CN1252244C - 耐氨性的l（+）－产乳酸菌及生产l（+）－乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
提供一种新的属于根霉菌属、具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌，以及使用其高收率地制备L(+)-乳酸的方法。优选使用用亚硝基胍使根霉MK96(Rhizopus sp.MK96)变异得到的具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌，特别是根霉MK96-1156(Rhizopus sp.MK96-1156)菌株。可以通过在有氧条件下培养上述菌株生产L(+)-乳酸，优选通过加入氨调整培养液的pH值。
Description
本发明涉及属于根霉菌属的、具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌及使用该菌种生产L(+)-乳酸的方法，更详细的说是涉及用亚硝基胍使作为母株的根霉MK96(Rhizopus sp.MK96)变异得到的具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌，也就是说，涉及根霉MK96-1156本身及用它们在有氧的条件下以氨气作为中和剂调节培养液的pH，从而高收率地制备L(+)-乳酸的方法。
乳酸可以作为食品添加剂用于酒类、清凉饮料、咸菜、酱油、面包、啤酒等的制备中，此外，在皮革、纤维、塑料等工业中也被利用，是一种有用的化合物。
目前，用发酵法生产乳酸，一般是将属于裂殖菌类的乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)等被称作乳酸菌类的菌在无氧的条件下培养，进行乳酸发酵。乳酸菌的培养过程中使用的培养基是以糖、淀粉等作为主原料，并向其中添加作为副原料的酵母提取物等营养源。利用这些乳酸杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)等菌进行的乳酸发酵具有过程简单，且乳酸收率高的优点，但是一般来说，因为酵母提取物等副原料的价格高，所以得到的L(+)-乳酸的价格也就高。另外，由于这些菌的大小均为1μm以下，与培养基的分离比较困难，培养处理的操作性差。
另一方面，也有使用根霉菌属类的丝状菌在含有碳酸钙的培养液中通过有氧培养生产乳酸的方法。从糖得到乳酸的收率在70-80％，由于葡萄糖等单糖能够作为碳源，而且培养基的成份除糖以外只要求少量的无机盐，所以发酵后培养基中的杂质比较少。例如，Kristofikova等(L.Kristofikova，M.Rosenberg，，A.Valnove，J.Sajbidor及M.Certik Folia Microbiol，36(5)，451-455(1991))以葡萄糖作为碳源，由无根根霉CCM8109(Rhizopusarrhizus CCM8109)生产79克/升乳酸。
另外，也有使用米根霉NRRL395(Rhizopus oryzae NRRL395)菌体生产乳酸的方法。例如，Yang等(C.W.Yang，，Zhongjing Lu及Geroge T.Tsaso；ApplidBiochemistry and Biotechology vol.51/52 p57-71，1995)描述的方法是在有氧的条件下，用添加了碳酸钙的培养液培养该菌体，得到收率为78％的乳酸。
另外，上述根霉菌属的菌体容易形成聚集体(粒状沉淀)，由于能够简单的与培养基分离，所以容易从发酵后的培养基中分离纯化乳酸和该粒状沉淀。利用了这种粒状沉淀的优点的方法，有使用米根霉NRRL395(Rhizopus oryzaeNRRL395)，在以木糖作为碳源的培养液中使之形成菌体粒状沉淀，用该粒状沉淀由葡萄糖生产乳酸的方法。例如，Soccol等(C.R.Soccol，B.Marin，M..Raimbault；Appl Microbiol Biotechnol 41，286-290(1991))在有氧的条件下，在含有中和剂碳酸钙的培养液中发酵培养得到的菌体粒状沉淀，得到收率约为75％的乳酸。采用这种方法，在含有碳酸钙的培养液中培养该粒状沉淀，通过每次消耗完作为碳源的葡萄糖后再在新的培养液中培养，可以连续的生产乳酸。
这样，在有氧的条件下培养根霉菌属的菌株，以葡萄糖和淀粉为原料生产L(+)-乳酸时，与使用乳酸菌的场合相比，具有多种优点。
但是，在有氧的条件下培养根霉菌，产生乳酸的收率一般比较低，而且发酵大多需要7-10天，生产乳酸的时间长。因此，与使用乳酸菌在无氧条件下的发酵比较，缺乏工业实用性。
另外，虽然上述Soccol等也报告了再次使用根霉菌的连续培养，但是使用该菌株时，3次以后乳酸的产量大大降低，为了防止这种事情的发生，就必须向培养液中添加尿素作为氮源。
另外，一般的采用产乳酸菌生产L(+)乳酸的方法中，为了抑制产生的L(+)-乳酸阻碍产物的产生，而且为了中和培养液的酸度，必须使用碳酸钙及氢氧化钠作为中和剂中和L(+)-乳酸。以高收率得到乳酸时，目前已知的用根霉菌属进行乳酸发酵所使用的中和剂几乎都是碳酸钙，为了从生成的乳酸钙中分离纯化乳酸，除了使用添加硫酸分离硫酸钙沉淀的方法以外没有其它方法，由于生成大量副产物硫酸钙，在工业上也是一个问题。某些时候使用氨气作为中和剂得到乳酸铵时，由于氨气阻碍了菌体的活性，所以很容易在收率及生产性方面出现不理想的情况。而且，上述Soccol等指出，不使用碳酸钙等作为生成的酸的中和剂，而是用聚4-乙烯吡咯烷酮(PVP)树脂吸附分离L(+)-乳酸，由于细胞收到损伤而存在产量降低的问题。
另外，可以由含有多糖的糖类在菌体内各种酶的作用下产生乳酸，如果使用的菌株本身营养要求复杂，就必须在培养液中加入各种成份，这样从培养液中分离产乳酸菌产生的乳酸就比较困难，不容易制备收率好、纯度高的乳酸。另外，由于培养条件生成了副产物，为了乳酸纯化阶段的操作简便，就必须选择副产物生成少的培养条件。另一方面，为了高效率的使用菌体，优选再次使用产乳酸菌，但是一般如果再次使用菌株则难以完全满足其营养要求，生成乳酸能力低下的场合比较多。因此，必须选择再次使用性强的菌株。
本发明鉴于上述课题，提供了一种使用亚硝基胍使根霉MK96(Rhizopussp.MK96)变异得到具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌。
另外，还提供一种根霉MK96-1156(Rhizopus sp.MK96-1156)的菌株。
另外，还提供一种在有氧条件下培养上述菌株生产L(+)-乳酸的方法。
另外，还提供一种根霉MK96(Rhizopus sp.MK96)。
本发明中，只要是属于根霉菌属、具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌，就可以使用。属于根霉菌属的、具有乳酸发酵能力的微生物，例如可以举出无根根霉(Rhizopus arrhizus)、德列马根霉(Rhizopus delemar)、爪哇根霉(Rhizopusjavanic)、变黑色根霉(Rhizopus nigricans)、米根霉(Rhizopus oryzae)、葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)等，其中优选米根霉(Rhizopus oryzae)或无根根霉(Rhizopus arrhizus)，L(+)-乳酸生成的能力高。这是因为这些属于根霉菌属、具有乳酸发酵能力的菌类能够呈颗粒状、块状培养。
本发明中使用的L(+)-产乳酸菌，还必须具有耐氨性。作为这样的菌株，有本发明者们采用下述方法使从土壤中新分离出的母株根霉MK96(Rhizopussp.MK96)突变得到的变异株根霉MK96-1156(Rhizopus sp.MK96-1156)。也就是说，本发明者为了解决上述问题，以得到具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌为目的，从自然界新分离出可以生成L(+)-乳酸的根霉菌属的菌体，经变异处理使之具有耐氨性，从而得到具有较高L(+)-乳酸生成能力的菌株。因此，即使使用氨气作为中和剂的时候，也能够产生L(+)-乳酸，并且不会导致收率降低。
(1)母株的第1次筛选
从水田土壤中取样品1g，用5ml灭菌蒸馏水使之悬浊，调制成样品原液。将其适当稀释得到的最终稀释液用康拉迪氏(コンラ-ジ)棒分别取0.1ml涂在如表1所示的含有L(+)-乳酸的马铃薯琼脂培养基的分离用琼脂培养基上。接种后在24℃的恒温槽中培养，从第三天开始，用铂丝取出发展起来的菌落，移植到具有表1所示组成的斜面琼脂培养基上。土壤样品取1次约有50株，土壤样品取100次合计约分离出3500株推测是真菌的菌株。这些真菌中，从斜面琼脂培养基中，选择800株认为形态接近根霉菌属的菌作为1次筛选通过菌株。另外，表1所示的各种琼脂培养基的组成是用1升蒸馏水中的g数来表示的。
表1
| 分离用琼脂基质 | 斜面培养琼脂基质 | |
| 马铃薯蔗糖L(+)-乳酸琼脂pH(灭菌前) | 200201207(NaOH) | 200201207(NaOH) |
| 用高压灭菌器(1kg/cm2)G灭菌15分钟 | 用高压灭菌器(1kg/cm2)G灭菌15分钟 |
(2)采用试管振荡培养进行第2次筛选
将前述斜面琼脂培养基上的孢子取1铂丝，接种到10ml表2所示的前培养基上，在试管振荡培养装置中培养2天。将1ml这种前培养基接种到装有10ml表2所示的生产培养基的试管中，采用与前培养同样的方法振荡培养1天。然后，添加碳酸钙1g，进一步振荡培养2天。将培养上清液用バ-カ-サマ-ソン法比色定量L(+)-乳酸。对于所有1次通过的菌株800株，调查其L(+)-乳酸蓄积量，发现从静冈县藤枝市附近水田采集的土壤样本得到的菌株在其中具有最高的L(+)-乳酸蓄积量，将此菌株命名为根霉MK96(RhizopussD.MK96)。
表2
| 前培养基 | 生成培养基 | |
| 葡萄糖(NH4)2SO4KH2PO4ZnSO4·7H2OMgSO4·7H2OpH(灭菌前) | 1001.350.30.040.157(NaOH) | 1203.020.250.040.257(NaOH) |
| 用高压灭菌器(1kg/cm2)G灭菌15分钟 | 用高压灭菌器(1kg/cm2)G灭菌15分钟 |
(3)根霉MK96的菌学特征
下面叙述本菌的菌学性质。
(a)形态特征；用马铃薯琼脂培养基在24℃下培养得到的根霉MK96菌株的形态学特征有以下几点：
①孢子(sporangium)有中隔；
②只形成孢子囊、呈球形；
③孢子囊柄(sporangiophore)呈苍白色；
④有假根(Rhizoid)和匍匐丝(stolon)；
⑤孢子囊柄由假根的基部开始生长；
⑥孢子囊和菌丝层都很发达。
(b)生理学特征；使用表3所示的蔡氏(Czapek)培养基，研究培养本菌时培养温度及初始pH的影响。结果如表4-7所示。
表3
| 蔡氏(Czapek)培养基的组成(均是1升蒸馏水中的g数) | |
| NaNO3KH2PO4MgSO4·7H2OKClFeSO4·7H2O蔗糖 | 210.50.50.0130 |
| pH 6.0、用高压灭菌器(1kg/cm2)G灭菌 | |
表4：(b-1)增殖温度
| 温度(℃) | 增殖 | 温度(℃) | 增殖 |
| 20253035 | ++++++ | 40455055 | +--- |
| 根据结果可以判断出本菌繁殖界限温度在40-45℃ | |||
表5：(b-2)增殖pH(增殖温度30℃)
| pH | 增殖 | pH | 增殖 |
| 22.533.54.5 | --+++ | 5.566.578 | ++++++± |
表6：(b-3)各种碳水化合物与是否增殖
| 变换蔗糖，在添加了下述所示的碳水化合物的马铃薯琼脂培养基上24℃下培养，观察其繁殖状况 | |||
| L-***糖D-果糖D-葡萄糖乳糖D-甘露糖醇α-甲基-(+)葡糖苷D-棉子糖蔗糖 | +++++++++±+++ | 糊精D-半乳糖旋覆花素麦芽糖D-甘露糖L-鼠李糖D-木糖 | +++++++++++ |
表7：(b-4)各种碳水化合物与是否增殖
| 在蔡氏(Czapek)培养基中添加各种烃类后气体的发生情况 | |||
| L-***糖D-果糖D-葡萄糖乳糖D-甘露糖醇α-甲基-(+)葡糖苷D-棉子糖蔗糖 | -++---±+ | 糊精D-半乳糖旋覆花素麦芽糖D-甘露糖L-鼠李糖D-木糖 | ±+-±+-- |
(4)鉴定
从以上形态学及生理学的特征，进行本菌(根霉MK96)的菌学鉴定试验。依照Zycha等的分类标准(Zycha.H.，Siepmann and G.limmemann：Mucorales，lehre(1969))，由于本菌的孢子囊形态为球形或扁球形、由多孢子组成、有中隔，本菌明显应该是毛霉(Mukoraceae)(毛霉)科的接合菌。另外，依照Hesseltine(Hesseltine)及Ellis(Ellis)等提出的毛霉(Mukoraceae)目的检索，由于本菌的孢子囊具备骨突，孢子囊柄生有菌丝、伴有假根、而且菌丝的假根形成部分直立，所以本菌应该属于根霉菌属(Rhizopus)(根霉属)。
根霉菌属现在报告有15种，但是依照Inui等(Inui T.，Takeda Y.andIizuka H.，Taxonomical studies on geus Rhizopus，The Journal of Generaland Applied Microbiology，11，1-121(1965))提出的检索表，和被认为与本菌近缘的Rhizopus oryzae Went and Prinsen-Geerlings对比，同时进行本菌的详细鉴定。
从形态学特征及在蔡氏培养基中的生理学特征等判断，本菌株是与Rhizopus oryzae Went and Prinsen-Geerlings非常近缘的菌株。但是，如表8所示，与米根霉(Rhizopus oryzae)的标准培养物比较，L(+)-乳酸的生成量高出近4倍。从这个结果可以看出本菌株是新型菌株，命名为根霉MK96(Rhizopus sp.MK96)菌株。根霉MK96(Rhizopus sp.MK96)作为下述有用的变异菌株根霉MK96-1156(Rhizopus sp.MK96-1156)的母株是有用的。另外，该菌株于1998年7月7日被保存在日本国通产省工业技术院微生物工业技术研究所，保存号为FERM P-16876，将该保存转换为基于布达佩斯条约的保存，保存在同一地点，保存号为FERM BP-6776。
表8
| 菌株(R) | L(+)-乳酸的生成量(g/升) |
| Rhizopus oryzaeIFO4707IFO4798IFO5378IFO5379IFO5380IFO5384IFO31005Rhizopus sp.MK96 | 8.511.511.213.211.210.69.7840.6 |
(5)通过对根霉MK96的突变处理，从而诱导具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌
亚硝基胍(NTG)变异；将上述根霉MK96菌株在具有如表1所示组成的斜面琼脂培养基上、24℃下培养10天。在斜面上添加5ml灭菌水，很好的取下孢子后，使孢子悬浊液通过用纱布包裹的棉层，将除去孢子编的液体离心分离，只收集孢子。将这些孢子放在Tris苹果酸盐悬浊液中悬浊，添加NTG达到1mg/ml后，在24℃下振荡孢子悬浊液2.5小时、150分钟。然后，向离心分离得到的孢子中添加5ml灭菌水，再次进行离心分离。进行2次这种操作，完全将孢子洗干净后，涂在按照L(+)-乳酸铵的浓度梯度为0～100g/l制成的琼脂培养基(培养皿)上在24℃条件下培养3天(浓度梯度平板培养法，Science，116，46-48(1952))。接着，把在L(+)-乳酸铵盐浓度比较高的部分繁殖发育起来的菌落取出，在24℃下培养10天。
(6)L(+)-产乳酸菌的选择
将1铂丝的上述(5)得到的变异菌株接种到含有10ml表2所示生产培养基的试管中，35℃下在试管振荡培养装置中培养1天后，添加灭菌的碳酸钙1g，再培养2天。采用バ-カ-エマ-ソン法比色定量培养上清液中的L(+)-乳酸。在所有菌株中选择烧瓶培养后L(+)-乳酸的生成量比较高的菌株10株，在后述实施例1所示的发酵缸中用氨气中和的方法比较培养，将其中L(+)-乳酸生成量最高的菌株作为根霉MK96-1156(Rhizopus sp.MK96-1156)。该菌株于1998年7月7日被保存在日本国通产省工业技术院微生物工业技术研究所，保存号为FERM P-16877，将该保存转换为基于布达佩斯条约的保存，保存在同一地点，保存号为FERM BP-6777。
(7)L(+)-乳酸的生产方法
通过有氧培养使本发明所使用的具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌产生L
(+)-乳酸。本发明可以使用分离得到的根霉MK96-1156菌株的孢子或菌丝，接种到含有营养源的培养基上，在有氧的条件下使其增殖，从而产生L(+)-乳酸。
本发明分离培育出具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌，在有氧的条件下，把它们分批、半分批或连续的在通气搅拌型或气泡塔型生物反应器中培养，进一步，通过伴随着菌体再次利用的反复分批培养，能够得到高收率的L(+)-乳酸、而且产生高效率化。以下说明L(+)-乳酸的制备方法。
作为具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌的营养源，通常可以使用的如烃类、氮源、无机物等能够同化的营养源。例如作为碳源可以举出玉米淀粉、玉米粗粉、淀粉、糊精、麦芽糖、葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜等，能够单独或作为混合物使用。作为氮源可以举出硫酸铵、硝酸钠、大豆粉、玉米浆、谷胶粗粉、肉提取物、脂肉骨粉、酵母提取物、干燥酵母、棉籽粉、胨、小麦胚芽、鱼粉、肉末、脱脂米糠、脱脂肉骨粉、麦芽提取物、玉米谷胶粗粉等无机或有机氮源，能够单独或作为混合物使用。作为无机盐可以举出碳酸钙、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、溴化钠、硼酸钠或磷酸二氢钾、硫酸锌、硫酸镁等各种无机盐，能够单独或作为混合物使用。另外，相应必要的添加微量的铁、锰、锌、钴、钼酸等重金属。另外，只要是生产L(+)-乳酸的物质即可，可以使用任何一种营养源，也可以使用任何一种众所周知的真菌培养材料。还有，为了消除加热灭菌及培养过程中的发泡现象，也可以添加大豆油、亚麻籽油等植物油、十八烷醇等高级醇类、各种硅氧烷等的消泡剂。如上所述的营养源的配比没有特别的限制，可以在很宽的范围内变化，可以根据使用条件通过简单的小规模试验很容易的决定最适宜营养源及配比。
另外，为了使营养培养基在培养前灭菌后的pH在5-7左右，优选使用氢氧化钠、氨水或氨气调节pH值。
另外，对于本发明中属于根霉菌属、具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌孢子的植菌方法没有特定的限制，通常可以使用将上述孢子在以下液体中悬浊，把该悬浊液直接接种到发酵用液体培养基上的殖菌的方法。
作为上述孢子的悬浊方法，例如可以使用在琼脂培养基上培养，向形成该孢子的根霉菌属中具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌的菌体中添加液体后混合搅拌的方法。另外，作为上述液体通常使用的是无菌水，也可以使用添加了少量(例如对全部液体占0.01重量％的程度)在生化学领域可以使用的物质，例如吐温80等吐温类表面活性剂、Triton X系列等Triton表面活性剂、酰基脱水山梨醇等的无菌水。依照这种操作可以有效的在无菌水中分散孢子，从而能够得到均匀的悬浊液。
用该营养培养基对本菌株的培养，原则上可以按照由一般的真菌制备L(+)-乳酸时通常所使用的液体培养来进行。液体培养的场合可以使用静置培养、搅拌培养、振荡培养或通气培养等的任何一种。本发明中特别优选振荡培养、深部通气搅拌培养。在培养时，优选有氧培养、氧气或纯氧的导入量优选0.05-3.0vvm，更优选0.2-1.0vvm。对于满足这种条件的培养装置，没有特定限制，但是优选一边通入空气或纯氧或两者混合气体，一边用搅拌型反应器或气泡塔型反应器中的任何一种进行培养。特别是气泡塔型反应器具有菌丝不能缠绕在搅拌叶片上、从而可以防止菌丝本身破损的优点。
而且，培养操作可以通过空气或氧气的导入连续的、每次在新的培养液中分批的，或通过供给新的培养液半分批的进行培养。而且，分批进行时可以再次使用菌体。
对于培养温度并没有特别的限定，只要实质上不阻碍本菌株增殖，可以生产L(+)-乳酸即可，但是一般在20-40℃，优选35-40℃的范围内的温度。
另外，培养时间最好根据葡萄糖等碳水化合物源的消耗及生产L(+)-乳酸的时间、反应器的种类等综合判断。特别是本发明的根霉MK96-1156，由于产生L(+)-乳酸的活性强，例如采用分批式的场合可以在20-100小时，优选20-80小时，更优选30-50小时内完全得到L(+)-乳酸。另一方面，在该L(+)-乳酸菌中由于连续使用导致产生L(+)-乳酸的活性降低的菌株较少，因而也可以分批式、半分批式的再次使用或者连续的使用。连续使用的场合，可以随时的考察该菌株生产L(+)-乳酸的活性，调整适宜的培养时间。
另外，培养基的pH优选4-8，更优选5-7。是因为在这个范围中的生产情况良好。为了达到这个目的，优选在给培养基灭菌前添加碳酸钙或在培养过程中用pH传感器或pH控制器添加氢氧化钠水溶液或氨水或氨气等，自动地维持适宜的pH值。特别是，本发明中优选通过导入氨水或氨气来调节pH值。理由是以下几点。
也就是说，大规模进行生产的场合，在L(+)-乳酸发酵中一般使用碳酸钙，但是，大多数时候在从培养液中分离纯化游离的L(+)-乳酸时，会带来非常大的困难。碳酸钙作为中和剂使用时，由于生成的L(+)-乳酸转变成L(+)-乳酸钙的形式，在生产游离的L(+)-乳酸时，就必须添加硫酸，使之生成难溶的硫酸钙，从而得以分离。因此，为了处理大量生产时生成的大量硫酸钙，就必须要求大量的劳力和经费。
另一方面，对于使用氨水或氨气作为中和剂时，生成的L(+)-乳酸成为铵盐的形式。该L(+)-乳酸铵盐采用双向电透析生成游离L(+)-乳酸的同时，可以回收同时产生的氨，从而在发酵中再次使用。另外，添加丁醇等醇类，直接使L(+)-乳酸氨酯化，也可以在得到L(+)-乳酸酯的同时回收氨，从而在发酵中再次使用。而且，也可以添加计算量的硫酸，使之生成作为肥料有用的硫酸铵，采用萃取等方法分离L(+)-乳酸，对氨的处理具有多样性。
一般氨对微生物的增殖具有阻碍作用，氨的浓度如果达到一定限度以上，几乎能够阻碍增殖的进行。但是，本发明中使用的属于根霉菌属的产乳酸菌，是具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌，即使是在氨存在下，也能够发挥优秀的生产L(+)-乳酸的能力。因此，这种处理可以高收率的生产L(+)-乳酸同时易于进行包括处理生成的盐、分离纯化L(+)-乳酸等在内的后处理。
按照本发明，可以提供一种具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌。使用该菌株，通过在有氧的条件下培养，能够高收率的生产L(+)-乳酸。另外，通过在培养基中添加氨，能够除去中和剂或产物带来的阻碍作用，而且使用氨不会造成L(+)-乳酸生产能力降低、可以高收率的生产L(+)-乳酸。由于前培养进行1次即可，该菌株的反复分批发酵可以缩短生产时间，而且收率较高。
由于按照上述L(+)-乳酸的制备方法可以比较廉价地得到L(+)-乳酸，因此可以作为食品添加剂用于酒类、清凉饮料、咸菜、酱油、面包、啤酒等的制备，另外也可以在工业中如皮革、纤维、塑料等的制备中广泛利用。
以下，结合实施例说明本发明，但是本发明并不局限于此。另外，“％”表示“重量％”。
实施例1：L(+)-乳酸的分批发酵生产(通气搅拌型反应器)
在表1所示的斜面琼脂培养基上培养根霉MK96-1156，然后收集孢子。接种到装有如表9所示的前培养基100ml的500ml三角烧瓶中，使孢子浓度为106个/ml。在30℃下使用旋转震动器(旋转数170rpm、旋转半径2cm)将其培养15分钟。
然后，在装有表9所示的生产培养基1.5升的2.5升发酵缸(丸菱バイオエンジ(株)，东京)中添加前述前培养液，使之成为培养基量的10％(v/v)。在转速为300rpm、通气量为0.5vvm、培养温度为35℃的条件下将其通气搅拌培养。培养开始后，为了维持pH值为5.5，通过pH控制器添加10％的氨水。发酵过程如表10所示。
从接种前培养液后24小时开始，糖的消耗活跃起来，与此同时开始产生L(+)-乳酸。72小时后葡萄糖完全消失，生产出76克/升(结束时培养基的量为1.64升)的L(+)-乳酸。这时L(+)-乳酸的生产量为25g/升/日，以加入的葡萄糖为基准，L(+)-乳酸的产率超过69.2％。对于通过氨中和生产L(+)-乳酸，这是非常高的收率。
表9
| 前培养基的组成(g) | 生产培养基的组成 | |
| 淀粉葡萄糖(NH4)2SO4KH2PO4ZnSO4MgSO4·7H2OCaCO3自来水pH(灭菌前) | 50501.350.30.040.2510.0使总量达到1升6.8 | -1201.350.250.040.15-使总量达到1升4.8 |
| 用高压灭菌器(1kg/cm2)G灭菌15分钟 | ||
表10
| 时间(h) | 葡萄糖(g/升) | L(+)-乳酸(g/升) |
| 02030446572 | 1201129677130 | 0120336876 |
比较例1
使用作为根霉MK96-1156菌母株的根霉MK96菌株，在与实施例1相同的培养条件下，使用发酵缸进行培养。其结果如表11所示。
从表11可以看出，根霉MK96菌株即使在培养开始72小时后，L(+)-乳酸的蓄积量也只是根霉MK96-1156的50％以下，只蓄积了30g/升、最终液量为1.54升的L(+)-乳酸。以加入的葡萄糖为基准计算出的产率，在72小时后为25.7％。从该比较例也可以看出，根霉MK96-1156作为L(+)-乳酸的生成菌是非常优秀的。
表11
| 时间(h) | 葡萄糖(g/升) | L(+)-乳酸(g/升) |
| 0102030446572 | 12011811595817062 | 000.212192530 |
比较例2
除使用米根霉NRRL395代替根霉MK96-1156以外，在与实施例1相同的条件下进行操作。147小时后的最终液量为1.50升，收率是44.2％。结果如表12所示。
从表12可以看出，如果与以前的米根霉NRRL395菌株比较，本根霉MK96-1156菌株是生产L(+)-乳酸收率极高的乳酸生产菌。
表12
| 时间(h) | 葡萄糖(g/升) | L(+)-乳酸(g/升) |
| 09244553103147 | 120112896254200 | 031624264453 |
实施例2；L(+)-乳酸在气泡塔型反应器中的分批生产
在表1所示组成的斜面琼脂培养基上培养根霉MK96-1156，然后收集孢子。接种到装有表9所示的前培养基100ml的500ml三角烧瓶中，使孢子浓度为106个/ml。在30℃下使用旋转震动器(转速170rpm、旋转半径2cm)将其培养15分钟。
然后，向装有表9所示的生产培养基1.5升的2.5升气泡塔型反应器中添加前述前培养液，使之成为培养基量的10％(v/v)。在通气量为1.0vvm、培养温度为35℃的条件下，只通气进行培养。培养开始后，为了维持pH值为5.5，通过pH控制器添加10％的氨水。培养过程如表13所示。
从表13可以看出，与实施例1所示的通气搅拌型反应器比较，L(+)-乳酸的生产速度快，50小时后蓄积了81g/升(结束时培养基量为1.72升)，相对加入的葡萄糖其产率为77.4％。从发酵槽的制造成本、运行成本及规模扩大化的容易程度等方面综合考虑，优选气泡塔型反应器。
表13
| 时间(h) | 葡萄糖(g/升) | L(+)-乳酸(g/升) |
| 08232831354750 | 12011810178654140 | 00.1122638537881 |
实施例3：L(+)-乳酸的反复分批发酵生产(气泡塔型反应器)
采用与实施例2相同的方法，使用100升的大型气泡塔型反应器进行反复分批培养。第1次加入的生产培养基的量为65升。另外，使用28％的氨水调整pH值。如表14所示，确认培养开始后第2天作为碳源的葡萄糖完全消失之后，停止通气，使生成的菌丝块沉淀于反应器的底部。然后取出上清液，得到含有菌丝块的沉淀部分约10升。加入刚刚灭菌后的生产培养基，使总量达到65升，再次进行通气开始培养。这种反复分批培养包括最初一次在内共反复9次。
从表14可以看出，在1次分批培养中所必需的天数随次数的增加而变短从第2次到第6次1.5天后结束培养，第7次以后为2天后结束培养。在15.5天后结束，共进行了9次反复分批培养。在通常的分批培养中，由于发酵需要2.5天，反应器的洗涤再需要0.5天，在15.5天内只能进行5次分批培养。与此相比，本发明的根霉MK96-1156即使9次反复分批培养仍具有优良的生产性，与这种已知的方法相比具有大约1.5倍的乳酸生产性，收率非常高。另外，在该反复分批培养中，由于前培养只进行最初的一次即可，与以前分批培养中每次都必须调制前培养液相比，可以大幅度降低劳动成本。
表4
| 次数 | 时间(h) | 总天数(d) | 葡萄糖(d/L) | L(+)-乳酸(g/L) |
| 1 | 0122448 | 00.51.02.0 | 120112750 | 032485 |
| 2 | 02436 | 2.03.03.5 | 101460 | 85088 |
| 3 | 02436 | 3.54.05.0 | 104440 | 95086 |
| 4 | 02436 | 5.06.06.5 | 107450 | 85189 |
| 5 | 02436 | 6.57.58.0 | 101420 | 75389 |
| 6 | 02436 | 8.09.09.5 | 105490 | 74480 |
| 7 | 0243648 | 9.510.511.011.5 | 10040100 | 8436572 |
表4(续)
| 8 | 02448 | 11.512.513.5 | 99360 | 64472 |
| 9 | 02448 | 13.514.515.5 | 95340 | 94568 |
实施例4：使用气泡塔型反应器分批生产L(+)-乳酸
作为生产培养基，除在实施例2所使用的组成中加入了玉米粗粉1g/升之外，采用完全相同的操作，使用气泡塔型反应器进行发酵。36小时后的最终液量为1.65升，收率为81.6％。结果如表15所示。生产速度得到了大幅度的改善，同时也可以得到较高的产率。
表15
| 时间(h) | 葡萄糖(g/升) | L(+)-乳酸(g/升) |
| 052024273036 | 119.0121.577.264.450.037.60 | 00.535.045.557.568.089.0 |
Claims (6)
1.保存号为FERM BP-6777的具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌。
2.L(+)-乳酸的生产方法，其特征在于在有氧条件下培养权利要求1所述的菌株，通过加入氨来调整培养液的pH。
3.如权利要求2所述的L(+)-乳酸的生产方法，其特征在于上述有氧培养通过空气或氧气的导入连续地、每次在新的培养液中分批地，或通过供给新的培养液半分批地进行培养。
4.如权利要求3所述的L(+)-乳酸的生产方法，其特征在于上述有氧培养以分批式进行时，不进行前培养，而再次使用菌体进行分批式的培养。
5.如权利要求4所述的L(+)-乳酸的生产方法，其特征在于上述有氧培养是采用通气搅拌型生物反应器或气泡塔型生物反应器进行的。
6.根霉MK96(Rhizopus sp.MK96)，其保存号为FERM BP-6776。
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