CN1840653A - 干酪乳杆菌改组菌株、制备方法及发酵生产l－乳酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种产酸速率快及耐酸性强的干酪乳杆菌基因组改组菌株、改组菌株的制备方法及该菌株发酵生产L－酸。该菌株于2005年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1466。分类命名为干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)。该菌株可用于发酵生产L－乳酸，接种量为2％～20％体积浓度，发酵培养基中包括2％～30％体积浓度的初始碳源和1％～15％体积浓度的氮源，发酵液于35℃～45℃、200rpm搅拌条件下进行厌氧发酵培养，发酵过程中控制发酵液的pH值为3.2～7.0，发酵15h～120h。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种产酸速率快及耐酸性强的干酪乳杆菌基因组改组菌株、该改组菌株的制备方法及该菌株用于发酵生产L-乳酸。
背景技术
乳酸是一种广泛应用于食品、医药、化工等行业的有机酸，尤其是以它作为单体可用于制备生物可降解塑料-聚乳酸，缓解能源和环境问题，因此乳酸的生产日益得到重视。由于乳酸的光学纯度对聚乳酸的物理性质和生物可降解率有重要影响，高光学纯度L-乳酸的需求量日益增加。微生物发酵可以获得理想光学纯度的乳酸，但是，在微生物发酵法生产乳酸过程中，因为菌种、培养基，培养条件、发酵和提取方法等诸多因素的影响，导致L-乳酸在产量、得率和纯度上都有很大差异。目前应用生产L-乳酸常用的菌有两大类，一类为乳酸菌，另一类为根霉(Rhizopus royzae)。根霉发酵属于好氧异型发酵，通过糖酵解途径，发酵产生L-乳酸的同时产生乙醇、富马酸等，产物复杂；糖转化率较低。乳酸菌发酵为同型发酵，可以将1mol葡萄糖转化为2mol乳酸，理论转化率为100％；另外，乳酸菌厌氧发酵可以大规模降低能耗，减少乳酸的生产成本。近年来，由于乳杆菌具有较强的耐酸性和可以利用基因工程选择生产D-和L-乳酸的能力而广泛用于乳酸发酵生产，其中干酪乳杆菌鼠李糖亚种(L.caseisubsp.Rhamnosus)是仅生产L-乳酸的同型乳酸发酵菌株，也是L-乳酸生产最常用菌株。但是，在使用此菌株生产L-乳酸过程中，存在两个重要问题，一个是产酸速率低，生产周期长；另一个是菌种耐酸性差，只能在近中性条件下发酵。乳酸发酵是典型的产物抑制型生物转化过程，游离乳酸的积累会抑制细胞生长和产品生产，通常需要加入氨水和碳酸钙等碱性物质进行中和，使发酵体系pH维持在6.0-6.5之间。值得注意的是，近年来发展起来的乳酸原位分离耦联发酵技术，即采用电渗析等方法除去反应体系中的乳酸来解除产物抑制作用。筛选能够在低pH条件下生长代谢的微生物，尤其是在pH低于3.8(乳酸pKa＝3.86)以下，游离乳酸浓度占总乳酸的比例将超过50％，可以有效的减少工业生产中杂菌的污染，简化产品后处理工艺，降低生产成本，还有利于发展乳酸发酵新工艺。因此，提高乳杆菌的耐酸性是改良乳酸生产菌种的一个重要发展方向，受到国内外学者的关注。Patnaik等人采用基因组改组技术，经过5轮改组，突变菌株能够在pH 3.9条件下生长，在pH 4.0条件下发酵，乳酸产量较原始菌株菌株提高了3倍。Porro等人用Kluyveromyces Lactis表达牛的乳酸脱氢酶基因工程菌在pH 4.5条件下发酵生产L-乳酸，但是同时产生乙醇，转化率仅为59.5％，而且发酵过程控制复杂，副产物多。我国天津科技大学也开展了细菌L-乳酸发酵的研究工作，经离子注入诱变获得临界乳酸浓度为24g/L的菌株，L-乳酸产量为70g/L。
基因工程作为比较成熟的基因操作技术在目前应用较为广泛，但是生物化学和蛋白质组学以及基因分析表明乳酸菌的酸应答是一个包括与多个酶和基因相关的反应机制的复杂过程。研究表明，乳酸菌的耐酸性与F1F0-ATPase、细胞膜通透性、细胞内碱性物质的产生以及细胞内存在的大分子保护物质(包括DNA和蛋白质)等多个机制有关。二维电泳分析表明Lactobacillus sanfranciscensis耐酸性突变子与原始菌株之间存在63种差异表达蛋白质。代谢工程分析表明代谢***优化需要多个酶的调节，除了基因控制以外，可能还需要一些非编码区域的参与。另外，本研究所用菌株还未被遗传表征。因此，直接用分子生物学手段提高其耐酸性和产酸速率是很困难的。利用传统诱变方法，虽然可以获得目的菌株，但是需要大量的时间和人力。基因组改组(genome shuffling)技术是由Patnaik等人(2002年)建立的进化工程新技术，即应用多母本递近融合(recursive fusion)，定向筛选具有重要表型特征改变的突变体。基因组改组作为有效的工业微生物菌种改造技术，可以用于工业微生物复杂表型的改良。值得注意的是，目前为止，仅仅应用基因组改组改良了菌株的某一个性状，而且融合后突变库容量大，筛选工作量大，筛选时间长。应用生物高技术手段进行分子育种，快速获得耐酸性强和产酸速率快的双突变L-乳酸生产菌种，并建立L-乳酸生产的工艺路线具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的之一是以干酪乳杆菌ATCC11443为原始菌株，通过改良基因组改组技术和筛选，获得产酸速率快、光学纯度高和耐酸性强的L-乳酸生产菌株；
本发明的目的之二是提供一种上述产酸速率快、光学纯度高和耐酸性强的L-乳酸生产菌株的生产方法；
本发明的目的之三是提供一种利用本发明获得的菌株发酵生产L-乳酸的方法。
原始菌株--干酪乳杆菌鼠李糖亚种ATCC11443(以下简称Lc-WT)购自于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，可以用于L-乳酸的生产。最佳培养温度为37℃，发酵生产乳酸过程中pH一般控制在5.5-6.5之间，发酵过程中需要大量的碱性物质中和，增加了L-乳酸下游处理操作，提高了生产成本。另外，目前新发展起来的乳酸原位分离耦联工艺可以解除发酵液中L-乳酸的抑制，所以提高该菌株的耐酸性是一个重要的研究方向。同时我们在前期实验过程中发现提高该菌株的生产速率还有一定的研究空间，通过提高生产速率来缩短生产周期。为了使该菌株能够更好的用于L-乳酸生产工业，降低产品生产成本，提高其耐酸性和生产速率具有重要意义。通过基因工程和传统诱变方法都很难获得这样两种复杂性状同时发生突变的菌株。本发明采用改良的基因组改组技术手段，可以解决这一问题。
本发明的步骤为：
第一步，原始菌株的培养
原始菌株-干酪乳杆菌鼠李糖亚种ATCC11443(以下称Lc-WT)采用MRS固体培养基进行分离纯化，挑取固体平板上较大的菌落接种于液体MRS培养基，37℃，120转/分钟，震荡培养过夜，8000转/分钟离心收集菌体，灭菌0.01M Tris·HCl(pH6.8)洗涤两次，重悬于灭菌0.01M Tris·HCl(pH 6.8)中；
第二步，菌种初级诱变
原始菌株培养后，分别采用物理和化学两种不同的诱变方法(物理方法如：紫外线(功率为15W)，X射线与Y射线；化学方法如：磺酸乙酯，硫酸二乙酯、环氧乙烷与亚硝基胍)对原始菌株进行诱变处理(具体诱变方法参考周德庆主编的《微生物学教程》244-250页)，再通过低pH平板、碳酸钙平板和摇瓶试验，分别筛选得到经物理方法诱变的产酸速率和耐酸性比原始菌株增加1％以上的多株突变菌株-Lc-UV，和经化学方法诱变的产酸速率和耐酸性比原始菌株增加1％以上的多株突变菌株-Lc-NTG；
第三步，基因组改组(genome shuffling)
(1)原生质体制备与再生：
菌体培养将分别经紫外线和NTG初级诱变筛选得到的突变菌株于MRS培养基中过夜培养后，分别接种(接种量为2～10％)于30ml含1.0～2.0％甘氨酸液体MRS培养基，37℃振荡培养，8000转/分钟离心收集菌体。将收集的菌体用LPB洗涤2次，重悬于LPB中，加入溶菌酶和变溶菌素，终浓度分别为1～20mg/mL和5～50ug/mL，于37℃酶解0.5～2.0h，显微镜下观察破壁情况，90％以上菌体破壁后，离心收获原生质体，LPB洗涤2次，重悬于LPB中备用，菌液中原生质体数均为108cfu/mL数量级。
(2)多母本递近式原生质体融合即基因组改组(genome shuffling)
将步骤(1)得到的紫外诱变和NTG诱变菌株的原生质体菌液等体积(由于上一步骤中获得的菌液中原生质体数是相同数量级的，故而同体积的每个菌株的原生质体菌液中原生质体是数量级相等的)混合后均分为两组，一组置于功率为15W的紫外线下处理10～50min，另一组置于60℃水浴中处理30～150min完全灭活后，混合离心，重悬于50μL LPB中，加9倍体积的40％PEG 6000，室温放置2～6min，加5mL LPB稀释，离心、洗涤，重悬于100μL LPB，倍数稀释涂RM平板，37℃，CO2(5％)培养箱避光培养5天。RM平板菌落为融合后菌株。把RM平板上菌落用灭菌生理盐水洗下来，稀释，涂pH 4.0YE平板，37℃，CO2(5％)培养箱避光培养，将pH 4.0平板上获得的菌落用生理盐水洗下来，适当稀释后涂布碳酸钙平板，37℃，CO2(5％)培养箱培养48h，挑取碳酸钙平板上透明圈较大的菌落进行摇瓶培养17h，测定产酸量，得到产酸量比原始菌株高1％以上的突变菌株，记作Lc-F1；
将多个Lc-F1菌株继续步骤(1)、(2)进行下一轮的原生质体制备、灭活、融合与筛选(pH 3.8平板、碳酸钙平板和摇瓶试验)，测定产酸量，得到产酸量比Lc-F1突变菌株高2％以上的突变菌株，记作Lc-F2；
再次将筛选到Lc-F2菌株继续按步骤(1)、(2)进行下一轮的原生质体制备、灭活、融合与筛选(pH 3.6平板、碳酸钙平板和摇瓶试验)，测定产酸量，得到产酸量比Lc-F2突变菌株高2％以上的突变菌株，记作Lc-F3。
对上述获得的Lc-F3各菌株进行稳定性试验、耐酸性和产酸量性质分析，获得一株耐酸性最强和产酸速率最快的突变菌株(Lc-F34)，采用高效液相色谱结果表明，该菌株发酵液中没有产生其他有机酸产生，乳酸仍为主要发酵产物，转化率高于90％；Boehringer Mannheim试剂盒测定其发酵液中L-乳酸光学纯度高于95％。该菌株已于2005年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市海淀区中关村北一条13号(100080)，保藏编号为CGMCC No.1466，分类命名为：干酪乳杆菌鼠李糖亚种Lactobacillus casei subsp.rhamnosus。
本发明提供的CGMCC No.1466菌株的特征如下：
1.菌体形态特征：菌体为弯曲形杆状，革兰氏染色阳性，无芽孢。
2.培养特征：菌落为乳白色，有明显突起，边缘整齐。液体培养可以在普通摇床中进行，发酵液浑浊，液面不产生膜。
3.生理生化特征：同型发酵，产L-乳酸；可利用葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖酸钠作为唯一碳源；接触酶阴性；明胶不液化；牛奶不胨化；不还原硝酸盐；不水解淀粉；生长pH值为3.2～9.5；生长温度为5～50℃。
4.菌株培养条件：平板培养需在5％的二氧化碳培养箱中进行，液体培养可以在普通摇床中进行，最适培养温度40℃，最适pH 5.5。
5.培养基：
固体纯化培养基：MRS(MAN，ROGOSA，SHARPE)琼脂培养基，包括蛋白胨10.0g，肉浸膏10.0g，酵母抽提物5.0g，葡萄糖20.0g，三水醋酸钠晶体5.0g，Tween 80 1.0mL，柠檬酸三铵2.0g，K2HPO4 2.0g，琼脂15.0g，MgSO4·7H2O0.2g，MnSO4·2H2O 0.05g，蒸馏水1000mL。也可以通过ATCC购买。
液体增殖培养基：MRS液体培养基(不含琼脂)。也可以通过ATCC购买。
发酵培养基：碳源包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖糖浆(长春大成实业集团)和乳糖的一种或多种；营养物质包括酵母抽提物、麦根、麦芽汁、毛发水解液、大豆蛋白水解液和玉米浆(玉米浆为棕褐色、黏稠状液体或干粉，玉米浸泡液通过双效或三效蒸发器进行处理即可制得玉米浆。玉米浆干粉中蛋白质含量为20％，氨基酸为12％；液体玉米浆中含蛋白质16％～30％，氨基酸8％～12％)的一种或多种。
根据“伯杰***细菌学手册”(Bergy’s Manual of Systematic Bacteriology)第八版提供的鉴定方法和上述试验结果表明，上述菌株仍属干酪乳杆菌鼠李糖亚种。
本发明采用灭活的双亲原生质体再融合互补获得活性融合子的方法，进行递近式原生质体融合，有效地提高了基因组改组(genome shuffling)后的筛选效率，为基因组改组技术的普遍应用提供了新途径。
本发明对每一轮突变菌株进行双表型(耐酸性和产酸速率)筛选，获得多个亲本突变株后进行基因组改组(genome shuffling)，使菌株的正突变特性高度组合，筛选到产酸速率快、耐酸性强、光学纯度高的L-乳酸生产菌株。
本发明采用低pH平板(每一轮改组后所用的低pH平板的pH不同，依次为4.2，4.0，3.8，3.6)和碳酸钙平板初筛两种简单的初筛方法及摇瓶复筛的方法，选育耐酸性强和产酸速率快的双表型突变的优良菌株。具体方法如下：
1.平板筛选
再生培养基(RM)平板：固体MRS培养基(不含Tween80)中含有2.5％的明胶，20mM的MgCl2，0.5M的蔗糖，115℃灭菌20分钟灭菌，冷却至50℃，添加0.5％的小牛血清，倒平板。将40％聚乙二醇(PEG)6000处理6分钟后的原生质体稀释液涂布再生平板，CO2(5％)培养箱37℃培养，5天后观察结果。
低pH值YE平板筛选：酵母抽提物15.0g，葡萄糖100.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，4M盐酸调节pH至4.2，4.0，3.8和3.6，115℃灭菌20分钟灭菌，冷却至50℃倒平板。将再生平板上融合子转移到低pH值YE平板，CO2(5％)培养箱37℃培养，5天后观察结果。
碳酸钙平板筛选：酵母抽提物15g，葡萄糖100g，CaCO3为2g，蒸馏水1000mL，115℃灭菌20分钟，冷却至50℃倒平板。将低pH平板上菌落刮下来，适当稀释后涂布于碳酸钙平板，CO2(5％)培养箱37℃培养，24h观察结果。
2.摇瓶试验 酵母抽提物15.0g，葡萄糖100.0g，琼脂3.0g，蒸馏水1000mL，混合均匀，分别取100mL溶液置于250mL三角瓶中，加9g碳酸钙，115℃灭菌20分钟。实验菌株过夜培养物接种(接种量为10％)于含100mL YE培养基(含9克碳酸钙)的250mL三角烧瓶，37℃，120转/分钟振荡培养。分别于15h～24h之间，每小时取样测定乳酸含量。
本发明所使用的分析方法：包括乳酸、乳酸钙、葡萄糖和生物量分析。
(1)乳酸：发酵液中总乳酸采用日本岛津LC-9A高效液相色谱法分析，色谱条件：SCR-101H有机酸柱，SPD-6AV紫外检测器，波长210nm，流动相为10mmol HClO4；L-和D-乳酸采用Boehringer Mannheim试剂盒分析。
(2)乳酸钙的定量测定：发酵液经8000rpm，离心5min，取上清液1mL于100mL的蒸馏水中，加入1M的NaOH 10mL，加钙指示剂2滴，用0.05M EDTA·Na2试剂滴定，终点为溶液颜色变为纯蓝色。由EDTA·Na2体积计算乳酸钙和乳酸的含量。结果计算如下：
乳酸钙含量：WCaL.2＝218.2c*V(mg)
乳酸含量：WLa＝180c*V(g/L)
其中：V-滴定消耗EDTA·Na2的量(mL)
c-EDTA·Na2的浓度(mol/L)
(3)葡萄糖：采用3′5-二硝基水杨酸(DNS)法进行分析。
(4)生物量：细胞密度用紫外分光光度计(cary50)测定OD600。将发酵液后收集菌体，蒸馏水洗涤，重悬于蒸馏水中，调整细胞密度OD600为10左右，取50mL菌体溶液于105℃干燥至衡重，称重并计算。1OD600菌体密度相当于0.35g/L菌体干重。
本发明还涉及一种生产L-乳酸的方法：首先采用本领域熟知的逐级种子扩大培养方法获得Lc-F34突变菌株的纯培养物，再按2％～20％发酵培养基体积浓度的接种量将Lc-F34突变菌株的纯培养物接种于含发酵培养基的密闭发酵设备中，发酵培养基中包括2％～30％体积浓度的初始碳源和1％～15％体积浓度的氮源，其余为水；发酵液于35℃～50℃、200rpm搅拌条件下进行厌氧发酵培养，发酵过程中控制发酵液的pH值为3.2～7.0，发酵15h～120h。
在具体发酵过程中，为获得较好的发酵效果，获得较高的产率，可以进行补料分批发酵，在上述发酵工艺基础上，需要补加碳源和氮源，使发酵液中碳源体积浓度维持在发酵液总体积的1％～20％之间，氮源的体积浓度维持在发酵液总体积的1％～10％之间；补加碳源时间为10h～20h；补加氮源时间为8h～20h。
发酵过程中使用碱性物质控制发酵液的pH值，所使用的碱性物质包括NaOH、氨水、CaCO3中的一种或多种。
本发明Lc-F34菌株所利用的碳源和氮源等营养物范围不局限于任何指定的糖类和含氮类物质，只要能被该菌株利用并转化形成乳酸的物质都可以。适合本发明的碳源包括：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖糖浆(长春大成实业集团)和乳糖，适合的氮源包括：硫酸铵、酵母抽提物(Yeast extract)、硝酸铵、玉米浆以及其它营养因素-硫酸镁、硫酸锰、柠檬酸钠、乙酸钠、米糠。
在优选实施方案中，本发明使用葡萄糖，蔗糖，乳糖作为碳源；硫酸铵、硝酸铵、牛肉膏、蛋白胨、酵母抽提物和玉米浆为氮源；进一步优选实施方案中，本发明使用葡萄糖作为碳源；酵母抽提物和玉米浆为氮源；本发明最佳实施方案中碳源采用D-葡萄糖，玉米浆为氮源。
进一步，本发明采用响应面分析方法，在5升发酵罐中进行本发明菌株Lc-F34发酵条件的优化实验，确定其发酵时间、温度、搅拌速度等生产工艺参数，以及分批补料发酵过程中最佳的补料时间。
本发明Lc-F34菌株接种量为2％～20％(体积比)，进一步优选实施方案中，本发明使用接种量为5％～15％，本发明最佳实施方案中接种量为10％。
本发明发酵过程的pH为3.2～7.0，发酵温度为35℃～50℃；进一步优选实施方案中，本发明控制pH为4.5～6.0，控制温度为37℃～42℃；本发明最佳实施方案中控制pH为5.5，控制温度为40℃。
本发明采用初始碳源浓度为2％～30％，进一步优选实施方案中，本发明使用初始碳源浓度为8％～20％，本发明最佳实施方案中初始碳源浓度为10％～16％。
本发明采用初始氮源浓度为1％～15％，进一步优选实施方案中，本发明使用初始氮源浓度-酵母抽提物为1.0％～2.5％、玉米浆4.5％～7.0％；最佳实施方式中氮源浓度-酵母抽提物为1.5～2.0％、玉米浆为5.0～6.5％。
附图说明
图1(A)：突变菌株库与原始菌株在低pH 4.4值YE平板上比较；
图1(B)：突变菌株库与原始菌株在低pH 3.6值YE平板上比较；
图2：改组菌株与原始菌株菌株在含CaCO3 YE摇瓶发酵结果图；
图3(A)：突变菌株与原始菌株在pH 3.8 YE培养基中生长比较图；
图3(B)：突变菌株与原始菌株在pH 3.8 YE培养基中产酸比较图；
图4(A)：改组菌株与原始菌株在pH 3.8条件下的摇瓶发酵生长过程比较图；
图4(B)：改组菌株与原始菌株在pH 3.8条件下的摇瓶发酵产酸过程比较图；
图5：优化发酵条件响应面法立体分析图；
图6：5L发酵罐补料分批发酵结果图；
图7：30L发酵罐的补料分批发酵结果图；
图8：pH 4.5条件下改组菌株与原始菌株发酵结果比较图；
图9：pH 5.0条件下改组菌株与原始菌株发酵结果比较图。
如图1所示，其中1表示原始菌株Lc-WT；2表示紫外线诱变菌株库Lc-UV(紫外线诱变后未经筛选的混合菌株)；3表示亚硝基胍诱变菌株库Lc-NTG(NTG诱变后未经筛选的混合菌株)；4表示第三轮改组菌株库Lc-F3(第三轮改组后未经筛选的混合菌株)。
如图2所示，改组菌株与原始菌株分别于YE摇瓶培养17h，乳酸产量的比较。WT表示原始菌株Lc-WT；UV依次表示紫外诱变菌株Lc-UV1，Lc-UV2；NTG依次表示NTG诱变菌株Lc-NTG1、Lc-NTG2、Lc-NTG3；F1依次表示第一轮改组菌株Lc-F11-16；F2依次表示第二轮改组菌株Lc-F21-24；F3依次表示第三轮改组菌株Lc-F31-34。
如图3所示，突变菌株与原始菌株菌株分别于pH 3.8 YE液体摇瓶培养48小时，发酵过程中于不同时间取样，测定OD600和乳酸产量。WT表示原始菌株Lc-WT；UV依次表示紫外诱变菌株Lc-UV1，2；NTG依次表示NTG诱变菌株Lc-NTG1-3；F1依次表示第一轮改组菌株Lc-F11-16；F2依次表示第二轮改组菌株Lc-F21-24；F3依次表示第三轮改组菌株Lc-F31-34。
如图4所示，第三轮改组菌株与原始菌株分别于pH 3.8液体YE中摇瓶培养48小时过程中，菌体密度(OD600)与乳酸产量的比较。曲线0表示原始菌株Lc-WT；曲线1表示改组菌株Lc-F31；曲线2表示改组菌株Lc-F32；曲线3表示改组菌株Lc-F33；曲线4表示改组菌株Lc-F34。
如图5所示，应用本发明所述菌株Lc-F34制备L-乳酸菌工艺中较适发酵温度为37～42℃，较适pH为5.0～6.0；最适发酵温度为40℃，最适pH为5.5。
如图6所示，为本发明所述应用菌株Lc-F34制备L-乳酸菌工艺中采用5L发酵罐补料分批发酵结果。Lc-F34以玉米浆和葡萄糖培养基(初糖浓度为10％)，控制转速200rpm，温度为40℃，以碳酸钙中和发酵过程中产生的乳酸，发酵12h，补加葡萄糖200.0g，玉米浆60.0g，发酵26h。曲线1：残糖；曲线2：菌体干重；曲线3：乳酸产量。
图7所示，30L发酵罐的补料分批发酵结果。Lc-F34以玉米浆和葡萄糖培养基(初糖浓度为10％)，控制转速200rpm，温度为40℃，以碳酸钙中和发酵过程中产生的乳酸，发酵24h，补加葡萄糖1600.0g，发酵40h。曲线1：残糖；曲线2：乳酸产量。
图8所示，pH 4.5条件下改组菌株与原始菌株发酵结果比较。Lc-WT和Lc-F34，分别于5L发酵罐发酵培养，发酵培养基为液体YE培养基，工作体积为3L，以7.0M的NH4OH将pH分别控制为4.5，发酵84h，监测发酵过程中菌体密度和乳酸产量的变化。曲线1：Lc-F34菌株残糖；曲线2：Lc-F34菌株菌体干重；曲线3：Lc-F34菌株乳酸产量。曲线4：Lc-WT菌株残糖；曲线5：Lc-WT菌株菌体干重；曲线6：Lc-WT菌株乳酸产量。
图9所示，pH 5.0条件下改组菌株与原始菌株发酵结果比较。Lc-WT和Lc-F34，分别于5L发酵罐发酵培养，发酵培养基为液体YE培养基，工作体积为3L，以7.0M的NH4OH将pH分别控制为5.0，发酵84h，监测发酵过程中菌体密度和乳酸产量的变化。曲线1：Lc-F34菌株残糖；曲线2：Lc-F34菌株菌体干重；曲线3：Lc-F34菌株乳酸产量。曲线4：Lc-WT菌株残糖；曲线5：Lc-WT菌株菌体干重；曲线6：Lc-WT菌株乳酸产量。
具体实施方式
实施例1：L-乳酸菌种的选育
(1)菌种初级诱变
本发明对原始菌种分别采用紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)进行如下诱变：
紫外线(UV)诱变：原始菌株采用MRS固体培养基进行分离纯化，挑取固体平板上较大的菌落接种于液体MRS培养基，37℃，120转/分钟，震荡培养过夜，8000转/分钟离心收集菌体，灭菌0.01M Tris·HCl(pH 6.8)洗涤两次，重悬于灭菌0.01MTris·HCl(pH 6.8)，调整菌体浓度为108cfu/mL。将10mL菌体溶液置于灭菌(160℃干热灭菌箱灭菌2h)的带磁力棒的培养皿(直径90mm)中，培养皿放置在磁力搅拌器载物台上，开启搅拌器，在预热20min的紫外灯(功率为15W，距离20cm)下边照射边搅拌，并计时。分别于0.5min，1.0min，1.5min，3.0min，5.0min各取2mL菌液混合，进行适当稀释后，涂布于pH 4.2 YE平板，CO2(5％)培养箱37℃培养，5天后观察结果。将pH 4.2 YE平板上的菌落用灭菌生理盐水洗下来，适当稀释后涂布碳酸钙平板，CO2(5％)培养箱37℃培养48h，挑取碳酸钙平板上透明圈儿较大的菌落进行摇瓶发酵，17h取样测定产酸量。获得两株产酸量较高的菌株-Lc-UV1和Lc-UV2。
亚硝基胍(NTG)诱变：原始菌株按紫外线诱变中所述方法进行培养，离心，洗涤，收集菌体，重悬于0.01M Tris·HCl(pH 6.0)中，调整菌体浓度为108cfu/mL。取10mL菌液等分为5份，分别加入NTG至终浓度为50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL，置于30℃下保温过夜，离心，洗涤，混匀后进行倍数稀释，按紫外线诱变后筛选方法进行筛选，获得三株NTG诱变菌株-Lc-NTG1、Lc-NTG2和Lc-NTG3。
以上诱变所得5株突变菌株为用于基因组重组的初始菌株。
(2)基因组改组(genome shuffling)
A.原生质体制备与再生将初步筛选的紫外线和NTG诱变的5个菌株于MRS培养基中过夜培养后，分别接种(接种量为10％)于30mL含1.0％甘氨酸MRS液体培养基，37℃振荡培养12h，离心收集菌体。将收集的菌体用LPB(0.01M Tris·HCl中含20mM MgCl2和0.5M蔗糖，pH 6.8)洗涤2次，重悬于LPB中，同时加入溶菌酶(Lysozyme北京鼎国生物技术有限责任公司提供)和变溶菌素(Mutannolysin，Sigma公司提供)，终浓度分别为10mg/mL和25ug/mL，于37℃酶解1.0～1.5h，显微镜下观察破壁情况。90％以上菌体破壁后，离心收获原生质体，LPB洗涤2次，重悬于LPB中备用。
B.多母本递近式原生质体融合即基因组改组(genome shuffling)将步骤A中制备的5株紫外诱变菌株和NTG诱变菌株的原生质体溶液等体积混合后(保证每个菌株的原生质体数量相等)均分为两组，一组置于紫外线下(功率为15W，距离紫外灯20cm)处理15min，另一组置于60℃水浴中处理50min完全灭活后，两组灭活后的原生质体混合离心，重悬于50μL LPB中，加9倍体积的40％PEG 6000，室温放置2min，加5mL LPB稀释，离心、洗涤，重悬于100μL LPB，倍数稀释涂RM平板，37℃，CO2(5％)培养箱避光培养5天。把RM平板上菌落用灭菌生理盐水洗下来，稀释，涂pH 4.0 YE平板，37℃，CO2(5％)培养箱避光培养，经pH 4.0平板、碳酸钙平板和摇瓶试验筛选，获得6株产酸量高、耐酸性强的突变菌株，即第一轮重组菌株Lc-F11、Lc-F12、Lc-F13、Lc-F14、Lc-F15、Lc-F16。将所得6个F1菌株按同样的策略进行培养，原生质体制备，融合，再生后于pH 3.8 YE平板、碳酸钙平板和摇瓶发酵实验筛选，获得第二轮重组菌株(F2)4株，记作Lc-F21、Lc-F22、Lc-F23、Lc-F24；再次将4株F2菌株进行融合、筛选(pH 3.6平板，碳酸钙平板和摇瓶发酵实验筛选)获得F3菌株，Lc-F31、Lc-F32、Lc-F33、Lc-F34。以未经PEG处理的每一轮原生质体再生菌株作对照。
(3)突变菌株的遗传稳定性实验
将第三轮改组菌株分别进行MRS液体培养基传代培养20次，涂布pH 3.6 YE平板，通过计算活菌数比较其在平板上耐酸性变化；同时，分别进行摇瓶发酵实验(37℃震荡培养，17h取样测定产酸量)，比较其产酸速率(表1)。结果可见，突变菌株经20次传代培养，在固体平板上耐酸性和摇瓶发酵容积产率没有发生显著变化，表明突变菌株具有很好的遗传稳定性。
表1.突变菌株稳定性实验结果
| 菌株 | 活菌数(cfu/mL) | 产酸速率(g/L/h) | ||
| 第1代 | 第20代 | 第1代 | 第20代 | |
| Lc-F31 | 3.26*108 | 3.57*108 | 5.68 | 5.71 |
| Lc-F32 | 2.97*108 | 2.61*108 | 5.79 | 5.66 |
| Lc-F33 | 3.15*108 | 3.84*108 | 5.62 | 5.46 |
| Lc-F34 | 3.37*108 | 3.52*108 | 5.81 | 5.79 |
实施例2：突变菌株与原始菌株的比较
(1)突变菌株与原始菌株在低pH YE平板上的比较
将紫外线(Lc-UV)，NTG(Lc-NTG)和第三轮改组(Lc-F3)突变菌株库与原始菌株Lc-WT分别于pH 4.4，3.6 YE平板上培养(图1)。Lc-UV，Lc-NTG和Lc-F3菌株库与Lc-WT在pH 4.4 YE平板上均能够生长繁殖，而在pH 3.6 YE平板上只有Lc-F3能够生长，其他菌株(库)不能生长。
(2)突变菌株与原始菌株产酸速率的比较
将各步骤制备的突变菌株与原始菌株(Lc-WT)分别于含9％CaCO3 YE摇瓶中发酵17小时，采用EDTA滴定法测定发酵液中乳酸的含量。比较其乳酸生产情况。结果(图2)表明，传统诱变方法(紫外线和NTG诱变)得到突变菌株(Lc-UV1，2和Lc-NTG1-3)摇瓶发酵培养17h，其乳酸生产量较原始菌株区别不显著；而改组菌株(Lc-F11-16，Lc-F21-24和Lc-F31-34)乳酸产量较原始菌株都有明显提高，第三轮改组菌株提高更显著，发酵17h，产酸量较野生菌株提高了27％。原始菌株的容积产率为4.55g/L/h，而第三轮融合菌株的容积产率在5.72-5.82g/L/h之间。取发酵液进行离心，过滤，稀释。采用高效液相色谱与Boehringer Mannheim试剂盒分析L-乳酸纯度。高效液相色谱结果表明，突变菌中没有产生其他有机酸，乳酸仍为主要发酵产物；Boehringer Mannheim试剂盒测定改组菌株发酵液中L-乳酸光学纯度达到98.2％。说明改组菌株的代谢途径未发生改变。
(3)突变菌株与原始菌株摇瓶发酵特征比较
突变菌株与原始菌株摇瓶发酵结果比较将突变菌株与原始菌株分别于pH 3.8YE液体摇瓶中培养48小时，比较其生长和乳酸生产情况(图3)。结果表明，传统诱变方法得到突变菌株(Lc-UV1-2和Lc-NTG1-3)在pH 3.8条件下发酵培养48h，其菌体生长与乳酸生产量较原始菌株区别不显著；而改组菌株(Lc-F11-16，Lc-F21-24和Lc-F31-34)无论是菌体生长量还是乳酸产量较原始菌株都有明显提高，第三轮改组菌株提高更显著，发酵48h，原始菌株(Lc-WT)菌体密度(OD600)为1.69，乳酸产量仅为1.59g/L，而改组菌株的菌体密度(OD600)达到3.4左右，乳酸产量均在4.6-5.0g/L之间，最好的改组菌株产酸量达到5.00g/L，是原始菌株的3.14倍。图3所示，
(4)第三轮重组菌株与原始菌株摇瓶发酵进程比较
将第三轮重组菌株与原始菌株分别接种于pH 3.8 YE液体培养基，37℃发酵96h，监测发酵过程中菌体密度与乳酸产量变化情况(图4)。由图4可见，发酵24h前，第三轮重组菌株与Lc-WT的生长(如图A所示)与产酸(如图B所示)有相似之处，且各菌株之间菌体密度和产酸量又存在差异，但是，第三轮重组菌株的菌体密度和产酸量均明显高于原始菌株。发酵24h后，原始菌株(Lc-WT)菌体密度略有增加，乳酸产量却没有变化，而改组后菌株的菌体密度与产酸量均呈现明显的上升趋势。发酵96h，而改组菌株的菌体密度(OD600)达到5.0左右，乳酸产量均在4.7-5.67g/L之间，最好的改组菌株产酸量达到5.67g/L，是原始菌株的3.5倍。说明改组菌株在酸性条件下仍能进行生长代谢，充分证明改组菌株的耐酸性得到明显提高。由于乳杆菌产酸主要集中在对数生长期，提高菌种在稳定期的产酸量能够有效提高发酵过程中乳酸的产量。改组菌株Lc-F31-34发酵96小时pH最低可以达到3.3，原始菌株仅达到3.5左右。
实施例3：培养基的优化
在L-乳酸生产过程中，原材料的价格是产品成本的一个重要影响因素。乳酸菌对营养要求较苛刻，通常需要以酵母抽提物为氮源，根据Tejayadi和Cheryan(1995)报导，用酵母抽提物为氮源生产L-乳酸的成本中，酵母抽提物占总成本的38％。筛选廉价的发酵培养基对于降低L-乳酸的生产成本是非常必要的。因此，我们采用Placket-Burman设计(本领域常用的一种统计优化实验设计法)方法对葡萄糖、玉米浆、米糠等营养物质进行优化，从而获得适于大规模生产的发酵培养基。
(1)二水平试验 对基因组改组菌株Lc-F34，采用Placket-Burman设计(表2)
表.2 Placket-Burman实验设计
| 序号 | X1 | X2 | X3 | X4 | X5 | X6 | X7 | X8 | X9 | X10 | X11 | X12 | X13 | X14 | X15 | Y(g/L) |
| 12345678910111213141516 | +1-1-1-1-1+1+1+1-1+1+1-1-1+1+1-1 | +1+1-1-1-1-1+1+1+1-1+1+1-1-1+1-1 | +1+1+1-1-1-1-1+1+1+1-1+1+1-1-1-1 | -1+1+1+1-1-1-1-1+1+1+1-1+1+1-1-1 | -1-1+1+1+1-1-1-1-1+1+1+1-1+1+1-1 | +1-1-1+1+1+1-1-1-1-1+1+1+1-1+1-1 | +1+1-1-1+1+1+1-1-1-1-1+1+1+1-1-1 | -1+1+1-1-1+1+1+1-1-1-1-1+1+1+1-1 | +1-1+1+1-1-1+1+1+1-1-1-1-1+1+1-1 | +1+1-1+1+1-1-1+1+1+1-1-1-1-1+1-1 | +1+1+1-1+1+1-1-1+1+1+1-1-1-1-1-1 | -1+1+1+1-1+1+1-1-1+1+1+1-1-1-1-1 | -1-1+1+1+1-1+1+1-1-1+1+1+1-1-1-1 | -1-1-1+1+1+1-1+1+1-1-1+1+1+1-1-1 | -1-1-1-1+1+1+1-1+1+1-1-1+1+1+1-1 | 91.855.864.850.452.273.866.690.050.4100.891.863.054.086.479.237.8 |
对葡萄糖、硫酸铵、酵母抽提物、硝酸铵、玉米浆、硫酸镁、硫酸锰、柠檬酸钠、乙酸钠、米糠等营养物质进行优化，考察各因素的主效应和交互作用的一级作用(表3)。利用SAS软件(Statistics Analysis System，著名的计算机统计软件，可由网上下载)进行分析，结果表明葡萄糖、酵母抽提物和玉米浆对改组菌株Lc-F34产酸有显著影响。
表3.Placket-Burman设计筛选培养基成分结果
| 培养基成分 | Estimate | Pr＞|t| |
| 葡萄糖硫酸铵酵母抽提物硝酸铵玉米浆硫酸镁硫酸锰柠檬酸钠乙酸钠米糠麸皮糖浆 | 1.2870.1390.326-0.0810.2620.021-0.294-0.103-0.0890.150-0.042-0.170 | 0.00060.19660.03140.42270.05660.81430.03820.31910.37950.17660.65260.1286 |
(2)玉米浆浓度对对改组菌株发酵生产L-乳酸影响
分别以2.5％，3.5％，4.0％，5％和5.5％玉米浆为氮源，D-葡萄糖为碳源，其浓度100g/L，进行摇瓶发酵试验，研究不同玉米浆浓度对改组菌株Lc-F34分批发酵生产乳酸的影响(表4)。结果表明，玉米浆浓度在2.5％-5.0％之间，L-乳酸浓度随葡萄糖浓度增加而增加。5.0％和5.5％玉米浆发酵结果基本一致。由此表明，5.0％玉米浆可以提供足够的氮源，玉米浆作为氮源最佳浓度是5.0％。
表4.初始玉米浆浓度对改组菌株Lc-F34发酵生产乳酸影响
| 实验序号 | 培养基(g/L) | 24h乳酸量(g/L) | |
| D-葡萄糖 | 玉米浆(液体) | ||
| 123456 | 100100100100100100 | 2.53.54.04.55.05.5 | 41.3462.578.6889.3698.4397.38 |
(3)初始葡萄糖糖浓度对改组菌株发酵生产L-乳酸影响
分别以5％玉米浆为氮源，D-葡萄糖浓度为30g/L，50g/L，70g/L，90g/L，110g/L，140g/L，170g/L，200g/L进行摇瓶发酵试验，研究不同初始葡萄糖浓度对改组菌株Lc-F34分批发酵生产乳酸的影响(表5)。结果表明，L-乳酸浓度随葡萄糖浓度增加而增加。转化率随葡萄糖浓度的增加呈下降趋势，容积产率受初糖浓度影响也很大，在初糖浓度30～110g/L之间时，容积产率逐渐增大，初糖浓度为110g/L时，容积产率达到最大(5.84g/L/h)，葡萄糖浓度继续增加，容积产率反而减少。这是因为高糖浓度下，渗透压增大，影响了菌体的正常生长和代谢。为了得到较高的L-乳酸的生产速度和葡萄糖转化率，可以将初糖浓度控制在90～110g/L进行补料分批发酵。补料时间应该控制通过监测发酵液中葡萄糖浓度进行控制，使发酵液中的总糖浓度不超过110g/L为益。
表5.初始葡萄糖浓度对改组菌株Lc-F34发酵生产乳酸影响
| 初始葡萄糖(a/L) | 发酵时间(h) | 转化率(％) | 容积产率(a/L/h) | 乳酸浓度(a/L) |
| 30507090110140170200 | 7.010.013.516.018.525.044.061.5 | 9998.897.998.198.097.490.287.7 | 4.244.905.075.565.845.43.112.27 | 29.749.068.589.0108.0136.4142.6156.1 |
(4)玉米浆和酵母抽提物发酵生产L-乳酸结果比较
采用5L发酵罐发酵培养，发酵培养基营养物质分别为酵母抽提物和玉米浆，D-葡萄糖浓度为10％，工作体积为3L，接种Lc-F34(接种量10％)，以7.0M的NH4OH将pH控制为5.5(表6)。
表6.分别以酵母抽提物和玉米浆为氮源Lc-F34菌株发酵生产L-乳酸的结果
| 培养基 | 酵母抽提物(1.5％) | 玉米浆(5％) |
| pH发酵时间(h)细胞浓度(OD600)L-乳酸(g/L)转化率(％)最大容积产率(g/L/h) | 5.52420.792.3495.315.88 | 5.52421.292.1594.565.82 |
以玉米浆代替酵母抽提物为氮源发酵17h，菌体密度和乳酸产率，转化率及最大体积产率与酵母抽提物为氮源发酵相同时间结果基本一致。因此，玉米浆可以作为氮源用于乳酸发酵生产。
实施例4：Lc-F34菌株补料分批发酵生产乳酸
为了进一步研究采用改组菌株Lc-F34补料分批发酵生产乳酸工艺，采用摇瓶(酵母抽提物1.5％，D-葡萄糖初始浓度为100g/L，250mL三角瓶，装液量100mL)发酵，并于不同时间分批补加D-葡萄糖100g/L，发酵至终点(残留D-葡萄糖为1g/L以下)，取样测定乳酸含量(见表7)。由表7可见，发酵液中乳酸浓度和总发酵时间随补料时间不同而发生变化，补料时间控制在12～15h之间，乳酸产量最高，发酵时间最短。
表7：不同补料时间对Lc-F34菌株发酵生产乳酸的影响
| 补加D-葡萄糖(g/L) | 补料时间(h) | 补料前残留D-葡萄糖(g/L) | 总发酵时间(h) | 转化率(％) | 容积产率(g/L/h) | 乳酸浓度(g/L) |
| 100100100100100100100 | 10111213141516 | 55.149.743.436.328.421.112.6 | 50484545454647 | 85.588.394.894.595.592.891.6 | 3.403.664.194.184.224.013.87 | 159.1164.2176.4175.7177.6172.6170.4 |
实施例5：发酵条件优化
采用5L发酵罐发酵培养，以液体YE培养基为发酵培养基，工作体积为3L，以7.0M的NH4OH控制pH，搅拌速度为200rpm，温度和pH按表8中设计进行发酵17h。
表8.改组菌株Lc-F34发酵温度和pH优化试验设计
| 变量 | -a | -1 | 0 | +1 | +a |
| 温度(℃)pH | 32.94.25 | 354.5 | 405.5 | 456.5 | 47.16.75 |
应用响应面分析(Response Surface Methodology，一种统计优化技术)对改组后菌株的最佳发酵条件进行优化-发酵温度和pH值，运行SAS软件分析实验结果(图5)。所得到的拟合全变量二次回归方程为：
Y＝68.7530+7.2897pH+10.9896T-8.3966pH*pH+0.125T*pH-12.1477T*T
由结果可知，决定系数R2＝0.8935，说明回归方程的拟合程度较好。温度与pH是影响改组菌株Lc-F34生产L-乳酸的重要因素(p＝0.0326和0.0418)。由图5可知，较适发酵温度为37～42℃，pH为4.5～6.0，最适合pH为5.5，温度为40℃。
实施例6：采用小容量发酵罐分批补料发酵生产乳酸
采用5L发酵罐，初始培养基为酵母抽提物(1.5％)和D-葡萄糖培养基(初糖浓度为10％)，初始工作体积为2.5L，接种10％Lc-F34培养液，控制转速200rpm，温度为40℃，以碳酸钙(在灭菌后培养基中添加9％的灭菌碳酸钙)中和发酵过程中产生的乳酸(pH控制在4.5-6.0)，发酵10h，补加酵母抽提物30.0g；发酵12h，残糖降为4％，补加D-葡萄糖200.0g，发酵至26h，发酵液总体积为3.36L，残糖为1.02％，L-乳酸的浓度为118.38g/L，转化率为95.7％，平均体积产率为4.55g/L/h(图6)。常规乳酸生产必须添加碳酸钙或氨水等碱性物质进行中和，否则过多的乳酸会抑制菌体生长。
实施例7：采用大容量发酵罐分批补料发酵生产乳酸
采用30L发酵罐，以玉米浆(5％)和D-葡萄糖为发酵基质，初糖浓度为16％，初始工作体积为20L，接种10％Lc-F34培养液，控制转速200rpm，温度为40℃，以碳酸钙(在灭菌后培养基中添加9％的灭菌碳酸钙)中和发酵过程中产生的乳酸(pH控制在4.5-6.0)。发酵15h，补加玉米浆800g；发酵24h后，补加D-葡萄糖1600.0g，继续发酵至40h，发酵液总体积为26.4L，残糖为0.10％，L-乳酸的浓度为154.6g/L，转化率为91％，平均体积产率为3.85g/L/h(图7)。
实施例8：低pH发酵生产L-乳酸
Lc-WT菌株的最低生长pH为4.4，采用接近原始菌株的最低生长pH(4.5)的液体YE培养基培养Lc-WT和Lc-F34，比较两菌株的生长及生产特征。将第三轮重组后筛选的耐酸性高产菌株Lc-F34和Lc-WT菌株分别于5L发酵罐发酵培养，发酵培养基为液体YE培养基，工作体积为3L，以7.0M的NH4OH将pH分别控制为4.5，5.0，监测发酵过程中菌体密度和乳酸产量的变化。在pH 4.5(图8)的条件下，发酵至84h，Lc-F34菌株获得的菌体干重4.54g/L，发酵液中残糖为3.82g/L，乳酸浓度83.8g/L，转化率为86％，平均容积产率为0.998g/L/h，最大容积产率3.59g/L/h；而Lc-WT菌株获得的菌体干重3.59g/L，发酵液中乳酸浓度52.17g/L，残糖为43.1g/L，转化率为56.2％，平均容积产率为0.623g/L/h，最大容积产率3.02g/L/h。Lc-F34菌株发酵液中乳酸浓度较原始菌株提高了60.6％，平均容积产率提高了60.2％。
在pH 5.0(图9)的条件下，发酵至60h，Lc-F34菌株获得的菌体干重6.34g/L，发酵液中残糖为0.93g/L，乳酸浓度88.06g/L，转化率为89.6％，平均容积产率为1.47g/L/h，最大容积产率5.17g/L/h；而Lc-WT菌株获得的菌体干重4.36g/L，发酵液中乳酸浓度61.75g/L，残糖为43.1g/L，转化率为74.9％，平均容积产率为1.03g/L/h，最大容积产率4.11g/L/h。结果表明，在接近原始菌株的最低生长pH条件下，改组菌株比原始菌株耐酸性有显著提高。突变菌株可以用于低pH发酵工艺生产L-乳酸。Lc-F34菌株发酵液中乳酸浓度较原始菌株提高了42.61％，平均提高了42.7％。
在pH(5.0和4.5)较低条件下，Lc-F34菌株比原始菌株的产酸量和容积产率均有明显提高，说明改组菌株的耐酸性较原始菌株明显增强。尤其在pH 4.5条件下进行发酵，发酵液中游离乳酸的含量约占总乳酸含量的20％，可以降低发酵过程中的碱性物质的用量，降低乳酸下游处理的成本；另外，可以适用于新发展起来的乳酸原位分离耦联发酵生产工艺(电渗析等)。
Claims (10)
1、一种干酪乳杆菌改组菌株(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)-Lc-F34，其于2005年9月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No1466，分类命名为：干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)。
2、一种制备权利要求1所述干酪乳杆菌改组菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)-Lc-F34的方法，其包括如下步骤：
第一步，原始菌株的培养
将原始菌株—干酪乳杆菌鼠李糖亚种ATCC11443，采用MRS固体培养基进行分离纯化，挑取固体平板上较大的菌落接种于液体MRS培养基，37℃，120转/分钟，震荡培养过夜，8000转/分钟离心收集菌体，灭菌0.01M Tris·HCl、pH6.8洗涤两次，重悬于灭菌0.01M Tris·HCl、pH6.8中；
第二步，菌种初级诱变
分别采用紫外线-UV和亚硝基胍-NTG两种诱变方法对第一步培养的原始菌株进行诱变处理，再通过低pH平板、碳酸钙平板和摇瓶试验，分别筛选得到经紫外线诱变的产酸速率和耐酸性比原始菌株增加1％以上的多株突变菌株-Lc-UV，和亚硝基胍诱变的产酸速率和耐酸性比原始菌株增加1％以上的多株突变菌株-Lc-NTG；
第三步，基因组改组
(1)原生质体制备与再生
菌体培养将经UV和NTG初级诱变筛选得到的Lc-UV和Lc-NTG突变菌株于MRS培养基中过夜培养后，分别接种于30ml含1.0～2.0％甘氨酸液体MRS培养基，接种量为2～10％，37℃振荡培养，8000转/分钟离心收集菌体；将收集的菌体用LPB洗涤2次，重悬于LPB中，加入溶菌酶和变溶菌素，终浓度分别为1～20mg/mL和5～50ug/mL，于37℃酶解0.5～2.0h，显微镜下观察破壁情况，90％以上菌体破壁后，离心收获原生质体，LPB洗涤2次，重悬于LPB中备用，菌液中原生质体数均为108cfu/mL；
(2)多母本递近式原生质体融合即基因组改组
将步骤(1)得到的UV诱变和NTG诱变菌株的原生质体菌液等体积混合后均分为两组，一组置于功率为15W的紫外线下处理10～50min，另一组置于60℃水浴中处理30～150min完全灭活后，混合离心，重悬于50μL LPB中，加9倍体积的40％ PEG 6000，室温放置2～6min，加5mL LPB稀释，离心、洗涤，重悬于100μL LPB，倍数稀释涂RM平板，37℃，CO2(5％)培养箱避光培养5天。RM平板菌落为融合后菌株。把RM平板上菌落用灭菌生理盐水洗下来，稀释，涂pH4.0YE平板，37℃，CO2(5％)培养箱避光培养，将pH4.0平板上获得的菌落用生理盐水洗下来，适当稀释后涂布碳酸钙平板，37℃，CO2(5％)培养箱培养48h，挑取碳酸钙平板上透明圈较大的菌落进行摇瓶培养17h，测定产酸量，得到产酸量比原始菌株高2％以上的突变菌株-Lc-F1；将多个Lc-F1菌株继续步骤(1)、(2)进行下一轮的原生质体制备、灭活、融合与pH3.8平板、碳酸钙平板和摇瓶试验筛选，测定产酸量，得到产酸量比Lc-F1突变菌株高2％以上的突变菌株-Lc-F2；
再次将筛选到Lc-F2菌株继续按步骤(1)、(2)进行下一轮的原生质体制备、灭活、融合与pH3.6平板、碳酸钙平板和摇瓶试验筛选，测定产酸量，得到产酸量比Lc-F2突变菌株高2％以上的突变菌株-Lc-F3；
对上述获得的F3菌株进行稳定性试验、耐酸性和产酸量性质分析，获得一株耐酸性最强和产酸速率最快的突变菌株-Lc-F34，即本发明所述的干酪乳杆菌改组菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)。
3、权利要求1所述的干酪乳杆菌改组菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)-Lc-F34在用于厌氧发酵生产L-乳酸中的应用。
4、如权利要求3所述的干酪乳杆菌改组菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)-Lc-F34在用于厌氧发酵生产L-乳酸中的应用，其工艺步骤如下：经逐级种子扩大培养获得Lc-F34突变菌株的纯培养物，再按2％～20％发酵液体积浓度的接种量将Lc-F34突变菌株的纯培养物接种于含发酵培养基的密闭发酵设备中，发酵培养基中包括2％～30％体积浓度的初始碳源和1％～15％体积浓度的氮源，其余为水；发酵液于35℃～50℃、200rpm搅拌条件下进行厌氧发酵培养，发酵过程中控制发酵液的pH值为3.2～7.0，发酵过程中保持发酵液中碳源体积浓度在1％～20％。
5、如权利要求4所述的干酪乳杆菌改组菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)-Lc-F34在用于厌氧发酵生产L-乳酸中的应用，其特征在于：使用碱性物质控制发酵液的pH值。
6、如权利要求4所述的干酪乳杆菌改组菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)-Lc-F34在用于厌氧发酵生产L-乳酸中的应用，其特征在于：碱性物质为NaOH、氨水或GaGO3中的一种或多种。
7、如权利要求4所述的干酪乳杆菌改组菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)-Lc-F34在用于厌氧发酵生产L-乳酸中的应用，其特征在于：碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖糖浆或乳糖，氮源为硫酸铵、酵母抽提物、硝酸铵、玉米浆、硫酸镁、硫酸锰、柠檬酸钠、乙酸钠或米糠。
8、如权利要求7所述的干酪乳杆菌改组菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)-Lc-F34在用于厌氧发酵生产L-乳酸中的应用，其特征在于：碳源为葡萄糖；氮源为酵母抽提物或玉米浆。
9、如权利要求8所述的干酪乳杆菌改组菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)-Lc-F34在用于厌氧发酵生产L-乳酸中的应用，其特征在于：Lc-F34菌株接种量为5％～15％，发酵过程控制pH为4.5～6.0，控制温度为37℃～42℃，碳源浓度为8％～20％，氮源浓度—酵母抽提物为1.0％～2.5％或玉米浆4.5％～7.0％。
10、如权利要求9所述的干酪乳杆菌改组菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)-Lc-F34在用于厌氧发酵生产L-乳酸中的应用，其特征在于：Lc-F34菌株接种量为10％，发酵过程pH为5.5，控制温度为40℃，碳源浓度为10％～16％，氮源浓度—酵母抽提物为1.5～2.0％或玉米浆为5.0～6.5％。
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Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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