背景相近品种间的多态性频率不高，这就需要对一个抗病基因开发不同类型的、多个分子标记供不同品种间抗病基因转育或聚合的辅助育种应用。如Jia等根据已克隆的抗稻瘟病基因Pi-ta的多态性开发了多个基于PCR的分子标记[Jia Y L et al.Development ofdominant rice blast Pi-ta resistance gene markers.Crop science，2002，42(6)：2145-2149]。我国地方品种中蕴涵着丰富的抗稻瘟病资源。由于稻瘟病菌对特定品种结构和环境的不断适应，稻瘟病菌小种呈现明显的地理分布特征。根据基因对基因的关系，在缺乏遗传交流的地方品种中，抗病基因应该也存在地域分布。我国品种中发现一些新的抗稻瘟病基因资源正说明了这一点[朱立煌等。用分子标记定位一个未知的抗稻瘟病基因。中国科学(B辑)，1994，24(10)：1048～1052]。我们对太湖流域广谱、高抗稻瘟病的粳稻地方品种黑壳子粳的抗病基因组成进行分析，发现至少携带8个不同的Pi基因位点，先对其中的2个抗性基因Pi-hk1(t)、Pi-hk2(t)进行定位，并用于分析标记辅助选择育种。

发明内容

技术问题  本发明的目的是：筛选出几个与水稻抗稻瘟病基因Pi-hk1(t)、Pi-hk2(t)紧密连锁且不受环境影响的分子标记，这些分子标记用于水稻抗稻瘟病辅助选择育种，可以大大提高抗性的选择效率。

技术方案  本发明的实施方案如下。

与水稻抗稻瘟病基因连锁的分子标记，是通过以下方法筛选出的：

利用广谱、高抗稻瘟病的太湖流域粳稻地方品种黑壳子粳(国家种质资源库均有保存，可对外提供)，与感病品种苏御糯(国家种质资源库均有保存，可对外提供)杂交进行杂交，F₁种子自交产生F₂。用SDS法提取黑壳子粳、苏御糯及其F₁、F₂分离群体的单株DNA。

采用350对SSR分子标记对上述2个亲本及其F₁进行PCR扩增产物多态性筛选，然后依次对F₂抗感池、F₂群体的各个体筛选抗稻瘟病基因连锁标记。PCR反应程序为：DNA 94℃预变性5min后；94℃变性45min，55～65℃(根据具体引物确定温度)退火45min，72℃延伸1min，循环35次；最后72℃延伸7min。在eppendorf Mastercycle gradient DNA扩增仪上进行扩增，扩增产物在10％聚丙烯酰胺凝胶上进行分离鉴定，银染显色。

发现第11染色体上长臂末端的SSR标记RM144H_240+260、RM7654 H₁₂₀、RM72¹2H₁₂₀、RM5923H₁₅₀等与抗病基因Pi-hk1(t)连锁；第12染色体上的SSR标记RM277H₇₀、RM511H₈₀₊₉₀、RM2972H₉₀等标记与抗病基因Pi-hk2(t)连锁。

有益效果  本发明选用的是一个广谱高抗稻瘟病的水稻地方品种黑壳子粳开展抗稻瘟病基因的分子标记筛选。与目前传统育种技术相比，其优点是：

(1)标记稳定，不受环境影响。本研究在水稻品种黑壳子粳中鉴定出与2个抗瘟基因Pi-hk1(t)、Pi-hk2(t)连锁的SSR标记7个。黑壳子粳×苏御糯组合的亲本、F₁和部分F₂分离群体，于2002年分别在不同生育期取样，用这些标记进行检测，表明标记表现稳定，不受环境条件的影响。

(2)辅助育种选择目标明确，节约时间和成本。按照传统的育种技术，在提高抗性育种方法中，通常利用广谱高抗基因的供体亲本与受体亲本进行杂交、多次回交或进一步抗病基因聚合复交。但首先要筛选受体亲本的毒性菌株，而且这个菌株对供体亲本抗病基因无毒，否则无法鉴定抗病基因是否导入受体亲本，而且即使导入单个抗病基因，在生产上缺乏持久抗性，因此作用不大；在2个抗病基因的转育或聚合杂交的过程中，每个抗病基因必须分别筛选到明确的无毒菌株和毒性菌株，并且两个抗病基因的无毒菌株与毒性菌株只能互补不能相互覆盖，否则无法鉴定2个抗病基因是否都导入或聚合到后代中，因此鉴别菌株的筛选与利用是关键的一步，却需要花费大量时间和精力，接种大量的菌株才能确定，而且在每轮回交中都要对抗性进行鉴别菌株接种鉴定；尤其是多个抗病基因的聚合则很难利用接种稻瘟病菌方法进行筛选。因此传统育种方法鉴定工作量大，而且鉴定受季节限制、鉴定结果受环境条件等外界因素影响，要求群体大，盲目性也大，选择准确性差。通过本发明筛选出的与抗稻瘟病基因紧密连锁且不受环境影响的分子标记用于辅助选择，可以准确地靶定抗病基因，大大提高抗稻瘟病育种的选择效率。

三、具体实施方式

本发明的实施程序是：利用1996至1999年构建的黑壳子粳/丽江新团黑谷的重组自交系分别接种3个ZG1、1个ZC5、1个ZB15小种和日本鉴别菌株北1、研54-04、P-2b等不同的稻瘟病菌(都是公知公用小种菌株)，鉴定出8个不同的抗稻瘟病基因，我们对其中的2个基因进行连锁的分子标记筛选。北1菌株鉴定抗病基因Pi-hk1(t)，ZB15小种鉴定抗病基因Pi-hk2(t)。(王建飞，何新建，张红生等。太湖流域粳稻地方品种黑壳子粳对稻瘟病抗性的遗传分析。遗传学报2002，29(9)：803-807)

2001年黑壳子粳与感病品种苏御糯进行杂交，年底F₁种子送海南岛加代，自交产生F₂种子。2002年将F₂分离群体播种于育秧盘，在苗期接种北1和ZB15小种鉴定单株抗性，发现典型感病个体及时编号移栽，种植在南京农业大学网室。在分蘖期取样用SDS法提取F₂分离群体的单株DNA。成熟后收获种子，在2003年春季在F₃家系分别接种北1和ZB15小种复鉴抗性，以推测F₂基因型。

采用350对SSR分子标记首先对上述2个亲本及其F₁多态性筛选，然后分别对2个的抗病/感病池、F₂群体筛选抗稻瘟病基因连锁标记。SSR引物序列来源于 http://www.gramene.org/网站。委托上海生工合成。PCR反应体系为：模板DNA(10ng/ul)1ul；SSR引物对(4pmol/ul)0.7ul；10x缓冲液1ul；dNTP(2.5mM)0.2ul；MgCl₂(25mM)0.6ul；Taq酶(5U/ul)0.1ul；ddH₂O 6.4ul；总计10ul。PCR反应程序为：DNA 94℃预变性5min后；94℃变性45min，55℃(根据具体引物确定温度，一般为55℃)退火45min，72℃延伸1min，循环35次；最后72℃延伸7min。在eppendorf Mastercycle gradient DNA扩增仪上进行扩增，扩增产物在10％聚丙烯酰胺凝胶上进行分离鉴定，银染显色，然后在可见透射仪上观察、记录实验结果。

对抗感亲本间存在多态扩增带的SSR引物，分别对抗病/感病池进一步进行扩增鉴定。抗病/感病池的构建主要根据各F₃家系抗感表现推测F₂基因型，选择典型纯合抗病和纯合感病的F₂个体组成抗病/感病池。各家系分别接种北1和ZB15小种，每F₃家系鉴定20苗左右为一次重复，设置3～5次重复，分别组成2个抗病/感病池。抗病亲本的特异扩增带在抗病池中能重复出现而在感病池中不表现的引物，然后自用于(黑壳子粳/苏御糯)F₂单株DNA进行扩增。

分子标记筛选结果表明：有76对SSR引物的PCR扩增条带在黑壳子粳与苏御糯之间存在差异。发现有2个SSR标记RM144H_240+260(用RM144引物在黑壳子粳可扩增出240bp和260bp核苷酸长度的DNA片段，而在苏御糯可扩增出180bp核苷酸长度的DNA片段)、RM7654H₁₂₀(用RM7654引物在黑壳子粳可扩增出120bp核苷酸长度的DNA片段，而在苏御糯可扩增出110bp核苷酸长度的DNA片段)与水稻对菌株北1的抗稻瘟病基因Pi-hk1(t)连锁。进一步合成20对位于该染色体区域的SSR引物，发现标记RM7212H₁₂₀(用RM7212引物在黑壳子粳可扩增出120bp核苷酸长度的DNA片段，而在苏御糯可扩增出140bp核苷酸长度的DNA片段)、RM5923H₁₅₀(用RM5923引物在黑壳子粳可扩增出150bp核苷酸长度的DNA片段，而在苏御糯可扩增出170bp核苷酸长度的DNA片段)在双亲间存在差异并与Pi-hk1(t)连锁。利用MAPMAKER/EXP3.0程序进行连锁检测，证明这4个SSR标记：RM144H_240+260、RM7654H₁₂₀、RM7212H₁₂₀、RM5923H₁₅₀与抗稻瘟病基因Pi-hk1(t)连锁。

同样利用上述76对SSR引物，在另一个黑壳子粳/苏御糯抗感池(对ZB15小种)PCR扩增筛选标记。发现有位于第12染色体上的1个SSR标记RM277H₇₀(用RM277引物在黑壳子粳可扩增出70bp核苷酸长度的DNA片段，而在苏御糯可扩增出80bp核苷酸长度的DNA片段)与水稻抗稻瘟病基因Pi-hk2(t)连锁。进一步合成10对位于该染色体区域附近的SSR引物，有2个标记在双亲间存在差异并与Pi-hk2(t)连锁，RM511H₈₀₊₉₀(用RM511引物在黑壳子粳可扩增出80bp和90bp核苷酸长度的DNA片段，而在苏御糯可扩增出120bp和130bp核苷酸长度的DNA片段)，RM2972H₉₀(用RM2972引物在黑壳子粳可扩增出90bp核苷酸长度的DNA片段，而在苏御糯可扩增出80bp核苷酸长度的DNA片段)。利用MAPMAKER/EXP3.0程序它们进行连锁检测，证明这3个SSR标记：RM277H₇₀、RM511H₈₀₊₉₀、RM2972H₉₀与一个抗稻瘟病基因Pi-hk2(t)紧密连锁。因此用这些分子标记辅助选择可以有效地开展水稻抗稻瘟病育种。

7对SSR引物序列、退火温度、染色体标记位置，如下：

RM144：tgccctggcgcaaatttgatcc gctagaggagatcagatggtagtgcatg 55℃ Chr.11 117.3cM

RM7654：ctcatggttgtgtcgtggtc gtgcagtgccagtggtacg           55℃ Chr.11 115.1cM

RM7212：tcagctcagctcagcatcag actcatcaatcgtgtgctgc          55℃ Chr.11 117.0cM

RM5923：atagttcggggggtaattcg gtcgatcgagatagttgggg    55℃  Chr.11  117.3cM

RM277：cggtcaaatcatcacctgac caaggcttgcaagggaag       55℃  Chr.12  62.2cM

RM511：cttcgatccggtgacgac aacgaaagcgaagctgtctc       55℃  Chr.12  59.8cM

RM2972：gagccaatatgttgtcttga gttcagatcatgatgcctac    55℃  Chr.12  65.3cM

Claims (2)

1、与水稻抗稻瘟病基因Pi-hk1(t)、Pi-hk2(t)连锁的分子标记，是通过以下方法筛选出的：

(1)利用太湖流域粳稻地方品种黑壳子粳，与感病品种苏御糯进行杂交，F₁种子自交产生F₂；

(2)用SDS法提取黑壳子粳×苏御糯F₂分离群体的单株DNA；

(3)采用SSR分子标记进行水稻抗稻瘟病标记的筛选；

(4)共筛选出7个SSR标记，其中4个SSR标记RM144H_240+260、RM7654H₁₂₀、RM7212H₁₂₀、RM5923H₁₅₀与抗病基因Pi-hk1(t)连锁；3个SSR标记RM277H₇₀、RM511H₈₀₊₉₀、RM2972H₉₀与抗病基因Pi-hk2(t)连锁。

2、根据权利要求1所述与水稻抗稻瘟病基因的分子标记，采用的SSR分子标记进行水稻抗稻瘟病标记的筛选方法为：

用7对SSR引物RM144、RM7654、RM7212、RM5923、RM277、RM511、RM2972，对黑壳子粳和苏御糯亲本的DNA多态性进行初步分析；

PCR反应体系为：模板DNA 10ng/ul 1ul；SSR引物对4pmol/ul 0.7ul；10×缓冲液1ul；dNTP 2.5mM 0.2ul；MgCl₂ 25mM 0.6ul；Taq酶5U/ul 0.1ul；ddH₂O 6.4ul；反应总量10ul；

PCR反应程序为：DNA 94℃预变性5min后；94℃变性45min，55℃，退火45min，72℃延伸1min，循环35次；最后72℃延伸7min；

在DNA扩增仪上进行扩增，扩增产物在10％聚丙烯酰胺凝胶上进行分离鉴定，银染显色，然后在可见透射仪上观察、记录实验结果。