CN1119458A - 核酸药物 - Google Patents

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Abstract

在通过注射或其他方式直接导入动物组织后，能够得以表达的编码流感病毒基因产物的DNA构建体是新的预防药物，其可提供对抗流感病毒之同源和异源毒株感染的免疫保护作用。

Description

发明题目 核酸药物
交叉涉及的相关申请
本申请是1993年7月8日提交的未决的USSN 08/089,985的部分持续申请，而USSN 08/089,985又是1993年3月18日提交的未决的USSN 08/032,383的持续申请。本发明的背景i.发明领域：
本发明涉及生产和使用新的医药产品：即核酸，当它直接被引入活的脊椎动物组织时，可诱导特异性识别人流感病毒之免疫反应的产生。ii.发明背景：
流感是急性发热性疾病，它由甲型流感病毒或乙型流感病毒感染呼吸道而引起。伴有周期性流行病或大流行病的流感的突然蔓延几乎每年都要在世界范围内发生。流感可引起明显的需要住院的全身症状、严重疾病(如病毒性肺炎)以及如继发性细菌肺炎等并发症。近期美国的流行病已导致每年＞10,000(最多到40,000)的额外死亡，而在没有流行病的年度每年的死亡人数为5,000-10,000。防止与流感有关的发病率和死亡率的最佳策略是接种疫苗。现行经许可疫苗是从生长于鸡蛋中然后被灭活的病毒得到的，它包括三个病毒株(两个A株一个B株)。三种形式的疫苗是可用的：完整的病毒、亚病毒粒子以及经纯化的表面抗原。只有后两种可用于儿童，因为用完整的病毒接种会增加发热反应。9岁以下的儿童需要两次免疫接种，而成年仅需要一次注射接种。然而，有人建议[见Medical Letter 32：89-90，Sept.17，1993]“病人在秋季早期接种会受益于冬季或早春的第二次给药”，这是由于观察到在一些年纪较大的病人中，接种后的抗体效价在四个月或更短的期间会逐渐降低到低于保护水平。每年都要重新配制这些疫苗，需通过预测哪种最近的病毒株会在临床上传播以及评价哪种新的毒力株在即将来临的流感季节中会有望占优势。推荐每年都要再接种。A.被许可之疫苗的局限性：
1)抗原的差异，尤其在流感病毒A株中的变异会导致病毒不能由先前疫苗(或先前感染)产生的抗体所中和。新病毒株的产生是通过点突变(抗原性的漂变)以及通过编码表面糖蛋白(血凝素[HA]以及神经氨酸酶)基因的重分配(抗原移位)来实现的，而在经过漂变和移位的病毒株中，内部蛋白质是高度保守的。免疫接种会引起“同源”株特异性抗体介导的免疫，而不是基于细胞介导的免疫的“异源”类通常免疫。
2)即使流感病毒的优势传播毒株从一年到下一年之间不会有明显的漂变或移位，也必须每年都进行免疫接种，因为抗体的效价要逐渐降低。尽管一些入报道血细胞凝集抑制(HI)和中和抗体可持续数月至数年随后再逐渐降低，但免疫接种实践咨询委员会引证抗体效价在接种后年度内的降低作为理由，认为即使在没有显著的漂变或移位也要进行免疫接种。(HI抗体抑制流感病毒凝集红血细胞的能力。它们象中和抗体一样，主要是抗HA抗原。血细胞凝集抑制试验因其与中和检定法相比，可较简单并较便宜地进行，故常用作估计抗流感病毒某病毒株之抗体与不同病毒株反应能力的手段)。如上文提及的，Medical Letter建议某些高风险的、年纪较大的个体应在一个季节接种两次，这是由于短期有效的保护性抗体的效价之故。
3)疫苗的效力是亚最适的。下一季节疫苗的开发要依靠对即将出现的传播株(经由亚洲卫兵取样)的预测，这是不准确的并且它可导致用作疫苗的病毒株和那些实际上正在传播的病毒株之间匹配性不好。而且如1992-1993流感季节期间所发生的，新的H3N2病毒株(A/Beijing/92)在流感季节后期在临床上变得很明显。这推动了对1993-1994疫苗组合物的改变，这是由于抗原移位使病毒株A/Beijing/92与经早期H3N2病毒株(A/Beijing/89)诱发产生的抗体交叉反应性很差。然而由于需要较长一段时间来配制目前被许可的疫苗，故在1992-1993的季节中，尽管事实是已有疫苗的保护作用很差而新传播的H3N2病毒株的毒力在增加，而末能引入新的疫苗病毒株。
既使当疫苗和传播中的病毒株很相匹配时，经许可的疫苗也只能防治约70％健康儿童和年轻人的疾病以及30-40％虚弱的年纪较大的成年人的疾病。因此当疫苗病毒株符合传播中的病毒株时，应使用其它标准来表明疫苗的效力。这些标准包括防止严重疾病以及继发性的并发症，它是以防止住院(对于住在家中的老人为70％，相对地，对于住在小型疗养院的老年人为50-60％)以及防止死亡(对于小型疗养院的居民为80％)来反映的。成群免疫在疗养院中减少感染的扩散被认为是另一种有益的免疫。B.理想的通用的流感疫苗(本发明主题)的特性：
1)常用类(异种的)保护的产生。通用的疫苗应能对抗不同的病毒株，例如对抗在H3N2亚型内的病毒，甚至可能是杂交亚型，例如从H1N1到H3N2的亚型。这可能是由内部保守病毒蛋白质的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别抗原介导的，但直接抗膜结合蛋白质保守部分的中和抗体也可能起作用。
2)增加的抗体反应宽度。由于CTL被认为在疾病的恢复中起作用，所以仅基于CTL反应的疫苗可望缩短疾病的持续时间(有可能使之变成亚临床疾病的程度)，但它也不能完全防止疾病。通过在鸡蛋中传代以生产现有流感疫苗的方法在实验上已表明它能够选择出已改变了HA抗原性的病毒亚群。作为结果，疫苗的效力会减小，因为疫苗产生的抗体对占优势的传播病毒株不能完全有效。因此人们想生产一种与现有疫苗相比改良了反应宽度的抗体。1992-93流感季节提供了极好的病例以研究现有疫苗的局限性，其中利用A/Beijing/89的疫苗可产生抗体，此抗体与新的、也更具毒性的A/Beijing/92病毒株很难发生交叉反应(保护性差)。两个病毒株都是H3N2，即为同一亚型。然而根据氨基酸序列，A/Beijing/92样病毒株与A/Beijing/89样病毒株的区别仅通过HA1区域的11个点突变(位点133，135，145，156，157，186，190，191，193，226和262)。不知道现行的操作方法是否会影响到交叉反应的缺少，但清楚的是对抗体反应宽度的改善是需要的。
3)增加抗体反应的持续时间。因为处于因流感病毒感染而发病和死亡的最大风险之中的特殊群体之一(老年人)也即这样的群体，他们的保护性抗体的效价会很快降低以使每年的免疫接种没有效果，而经改良的疫苗应产生可持续更长时间的抗体保护效价。C.作为疫苗的多核苷酸
肌内接种多核苷酸构建体，也即编码蛋白质的DNA质粒，已被证实会导致在肌肉细胞中原位产生蛋白质。使用编码病毒蛋白质的cDNA质粒，产生抗体和CTL反应提供分别对抗随后的同种或交叉病毒株攻击的同种的和异种保护作用。这些免疫反应类型中的每一种都提供了超出现有接种策略的可能的优点。使用PNVs产生抗体会导致抗体反应持续时间的增加，也可提供抗原，它可具有病毒临床传播株的准确序列，也由正确翻译后修饰和天然蛋白质(与重组蛋白质相对)构成。通过此方法产生CTL反应有利于病毒株交叉保护，而无需使用活的潜在致病性载体或减毒病毒。D.背景的进一步描述：
因此对于抗病毒如流感病毒、可产生中和抗体的疫苗的开发的主要挑战是：不同分离株或病毒株中病毒外膜蛋白质的多样性。如鼠和人体内的细胞毒性T淋巴细胞都能够识别衍生于保守的病毒内部蛋白质的抗原决定基[J.W.Yewdell et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82，1785(1985)；A.R.M.Townsend et al.，Cell 44，959(1986)；A.J.McMichael et al.，J.Gen.Virol.67，719(1986)；J.Bastin et al.，J.Exp.Med.165，1508(1987)；A.R.M.Townsend和H.Bodmer，Annu.Rev.Immunol.7，601(1989)]，并被认为在抗病毒的免疫反应中是重要的[Y.-L.Lin和B.A.Askonas，J.Exp.Med.154，225(1981)；I.Gardner etal.，Eur.J.Immunol.4，68(1974)；K.L.Yap和G.L.Ada，Nature 273，238(1978)；A.J.McMichacl et al.，New Engl.J.Med.309，13(1983)；P.M.Taylor和B.A.Askonas，Immunol.58，417(1986)]。已将努力放在开发能够提供抗不同病毒株之异种保护作用的CTL疫苗上。
当CD8+CTL的T细胞受体识别与MHCI类分子相关的病毒肽时，CD8+CTL即杀死被病毒感染的细胞[R.M.Zinkernagel andP.C.Doherty，ibid，141，1427(1975)；R.N.Germain，Nature353，605(1991)]。这些肽衍生于内源合成的病毒蛋白质，而不管在病毒中这些蛋白质的位置或功能如何。因此通过识别衍生于保守的病毒蛋白质的抗原决定基，CTL可提供病毒株交叉保护作用。能与MHCI类联系以进行CTL识别的肽来源于蛋白质，此蛋白质存在于或穿过细胞质或内质网[J.W.Yewdell and J.R.Bennink，Science 244，1072(1989)；A.R.M.Townsend et al.，Nature340，443(1989)；J.G.Nuchtern et al.，ibid.339，223(1989)]。因此，通常进入核内体加工途径的外源蛋白质(如在由MHCII类分子呈现的抗原的情况下)在产生CD8+CTL反应方面是无效的。
大多数产生CTL反应的努力或者是使用复制载体以在细胞内产生蛋白质抗原[J.R.Bennink et al.，ibid.311，578(1984)；J.R.Bennink and J.W.Yewdell，Curr.Top.Microbiol.Immunol.163，153(1990)；C.K.Stover et al.，Nature 351，456(1991)；A.Aldovini and R.A.Young，Nature 351，479(1991)；R.Schafer et al.，J.Immunol.149，53(1992)；C.S.Hahn et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89，2679(1992)]，或者他们致力于将肽引入细胞溶质[F.R.Carbone and M.J.Bevan，J.Exp.Med.169，603(1989)；K.Deres et al.，Nature342，561(1989)；H.Takahashi et al.，ibid，344，873(1990)；D.S.Collins et al.，J.Immunol.148，3336(1992)；M.J.Newman et.al.，ibid.148，2357(1992)]。这两种方法都有局限性在于可降低它们作为疫苗的效用。后病毒载体对有可被表达为融合蛋白质的多肽的大小和结构有限制，而同时又保留重组病毒复制的能力[A.D.Miller，Curr.Top.Microbiol.Immunol.158，1(1992)]，并且用于随后免疫之载体如牛痘病毒的效力可受到抗载体自身之免疫反应的损害[E.L.Cooney et al.，Lancet 337，567(1991)]。另外，病毒载体和经修饰的病原体也存在潜在的危险，从而阻碍它们在人体中的使用[R.R.Redfield et al.，New Engl.J.Med.316，673(1987)；L.Mascola et al.，Arch.Intern.Med.149，1569(1989)]。此外，对所呈现的肽抗原决定基的选择取决于个体之MHC抗原的结构，因此由于远亲繁殖的人体中MHC单倍型的差异，会使肽疫苗的效用受到限制。
Benvenisty，N.，和Reshef，L.[PNAS 83，9551-9555，(1986)]证明引入小鼠腹膜内、静脉内或肌肉内的CaCl2沉淀的DNA可得以表达。已证明在小鼠中肌内(i.m.)注射DNA表达载体可导致DNA被肌肉细胞摄入，并且表达由DNA编码的蛋白质[J.A.Wolff et al.，Science 247，1465(1990)；G.Ascadi et al.，Nature 352，815(1991)]。质粒可作为附加体维持着而不复利。随后，在经i.m.注射后的大鼠、鱼和灵长类的骨骼肌中以及大鼠的心肌中可观察到持续表达[H.Lin et al.，Circulation 82，2217(1990)；R.N.Kitsis et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88，4138(1991)；E.Hansen et al.，FEBS Lett.290，73(1991)；S.Jiao et al.，Hum.Gene Therapy 3，21(1992)；J.A.Wolffet al.，Human Mol.Genet.1，363(1992)]。WO90/11092 (1990年10月4日)中报道了使用核酸作为治疗剂的技术，其中裸露的多核苷酸被用来接种脊椎动物。
方法的成功不一定作肌肉内的免疫接种。因此，Tang等人[Nature，356，152-154(1992)]公开了将经编码牛生长激素(BGH)的DNA包被的金微弹丸引入小鼠皮肤内，会导致小鼠产生抗BGH抗体。Furth等人[Analytical Biochemistry，205，365-368(1992)]表明可用喷射注射器转染活动物的皮肤、肌肉、脂肪和***组织。Friedman，T.，[Science，244，1275-1281(1989)]最近评述了引入核酸的不同的方法(也参见Robinson等人的Abstractsof Papers Presented at the 1992 meeting on Modern Approachesto New Vaccines，Including Prevention of AIDS，Cold SpringHarbor，p92)，其中将鸟流感病毒DNA通过im，ip和iv用于鸡，证实其可提供抗致死性攻击的保护作用。然而，没有公开使用的是何种鸟流感病毒基因，另外只证实了H7特异性免疫反应，而没有提及对交叉病毒株保护的诱导。
因此，本发明仔细考虑了任何已知方法，以将核酸引入活组织中来诱导蛋白质的表达。本发明提供了将病毒蛋白质引入抗原加工途径以产生病毒特异性CTL的方法。因此在本发明中，流感病毒正迎合了对特异性治疗剂的需要，它能够产生所需的抗病毒病原体的预防性免疫反应。这种治疗方法中，特殊重要的在于其诱导T细胞免疫反应的能力，它甚至能防止与作为抗原基因来源之病毒株异源的病毒株的感染。因此，本发明提供了DNA构建体，它编码人流感病毒的病毒蛋白质：核蛋白质(NP)，血凝素(HA)，神经氨酸酶(NM)，基质(M)，非结构蛋白质(NS)，聚合酶(PB1和PB2＝碱性聚合酶1和2；PA＝酸性聚合酶)，或者编码可产生特异性CTL之编码产物的任何其他流感病毒基因。
流感病毒具有由多个RNA片段组成的核糖核酸(RNA)基因组。每个RNA至少编码一种基因产物。NP基因产物与RNA结合并将病毒RNA易位至被感染之细胞的核中。序列是保守的，与在50年期间内产生的氨基酸序列仅有约7％的偏离。P基因产物(PB1，PB2，PA)负责合成新的病毒RNA，这些基因甚至比NP基因有更加高度保守，HA是主要的病毒外膜基因产物。它比NP的高度保守性稍差。它与细胞受体结合，因而在新的流感病毒感染的开始起到作用。主要中和抗体反应直接对抗此基因产物。大量的细胞毒性T淋巴细胞反应也是针对此蛋白质的。现有的抗人流感病毒的疫苗掺入了三株流感病毒或它们的HA蛋白质。然而，由于不同病毒株中HA蛋白质序列的差异性，疫苗必须持续适应于引起发病的流行病毒株。然而如果适当呈现，HA恰恰具有一些用以产生CTL的保守元件。NS1和NS2基因产物的生物功能尚未完全鉴定出，但它们对于保护性CTL反应的产生可能是有意义的。最后，比HA稍微更保守的M1和M2基因产物可诱导主要的CTL反应。M1蛋白质是十分丰富的病毒基因产物。
通过用编码一种或多种以上提及的病毒蛋白质的非复制质粒DNA免疫接种证明抗继后病毒攻击之DNA疫苗接种的保护效力。它的好处在于没有感染剂的参予，无需装配病毒颗粒，以及允许选择决定基。而且，由于核蛋白质序列和几个其他病毒基因产物在流感病毒的不同株中是保守的，故对抗继后的与被克隆基因来源株同种或异种的流感病毒毒力株攻击之保护作用是可能的。发明概要
能够在直接引入、注射或其他方式进入动物组织后而得以表达的DNA构建体是新的预防药物。它们诱导病毒抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)以应答不同的病毒株，与之形成对照的是一般为株特异性的抗体。就病毒感染来说，这种CTL在体内的产生通常需要抗原的内源表达。为了产生呈现于免疫***的病毒抗原，又不限制直接的肽释放或病毒载体的使用，可将编码人流感病毒蛋白质的质粒DNA注射到BALB/c小鼠的四头肌中，以导致流感病毒特异性的CTL的产生并可保护小鼠免受继后的流感病毒异源毒株的攻击，这可通过肺中病毒效价的降低、对体重减轻抑制以及存活率上升来测定。在猕猴中产生了高效价抗血凝素中和抗体以及抗核蛋白质抗体，而在雪貂中经同种和异种攻击后可观察到降低的鼻病毒效价。
与本发明相关的主要观察资料包括：
1)效力的证实。经用核蛋白质(NP)DNA免疫接种后的小鼠，再被不同于NP基因来源病毒株的流感病毒株攻击，通过测知存活率上升、肺病毒效价的降低以及对体重减轻的抑制可观察到异种保护。在这种情况下，两种病毒株的表面蛋白质有很大不同(H1N1对H3N2)，而攻击株在最初的病毒株之后34年出现。用NP DNA和基质(M1)DNA，或者单独地、一起地或者与HA DNA联合免疫接种雪貂可提供保护(减少了鼻病毒的扩散)使之免受漂变之病毒株(临床分离物)的攻击。值得注意的是在雪貂中DNA混合物(编码Beijing/89蛋白质的NP和M1 DNA以及编码Beijing/89或者Hawaii/91 HA的HA DNA)抗漂变病毒株(Georgia/93)的保护比被批准之疫苗(含有Beijing/89)提供的保护要强。含有得自Hawaii/91之HA DNA的混合物显得比含有得自Beijing/89之HADNA混合物的效力稍强。用包括得自Hawaii/91之HA DNA的混合物观察到的保护作用，产生与用同源HA DNA(Georgia/93)观察到的保护作用相同，而带有Beijing/89的HA DNA混合物观察到的保护作用与同源保护不同，尽管它仍比被许可的产品明显地好。HI抗体可在所有被试验动物中产生，其中包括小鼠、雪貂、猕猴和非洲绿猴。
2)持续时间。在使用编码报道基因的DNA进行的研究中，DNA和蛋白质表达可持续存在至少1.5年(在试验小鼠中时间最长；Wolff et al.，Human Mol.Genet.，1992)。因此如果流感病毒基因产物也持续表达，则所产生的免疫反应也应该是持续的。已证实在小鼠中经流感病毒DNA注射所产生的抗体和CTL(Yankanckaset al.，DNA & Cell Biol.，1993)，以及同源保护性免疫(MRL数据)可持续一年以上。在猕猴中，迄今抗体已至少持续了一年。CTL反应和异源保护作用(存活率上升)的持续时间为6个月(迄今为止试验的最长时间点)。异源保护的水平会出现少量的下降，但此保护是可增强的。
3)剂量范围。对猕猴进行的剂量研究表明，两次施用100μgHA DNA会导致迄今为止已持续一年的HI抗体的良好效价。在小鼠中以低达6μg的剂量(给药三次)和以一次注射200μg的剂量给药都可观察到保护作用的产生(异源攻击后存活率上升)，但通常增加注射的次数(最高至3次)，可改善保护的水平。对灵长类的研究表明，两次注射10或100μg编码3HA和NP及M1的DNA(后者编码H3N2 Beijing/89基因)，会导致HI抗体的效价与由被批准使用的疫苗产生的抗体效价十分相近。重要的是需记住所有被研究的动物都是第一次接触到流感病毒，而临床种群对象(年纪较大的个体)都已经历过流行性感冒(可回忆九岁以下的儿童已两次注射被批准的疫苗)。附图的简要描述
图1.通过PCR检测肌肉中NP质粒DNA。将RSV-NP DNA或空白载体(100μg/每只腿)三次注射入BALB/c小鼠的两个四头肌中，间隔为三周，随后用流感病毒感染。末次注射后四周切掉肌肉并立即置液氮中冷冻，然后在裂解缓冲液(25mM Tris-H3PO4 pH8，2mM反式-1：2-二氨基环己烷-四-乙酸(CDTA)，2mM DTT，10％甘油，1％Triton X-100)中用MIKRO-DISMEMBRATORTM(B.Braun Instrument)将其研碎，用酚/氯仿抽提高分子量DNA并用乙酵沉淀之。进行40次PCR反应循环(PCR按Perkin ElmerCetus GENEAMPTM试剂盒中的逐条说明来进行)以检测肌肉中NP质粒DNA的存在。一个772碱基对的PCR产物(见箭头所指)，从CMV启动子处跨越至***之NP基因5′部分的大部分区域，它由在启动子区域(GTGTGCAC CTCAAGCTGG，SEQ.ID：1：)被引导的18碱基长的有意义寡核苷酸，和在被***之NP序列的5′部分CCCTTTGAGAATGTTGCACATTC，SEQ.ID：2：)的23碱基长的寡核苷酸反义引物产生。在选择的NP DNA注射的肌肉样品中，从经溴乙锭染色的琼脂糖凝胶中可看到772bp的产物，而在空白载体的对照(600L)中则没有看到。上方标记每条泳道指示小鼠的认定号码以及右或左腿。
图2.在用NP DNA注射过的小鼠中NP抗体的产生。将100μgV1-NP DNA在第0，3和6周注射进小鼠的每只腿中，在第0、2、5和8周放血，使用已经杆状病毒表达载体转染的昆虫细胞中纯化到的NP，通过ELISA(J.J.Donnelly et al.，J.Immunol.145，3071(1990))检测血清中抗-NP IgG的存在。将第一次注射NP DNA后的结果对时间作图，以平均log10ELISA效价±SEM(n＝10)表示之。用空白载体免疫过的小鼠没有产生可测知的NP抗体。
图3.在4小时51Cr释放试验中测得得自经DNA免疫的小鼠的CTL的特异性溶解百分数。小鼠经用400μg V1-NP DNA(实心圆圈)或空白载体(实心方块)免疫，3-4周后处死。阴性对照组CTL得自天然小鼠(空心三角)，而阳性对照得自从四周前的A/HK/68感染中恢复健康的小鼠(实心三角)。图示的数据得自有代表性的个别小鼠。每组条件下至少研究8个个体。A框：用经NP 147-155脉冲的自身脾细胞再刺激的脾细胞并针对施加NP 147-155脉冲的P815细胞进行检测。B框：用经NP 147-155脉冲的自身脾细胞再刺激的脾细胞并针对加入CTL前已被流感病毒A/Victoria/73(H3N2)感染了6小时的P815靶细胞进行检测。C框：不加额外的抗原而用Con A和IL-2再刺激脾细胞并针对经NP 147-155脉冲的P815细胞进行检测。D框：将V1-NP DNA或空白载体三次注射给小鼠，每次注射200μg，其间隔为3周，末次免疫接种后4周收获脾脏，将脾细胞与IL-2和Con A一起培养7天，并针对经用A/Victoria/73感染的P815靶细胞检测CTL。
图4.在经DNA免疫的小鼠中，不经麻醉用104TCID50的A/HK/68鼻腔内攻击后总的损失(以克计)和恢复。用V1-NP DNA或空白载体免疫小鼠三次，间隔为3周，或者不注射，末次免疫接种后3周攻击小鼠。对于注射了NP DNA的小鼠(实心圆圈)、空白载体对照组(空心三角)以及未经注射的对照组(空心圆圈)在攻击的时刻和从第4天起的每一天需测定每组10只小鼠的体重，表示为平均重量±SEM。经由t试验分析注射了NP DNA的小鼠与注射了空白载体以及未经注射的小鼠相比，在第8天至13天之间表现出显著较少的体重损失(P≤0.005和P≤0.01)，在两个对照组之间没有显著差别(经t试验，P＝0.8)。
图5.经DNA免疫的小鼠用102.5TCID50的A/HK/68鼻内攻击(经麻醉)后的存活率。用V1-NP DNA(封闭的圆圈)或空白载体(空心圆圈)免疫小鼠三次，间隔为三周，末次免疫接种三周后攻击这些小鼠以及未注射的对照小鼠(空心三角)。各组9或10只小鼠的百分存活率如图所示。注射过NP DNA的小鼠的存活率显著大于对照组(经Chi-Square分析P＝0.0004)，而在注射过空白载体的小鼠和未注射的小鼠之间没有观察到有明显差别(经Chi-Square分析P＝0.17)。
图6.表达载体V1J，SEQ.ID：10：的序列。
图7.表达载体V1Jneo，SEQ.ID：18：的序列。
图8.CMVint A-BGH启动子-终止子序列，SEQ.ID：11：的序列。
图9.猴抗NP抗体。
图10.雪貂的血凝素抑制，点线表明最小的保护抗体效价，有线穿过的圆圈表示的是平均值。
图11.雪貂经DNA免疫接种后雪貂的IgG抗NP抗体。
图12.用DNA和未用DNA免疫之雪貂排出的流感病毒。
图13.PRSV-PR-NP和VI-NP载体图谱。X代表***的编码区域。
图14.流感病毒蛋白质和病毒株的图解。
图15.在细胞内加工之注射的DNA的图解。
图16.经用HA和内部蛋白质基因免疫而诱导之雪貂对流感病毒A/RP/8/34的抗性。
图17.V1Jns载体的图解。
图18.用含有HA DNA(A/Beijing/89，B/Panama/90，A/Texas/91)，NP DNA(A/PR/34)和M1 DNA(A/PR/34)的DNA混合物注射非洲绿猴。每种成分以10μg(实心方块)或为100μg(实心圆圈)分两次给药，间隔为6周(见箭头)。为了作比较，给其它动物注射全人剂量(45μg蛋白质等同物；每份HA为15μg)经许可的亚病毒粒子(空心方块)和完整病毒粒子(空心圆圈)疫苗。每两周收集一次血清样品，持续18周，分析抗A/Beijing/89 HA的HI效价。数据用图形表示为平均HI效价±SEM，其中n＝3。
图19.用A/PR/34 NP DNA(200μg)三次注射雌性BALB/c小鼠(4-6周龄)，间隔为3周。阴性对照组包括用对照DNA(200μg)、重组NP蛋白质(10μg)注射过的小鼠，以及天然的，未经注射的小鼠(模型)。作为对照，也检测了被流感病毒A/HK/68(流感病毒)感染的小鼠。一次给药后6个月得到CTL，再用病毒感染的同源脾细胞在体外再刺激，以效应物：靶细胞为10∶1的比率检测经NP肽脉冲的P815细胞，数据表示为百分特异性溶解±sd，其中n＝3。
图20.用正常的C2C12成肌细胞(1×107个细胞)、重组NP蛋白质(2μg)，或经NP转染的成肌细胞(1×107个细胞)注射C3H/HeN小鼠。NP蛋白质的量(2μg)足以产生抗体反应，它约等同于被移植的经NP转染之成肌细胞中所存在的NP量的约100倍。用经流感病毒感染的同源脾细胞在体外处理和再刺激这些小鼠6周后制备得到CTL。作为阳性对照，还需从被流感病毒A/HK/68感染的小鼠中制备CTL。未经处理的(实心柱)，经流感病毒A/Victoria/73感染的(斜纹柱)以及经NP转染的成肌细胞(点状柱)被用作靶细胞，其中效应物∶靶细胞的比例为25∶1。数据表示为百分特异性溶解±sd，其中n＝3。
图21.用200μg NP DNA肌肉内免疫四周龄的雌性BALB/c小鼠三次，间隔为3周。第三次免疫后三周用300 TCID50的A/HK/68在麻醉下给药以攻击小鼠(总呼吸道攻击)。攻击后将存活小鼠的比例(10只小鼠/组)对时间作图。
图22.用100μg NP DNA肌肉内免疫四周龄的雌性BALB/c小鼠三次，间隔为三周。第三次免疫后三周用300 TCID50的A/HK/68在麻醉下给药以攻击小鼠(总呼吸道攻击)。每天给小鼠称重，计算出每只存活鼠最初体重的比例，将攻击后平均最初体重百分数±SEM对时间作图。
图23.用200μgNP DNA肌肉内免疫四周龄的雌性BALB/c小鼠三次，间隔为三周。第三次免疫后三周用2000 TCID50的A/HK/68不经麻醉给药以攻击小鼠(上呼吸道攻击)。攻击后7天小鼠安然死去，摘取肺脏并匀浆化，通过对MDCK细胞的系列滴定测出病毒效价。
图24.用6.25、25、100、或200μg NP DNA肌肉内免疫四周龄的雌性BALB/c小鼠三次，间隔为3周。第三次免疫后三周用300 TCID50的A/HK/68在麻醉下给药以攻击小鼠(总呼吸道攻击)。攻击后将存活小鼠(10只小鼠/组)的比例对时间作图。
图25.用200μg编码得自A/PR/34之NP的DNA、对照DNA、或假注射肌肉内免疫四周龄的雌性BALB/c小鼠三次，间隔为三周。在第三次注射DNA后的第6、12和25周用300TCID50的A/HK/68在麻醉下攻击小鼠。在第22周用200μg NPDNA重新免疫所选择的小鼠并在第25周攻击之(“再加强”)。平均体重被表示为每组的最初总体重的百分数。所示的对照组体重是经第6、12和25周攻击的所有对照组体重的平均数，总共6组或是接受了对照DNA或是被假注射的。每组最初包括10只动物；死亡后的小鼠应从进一步的体重分析中排除。
图26.在第0天和42天，用1mg编码得自A/Beijing/89之NP的DNA，1mg编码得自A/Beijing/89之M1的DNA，或者1mg各DNA合并的混合物肌肉内免疫成年(22-28周龄)雄性雪貂。对照雪貂在第0天和42天接受非编码DNA或全人剂量(15μg/株)的含有A/Beijing/89的经许可的完整流感病毒疫苗(92-93配方)。在第56天用A/Georgia/93攻击雪貂。按上述方法测定鼻洗出液中病毒的排出量。通过差异性双向分析，将第3-5天的病毒排出量与注射了对照DNA的雪貂之病毒排出量相比较，注射了NP DNA、M1 DNA或NP＋M1 DNA的雪貂之排出量比对照雪貂之排出量要低很多(分别地为P＜0.0001，0.0016和＜0.0001)。注射了NP(未显示数据)、M1或NP＋M1的雪貂之排出量与注射了经许可的疫苗的雪貂之排出量没有显著差异(分别为P＝0.104，0.533和0.145)。对1mg免疫接种剂量的选择是随意的；剂量范周的研究在非人灵长类中进行。
图27.在第0、21和121天，用对照DNA、盐水、或编码流感病毒A/PR/8/34蛋白质的DNA肌肉内免疫8只雄性22-25周龄雪貂组，在第148天经用200 TCID50的A/PR/8/34鼻内攻击。免疫的动物接受1mg NP DNA，或2mg合并的NP，NS1，PB1，PB2和M1 DNA(每种构建体400μg)。对照组接受0.5ml/腿的盐水或1mg对照DNA。为了分析之目的，将接受盐水和对照DNA的组合并(对照组)，同样也将接受单独的或与其他内部蛋白质基因联合的NP DNA组合并(内部组)。该图显示鼻洗出液的感染效价，以3ml体积鼻洗出液的每50μl的TCID50表示。假定未稀释的洗出液(所试验的最低稀释度)是原始鼻渗出液的1∶10稀释度，而阳性未稀释样品被指定为1log值。基于在三个相同实验样品中的Reed-Muench内推法，指定1log以上的效价产生50％感染性终点。试验时指定未稀释的阴性样品为0log值。图中所示的P值是在所指出的天数通过对两个平均值的T试验所计算出的经免疫的雪貂对对照组的差异性。全部曲线的P值是通过差异性双向分析计算出的，NP对对照组＜0.0001，而合并的DNA对对照组＜0.001。
图28.用DNA免疫的小鼠再经流感病毒攻击后的存活率。用200μg编码得自A/PR/34之HA的DNA或者对照(非编码)DNA肌肉内注射小鼠三次，间隔为三周。末次免疫后三周用1000 TCID50的A/PR/34经总呼吸道攻击(在麻醉状态下的鼻内滴注)小鼠。攻击后将数据对时间作图，表示存活百分数(n＝每组9或10只小鼠)。
图29.经DNA免疫的小鼠再经流感病毒攻击后重量的丢失。用200μg编码得自A/PR/34之HA的DNA或者对照(非编码)DNA经肌肉内注射小鼠三次，间隔为三周。末次免疫后三周，用1000 TCID50的A/PR/34经总呼吸道攻击(于麻醉下的鼻内滴注)小鼠。数据对时间作图，表示为每组平均的每只动物初始体重百分数(死亡动物从平均值中排除)。
图30.经用DNA免疫的小鼠再经流感病毒攻击后的存活率。用1，10或100μg编码得自A/PR/34之HA的DNA或者对照(非编码)DNA肌肉内注射小鼠三次，间隔为三周。末次免疫后三周，用1000 TCID50的A/PR/34对小鼠经总呼吸道攻击(于麻醉下鼻内滴注)。攻击后数据作为存活百分数对时间作图。(n＝每组9或10只小鼠)。
图31.在第0、21和121天用对照DNA、盐水、或编码流感病毒A/PR/8/34蛋白质的DNA肌肉内免疫一组8只雄性22-25周龄雪貂，在第148天经用200 TCID50的A/PR/34鼻内攻击，被免疫的动物接受1mg HA DNA，或2mg合并的HA，NP，NS1，PB1，PB2和M1 DNA(每种构建体为330μg)。对照组接受0.5ml/腿的盐水或1mg对照DNA。为了分析之目的，将接受盐水和对照DNA的组合并(对照组)，同样也将接受单独的或与其他内部蛋白质基因联合的HA DNA(HA，HA＋内部蛋白质)组合并。图中所示为鼻洗出液的感染性效价，以3ml体积的鼻洗出液中每50μl的TCID50表示。假定未稀释的洗出液(所试验的最低稀释度)对原始鼻渗出液的稀释度为1∶10，而阳性未稀释样品被指定为1log值。基于在三个相同实验样品间的Reed-Muench内推法，指定1log以上的效价产生50％感染性终点。试验时未稀释的阴性样品被指定为0log值。整个曲线的P值是通过差异性双向分析计算出的，HA对对照组＜0.0001，而合并的DNA对对照组＜0.0001。
图32.在第0天和42天，用1mg编码得自A/Georgia/93之HA的DNA肌肉内免疫成年(22-28周龄)雄性雪貂。对照组雪貂在第0天和42天接受非编码的DNA或全人剂量(15μg/株)被许可的含有A/Beijing/89的完整流感病毒疫苗(92-93配方)。在第56天用A/Georgia/93攻击雪貂。按上述方法测定鼻洗出液中病毒的排出量，通过差异性双向分析将第1-6天的病毒排出量与接受对照DNA的雪貂的病毒排出量相比较。接受HA DNA之雪貂的排出量比对照雪貂的排出量要低很多(P＜0.0001)。
图33.在第0天和42天，用1mg编码得自A/Hawaii/91或A/Beijing/89(数据未显示)之HA的DNA肌肉内免疫成年(22-28周龄)雄性雪貂。对照组雪貂在第0天和42天接受非编码的DNA或全人剂量(15μg/株)经许可的含有A/Beijing/89的完整流感病毒疫苗(92-93配方)。在第56天用A/Georgia/93攻击雪貂。按上述方法测定鼻洗出液中的病毒排出量，通过差异性双向分析将第1-6天的病毒排出量与接受对照DNA之雪貂的病毒排出量相比较。接受A/Hawaii/91 HA DNA之雪貂的排出量显著低于对照组雪貂的排出量(P＜0.0001)。接受A/Hawaii/91 HA DNA之雪貂的排出量显著低于接受经许可之产品的雪貂的排出量(对于A/Hawaii/91HA DNA P＝0.021；第1-6天的双向ANOVA)；接受A/Beijing/89HA DNA(数据未显示)之雪貂的排出量与接受经许可产品之雪貂的排出量没有明显差别(P＝0.058；第1-6天的双向ANOVA)。
图34.在第0天和42天，用1mg编码得自A/Hawaii/91之HA的DNA(见图13)，或330μg编码得自A/Hawaii/91之HA的DNA，以及编码得自A/Beijing/89的NP和M1 DNA中的每一种肌肉内免疫成年(22-28周龄)雄性雪貂。对照组雪貂在第0天和42天接受非编码的DNA或全人剂量(15μg/株)经许可的含有A/Beijing/89的完整流感病毒疫苗(92-93配方)。在第56天用A/Georgia/93攻击雪貂。按上述方法测定鼻洗出液中病毒的排出量，通过差异性双向分析将第1-6天的病毒排出量与接受对照DNA之雪貂的病毒排出量相比较。接受HA＋NP＋M1 DNA之雪貂的排出量显著低于接受被许可之疫苗(P＜0.0001)或单独的HADNA(P＝0.0053)之雪貂的排出量。
图35.在第0天和42天，用1mg编码得自A/Georgia/93之HA的DNA，或330μg编码得自A/Hawaii/91之HA的DNA，以及编码得自A/Beijing/89的NP和M1 DNA中的每一种肌肉内免疫成年(22-28周龄)雄性雪貂。对照组雪貂在第0天和42天接受非编码的DNA或全人剂量(15μg/株)经许可的含有A/Beijing/89的完整流感病毒疫苗(92-93配方)。在第56天用A/Georgia/93攻击雪貂。按上述方法测定鼻洗出液中病毒的排出量，通过差异性双向分析将第1-6天的病毒排出量与接受对照DNA之雪貂的病毒排出量相比较。接受HA＋NP＋M1 DNA之雪貂的排出量与接受同源HA DNA之雪貂的病毒排出量没有显著差别(P＝0.064)。
图36.V1R的序列。发明的详细描述
本发明提供了核酸药物，当将其直接引入包括脊椎动物如哺乳动物和人在内的动物体内时，可在动物体内诱导其所编码的蛋白质的表达。如所说的蛋白质是该动物体内除了在病理情况下外不能正常产生的蛋白质，例如与流感病毒相关的蛋白质，例如但不局限于流感病毒的核蛋白质，神经氨酸酶、血凝素、聚合酶、基质或非结构蛋白质，便使动物的免疫***被激活以发动保护性应答。由于这些外源性蛋白质是由动物自身组织产生的，所以经表达的蛋白质由主要组织相容性复合物，MHC来加工和生成。此识别与经相关生物体实际感染时出现的识别相似。本公开中所示结果是诱导对抗病毒感染的保护性免疫反应。
本发明提供了核酸，当其以相似的机理经注射、吸入或划痕被引入动物活体组织中时(见上述本发明的背景部分)，即可诱导人流感病毒基因产物的表达。因此，例如将本发明的DNA构建体注射到小鼠的肌肉中即可诱导所编码的基因产物表达，同样地在雪貂和猕猴中也是如此。随后，使用毒性流感病毒攻击，所用剂量同样都能杀死对照组动物，经多核苷酸疫苗注射过的动物呈现出降低很多的发病率和死亡率。因此本发明公开了对人防止流感病毒感染有用的疫苗。
我们已显示编码流感病毒蛋白质的DNA构建体可在动物中产生保护性免疫反应。以下将更详细地描述之，动物中的免疫反应包括鼠中抗体和CTL的产生，雪貂和灵长类的抗体产生，以及在鼠和雪貂中保护动物使之免受流感病毒同源的、经漂变和移位的病毒株的攻击。用编码病毒蛋白质的DNA免疫的最显著结果可能是赋予对抗病毒的不同亚型的能力。在疫苗中加入诱生CTL的成分之建议适用于减轻新变异体的影响，而此变异体在流感季节中期产生或者是每年为下一年选择疫苗病毒株时未曾预料到的。重要的是，在雪貂中用编码HA、NP和M1基因的cDNA载体免疫比用被批准的疫苗可得到更为有效的抗病毒漂变株的保护作用。这一点为使用编码PNV内部基因的构建体提供了正当的理由。
在一个实施方案中，疫苗产品将含有分离的DNA质粒，编码例如临床上流行的被称为A/H1N1(A/Texas/91)，A/H3N2(A/Georgia/93)，和B(B/Panama/90)病毒的三个病毒株的HA，以及编码得自A(Beijing/89；H3N2)和B病毒株两者之内部保守蛋白质NP和M1(基质)的DNA构建体，用以提供抗漂变和移位之抗原的普遍类保护。HA DNAs通过产生HA和得到抗HA的中和抗体而发挥作用。它与现有被许可的，以蛋白质为基础的疫苗相比为型特异性的，增加了抗漂变病毒株的保护宽处。NP和M1构建体会导致CTL的产生，CTL可提供具有潜在的较低病毒负荷以及可加速疾病恢复的交叉病毒株保护作用。预期的DNA构建体(以游离的非复制、非整合形式存在于肌肉细胞中)的持续时间可望能提供比现有疫苗更长的保护作用持续期。
预期超出目前被许可疫苗的优点包括：由于CTL反应±增加的抗体宽度而增加的保护宽度，以及增加的保护期限。PNV法无需象目前被许可的疫苗那样制造、选择和繁殖重分配子，因为新的DNA构建体可以更直接地从临床分离物制得。
在本发明的一个实施方案中，将得自A/PR/8/34株的人流感病毒核蛋白质即NP的序列克隆到表达载体中。载体含有RNA聚合酶转录的启动子，以及NP编码序列未端的转录终止子。在一个优选的实施方案中，启动子为禽肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)长末端重复区(LTR)，它是一种强的转录启动子。更优选的启动子是带有内含子A序列的巨大细胞病毒(CMV-intA)启动子。优选的转录终止子是牛生长激素终止子。特别优选CMV intA-BGH终止子的组合。另外为帮助药物制备，优选在表达载体中也包括抗生素的抗性标记，可使用氨苄青霉素抗性基因，新霉素抗性基因或者任何其它的药学上可接受的抗生素抗性标记。在本发明优选的实施方案中，抗生素抗性基因编码新霉素抗性的基因产物。另外为帮助在原核生物体中通过发酵以使药物高水平地产生，载体最好含有复制起点并且是高拷贝数的。大量商品原核克隆载体中的任何一种都可提供这些益处。在本发明的优选实施方案中，这些功能都由称为pUC的商品载体提供。理想的是除去非必需的DNA序列，因此在本发明的一个实施方案中除去了pUC的lacZ和lac1编码序列。
在一个实施方案中使用了pnRSV表达载体，其中禽肉瘤病毒(RSV)长末端重复区(LTR)被用作启动子。在另一实施方案中使用了V1，即经突变的pBR322载体，在其上克隆了CMV启动子和BGH转录终止子。用V1-NP构建体免疫小鼠并诱导可保护免受异源攻击的CTL。在本发明特别优选的实施方案中，联合了V1的元件以产生被称作V1J的表达载体。将流感病毒基因如A/PR/8/34NP，PB1，NS1，HA，PB2或M1基因克隆到V1J中。在另一个实施方案中，从V1J中除去氨苄青霉素抗性基因而代之以新霉素抗性基因，以产生V1J-neo(SEQ.ID：18：，图7)。根据本发明将大量不同的流感病毒基因中的任一种克隆进此载体以使用。仍在另一个实施方案中，载体为V1Jns，除了在V1J-neo的2114位置处的单一Kpn1位点中设计了唯一的Sfi1限制性位点外，它与V1J是相同的。在人基因组DNA中Sfi1位点的发生率非常低(大约每100,000个碱基有1个位点)。因此，简单地通过对经提取的基因组DNA进行Sfi1消化，此载体即可允许小心监测向宿主DNA中迁移的表达载体。进一步地改善中，载体是V1R。在此载体中，尽可能多地从载体上“切去”非必需DNA以产生高度简洁的载体。此载体是V1Jns的衍生物，并示于图36中(SEQ.ID：45：)。此载体允许使用较大的***段，较少涉及到被编码的非必需序列，并且将编码特异性流感病毒基因的构建体引入周围组织中时，它可被细胞最佳化摄入。图36中，缺失的V1Jneo部分(图7)以缺口表示，而***序列以轮廊清楚的黑体字表示，但V1Jneo的编号未变。前述载体的修饰和发展过程可根据本技术熟练人员熟知的方法来完成。然而尽管所描述的特殊产品是通过常规方法得到的，仍对它们所适合的特殊目的特别有用。
本发明的一个实施方案掺入来自A/PR/8/34株的流感病毒NP基因，而更优选的实施方案是掺入来源于更近的流感病毒分离物的NP基因、HA基因、NA基因、PB基因、M基因或NS基因。这可通过制备病毒基因的DNA拷贝，然后亚克隆单独的基因来完成。目前许多流感病毒株的许多基因的序列在GENBANK(对于流感病毒A基因约有509个这样的序列)上是公众可以利用的。因此本发明优选这些基因中的任一个，它们克隆自最新的Texas，Beijing或Panama病毒分离物，这些病毒株因在抗流感病毒疫苗中是合乎需要的而被疾病控制中心推荐(见Lederle，Physicians DeskReference，1993，p1232的FLU-IMMUNE_流感病毒疫苗，一种含有来自A/Texas/36/91之血凝素蛋白质，H1N1；A/Beijing/353/89血凝素蛋白质，H3N2；以及B/Panama/45/90的三价纯化的流感病毒表面抗原疫苗)。这里按照以下述常规描述DNA构建体以保持命名法的一致：“载体名称-流感病毒株-基因”。因此表达载体V1Jneo中克隆有A/PR/8/34病毒株之NP基因的构建体，这里所给的名称是“V1Jneo-PR-NP”。自然地，当病毒的病原株改变时，最适于混合进药物中的精确基因也会改变。然而正如以下所阐述的，由于细胞毒性淋巴细胞反应是经过诱导的，它能够对抗异源病毒株。因此与以完整病毒或亚单位多肽为基础的疫苗相比，本发明的新疫苗对病毒株的变异性不那么严格。另外，由于此药物易于操作以***新的基因，所以这是用一般的分子生物学技术容易做到的。
由于在流感病毒不同株中核蛋白质的序列是保守的，故可得到对抗随后的与所克隆的核蛋白质基因来源病毒株异源之流感病毒A毒力株的攻击。对大量流感病毒A株的NP的比较显示在二级结构上没有明显差异[M.Gammelin et al.，Vi vol.170，71，1989]，并且氨基酸序列改变很少[O.T.Gorman et al.，J.Virol.65，3704，1991]。在大约50年的期间内，人类病毒株中的NP仅以每年0.66个氨基酸变化的频率进化。而且，我们的显示出A/HK/68特异性CTL识别经用衍生于A/PR8/34 NP之合成肽NP(147-155)脉冲的靶细胞的结果表明，在34年的期间内，H-2Kd限制的CTL抗原决定基仍在功能上保持不变(见图2)。也应注意到，在基因编码病毒表面抗原如血凝素甚或神经氨酸酶时，除了很重要的细胞毒性淋巴细胞反应以外，还产生有意义的中和体液(抗体)免疫反应。
肌内注射编码流感病毒A的保守的内部蛋白质之DNA表达载体，可导致抗继后病毒攻击的有意义的保护性免疫的产生。尤其是产生NP特异性抗体以及初级CTL。与对照组相比，NP DNA免疫会导致肺病毒效价的降低，体重损失的抑制，以及存活率的上升。保护性免疫反应不是由NP特异性抗体介导的，这一点可通过对抗病毒感染时，单独的NP抗体不起作用来证明(见实施例4)，因此似乎应将它归功于NP特异性细胞免疫。而且，还产生了针对NP的显著水平的初级CTL。此保护是针对与所克隆DNA来源株异源的流感病毒A的强毒力株的。另外，攻击病毒株在A/PR/8/34株之后已产生了三十多年，这表明尽管可变的外壳蛋白质抗原移位和漂变，但针对保守蛋白质的免疫反应仍会有效。由于每种流感病毒基因产物都存在某种程度的保守性，又由于在反应细胞内表达和MHC加工时会产生CTL，所以可预测其它流感病基因引起的反应与NP所引起的相似。鉴定免疫原性抗原决定基的方法在本技术中是熟知的(例如参见Shirai et al.，J.Immunol 148：1657-1667，1992；Choppin etal.，J.Immunol 147：575583，1991；Calin-Laurens，et al.，Vaccine 11：974-978，1993]。因此已克隆了许多这样的基因，如通过在表达载体中经克隆和测序的连接所显示的，(见下文)，以致这些构建体成为可利用形式的预防剂。
因此本发明提供了作为免疫原的编码流感病毒蛋白质的表达载体。本发明还提供了可诱导交叉病毒株的保护性免疫，而无需自身复制药剂或佐剂的方法。另外，用DNA免疫提供了许多其他的优点。首先此疫苗接种方法应适用于肿瘤以及传染性因子，因为CD8+CTL应答对这两种病理生理学过程都是重要的[K.Tanaka et al.，Annu.Rev.Immunol.6，359(1988)]。因此引发抗转化过程中决定性的蛋白质的免疫反应是肿瘤保护或免疫治疗的有效手段。其次，注射病毒蛋白质(NP和血凝素)和人生长激素DNA(例如参见D.C.Tang et al.，Nature 356，152，1992]后抗被表达之蛋白质的高效价抗体的产生，表明这是制造基于抗体之疫苗的容易做到并十分有效的方法，此疫苗单独地使用或者与细胞毒性T淋巴细胞疫苗联合使用以对抗保守的抗原。
产生和纯化DNA构建体简单易行，与传统的蛋白质纯化相比是有利的，并便于产生联合疫苗。因此，例如可以制备、混合并合用编码NP、HA、M1、PB1、NS1或任何其他流感病毒基因的多种构建体。最后，由于注射DNA后可以维持蛋白质的表达[H.Linet al.，Circulation 82，2217(1990)；R.N.Kitsis et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88，4138(1991)；E.Hansen etal.，FEBS Lett.290，73(1991)；S.Jiao et al.，Hum.GeneTherapy 3，21(1992)；J.A.Wolff et al.，Human Mol.Genet.1，363(1992)]。可以提高B和T细胞记忆的持续时间[D.Grayand P.Matzinger，J.Exp.Med.174，969(1991)；S.Oehen etal.，ibid.176，1273(1992)]。因而可产生长期有效的体液和细胞介导的免疫。
被批准的流感病毒疫苗的现时局限性强调需要发展更有效的方法，以限止感染和改善病情。老的疫苗提供有局限的保护，仅对一些经选择的病毒株有效，短时间后它们的效力即会减退。因此，现有疫苗应为每年的接种重新配制以使之有效。抗内部蛋白质的经改善的CTL反应的产生可能会提供已被批准之疫苗现时所不能产生的显著长期的、交叉反应性免疫。
我们通过观察宿主直接抗流感病毒抗原的免疫反应，已在小鼠、雪貂和非人灵长类动物中证明了PNV构建体的蛋白质表达。与经用与DNA构建体所包括的不相同之流感病毒亚型(移位病毒株)攻击后的对照组动物相比，用编码流感病毒NP的DNA注射过的小鼠可导致存活率上升、肺部病毒的效价降低以及体重损失减小。我们也观察到经NP DNA接种的雪貂被移位病毒株攻击后病毒的排出量减少。这些结果表明抗流感病毒主要移位株的保护作用是由包括编码NP之基因的DNA疫苗辅助的。给实验室动物注射HA DNA后再用漂变的病毒株攻击甚至会导致病毒排出量更加实质性的减少。单独注射HADNA后观察到加入内部蛋白质DNA仅会略微增强高程度的保护作用。
小鼠经注射后对流感病毒DNA的免疫反应已持续长达6个月，并持续产生抗体、CTL活性以及体内保护作用。重复注射DNA后在第25周再用不同亚型的流感病毒株攻击可进一步增加存活率，这表明了加强保护性细胞介导之免疫的能力。也有文献指出在两次注射HA DNA后抗体可持续至少一年，并且给非洲绿猴注射一次HA DNA后抗体至少可持续九个月。
这些动物实验的结果表明，直接DNA注射可提供一种保护人免受流感病毒感染和疾病的改良方法。需注意的是，经DNA注射的实验保护作用是通过接种未接触过抗原的小鼠和雪貂获得的。经DNA接种的成人应已预先接触过流感病毒，这些人经用DNA构建体免疫后甚至会显示出更具实质性的免疫应答，并可能会增加持续时间。
就免疫原性进行剂量范围的比较以使所使用的浓度最佳化。在小哺乳动物实验中，少至1μg的NP DNA即可诱导抗体和CTL反应。对猕猴的免疫接种表明剂量为100和1000μg HA DNA(A/PR/08/34)时，2只动物中的2只都有抗体反应，而用10μg单次注射时，2只动物中只有1只有反应。在分立的实验中，用编码得自三个病毒亚型的HA以及编码流感病毒A毒株之NP和M1 DNA的五种不同DNA构建体的混合物注射天然非洲绿猴，每组的三只猴都对包含有10μg或100μg五种构建体的每种的疫苗有反应。根据这些发现可预测10、50、100和200μg的DNA剂量对人是有效的。
被批准的、灭活的疫苗预防感染与抗HA的血清和粘膜的抗体水平相关，而与针对流感病毒内部蛋白质的抗体反应无关。因此，流感病毒DNA疫苗的开发必须包括HA。然而，对NP的免疫反应加强了对HA的抗体反应，而流感病毒内部蛋白质提供了与抗原性不相同的流感病毒株有交叉反应的CTL反应。正如上文中提到的，动物实验也表明当注射包括有编码内部蛋白质以及HA的DNA构建体时，改善了免疫原性和保护作用。包括有编码内部蛋白质的DNA构建体的疫苗可能会增强此DNA疫苗对人的效力。由于剂量水平可能会依靠这些成分间的相互作用，因此经常规试验使本领域熟练技术人员能够决定疫苗中DNA的量，以制备HA、NP和M1 DNA构建体混合物。可分开测定宿主对这些成分中之每种成分的反应，并比较血凝素抑制(HI)效价和抗HA成分的中和抗体以及抗M1和NP抗原决定基的CTL反应。将结果与注射只表达HA之构建体后的抗体反应相比较，这些研究可以评价对含有编码HA以及内部蛋白质的DNA疫苗的潜在增强的反应。
对接受流感病毒DNA疫苗的志愿者再经鼻内攻击，以显示疫苗在人体内对抗类似病毒株以及不同亚型的流感病毒株的效力。疫苗的组分、剂量和给药方式是基于上述研究结果而定的。临床效力由感染率、病情以及疾病期限来显示。将这些临床发现与对宿主免疫应答和病毒排出的实验室评价相比较，以确定与保护作用相关的代用标志。
制备和纯化DNA构建体的分子生物学标准技术可用于准备本发明的DNA治疗剂。虽然分子生物学的标准技术足以生产本发明的产品，但本文公开的特殊构建体提供了新的治疗剂，该治疗剂令人惊奇地产生交叉病毒株保护作用，因此可达到一般灭活的完整病毒或亚单位蛋白质疫苗所不能达到的效果。
向疫苗接种者体内引入的可表达之DNA的量取决于用于DNA构建体的启动子转录和转译的强度，并取决于所表达之基因产物的免疫原性。通常，直接用药于肌肉组织的免疫学或预防学有效剂量为约1μg至1mg，优选约10μg至300μg。也可能经皮下注射、真皮内导入、通过皮肤划痕、以及其他给药方式如腹膜内、静脉内或吸入给药。也期望提供加强免疫接种。
DNA可以是裸露的，即与任何影响接受者免疫***的蛋白质、佐剂或其他试剂不相关联。在这种情况下，有必要将DNA制成生理上可接受的溶液，例如但不只限于用无菌盐水或无菌缓冲盐水。另外，DNA也可与脂质体相结合，如卵磷脂脂质体或其他本领域已知的脂质体，例如DNA-脂质体混合物(例如参见WO9324640)，或者DNA也可与本领域已知的佐剂相结合以促进免疫反应，如蛋白质或其他载体。使用协助细胞内DNA摄入的制剂例如但不只限于钙离子、病毒蛋白质和其他利于转染的试剂是有利的。这些试剂通常是指便于转染的试剂和药学上可接受的载体。本文所用的基因一词是指编码分离之多肽的核酸的片段。药物和疫苗二词可互换使用以指可用于诱导免疫反应的组合物。构建体和质粒两词也可替换使用。载体一词是指用根据本发明的方法的其中克隆有基因的DNA。
因此，本发明的一个实施方案是使用流感病毒基因诱导脊椎动物如包括人在内的哺乳动物体内免疫反应的方法，包括：a)分离基因，b)将基因与调节序列连接以使基因有效地连接于控制序列上，当将
其引入活体组织时会引导基因的转录起始以及随后的翻译，c)将基因导入活体组织，以及d)任选地，用另外的流感病毒基因促进。
本发明优选的实施方案是对抗流感病毒异源株的方法。这是通过使用免疫学上有效剂量的编码保守的流感病毒抗原决定基的核酸来实现的。例如，流感病毒核蛋白质的完整基因提供了此功能，也期望其他流感病毒基因的编码序列及这些基因内的编码保守的抗原决定基的部分同样可提供交叉病毒株保护作用。
本发明的另一个实施方案中，DNA疫苗编码人流感病毒核蛋白质、血凝素、基质、非结构蛋白质、或聚合酶基因产物。以下提供的是此实施方案的特殊例子，其中人流感病毒基因编码核蛋白质、碱性聚合酶1、非结构蛋白质1、血凝素、基质1、人流感病毒分离株A/PR/8/34的碱性聚合酶2，人流感病毒分离株A/Beijing/353/89的核蛋白质，人流感病毒分离株A/Texas/36/91的血凝素基因或者人流感病毒分离株B/Panama/46/90的血凝素基因。
在本发明的特殊实施方案中，DNA构建体编码流感病毒基因，其中DNA构建体能够在导入动物活体组织中后被表达并产生对抗所编码之流感病毒基因的表达产物的免疫反应。而且，本发明明显地希望包括含有这类构建体与编码其他与流感病毒无关之抗原的多核苷酸的组合。优选的编码流感病毒基的DNA构建体的例子包括：a)pnRSV-PR-NP，b)V1-PR-NP，c)V1J-PR-NP，其5′末端是SEQ.ID：12：，d)V1J-PR-PB1，其5′末端是SEQ.ID：13：，e)V1J-PR-NS，其5′末端是SEQ.ID：14：，f)V1J-PR-HA，其5′末端是SEQ.ID：15：，g)V1J-PR-PB2，其5′末端是SEQ.ID：16：，h)V1J-PR-M1，其5′末端是SEQ.ID：17：，i)V1Jneo-BJ-NP，其5′末端是SEQ.ID：20：，而3′末端是
SEQ.ID：21：，j)V1Jneo-TX-NP，其5′末端是SEQ.ID：24：，而3′末端是
SEQ.ID：25：，和k)V1Jneo-PA-HA，其5′末端是SEQ.ID：26：，而3′末端是
SEQ.ID：27：，1)V1Jns-GA-HA(A/Georgia/03/93)，构建体大小为6.56kb，其
5′末端是SEQ.ID：46：，而3′末端是SEQ.ID：47：，m)V1Jns-TX-HA(A/Texas/36/91)，构建体大小为6.56kb，其
5′末端是SEQ.ID：48：，而3′末端是SEQ.ID：49：，n)V1Jns-PA-HA(B/Panama/45/90)，构建体大小为6.61kb，其
5′末端是SEQ.ID：50：，而3′末端是SEQ.ID：51：，o)V1Jns-BJ-NP(A/Beijing/353/89)，构建体大小为6.42kb，
其5′末端是SEQ.ID：52：，而3′末端是SEQ.ID：53：，p)V1Jns-BJ-M1(A/Beijing/353/89)，构建体大小为5.62kb，
其5′末端是SEQ.ID：54：，而3′末端是SEQ.ID：55：，q)V1Jns-PA-NP(B/Panama/45/90)，构建体大小为6.54kb，其
5′末端是SEQ.ID：56：，而3′末端是SEQ.ID：57：，和r)V1Jns-PA-M1(B/Panama/45/90)，构建体大小为5.61kb，其
5′末端是SEQ.ID：58：，而3′末端是SEQ.ID：59：。
以下实施例对本发明提供进一步的限定，但没有将本发明局限于特定实施例。
                    实施例1编码人流感病毒蛋白质的DNA构建体的制备：
i).pnRSV-PRNP：A/PR/8/34NP基因是从pAPR501[J.F.Younget al.，in The 0rigin of Pandemic Influenza Viruses，W.G.Laver，Ed.(Elsevier Science Publishing Co.，Inc.，1983)]中分离出来的一条1565个碱基对的EcoRI片段。经Klenow补缺后克隆到经Klenow补缺并用磷酸酶处理过的pRSV-BL之XbaI位点上。经过先用XhoI和NcoI消化pBL-CAT3[B.Luckow and G.Schutz，Nuc.Acids Res.15，5490(1987)]载体以便去掉CAT编码序列，再以K1enow补缺并自身连接来构建pRSV-BL。作为NdeI和Asp718片段从pRshgrnx[V.Giguere et al.，Nature 330，624(1987)]中分离RSV启动子片段，经Klenow补缺后克隆到上面产生的中间载体(缺失CAT序列的pBL-CAT)的HindIII位点中。
ii)V1-NP：从pCMVIE-AKI-DHFR[Y.Whang et al.，J.Virol.61，1796(1987)]构建表达载体V1。经以EcoRI剪切载体并自身连接去掉AKI和DHFR基因。这一载体不含位于CMV启动子中的内含子A。因此，它作为一个具有删除了内部SacI位点[编号为1855，B.S.Chapman et al.，Nuc.Acids Res.19.3939(1991)]的PCR片段被加入。PCR反应所用的模板是pCMVint A-Lux，经连接来自pCMV6a120[见B.S.Chapman等，出处同上]的HindIII和NheI片段制成，其包括将hCMV-IE1增强子/启动子和内含子A，将其***pBL3的HindIII和XbaI位点以产生pCMVIntBL。将来自RSV-Lux[J.R.de Wet et al.，Mol.Cell Biol.7，725，1987]的1881个碱基对的荧光素酶基因片段(HindIII-SmaI片段，经klenow补缺)克隆到经Klenow补缺和磷酸酶处理过的pCMVIntBL之SalI位点中。跨越内含子A的引物是：5′引物，SEQ.ID：5：5′-CTATATAAGCAGAGCTCGTTTAG-3′3′引物，SEQ.ID：6：5′-GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGACTGCAG-3′用于去掉SacI位点的引物是：有义引物，SEQ ID：7：5-GTATGTGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC-3′和反意引物，SEQ ID：8：5′-GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACATAC-3′
用SacI和BglII切割PCR片段，并***已用相同酶切割过的载体中。来自流感病毒A(A/PR/8/34)的NP基因以1565个碱基对EcoRI片段形式从pAPR501[J.F.Young et al.，in The0rigin of Pandemic Influenza Viruses，W.G.Laver，Ed.(Elsevier Science Publishing Co.，Inc.1983)]中切割出来并修成平头。将它在切成平头的BglII位点***V1中，以产生V1-NP。质粒在E.coli中增殖并以碱溶解法纯化[J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，in Molecular Cloning，A LaboratoryManual，second edition(Cold spring Harbor Laboratory Press，1988)]。用乙醇沉淀经用CsCl分成带的DNA，以2mg/ml的浓度重新悬浮于0.9％盐水中用于注射。
                      实施例2人流感病毒细胞毒性T淋巴细胞试验：
从用DNA免疫过或用A/HK/68感染后康复的小鼠产生细胞毒性T淋巴细胞。对照组培养物得自用对照DNA注射过的小鼠和未经注射的小鼠。制备单细胞悬液，用氯化铵溶解以去掉红血细胞，在含有10％胎牛血清(FBS)，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.01M HEPEs(pH7.5)，和2mM L-谷氨酸的RPMI 1640培养基中培养脾细胞。用10μM的H-2Kd限制性肽抗原决定基NP147-155(Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val，SEQ ID：9：)脉冲辐射等量的自体刺激细胞60分钟或用流感病毒A/PR8/34(H1N1)感染该细胞，并将它与10U/ml的重组人IL-2(细胞产品，Buffalo，NY)一起加入脾细胞中，培养物在37℃、5％CO2和100％相对湿度条件下维持7天。在选择性实验中，加入rhIL-2(20U/ml)和ConA(2Lg/ml)代替自体刺激细胞。用每106细胞经60μCi的51Cr标记3小时并按上面所述以NP147-155脉冲辐射过或以流感病毒A/Victoria/73(H3N2)感染过的P815细胞测定细胞毒性T细胞效应活性。对照组靶细胞(标记的P815细胞不加肽或病毒)不溶胞。靶细胞在圆底96孔平板上以1×104细胞/孔铺板并一式三份与效应物保温4小时。从各孔中移出上清液(30μl)并在β板闪烁计数器(LKB-Wallac.Turku，Finland)中计数。测定每个靶细胞制品的最高计数值(经加入6M HCl而释放)和自发计数值(无CTL时释放的)。特异性溶胞百分数按下式计算：[(实验值-自发值)/(最高值-自发值)]×100。
                  实施例3NP特异性CTLs和抗体的体内产生：
在BALB/c小鼠的两腿四头肌上注射由劳氏肉瘤(Rous sarcama)病毒或细胞巨大病毒启动子驱动的编码A/PR/8/34核蛋白质之质粒cDNA。所用的表达载体是：i)pnRSV-PRNP，见实施例1；ii)V1-NP，见实施例1。
所用的动物为雌性BALB/c小鼠，得自Charles River实验室，Raleigh，NC。得到时小鼠年龄为4-5周，开始注射DNA时年龄为5-6周。除非特意指出，注射DNA均是经两腿四头肌给药，每腿接受50μl含100μg DNA的无菌盐水。小鼠每间隔3周接受1，2或3套接种。阴性对照动物不注射或注射合适的不含***NP基因的空白载体。
经PCR(图1)分析所选择的动物肌肉中是否存在NP质粒DNA。在48只经肌肉注射试验过的动物中有44只检测到质粒DNA(有NP或荧光素酶DNA)。在用荧光素酶DNA注射过的小鼠中。按照本领域已知的方法[J.A.Wolff et al.，Science247，1465(1990)；G.Ascadi et al.，Nature 352，815(1991)；H.Lin et al.，Circulation 82，2217(1990)；R.N.Kitsis etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88，4138(1991)；E.Hansenet al.，FEBS Lett.290，73(1991)；S.Jiao et al.，Hum.GeneIherapy 3，21(1992)；J.A.Wolff et al.，Human Mol.Genet.1，363(1992)]根据在肌肉抽提物中回收的荧光素酶活性证实蛋白质的表达。
注射NP DNA后NP在肌肉中的表达位于Western印迹分析检测的极限下(＜1ng)但它能用NP-特异性抗体产物显示出来(见图2)。为了分析NP特异性CTL的产生，从免疫后1-4周的动物中取出脾脏，脾细胞用重组人IL-2和经流感病毒A(A/PR/8/34)感染过或以H-2Kd-限制性核蛋白肽抗原决定基(NP残基147-155，见O.K.R_tzscke et al.，Nature 348，252(1990))脉冲辐射过的自体脾细胞一起再刺激。用经病毒感过或经抗原决定基脉冲辐射过的同源细胞再刺激过的脾细胞能杀死用核蛋白抗原决定基脉冲辐射过的靶细胞(图3A)。这表明NP DNA的肌肉注射产生适当的NP衍生肽，该肽与MHCI类相联合能诱导特异性的CTL反应。这些CTLs能识别并溶解病毒感染的靶细胞(图3B)、或以H-2Kd-限制性核蛋白肽抗原决定基脉冲辐射过的靶细胞和病毒感染过的靶细胞。这证实了它们的特异性以及检测被感染之细胞中天然产生之抗原决定基的能力。
NP DNA疫苗免疫原性的更具说服力的测量是估测初级CTL反应。取注射过NP DNA之小鼠的脾细胞，经与ConA和IL-2接触而被激活，但在试验它们杀死适当的靶细胞之能力前，不用抗原表达细胞进行体外再刺激。当用ConA和IL-2体外激活而不进行抗原特异性的再刺激时，来自以NP DNA免疫过之小鼠的脾细胞溶解以抗原决定基脉冲辐射过以及病毒感染过的靶细胞(图3C和D)。不论是再刺激过的还是激活的脾细胞，两者的溶胞活性都比同样处理过的来自预先用流感病毒A/HK/68[一种在A/PR/8/34(H1N1)34年后出现的强毒力小鼠适应性H3N2株]感染过的小鼠的脾细胞之溶胞活性要有利。因此，注射NP DNA产生了对核蛋白质抗原决定基特异的并能够鉴别天然加工之抗原(即：能杀死病毒感染过的细胞)的CTL。在表达人HLA-A2的转基因小鼠C3H和B6中也产生NP CTL。
在以小至1份剂量的1μg NP DNA(最低试验剂量)注射过的BALB/c小鼠脾脏中检测到NP CTL(表3-IV)：表3-IV
单次注射NP DNA后小鼠的CTL反应
  接种 剂量(μg) ％特异性溶胞     sd
 NP DNA    400400    52.580.4     10.710.3
 NP DNA    200200    75.644.6     5.44.4
 NP DNA    100100    76.735.6     2.98.9
 NP DNA    5050    62.976.7     0.67.4
 NP DNA    1010    83.237.7     10.12.5
 NP DNA    11    44.213     0.32
 对照DNA    100    4.9     1
 Flu    79.3     8.3
表3-IV：用单剂量的A/PR/34 NP DNA(V1JNP)或对照DNA(V1J)以所示的剂量注射雌性BALB/c小鼠(4-6周)。以流感病毒A/PR/34感染小鼠作为比较。8周后获得CTL，以经NP肽脉冲辐射过的同源脾细胞体外再刺激，按效应物∶靶细胞比率为50∶1对NP肽脉冲辐射过的P815细胞进行检测。数据以有代表性的个体小鼠的％特异性溶胞来表示。
随后的实验已表明接受1份剂量的1μg NP DNA的小鼠NP CTL至少保持4.5个月(试验的最后时间点)。DNA注射后CTL反应的量值与经流感感染后之小鼠中的反应量值差不多。然而，应该注意的是，经体外抗原再刺激后对CTL的分析不是严格定量的。因此，我们通常进行限制稀释试验以便更定量地估计小鼠的NP特异性CTL水平。在用3剂量的100μg NP DNA注射过的小鼠中，免疫后至少6个月检测到CTL反应(图19)。因此，流感PNV具有产生对抗保守流感病毒抗原的长期CTL反应的潜力。
用NP DNA注射小鼠导致高滴度的抗NP IgG抗体产生(图2)。在小鼠中产生高滴度IgG抗体被认为需要CD4+T细胞的帮助(P.Vieira and K.Rajewsky，Int.Immunol.2，487(1990)；J.J.Donnelly et al.，J.Immunol.145，3071(1990))。这表明从质粒表达的NP在存在MHCI类和II类的条件下在原位被加工。
                      实施例4小鼠在用强毒力人流感病毒攻击的保护作用
从两方面的探讨显示了NP抗体在流感保护性免疫中的作用：首先，在被动转移实验中测定肺部病毒滴度。以0.5ml从经200μgNP DNA注射过三次的小鼠中采集的血清(在2.0ml PBS中稀释)腹膜内注射≥10周龄的雌性BALB/c小鼠。用等体积合并的正常小鼠血清，或被A/HK/68感染后康复的小鼠血清，以及也在2.0ml PBS中注射对照组小鼠。调整A/HK/68免疫血清的剂量，使抗NP抗体的ELISA滴度等于从以NP DNA注射过的小鼠中采集之合并血清的滴度。血清注射后2小时，以盲方式用104 TCID50的A/HK/68攻击未经麻醉的小鼠，3天后，进一步注射等量的血清。感染6-7天后处死小鼠，按Moran[J.Immunol.146，321，1991]所述方法测定每毫升以TCID50表示的肺部病毒滴度。
将来自注射过NP DNA之小鼠的抗NP血清输入未经处理的小鼠中，再用A/HK/68攻击。以小鼠适应性的A/HK/68毒株进行病毒攻击，这一病毒株随后经在小鼠体内传代以维持之(Dr.I.Mbawuike，私人交流)。所用的病毒种子是被染之小鼠的肺匀浆，它在MDCK细胞上的感染性滴度为5×108 TCID50/ml。为滴定肺内病毒滴度和研究体重丢失，以鼻内滴入法将20μl含104 TCID50病毒液滴入未麻醉过的小鼠鼻内，以盲方式进行病毒攻击，如此导致BALB/c小鼠肺部受到病毒的进行性感染但未使动物致死[Yetter.R.A.et al.，Infect.Immunity 29，654，1980]。在存活性实验中，将20μl含102.5 TCID50的病毒液滴入用ketamine和xylazine完全麻醉的小鼠鼻孔中进行攻击，以这一剂量对麻醉小鼠的感染引起迅速的肺部感染并致使90-100％的未经免疫的小鼠死亡[J.L.Schulmanand E.D.Kilbourne，J.Exp.Med.118，257，1963；G.H.Scottand R.J.Sydiskis，Infect.Immunity 14，696，1976；R.A.Yetter et al.，Infect Immunity 29，654，1980]。按Moran等[出处同上]所述方法在96孔板上以MDCK细胞(得自ATCC，Rockville.MD)连续滴定检测肺内病毒滴度。
接受过抗NP抗血清的小鼠肺病毒滴度(6.3±0.2；平均值±SEM；n＝4)与接受过正常血清的对照组小鼠(6.1±0.3；平均值±SEM；n＝4)相比没有发现滴度降低。从经A/HK/68感染的小鼠采集血清并被动地转移给四只未处理过的小鼠以用作阳性对照。用A/HK/68攻击后，在其肺中检测不到病毒感染，表明抗全病毒的血清能对同源病毒的攻击提供完全保护。其次，用纯化的NP(5μg/腿，6周期间3次)经肌肉注射免疫未处理过的小鼠。这些小鼠产生高滴度的NP特异性抗体，但不产生NP特异性CTLs，并且对致死剂量的病毒感染不能提供保护。因此，与抗体对全病毒的中和效应不同，循环抗NP IgG不能为小鼠提供保护性免疫。
估测NP DNA注射的体内保护效力以鉴定细胞介导的免疫反应是否有功能上的意义。一种对免疫反应有效性的直接检测法是：测定以NP DNA免疫过的小鼠清除渐进的、异源性流感病毒株(A/HK/68，H3N2)的亚致死性肺感染之能力。按上面所述方法进行病毒攻击。攻击后的第7天，以NP DNA免疫过的小鼠肺部病毒滴度(1.0±1.0；平均值±SEM；n＝4)比未免疫过的(4.1±0.3；平均值±SEM；n＝4)或以空白载体免疫过的(4.5±0.0；平均值±SEM；n＝4)对照组小鼠低3个数量级。事实上，4只免疫过的小鼠中有3只肺中没有可检测水平的病毒，而对照组小鼠则没有一只能清除病毒达到这一水平。在该实验和其他6个实验中所见到的肺病毒滴度的实质性差别表明，免疫反应加速病毒的清除。空白载体对照缺乏保护效应证实了DNA本身不对免疫反应负责。而且，由于病毒的攻击株A/HK/68(一种强毒力的小鼠适应性H3N2病毒株)与克隆出NP基因的A/PR8/34(H1N1)株是异源性的，所以免疫显然是不同类型的。
为测定病毒引起的发病率，对用NP DNA免疫后以流感病毒A/HK/68进行亚致死性感染的小鼠之体重丢失进行监测(图4)。将未注射的小鼠或以空白载体注射的小鼠作为对照。以NP DNA免疫过的小鼠与对照组小鼠相比表现出较小的体重丢失并且流感病毒A感染后更快地恢复到攻击前的体重。
以流感病毒A鼻内感染完全麻醉的小鼠，如果感染不被控制将引起肺中迅速扩散的病毒复制并在第6-8天死亡(R.A.Yetter etal.，Infect.Immunity 29，654(1980))。用这种方法攻击过的小鼠的存活率反应了它们限制严重急性肺感染的能力。用两种不同的流感病毒株，A/HK/68(见图5)和A/PR/8/34攻击小鼠后，研究了它们的存活能力。预先用NP DNA免疫过的小鼠显示出90％的存活率，而注射过空白载体的小鼠存活率为0％，未注射的对照组动物则为20％(图5)。在总共14次这种实验中，以NP DNA免疫过的小鼠存活率比对照组鼠至少高50％。因此，NP DNA引起的免疫反应能有效地加速康复和减少由在34年后出现的不同病毒株所引起的疾病之能力支持针对保守蛋白蛋产生细胞毒性T淋巴细胞反应的基本原理。
                      实施例5从流感病毒分离物中分离基因：
许多老的流感病毒株保藏在ATCC(1990年动物病毒及抗血清、衣壳及立克次氏体目录，第6版，列出了20种流感病毒A株和14种流感病毒B株)。A.病毒株及其纯化：
含有流行的1992年流感季节疫苗的流感病毒株由Atlanta，GA，疾病控制中心病毒和立克次氏体疾病处的Nancy J.Cox博士提供。这些病毒株为：(1)A/Beijing/353/89(H3N2)；(2)A/Texas/36/91(H1N1)；(3)B/Panama/45/90；和(4)A/Georgia/03/93。
所有这些病毒均在9-11天龄的具胚胎化鸡卵中传代生长(除A/Georgia在MDCK细胞中生长外)(每种病毒制品100-200份)，其按Massicot等人(Virology 101，242-249(1980))所述的改进方法纯化之。简单地说，以8000rpm离心以澄清病毒悬液(Sorvall RC5C离心机，GS-3转子)，然后在Beckman 19型转子离心机中以18000rpm离心2小时得到片状沉淀物。将片状沉淀的病毒重悬于STE(0.1M NaCl，20mM Tris，pH7.4，1mM EDTA)中，以4000rpm离心10分钟(Hermle 2360K离心机)除去聚集物。将2ml上清液铺敷到由2ml 60％蔗糖溶液覆盖上7ml STE缓冲的30％的蔗糖溶液后组成的不连续蔗糖梯度溶液上，以36,000rpm(SW-40转子，Beckman)离心90分钟。收集界面的病毒带，以STE稀释10倍，30,000rpm离心2小时(Beckman Ti 45转子)形成片状沉淀，将片状沉淀的病毒在-70℃下冷藏。B.病毒RNA的提取及cDNA合成：
使用Chomczynski和Sacchi(Anal.Biochem.162，156-159(1987))的方法用商品试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)经异硫氰酸鈲提取从冷藏的病毒中纯化病毒RNA。使用商品cDNA合成试剂盒(Pharmacia)按产品说明书经几处修改后从病毒RNA制备双链cDNA。使用合成的寡聚脱氧核苷酸5′-AGCAAAAGCAGG-3′，SEQ.ID：30：引发cDNA第一条链的合成，所说的SEQ.ID：30：与所有A病毒株基因中位于病毒RNA3′端的保守序列互补。这一序列对所有A型流感病毒RNAs是共同的，因此为克隆任一个A株流感病毒基因提供了一种方法。cDNA的第一和第二条链合成后，反应物用酚/氯仿提取反应物并用乙醇沉淀之，而不继续按试剂盒的说明进行。然后将这些平头cDNA′s直接连接到经BglII限制性酶消化，以T4 DNA聚合酶修成平头及经小牛肠道碱性磷酸酶处理过的V1Jneo或V1Jns载体中。
我们使用合成的寡脱氧核苷酸筛选特定的全长病毒基因，该寡脱氧核苷酸被设计成与给定的病毒基因翻译开放阅读框未端的3′末端互补。经限制性图谱和以琼脂糖凝胶电泳测定大小表现出代表全长基因的样品，并用双脱氧核苷酸测序法测定病毒基因与V1Jneo的两个接合点之序列来证实之，下面实施例8给出了从这些病毒克隆的每个基因的顺序接合点。
除B/Panama/45/90外，采用同样的策略从上面所提到的各病毒中克隆cDNA′s，B/Panama/45/90在其病毒RNA的两端没有共同序列，一种寡聚脱氧核苷酸的混合物被用以引发第一条cDNA链的合成，这些引物是：(1)5′-AGCAGAAGCGGAGC-3′，SEQ.ID：31：用于PB1和PB2；(2)5′-AGCAGAAGCAGAGCA-3′，SEQ.ID：19：用于NS和HA；(3)5′-AGCAGAAGCACGCAC-3′，SEQ.ID：22：用于M；和(4)5′-AGCAGAAGCACAGCA-3′，SEQ.ID：23：用于NP。
对于以PCR克隆的基因，将修成平头的cDNA溶液作为DNA模板直接用作PCR反应中。以PCR法得到的用于克隆6个流感病毒基因的引物如下：1.来自A/Georgia/03/93的HA基因：有意义引物：SEQ.ID：33：5′GGT ACA ACC ATG AAG ACT ATC ATT GCT TTG AGC 3′反意引物：SEQ.ID：34：5′CCA CAT AGA TCT TCA AAT GCA AAT GTT GCA CCT AAT G3′2.来自A/Texas/36/91的HA基因：有意义引物：SEQ.ID：35：5′GGT ACA ACC ATG AAA GCA AAA CTA CTA GTC CTG TTATG 3′反意引物：SEQ.ID：36：5′CCA CAT TCA GAT GCA TAT TCT ACA CTG CAA AG 3′3.来自B/Panama/45/90的HA基因：有意义引物：SEQ.ID：37：5′GGT ACA ACC ATG AAG GCA ATA ATT GTA CTA CTC ATG3′反意引物：SEQ.ID：38：5′CCA CAT TTA TAG ACA GAT GGA GCA AGA AAC ATT GTC3′4.来自A/Beijing/353/89的M1基因：有意义引物：SEQ.ID：39：5′GGT ACA AGA TCT ACC ATG CTT CTA ACC GAG GTC 3′反意引物：SEQ.ID：40：5′CCA CAT AGA TCT TCA CTT GAA CCG TTG CAT CTG CAC 3′5.来自B/Panama/45/90的NP基因：有意义引物：SEQ.ID：41：5′GGT ACA GGA TCC ACC ATG TCC AAC ATG GAT ATT GACGGC 3′反意引物：SEQ.ID：42：5′CCA CAT GGA TCC TTA ATA ATC GAG GTC ATC ATA ATCCTC 3′6.来自B/Panama/45/90的M1基因：有意义引物：SEQ.ID：43：5′GGT ACA GGA TCC ACC ATG TCG CTG TTT GGA GAC ACAATT GCC 3′反意引物：SEQ.ID：44：5′CCA CAT GGA TCC TTA TAG GTA TTT CTT CAC AAG AGCTG 3′
所有的流感基因克隆，不管是由cDNA还是由PCR产生的，都经测定通过连接位点到基因间的序列和在被转染的RD细胞中表达该基因来鉴定。以免疫印迹法检测表达。
从A/Beijing/353/89基因制备A/H3N2病毒株的NP和M1构建体(载体4和5)。因为预料到NP和M1基因均具有高度保守性且鉴于它们的效力，所以选择了这些基因。
根据前述工作，经组合以形成疫苗的7种表达载体之特别优选组包括：
1.V1Jns-HA(A/Georgia/03/93)6.56Kb
2.V1Jns-HA(A/Texas/36/91)6.56Kb
3.V1Jns-HA/(B/Panama/45/90)6.61Kb
4.V1Jns-NP(A/Beijing/353/89)6.42Kb
5.V1Jns-M1(A/Beijing/353/89)5.62Kb
6.V1Jns-NP(B/Panama/45/90)6.54Kb
7.V1Jns-M1(B/Panama/45/90)5.61Kb。
下面提供了表达载体中这些基因接合点的相关顺序。仅有小部分构建体需要测序以证实克隆了正确的基因。经与相同的已知基因比较，很容易证实给定的基因是NP基因、HA基因、M1基因等。例如：A/Texas HA基因序列与A/Kiev/59/79 HA基因序列非常相似，而后者以登录号M38353可从GENBANK中得到。同样，B/Panama HA序列与B/England/222/82的HA序列非常相似，后者能以登录号M18384从GENBANK中得到。以同样的方式可证实对任一个克隆的来自人流感病毒的给定基因之序列的鉴定。在下述的每种情况下，均证实了5′序列和3′序列以确保整个基因的存在。在每个实例中，粗体字ATG显示流感病毒基因的起始密码子，3′部分的粗体字序列显示终止密码子：1.V1Jns-HA(A/Georgia/03/93)6.56Kb：5′序列：(SEQ.ID：46：)...TCA CCG TCC TTA GAT C/GG TAC AAC CAT GAA GACTAT CAT TGC TTT GAG CTA CAT TTT ATG TCT GGTTTT CGC....3′序列：(SEQ.ID：47：)...TCA TGC TTT TTG CTT TGT GTT GTT TTG CTG GGG TTCATC ATG TGG GCC TGC CAA AAA GGC AAC ATT AGG TGCAAC ATT TGC ATT TGA A/GA TCT ATG TGG GAT CTG CTGTGC...2.V1Jns-HA(A/Texas/36/91)6.56Kb：5′序列：(SEQ.ID：48：)...TTA GAT C/GG AAC ATG AAA GCA AAA CTA CTA GTC CTGTTA TGT GCA TTT ACA GCT ACA TAT GCA....3′序列：(SEQ.ID：49：)...CTG GTG CTT TTG GTC TCC CTG GGG GCA ATC AGC TTCTGG ATG TGT TCT AAT GGG TCT TTG CAG TGT AGA ATATGC ATC TGA ATG TGG/GAT CTG CTG TGC CTT....3.V1Jns-HA(B/Panama/45/90)6.61Kb：5′序列：(SEQ.ID：50：)...CCT TAG ATC/GGT ACA ACC ATG AAG GCA ATA ATT GTACTA CTC ATG GTA GTA ACA TCC AAC GCA GAT CGA ATCTGC ACT GGG ATA ACA TCT TCA AAC TCA CCT CAT GTG....3′序列：(SEQ.ID：51：)...TTG GCT GTA ACA TTG ATG ATA GCT ATT TTT ATTGTT TAT ATG GTC TCC AGA GAC AAT GTT TCT TGCTCC ATC TGT CTA TAA ATG TGG/GAT CTG CTG TGCCTT...4.V1Jns-NP(A/Beijing/353/89)6.42Kb5′序列：(SEQ.ID：52：)...GTC CTT AGA TC/C ACC ATG GCG TCC CAA GGC ACC AAACGG TCT TAT GAA CAG ATG GAA ACT GAT GGG GAA CGCCAG AAT GCA ACT...3′序列：(SEQ.ID：53：)...GAA AAG GCA ACG AAC CCG ATC GTG CCC TCT TTT GACATG AGT AAT GAA GGA TCT TAT TTC TTC GGA GAC AATGCA GAA GAG TAC GAC AAT TAA G/GA TCT GCT GTG CCT...5.V1Jns-M1(A/Beijing/353/89)5.62Kb5′Sepuence：(SEO.ID：54：)...CTT AGA TC/C AGA TCT ACC ATG AGT CTT CTA ACC GAGGTC GAA ACG TAT GTT CTC TCT ATC GTT CCA TCA GGC CCCCTC AAA GCC GAA ATC GCG CAG AGA CTT GAA GAT GTCTTT GCT GGG AAA AAC ACA GAT...3′序列：(SEQ.ID：55：)GGG ACT CAT CCT AGC TCC AGT ACT GGT CTA AAA GATGAT CTT CTT GAA AAT TTG CAG ACC TAT CAG AAA CGAATG GGG GTG CAG ATG CAA CGG TTC AAG TGA AGA TCTATG TGG/GAT CTG CTG TGC CTT...6.V1Jns-NP(B/Panama/45/90)6.54Kb5′序列：(SEQ.ID：56：)...CTT AGA TC/C ACC ATG TCC AAC ATG GAT ATT GAC GGTATC AAC ACT GGG ACA ATT GAC AAA ACA CCG GAA GAAATA ACT TCT...3′序列：(SEQ.ID：57：)...GTT GAA ATT CCA ATT AAG CAG ACC ATC CCC AAT TTCTTC TTT GGG AGG GAC ACA GCA GAG GAT TAT GAT GACCTC GAT TAT TAA G/GA TCT GCT GTG...7.V1Jns-M1(B/Panama/45/90)5.61Kb.5′序列：(SEQ.ID：58：)....CTT AGA TC/C ACC ATG TCG CTG TTT GGA GAC ACA ATTGCC TAC CTG CTT TCA TTG ACA GAA GAT GGA GAA GGCAAA GCA GAA CTA GCA GAA AAA TTA...3′序列：(SEQ.ID：59：)...AGA TCT CTT GGG GCA AGT CAA GAG AAT GGG GAA GGAATT GCA AAG GAT GTG ATG GAA GTG CTA AAG CAG AGCTCT ATG GGA AAT TCA GCT CTT GTG AAG AAA TAC CTATAA G/GA TCT GCT GTG...
                  实施例6V1J表达载体，SEQ.ID：10：
我们构建V1J的目的是为了从我们的载体V1中除掉启动子和转录终止元件，并将它们植入一更确定的上下游序列内，产生一个更严紧的载体，以提高质粒的纯化产率。
V1J衍生于载体V1(见实施例1)和pUC18(一种可从市场上买到的质粒)。V1用SspI和EcoRI限制性酶消化产生两条DNA片段。这些较小的片段含有CMVint A启动子和控制异源基因表达的牛生长激素(BGH)转录终止元件(SEQ.ID：11：)。从琼脂糖电泳凝胶中纯化之。然后将该DNA片段的末端用T4 DNA聚合酶“平头化”以便与另一“修成平头的”DNA片段相连接。
选用pUC18以提供表达载体的骨架。已知为产生高产率的质粒，其序列和功能需被充分鉴定，而且其大小要最小。我们以HaeII限制性酶经部分消化去掉了载体中的全部lac操纵子，因它对本实验的目的是不必要的而且可能对质粒产率和异源基因的表达是不利的。从琼脂糖电泳凝胶中纯化剩下的质粒，用T4 DNA聚合酶修成平头，用小牛肠道碱性磷酸酶处理，并与上述CMVintA/BGH元件连接起来。得到的质粒在pUC骨架中启动子元件表现出两种可能的取向。其中一种质粒在E.coli中产生较高的DIVA产率，将其命名为V1J(SDQ.ID：10：)。经对接合区域的序列分析及随后与V1相比产生类似的或更高水平的异源基因表达证实这一载体的结构。
           实施例7在表达载体V1J中的流感病毒基因构建体：
将来自A/PR/8/34流感病毒株的许多基因克隆到表达载体V1J中，这如实施例4所提到的，导致了与V1载体同样或更高水平的表达。PR8基因序列是已知的并能从GENBANK数据库中得到。对下面克隆的每个基因，提供了以凝胶电泳法检测已克隆之片段的大小，以及比较了GENBANK登录号与其部分序列的资料。有关从病毒株，例如从得自ATCC(A/PR/8/34为ATCC VR-95；其它许多病毒株也保藏于ATCC)的病毒中获得这些基因的方法，参见实施例5。A.亚克隆PR8基因到V1J中：1.NP基因
从pAPR501(J.F.Young，U.Desselberber，P.Graves，P.Palese，A.Shatzman，and M.Rosenberg(1983).in The Originsof Pandemic Influenza Viruses.ed.W.G.Laver，(Elsevier，Amsterdam)pp.129-138)中亚克隆NP基因。经用EcoRI切割pAPR501将其切下，片段经凝胶纯化，以T4 DNA聚合酶修成平头。将平头化的片段***用BglII切割并用T4 DNA聚合酶修成平头的V1J中。克隆的片段长1.6kb。2.NS
从pAPR801(J.F.Young.U.Desselberber，P.Graves，P.Palese，A.Shatzman，and M.Rosenberg(1983).in the Originsof Pandemic Influenza Viruses.ed.W.G.Laver，(Elsevier，Amsterdam)pp.129-138)中亚克隆NS基因。经用EcoRI切割pAPR801将其切掉，片段经凝胶纯化，用T4 DNA聚合酶修成平头。将平头化的片段***到用BglII切割并用T4 DNA聚合酶修成平头的V1J中。克隆的片段长0.9kb(完整的NS编码区包括NS1和NS2)。3.HA
从pJZ102(J.F.Young，U.Desselberber，P.Graves，P.Palese，A.Shatzman，and M.Rosenberg(1983).in The Originsof Pandemic Influenza Viruses.ed.W.G.Laver，(Elsevier，Amsterdam)pp.129-138)中亚克隆HA基因。经用HindIII切割pJZ102将其切下，片段经凝胶纯化，用T4 DNA聚合酶修成平头。将平头化的片段***到用BglII切割并用T4 DNA聚合酶修成平头的V1J中。克隆的片段长1.75kb。4.PB1
从pGem1-PB1中亚克隆PB1基因(测定载体与基因5′和3′接合点的顺序以证实其身份。参见J.F.Young，U.Desselberber，P.Graves，P.Palese，A.Shatzman，and M.Rosenberg(1983).in The Origins of Pandemic Influenza Viruses.ed.W.G.Laver，(Elsevier，Amsterdam)pp.129-138)。经用HindIII切割pGem-PB1将其切下，片段经凝胶纯化，并用T4 DNA聚合酶修成平头。将平头化的片段***到用BGlII切割并用T4 DNA聚合酶修成平头的V1J中。克隆的片段长2.3kb。5.PB2
从pGem1-PB2中亚克隆PB2基因(测定了载体与基因5′和3′接合区的顺序以证实其身份。参见J.F.Young，U.Desselberber，P.Graves，P.Palese，A.Shatzman，and M.Rosenberg(1983).in The Origins of Pandemic Influenza Viruses.ed.W.G.Laver，(Elsevier，Amsterdam)pp.129-138)。经用BamH1切割pGem-PB2将其切掉，凝胶纯化该片段，并将此粘性末端片段***到用BglII切割的V1J中。克隆的片段长2.3kb。6.M1
经PCR从质粒p8901 MITE中产生M1基因。该质粒中的M序列经PCR从pAPR701中产生(J.F.Young，U.Desselberber，P.Graves，P.Palese，A.Shatzman，and M.Rosenberg(1983).in The Origins of Pandemic Influenza Viruses.ed.W.G.Laver，(Elsevier，Amsterdam)pp.129-138)。其中所用的有意义引物为寡聚物5′-GGT ACA AGA TCT ACC ATG CTT CTA ACC GAG GTC-3′，SEQ.ID：3：，反意引物为寡聚物5′-CCA CAT AGA TCT TCA CTTGAA CCG TTG CAT CTG CAC-3′，SEQ.ID：4：。PCR片段经凝胶纯化，用BglII切割并与经BglII切割的V1J相连接。克隆的片段长0.7kb。编码M1的氨基末端由上面所示的有意义引物＂ATG＂密码子编码，M1翻译终止密码子由＂TCA＂密码子的反向序列编码，其在有意义链方向上是终止密码子＂TG＂。B.流感病毒基因-V1J表达构建体：
在每个实例中，列出了从5′启动子区(CMVintA)到克隆基因的接合区序列。这些序列经测定引物的序列得到：CMVinta引物5′-CTA ACA GAC TGT TCC TTT CCA TG-3′，SEQ.ID：28：，其产生编码序列的序列。接合点出现的位置以“/”分界，它并不代表序列的不连续性。在下列所有序列之后综述了制备这些构建体的方法。每个给定的序列代表一个指定的流感病毒基因之完整的、可获得的、能表达的DNA构建体。
将每个构建体瞬时转染到RD细胞(ATCC CCL136，一种培养的人成横纹肌细胞瘤细胞系)中。感染48小时后，收获细胞，溶胞并进行western印迹分析(除了V1J-PR-HA构建体在小鼠体内试验并在进行Western印迹之前产生抗HA特异性抗体。由于可观察到体内的表达，因而避免了进行Western印迹试验)。PB1，PB2和NS蛋白质的特异性抗体由剑桥大学的Stephen Inglis提供，他使用纯化的作为β-半乳糖苷酶融合蛋白质表达的蛋白质生产多克隆抗血清。经以全A/PR/8/34病毒免疫兔产生抗NP多克隆抗血清。Anti-M1抗体从Biodesign买到，它是一种羊抗-fluA抗血清，目录号为B65245G。在每个实例中，均观察到预期大小的蛋白质，证实了被编码的流感病毒蛋白质在体外的表达。
对这些构建体按照“载体名称-流感病毒株-基因”的惯例命名。在每个实例中，对照得自GENBANK的已知序列检查经克隆和测序的A/PR/8/34基因序列。按上面实施例2、3和4所述的同样方式显示每个构建体的生物学效力：CMVinta和来自A/PR/8/34的流感基因之5′接合区的顺序：1.V1J-PR-NP，SEQ.ID：12：，GENBANK登录号：M382795′GTC ACC GTC CTT AGA TC/A ATT CCA GCA AAA GCA GGG
           CMVintA           NP....TAG ATA ATC ACT CAC TGA GTG ACA TCA AAA TCA TG2.V1J-PR-PB1，SEQ.ID：13：，GENBANK登录号：J021515′ACC GTC CTT AGA TC/A GCT TGG CAA AAG CAG GCA AAC
      CMVintA       PB1....CAT TTG AAT GGA TGT CAA TCC GAC CTT ACT TTT CTTAAA AGT GCC AGC ACA AAA TGC TAT AAG CAC AAC TTTCCC TTA TAC3.V1J-PR-NS，SEQ.ID：14：，GENBANK登录号：J021505′GTC ACC GTC CTT AGA TC/A ATT CCA GCA AAA GCA GGG
           CMVintA           NS....TGA CAA AAA CAT AAT GGA TCC AAA CAC TGT GTC AAGCTT TCA GGT AGA TTG CTT TCT TTG GCA TGT CCG CAAACG AGT TGC AGA CCA AGA ACT AGG TGA T...4.V1J-PR-HA，SEQ.ID：15：，GENBANK登录号：J021435′TCT GCA GTC ACC GTC CTT AGA TC/A GCT TGG AGC AAA
           CMVintA                   HA...AGC AGG GGA AAA TAA AAA CAA CCA AAA TGA AGG CAAACC TAC TGG TCC TGT TAA GTG CAC TTG CAG CTG CAGATG CAG ACA CAA TAT GTA TAG GCT ACC ATG CGA ACAATT CAA CC...5.V1J-PR-PB2，SEQ.ID：16：，GENBANK登录号：J021535′TTT TCT GCA GTC ACC GTC CTT AGA TC/C CGA ATT CCA
           CMVintA                    PB2....GCA AAA GCA GGT CAA TTA TAT TCA ATA TGG AAA GAATAA AAG AAC TAA GAA ATC TAA TGT CGC AGT CTG CCACCC CGG AGA TAC TCA CAA AAA CCA CCG TGG ACC ATATGG CCA TAA TCA AGA AGT...6.V1J-PR-M1，SEQ.ID：17：，GENBANK登录号：J021455′GTC ACC GTC CTT AGA TCT/ACC ATG AGT CTT CTA ACC
           CMVINTA                  M1.....GAG GTC GAA ACG TAC GTA CTC TCT ATC ATC CCG TCAGGC CCC CTC AAA GCC GAG ATC GCA CAG AGA CTT GAAGAG TTG ACG GAA GA...片段的连接方式：1.V1J-PR-NP：平头化的BglII片段(载体)与平头化的EcoRI片
段(NP)连接。2.V1J-PR-PB1：平头化的BglII片段(载体)与平头化的HinDIII
片段(PB1)连接。3.V1J-PR-NS：平头化的BglII片段(载体)与平头化的EcoRI片
段(NS1)连接。4.V1J-PR-HA：平头化的BglII片段(载体)与平头化的HinDIII片
段(HA)连接。5.V1J-PR-PB2：粘性BglII片段(载体)与粘性BamHI片段
(PB2)连接。6.V1J-PR-M1：粘性BglII片段(载体)与粘性BglII片段
(M1)连接。
使用在两末端加有BglII并在起始于ATG前3个碱基，止于M1终止密码子(TGA)之后的右侧的p8901-M1TE作为模板和引物，经PCR制得M1。
                     实施例8V1 Jneo表达载体，SEQ.ID：18：
除去用于对含V1J的细菌进行抗生素选择的ampr基因是必要的，因为在大批量发酵罐中不可能使用氨苄青霉素。用SspI和Eam1105I限制性酶消化，去掉V1JpUC主链中的ampr基因。剩余的质粒以琼脂糖凝脉电泳纯化，并用T4 DNA聚合酶修成平头，然后用小牛肠道碱性磷酸酶处理。用PstI限制性酶切割从市场上购得的衍生于转座子903并包含在质粒pUC4K中的Kanr基因，经琼脂糖凝胶电泳纯化，并用T4 DNA聚合酶修成平头。将该片段与V1J主链连接。得到以两种取向含Kanr基因的质粒，并命名为V1Jneo#′s1和3。每种质粒均经限制性酶消化分析、接合区DNA测序来证实，而且显示出与V1J产生相似量的质粒。也对V1J这些V1Jneo载体的异源基因产物的表达进行了比较。我们随意挑出V1Jneo#3(下文称之为V1Jneo(SEQ.ID：18：))，它含有与V1J表达构建体中ampr基因有相同取向的Kanr基因。
将来自A/Beijing/353/89，A/Texas/36/91和B/Panama/46/90各病毒株的基因作为cDNAs克隆到载体V1Jneo中。在每个实例中，使用生产编码序列的引物：CMVinta引物5′-CTA ACA GAC TGT TCCTTT CCA TG-3′，SEQ.ID：28：测定从5′启动子区(CMVint A)到被克隆之基因的接合序列之顺序。该序列与终止子/编码顺序相邻接，也显示了它的接合序列。使用产生非编码链序列的引物：BGH引物5′-GGA GTG GCA CCT TCC AGG-3′，SEQ.ID：29：，生产这一序列。在每个实例中，用得自GENBANK的已知序列对照从这些或其他流感病毒分离物中克隆和测序的基因来检查该序列。出现接头的位置以“/”分界，但这并不代表序列的不连续性。至于V1Jneo-TX-HA接合区，由于测序凝胶被压缩，难以读出起始序列。因此，这一接合区的头8个碱基以“N”表示。这些核苷酸已被鉴定并提供了经鉴定的核苷酸。在每个序列中，第一个出现的“ATG”是编码相应克隆基因的翻译起始点。提供的每个序列代表一个所指定之流感病毒基因的完整的、可获得的、能表达的DNA构建体。按照“载体名称-流感病毒株-基因”的惯例命名。每个构建体的生物学效力以与上面实施例2，3和4相同的方式显示：使用不同的流感病毒株和蛋白质，确定跨越CMVintA和流感基因5′接合区的序列和跨越流感病毒基因与BGH终止子表达构建体3′接头的序列：I.A/RELJING/353/89A.V1Jneo-BJ-NP：启动子，SEQ.ID：20：5′TCA CCG TCC TTA GAT C/AA GCA GGG TTA ATA ATC
     CMVintA            NP....ACT CAC TGA GTG ACA TCA AAA TC ATG GCG TCC CAA GGCACC AAA CGG TCT TAT GAA CAG ATG GAA ACT GAT GGGGAA CGC CAG ATT终止子，SEQ.ID：21：5′GAG GGG CAA ACA ACA GAT GGC TGG CAA CTA GAA GGCACA GCA GAT/ATT TTT TCC TTA ATT GTC GTA C...
BGH         NP....II.A/TEXAS/36/91A.V1Jneo-TX-HA启动子，SEQ.ID：24：5′CCT TAG ATC/GGA AAT AAA AAC AAC CAA AAT GAACMVINTA            HA....AGC AAA ACT ACT AGT CC终止子，SEQ.ID：25：5′GCA GAT C/CT TAT ATT TCT GAA ATT CTG GTC...
 BGH       HA....TCA GAT...III.B/PANA MA/46/90A.V1Jneo-PA-HA启动子，SEQ.ID：26：(该序列的前1080个碱基以登录号M65171可从GENBANK中得到：下面得到的序列与已知序列相同；3′序列(下示的SEQ.ID：27：)尚未见报道)5′ACC GTC CTT AGA TC/C AGA AGC AGA GCA TTT TCT AAT
  CMVintA           HA....ATC CAC AAA ATG AAG GCA ATA ATT GTA CTA CTC ATGGTA GTA ACA TCC AAC GCA GAT CGA ATC TGC...终止子，SEQ.ID：27：5′GGC ACA GCA GAT C/TT TCA ATA ACG TTT CTT TGT
      BGH          HA....AAT GGT AAC
                    实施例9流感病毒基因的皮内注射：
基因的皮内导入方法与肌肉导入一样：以三周的间隔注射三次，每次注射200μg V1-PR-NP。第三次注射后第55天摘取脾脏，用于体外试验，并用非肽核蛋白抗原决定基147-155，SEQ.ID：9：再刺激。用异源病毒V/Victoria/73感染靶细胞(P815细胞，小鼠肥大细胞瘤，与BALB/c小鼠H-2d同源的)，使用脾细胞作效应物，按效应物∶靶细胞为5∶1到40∶1的比例范围特异性溶胞。经检测未经流感病毒感染的靶细胞的溶胞进行阴性对照。用得自注射过三次130μg V1-PR-NP并经A/HK/68株活流感病毒感染后仍存活的小鼠之脾细胞，检测流感病毒感染的靶细胞之溶解进行阳性对照。
结果：使用得自皮内注射之小鼠的脾细胞以在所有效应物∶靶细胞比例均达到特异性溶胞。当用来自未注射的小鼠或以不含***之PR-NP基因的载体V1注射的小鼠之脾细胞作为效应细胞时，则看不到特异性溶胞。而且，在所有效应物∶靶细胞比例下，使用皮内给药得到的特异性溶胞与使用肌肉给药得到的结果相当。还测定了皮内或肌肉注射过之小鼠的肺部流感病毒滴度。使用每组5只小鼠，以200μg/剂注射三次，每次间隔为三周，最后一次剂量注射后第3周进行攻击，得到如下的结果：疫苗       接种方式           小鼠肺滴度*
                   第5天             第7天V1-PR-NP    皮内       5.2±0.2         4.1±1**V1          皮内       5.9±1           6.6±0.3V1-PR-NP    肌肉       4.6±0.4         4.5±1.1**无        ---        6.2±0.3         5.9±0.3*.平均log滴度±SEM**.一只小鼠根本无病毒
最后，检查出到第28天小鼠的存活百分数。到第28天为止，接受V1-NP-PR的小鼠中，89％的肌肉内接种小鼠和50％的皮内接种小鼠仍存活。接种V1载体的小鼠均未存活，并且未处理的小鼠仅0％仍存活。这一实验表明，编码来自A/PR/8/34株之核蛋白质的DNA能诱导CTL，其可识别来自异源毒株A/Victoria/73的核蛋白质并产生抗异源株A/HK/68的保护性免疫反应。
                     实施例10在灵长类动物中的多核苷酸疫苗接种：1.猕猴的抗NP抗体：第一天用1mg/部位的RSV-NP在3个部位上给猕猴作肌肉内注射(006NP，009NP或对照101；021)。同时在分开的部位注射RSV-LUX和CMV-int-LUX(报导基因荧烛荧光素酶表达构建体)各1mg。在第15天，每只动物以与前面相同量的DNA及1mg pD5-CAT(一种标记基因氯霉素乙酰转移酶表达构建体)各在1个部位再次注射。对含有报导基因的肌肉部位进行活体组织检查并分析报导基因的活性。收集初次注射后第3、5、9、11、13和15周的血清。抗NP抗体的第一个阳性样品在第11周收集到，第13和15周也收集到阳性样品。用ELISA鉴定抗NP抗体。结果如图9中所示。2.猕猴的血细胞凝集抑制(HI)抗体：
第一天用V1J-PR-HA经肌肉内给猕猴注射。两只动物各在每个四头肌上注射1mg，100μg或10μg DNA。每次注射给药的体积为0.5ml。动物在第一天注射前抽血。第15天所有动物均再次注射DNA，此后每隔2-4周收集血液。初次注射V1J-R-HA DNA后第5周，9周和12周抗A/PR/8/34的血细胞凝集抑制(HI)滴度为阳性。结果如下列表10-I所示：
              表10-I
接种V1J-PR-HA DNA之猕猴的HI抗体滴度：
  猕猴号 剂量     在第#周的HI抗体滴度
PRE  3WK  5WK  9WK  12WK
88-010 1MG ＜10 ＜10  320  320  320
88-0200 ＜10 ＜10 ＜10  40  40
88-021 100UG ＜10 ＜10 ＜10  40  20
90-026 ＜10 ＜10  20  20  40
88-084 10UG ＜10  20  40  20  10
90-028 ＜10 ＜10  20 ＜10 ＜10
                     实施例11对雪貂的多核苷酸疫苗研究：1.为了确定以编码HA(一种能诱导病毒株特异性中和抗体的表面蛋白质)或内部蛋白质NP、NSI、PBI、M(认为其可诱导一种可能为不依赖于病毒株的细胞介导的免疫反应)的基因免疫后，动物是否能在流感病毒A感染时受到保护，进行了雪貂多核苷酸疫苗接种实验。如下所示，用在我们的V1J载体中编码不同流感病毒基因的DNA注射动物：
                           表11-I
    组     构建体     剂量 免疫过的动物号   攻击H1N1   攻击H3N2
    1     V1J-HA  1000mg     16     8     8
    2     V1J-NP  1000mg     16     8     8
    3 V1J-NP＋NS1＋PB1＋PB2＋M  2000mg总     16     8     8
    4 V1J-HA＋NP＋NS1＋PB1＋PB2＋M  2000mg总     16     8     8
    5     V1J-  1000mg     16     8     8
    6     无     无     10     5     5
总动物     90     45     45
2.免疫后第22和第43天，收集已免疫动物的血清，用ELISA法分析中和(血细胞凝集抑制-HI)抗体和抗核蛋白(NP)抗体。已注射过DNA的动物表达了抗相应基因的抗体。附图10、11和16反映了这些结果。3.在第128天，用1200 TCID50的流感A/HK/68攻击选出的免疫过的动物。该病毒株与作为用免疫之编码序列的来源的A/PR/8/34病毒是异源的，因此保护作用表明为基于细胞介导的，不依赖于病毒株之免疫机制的免疫。如附图12所示，可见在以编码内部蛋白质的DNA免疫过的动物中释放的病毒与对照组相比存在统计上的显著减少，进一步证实了用多核苷酸免疫雪貂能引发免疫反应且这种反应是保护性的。4.同样使用A/PR/8/34进行同源攻击试验，而且同样证实了以多核苷酸进行疫苗接种所诱导之中和抗体的保护效力。
                 实施例12V1Jns的产生
将SfiI位点加入V1Jneo中以利于整合实验。将市场购得的13bp SfiI接头(New England Biolabs)加入载体之BGH序列内的KpnI位点上。用KpnI位将V1Jneo切成线性，经凝胶电泳纯化，用T4 DNA聚合酶修成平头后与平头的SfiI接头相连接。以限制性图谱法选择克隆分离物，并通过接头测序来证实之。新载体命名为V1Jns(图17)。V1Jns(含有SfiI)中异源基因的表达与V1Jneo(含有KpnI)中同一基因的表达差不多。
                      实施例13免疫原性1.体液免疫反应：
在小鼠，雪貂或非人类灵长类动物(包括非洲绿猴和猕猴)中注射编码流感病毒HA、NP和M1的DNA引起了体液免疫反应。到现在已表明含有从流感病毒株A/PR/34，B/Panama/90，A/Beijing/89，A/Texas/91，A/Hawaii/91和A/Georgia/93克隆之HA基因的PNVs能产生抗体。
a)小鼠：用ELISA法检测从注射DNA后的小鼠血清中的抗NP和M1抗体。以少至1μg的NP DNA(A/PR/34)给药一次(试验的最小剂量)，在注射后2周时(试验的最早时间点)就产生高的抗体滴度(104-106)；而且至少在注射后的6个月内不减少。这些NP抗体不中和且不参与保护作用。但是如果注射DNA后体内有NP蛋白质表达，则证明它们参与保护作用。相反，抗HA抗体则提供对抗同源流感病毒株的保护性免疫。以体外血细胞凝集抑制(HI)试验检测到，注射从A/PR/34株克隆的HA DNA引起中和抗体的产生。在许多接受过3剂100μg HA DNA的小鼠中测出HI滴度≥1280，在一些接受过少至2剂0.1μg DNA的动物中见有可检测到的滴度。在HI滴度与DNA剂量之间以及HI滴度与注射次数之间存在着剂量-反应关系(表13-I)：
        表13-I
小鼠中体液免疫反应的产生
    剂量(μg)               GMT HI
                #剂
    1      2     3
HA DNA(100)HA DNA(10)HA DNA(1)HA DNA(0.1)对照DNA(100)未注射     7537＜10a＜10b＜10b      1066913＜10a＜10b      2608624＜10a＜10b
               ＜10b
表13-I：用A/PR/34 DNA(V1JHA)按所示剂量以3周的间隔对雌性BALB/c小鼠(年龄为3-6周)进行一次，两次或三次注射。阴性对照包括用由不含基因***序列(V1J)的载体组成的对照DNA注射过小鼠和当地产的、未经注射的小鼠。在第一次注射后的第7周收集血清样品并分析血细胞凝集抑制(HI)抗体的存在。数据以HI滴度的几何平均值表示，其中n＝10。a.一些试验的小鼠HI滴度呈阳性。b.所有的小鼠。
在每只试验的小鼠中，抗HI抗体的存在与同源攻击模型中的保护作用相关。用HA DNA(A/PR/34)注射过的小鼠HI抗体反应至少保持6个月不变。经用ELISA法测定，在使用来自A/Beijing/89，B/Panama/90和A/Texas/91注感病毒株的HA DNA的小鼠中也产生抗HA抗体。
经过试验年龄对HA的体液免疫反应的影响，证实了文献所报道的在注射过DNA的老年小鼠中，报导基因的表达水平较低。由于难以得到衰老而又未交配过的雌性小鼠，因此使用年龄为10个月的退役种鼠进行试验。比较退役种鼠与4-6周龄未交配过的小鼠产生抗HA抗体的能力。老年鼠在以低至1μg(试验的最低剂量)的HADNA注射后能产生抗HA抗体，尽管其滴度比幼年鼠要低(表13-II)：
                    表13-II
             年龄对体液免疫反应的影响
接种 剂量(μg)     GMT(4-6wk)     GMT(10mo)
    HA DNAHA DNAHA DNA对照DNA未注射Flu      100101100--     103433880＜5a＜5a538     1106820＜5a＜5a36
表13-II：以三周的间隔，按所示剂量用A/PR/34 HA DNA(V1JHA)注射雌性BALB/c小鼠(4-6周龄未交配过的雌性小鼠和年龄为10个月的退役种鼠)三次。用注射对照DNA(V1J)的和本地产的、未注射过小鼠作为阴性对照组。为了比较，用亚致死剂量的流感病毒A/PR/34注射其他小鼠。在第一剂后的第9周收集血清并分析HI滴度。数据以几何平均HI滴度表示，其中n＝15。a.所有被试小鼠的HI滴度均为阴性。
但这不是PNV本身的结果，而是老年小鼠产生全身性体液免疫反应能力降低所致，因为在注射活A/PR/34病毒后，老年小鼠也表现出比幼年小鼠较低的HI反应。事实上，在接种过DNA的老年小鼠中HI抗体比在流感病毒感染的老年小鼠中表现出较小的降低。而且用于这些实验的退役种鼠比典型的同龄未交配雌性小鼠约重50％，而根据其它人的研究，在小鼠中使用限制热量的食物对这些动物的免疫反应产生有害的影响。由于各种原因，这些小鼠的免疫反应可能不具有代表性。仅管如此，既使以低至1μg的剂量接种多核苷酸，年龄(至少达到10个月)也不会显著降低其诱导体液免疫反应的能力。b.雪貂：以来源于A/PR/34，A/Beijing/89，A/Hawaii/91和A/Georgia/93流感病毒株的HA DNA注射雪貂产生体液免疫反应。以适当的PNV诱导抗A/PR/34的HI抗体和抗来自其它病毒株之HAs的ELISA抗体。发现注射过A/Beijing/89，A/Hawaii/91和A/Georgia/93 HA DNAs的雪貂之血清中有HI抗体和中和抗体，因为这些动物能免受病毒攻击。c.非人类的灵长动物：(参见上面实施例10)
按每腿10,100和1000μg的剂量以HA DNA(A/PR/34)免疫猕猴两次。检测到接受100或1000μg剂量的动物HI滴度达到320，两只接受10μg剂量的猴中一只HI为80。迄今已分析了13个月内的血清，从6到13月HI滴度没有可估测的下降(表13-III)：
                          表13-III
                      猕猴HI抗体的产生
剂量(μg)   免疫前   1个月   2个月   5.5个月   13个月
    20002000     ＜10＜10     64040     32040     16020     8020
     200200     ＜10＜10      8080      4080      4040     8020
     2020     ＜10＜10      40＜10      20＜10      20＜10     20＜10
表13-III：在0和第2周按所示剂量以A/PR/34 HA DNA(V1JHA)注射体重范围为4.3至8.8kg的猕猴(雌雄均有)。在第一次注射后的所示时间收集血清样品并分析HI滴度。数据代表单个动物的HI滴度。
合用含100μg HA DNA(A/Beijing/89)的PNV注射非洲绿猴，第一剂后4-6周的血清测定显示为29 GMT(8/9反应)。这与接受了已许可的亚病毒粒子疫苗(16GMT，5/6反应)和接受了已许可的全病毒粒子疫苗(GMT＝36，6/6反应)的动物在同一时间点上的反应相比更有利(图18)。在接受了10μg剂量的HA DNA(1剂量后GMT为1.9而2剂量后为199)之动物中观察了显著的二次免疫加强效应。接受已许可的全病毒粒子疫苗后表现出同样的加强效应，而接受二次剂量的亚病毒疫苗者产生的HI滴度仅仅是暂时的。迄今为止的18周时间里，在以10μg和100μg剂量的HADNA免疫的动物中测到与使用最好的已被许可的疫苗(全病毒粒子)免疫过的动物相比具有相同水平的HI抗体。这些结果表明：PNV在产生中和抗体方面至少与全病毒粒子疫苗一样有效而且优于亚病毒粒子疫苗。纯化的亚单位疫苗在小鼠中检测不到免疫原性；因此未在非人类灵长动物身上试验之。本实验中，PNV含有编码来自A/Beijing/89，B/Panama/90和A/Texas/91的HA，和来自A/PR/34的NP和M1之5价混合DNA，以便相似于候选疫苗。我们也试验了这些动物对抗疫苗的其他成份体液免疫应答的产生，并检测到抗B/Panama/90和A/PR/34NP的抗体。在一个单独的实验中，经注射2剂量的PCR克隆的HA DNA诱导了HI和抗A/Texas/91HA的中和抗体。2.细胞介导的免疫反应见上面实施例3。3.免疫反应的产生
a)激素免疫：注射DNA后导致产生体液和细胞介导的免疫反应的过程尚未受阐明。为了产生中和抗体(例如抗流感病毒HA)，很可能是细胞必须在胞质膜上表达抗原或分泌抗原到细胞外环境中。另外，被转染的细胞应表达与其在病毒粒子中相似的有二级、三级和四级结构的HA。在一玫瑰结形成试验中，以HA DNA瞬时转染的RD细胞(成横纹肌细胞瘤；起源于成肌细胞)中证实了HA的细胞表面表达。红血细胞聚集到HA转染的细胞表面上但不聚集到模拟转染的细胞上，表明HA不仅在表面表达、而且保持了与含唾液酸之蛋白质结合的适当构型。
b)细胞介导的免疫：细胞介导的免疫反应的产生(例如抗流感病毒NP)需要蛋白水解加工和得自与MHCI型相联系的肽类的存在。注射DNA后，存在于细胞中的天然抗原是否导致免疫反应的产生尚不明确。肌肉细胞表达低水平的MHCI型而且认为在其表面上不表达协同刺激分子。因此，一般不认为肌细胞是呈现抗原的细胞。然而，一系列证据表明：肌肉注射DNA后，肌细胞与免疫反应的产生有关。首先，对能使裸露的质粒DNA内在化的组织引起蛋白质原位表达的有限调查表明，当将质粒直接注射到组织后，许多细胞类型都能表达报导基因，但与肌细胞相比，效率相当低。肌肉注射后由非肌细胞摄入DNA的完整分析尚未见报道，但很可能其摄入效率更低。其次，肌肉注射DNA后在许多不同种类的骨骼肌和心肌细胞中证实有报导基因的表达。第三，尽管经其他途径(iv.和i.d.)注射DNA后能产生CTL反应，但在小鼠中肌肉注射DNA后可得到最佳的保护性免疫反应。第四，CTL能在体外识别和溶解成肌细胞和肌细胞。而且以提高MHC表达的γ干扰素预处理后能增强这种溶胞作用。最后，将稳定转染的、表达NP的成肌细胞移植到未处理过的同源小鼠体内，导致体内保护性细胞介导的免疫反应的产生(图20)。因此，DNA注射后，肌细胞抗原的表达足以产生可见的保护性免疫反应。另外，非肌细胞DNA的摄入和表达在保护性免疫产生中可能无须考虑。从多核苷酸用作疫苗的观点来看，限制肌细胞的DNA摄入可能具有潜在的好处。首先，肌细胞已最终分化而且不会***，这对减少质粒DNA整合到染色体DNA中并保持可导致长期免疫反应之持久抗原表达的可能性是重要的。其次，肌细胞是大的多核细胞，其可能经成肌细胞的融合再产生。这可能有助于解释为什么注射DNA后导致蛋白质的表达能潜在地长期维持，而不被CTL的细胞溶解所破坏。
                    实施例14保护研究：
用编码流感病毒抗原的DNA免疫提供了避免死亡和疾病的保护作用，减少病毒负荷量，在各种组合的流感株中，对人流感的感染使用了两个广泛适用的动物模型(小鼠和雪貂)。1.异源性(异型，同组)：在动物模型中，用已被许可的灭活病毒疫苗不能提供有效的异源性保护。而接种DNA则可提供。这一保护在将编码NP或M1的DNA注射到实验动物中时得到证实。接种这些DNA所诱导的交叉反应性细胞介导的免疫反应提供保护性的反应。
a.小鼠：当以LD90的A/HongKong/68(H3N2)(一种异型病毒株(A/PR/34为H3vsH1))经总呼吸道感染来攻击以编码来自A/PR/34的NP的DNA肌肉注射过的BALB/c和C3H小鼠时，它们能免遭死亡和疾病(根据体重的减少来估计)。图21显示了以3周间隔用NP DNA(200μg/剂量)免疫过3次并在最后一次免疫后3周攻击过的BALB/c小鼠之存活率。图22显示了攻击后被免疫小鼠体重损失的抑制与经历严重体重降低之对照组小鼠的比较。图23显示了上呼吸道攻击后，用NP DNA免疫之小鼠7天后肺内病毒负荷的减轻与给予对照非编码DNA的小鼠间比较。与对照组小鼠相比，用NP DNA免疫过的小鼠完全免于死亡，经历了减轻的体重丧失，而且肺内表现出较低的病毒负荷。当经过3次DNA注射给药时，发现保护小鼠免于死亡和体重丧失所需的NP DNA量为每次注射≤6.25μg(图24)。在被免疫的小鼠中发现以NP DNA免疫引起的保护至少持续3个月基本不变。保护水平保持到6个月，但在最后一次免疫后的3到6月间略有下降。然而，在第22周以单次注射NP DNA再接种，即在第25周攻击后3周又恢复到完全的保护(图25)。因此，用NP DNA免疫小鼠产生了长期的、可加强的异源性保护。这些动物再免疫后产生记忆反应的能力提示，免疫记忆是由NP DNA免疫诱导的。
b.雪貂：由于雪貂对许多种人流感病毒分离物的感染敏感，因此一般被用于人流感病毒感染的模型。与肺内病毒负荷较大的小鼠相反，病毒的复制主要是在雪貂的鼻孔和气管中，而肺内的复制程度要小得多。经滴定鼻流出液中的病毒极容易监测雪貂的感染情况。用最近从人体中得到的病毒株(A/Beijing/89，H3N2)的NP DNA或M1DNA单独或联合免疫雪貂，在用野生分离株A/Georgia/93(H3N2)攻击后的1-6天中表现出明显的病毒流出物减少(图26)。该野生分离株表现出从A/Beijing/89发生的抗原性漂变，以至A/Beijing/89被许可的疫苗对人类抵抗由A/Georgia/93引起的疾病只提供很小或不能提供保护作用。以编码A/PR/34内部蛋白质的DNA免疫雪貂，在用同型病毒株A/PR/34感染后第5和第6天时，其鼻孔病毒流出物显著地减少(图27)。以A/Georgia/93攻击后在早期和晚期时间点都可见病毒流出减少，而在用A/PR/34攻击后则观察到晚期流出物减少，这可能是由于两种病毒株间对雪貂的毒力不同。2.在用HA DAN免疫的小鼠和雪貂中都很容易证实同源性(同类型，类型特异性)保护作用。
a.小鼠：用HA DNA(A/PR/34)免疫过的BALB/c小鼠能完全对抗LD90 A/PR/34的攻击。攻击后，经免疫过的小鼠既无死亡(图28)，也无超过5％的体重损失(图29)，而对照组小鼠则有90-100％死亡并经历了严重的重量丧失。达到保护目的所需的HA DNA剂量滴定表明：3次注射1μg HA DNA足以达到完全保护的目的(图30)。
b.雪貂：用编码A/PR/34 HA的DNA免疫的雪貂在同源攻击感染后第1-6天病毒流出物比接受对照DNA的雪貂明显地低(图31)。同样，用A/Georgia/93 HA DNA免疫的雪貂在同源感染后的第1天和3-7天病毒流出物也减少(图32)。所有被免疫过的雪貂血清中都存在抗适当病毒株的HI抗体(参见上文)。因此，用HA DNA免疫产生同源保护作用。3.疫苗组合：检查了在雪貂中当合用NP和M1 DNA时HA DNA提供较大宽度保护的能力。
a.对抗抗原漂变变异体的保护宽度：A/Beijing/89和A/Beijing/92病毒株之间发生足够量的抗原漂变，以至许多以含A/Beijing/89的被许可的疫苗免疫的人不能抵抗由A/Beijing/92变异株引起的疾病。在北美，普遍的疾病由与A/Beijing/92相似的野生型分离株，如A/Georgia/93所引起。北美野生型分离株与典型病毒株A/Beijing/92的抗原性相似；但分离的地理位置不同，而且它们的传代历史也不同，既它们是在哺乳动物细胞培养物中传代而不是在鸡卵中传代。然而，对于HA的氨基酸序列，A/Beijing/92样病毒株与A/Beijing/89样病毒株的区别为在于HA1区只有11个点突变(位置133，135，145，156，157，186，190，191，193，226和262)。因此，我们检测了由HA DNA诱导的同型免疫反应与由NP和M1 DNA诱导的交叉反应性CMI反应组合是否能为对抗原漂变变异体提供更大程度的保护。用已被许可的含A/Beijing/89病毒株的疫苗或用A/Beijing/89或Beijing-18样野生分离株(A/Hawaii/91)的HA DNA免疫雪貂，当用A/Georgia/93攻击雪貂时病毒流出物减少(图33)。合用含NP，M1和HA DNA的PNV免疫雪貂，与用已被许可的产品，或单独用HA DNA免疫雪貂相比，病毒流出显著降低(图34)。至于合用A/Beijing/89 NP和M1DNA与A/Hawaii/91 HA DNA，所产生的保护作用与由同源A/Georgia/93 HA DNA提供的最大保护作用则没有明显的区别(图35)。因此合用HA，NP和M1 DNA，与已被许可的疫苗相比，抗原漂变变异体的保护作用得到了改善。
b.疫苗抗原传代历史影响：用含有衍生于在MDCK细胞组织培养中传代之美国野生分离株(A/Hawaii/91)的HA DNA序列组成的疫苗免疫过的雪貂，当用抗原性漂变的病毒株A/Georgia/93攻击时，与接受过含鸡卵传代之A/Beijing/89病毒株之被许可的灭活病毒疫苗的雪貂相比，病毒流出较少(P＝0.021以两向ANOVA分析)(图33)。相反，接受衍生于A/Beijing/89之HA DNA的雪貂，在用A/Georgia/93攻击后，与接受过含相同病毒之被许可疫苗的雪貂相比，病毒流出无明显区别(p＝0.058)。在鸡卵和哺乳动物细胞中生长的病毒株区别在于其HA的HA1区有两处点突变(位置186和193)，两者都位于抗原位点B中，与HA单位的顶端靠近，这一区域认为对HI和中和抗体的结合是重要的。在有些情况下，一些人流感病毒分离株结合鸡RBC的能力开始很低，但在鸡卵中成功地传代后会逐渐升高，这表明经过在鸟类细胞中的生长，HA的受体结合区可能经历有价值的选择。在实验动物中，小序列变异对以HA为基础的流感疫苗之效力的影响强调了在制备这类疫苗中尽可能接近野生型病毒序列的潜在重要性。c.非人类灵长动物：非人类的灵长动物不常用作流感攻击模型，因为它们缺乏临床的抗感染反应。然而，我们研究了在非人类灵长动物中，PNV疫苗组合与已被许可的灭活病毒疫苗的比较。由含HA和内部蛋白质基因的组合PNV诱导的抗体滴度与用被许可产品诱导的HI抗体滴度和反应持续时间至少是相等的(参见上文)。用PNV免疫过的非洲绿猴对抗原漂变变异体的HA PNV发生了反应，表明预先免疫过的对象能对PNV产生型特异性的反应。用PNV免疫过的猴也能应答随后用常规灭活病毒疫苗进行的免疫。4.结论：在流感病毒感染的实验动物模型中，多核苷酸抗流感是有效的。使用编码HA的DNA载体能获得同源性保护，其免疫学机制很可能与通常所用的已被许可的流感疫苗HA蛋白质诱导的保护相似。使用含有编码流感病毒保守的内部蛋白质的DNA也能获得针对抗原转移和漂变的病毒株的异源性保护。在雪貂模型中，在单次免疫试验中结合这些研究结果，与常规的已被许可的疫苗相比抗抗原漂变变异体的保护作用有所改善。
                    实施例15载体V1R的制备：
为了努力继续优化我们的基本疫苗接种载体，我们制备了一个V1Jns的衍生物，命名为V1R。构建这一载体的目的是为了获得最小大小的疫苗载体，如：没有不必要的DNA序列，仍保留由V1J和V1Jns提供的全套最佳异源基因表达特征和高质粒产量。我们根据文献以及经过实验确定：(1)在pUC主链区内含有E.coli复制起点的区域可以去掉而不影响细菌中的质粒产量；(2)如果***细菌终止子来代替，可去掉卡那霉素开放阅读框架后Kanr基因的3′区，(3)从BGH终止子的3′半侧起约300bp可以去掉，而不影响其调节功能(在BGH元件内Kpn1限制性酶位点起点之后)。
用PCR从V1Jns合成分别代表CMVintA启动子/BGH终止子、复制起点、和卡那霉素抗性元件的三个DNA片段来构建V1R。用PCR寡聚物将每一片段的独特限制性酶位点加到每个片段末端：SspI和Xhol加到CMVintA/BGH上；EcoRV和BamHI加到Kanr基因上，Bcll和Sall加到orir上。挑选这些酶位点是因为它们允许每个得自PCR的DNA片段在随后失去各位点后能定向连接；EcoRV和SspI留下的平头DNA适于互相连接；BamHI和Bcll留下一互补末端；Sall和Xhol也是这样。经PCR得到这些片段后，用上述适当的限制性酶消化每个片段，然后在含有3种DNA片段的单一反应混合物中连接之。Orir的5′端设计为包含T2 rho的独立终止子序列(在正常情况下在这一区域发现有这一序列)以便能为卡那霉素抗性基因提供终止信息。经限制性酶消化(＞8种酶)以及连接接头DNA的测序来证实已连接产物。DNA质粒产量和在V1R内使用病毒基因的异源表达与V1Jns相似。获得的载体大小净减少是1346bp(V1Jns＝4.86kb；V1R＝3.52kb)，见图36，SEQ.ID：45：。
PCR寡聚体序列用于合成V1R(下示序列的限制性酶位点下划线并在括号中标明)：(1)5′-GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TAC G-3′[SspI]，SEQ.ID：60：，(2)5′-CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGC ACC-3′[Xhol]，SEQ.ID：61：
(用于合成CMVintA/BGH片段)(3)5′-GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGT TGT GTC TCA AAA TC-3′[EcoRV]，SEQ. ID：62：(4)5′-CCA CAT GGA TCC G TAA TGC TCT GCC AGT GTT ACA ACC-3′[BamHI]，SEQ.ID：63：
(用于合成卡那霉素抗性基因片段)(5)5′-GGT ACA TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATC TTC TTG-3′[Bcll]，SEQ.ID：64：，(6)5′-CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG-3′[Sall]，SEQ.ID：32：
(用于合成E.coli复制起点)
                     序列表(1)一般资料：
(i)申请人：Donnelly，John J
           Dwarki，Varavani.J
           Liu，Margaret A
           Montgomery，Donna L
           Parker，Suezanne E
           Shiver，John W
(ii)发明题目：核酸药物
(iii)序列数目：64
(iv)通信地址
    (A)收件人：Merck & Co.，Inc.
    (B)街道：P.O.Box 2000
    (C)城市：拉威
    (D)州：新泽西
    (E)国家：美国
    (F)邮编：07065
(v)可读的计算机形式：
    (A)介质类型：Floppy disk
    (B)计算机：IBM PC兼容机
    (C)操作***：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.25
(vi)目前的申请数据：
    (A)申请号：
    (B)申请日：
    (C)分类号：
(vii)以前的申请数据：
    (A)申请号：US 08/032,383
    (B)申请日：18-3-1993
(vii)以前的申请数据：
    (A)申请号：US 08/089,985
    (B)申请日：Q8-JUL-1993
(viii)代理人资料：
    (A)姓名：Bencen，Gerard H
    (B)登记号：35,746
    (C)档案号：18972Y
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    (A)电话：(908)594-3901
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(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：TCGCGCGTTT  CGGTGATGAC   GGTGAAAACC   TCTGACACAT   GCAGCTCCCG   GAGACGGTCA          60CAGCTTGTCT  GTAAGCGGAT   GCCGGGAGCA   GACAAGCCCG   TCAGGGCGCG   TCAGCGGGTG         120TTGGCGGGTG  TCGGGGCTGG   CTTAACTATG   CGGCATCAGA   GCAGATTGTA   CTGAGAGTGC         180ACCATATGCG  GTGTGAAATA   CCGCACAGAT   GCGTAAGGAG   AAAATACCGC   ATCAGATTGG         240CTATTGGCCA  TTGCATACGT   TGTATCCATA   TCATAATATG   TACATTTATA   TTGGCTCATG         300TCCAACATTA  CCGCCATGTT   GACATTGATT   ATTGACTAGT   TATTAATAGT   AATCAATTAC         360GGGGTCATTA  GTTCATAGCC   CATATATGGA   GTTCCGCGTT   ACATAACTTA   CGGTAAATGG         420CCCGCCTGGC  TGACCGCCCA   ACGACCCCCG   CCCATTGACG   TCAATAATGA   CGTATGTTCC         480CATAGTAACG  CCAATAGGGA   CTTTCCATTG   ACGTCAATGG   GTGGAGTATT   TACGGTAAAC         540TGCCCACTTG  GCAGTACATC   AAGTGTATCA   TATGCCAAGT   ACGCCCCCTA   TTGACGTCAA         600TGACGGTAAA  TGGCCCGCCT   GGCATTATGC   CCAGTACATG   ACCTTATGGG   ACTTTCCTAC         660TTGGCAGTAC  ATCTACGTAT   TAGTCATCGC   TATTACCATG   GTGATGCGGT   TTTGGCAGTA         720CATCAATGGG  CGTGGATAGC   GGTTTGACTC   ACGGGGATTT   CCAAGTCTCC   ACCCCATTGA         780CGTCAATGGG  AGTTTGTTTT   GGCACCAAAA   TCAACGGGAC   TTTCCAAAAT   GTCGTAACAA         840CTCCGCCCCA  TTGACGCAAA   TGGGCGGTAG   GCGTGTACGG   TGGGAGGTCT   ATATAAGCAG         900AGCTCGTTTA  GTGAACCGTC   AGATCGCCTG   GAGACGCCAT   CCACGCTGTT   TTGACCTCCA         960TAGAAGACAC  CGGGACCGAT   CCAGCCTCCG   CGGCCGGGAA   CGGTGCATTG   GAACGCGGAT        1020TCCCCGTGCC  AAGAGTGACG   TAAGTACCGC   CTATAGAGTC   TATAGGCCCA   CCCCCTTGGC        1080TTCTTATGCA  TGCTATACTG   TTTTTGGCTT   GGGGTCTATA   CACCCCCGCT   TCCTCATGTT        1140ATAGGTGATG  GTATAGCTTA   GCCTATAGGT   GTGGGTTATT   GACCATTATT   GACCACTCCC        1200CTATTGGTGA  CGATACTTTC   ATTACTAAT    CCATAACATG   GCTCTTTGCC   ACAACTCTCT        1260TTATTGGCTA  TATGCCAATA   CACTGTCCTT   CAGAGACTGA   CACGGACTCT   GTATTTTTAC        1320AGGATGGGGT  CTCATTTATT   ATTTACAAAT   TCACATATAC   AACACCACCG   TCCCCAGTGC        1380CCGCAGTTTT  TATTAAACAT   AACGTGGGAT   CTCCACGCGA   ATCTCGGGTA   CGTGTTCCGG        1440ACATGGGCTC  TTCTCCGGTA   GCGGCGGAGC   TTCTACATCC   GAGCCCTGCT   CCCATGCCTC        1500CAGCGACTCA  TGGTCGCTCG   GCAGCTCCTT   GCTCCTAACA   GTGGAGGCCA   GACTTACGCA        1560CAGCACGATG  CCCACCACCA   CCAGTGTGCC   GCACAAGGCC   GTGGCGGTAG   CGTATGTGTC        1620TGAAAATGAG  CTCGGGGAGC   GGGCTTGCAC   CGCTGACGCA   TTTGGAAGAC   TTAAGGCAGC        1680GGCAGAAGAA GATGCAGGCA GCTGAGTTGT TGTGTTCTGA TAAGAGTCAG AGGTAACTCC     1740CGTTCCGGTG CTGTTAACGG TGGAGGGCAG TGTAGTCTGA GCAGTACTCG TTCCTGCCGC     1800GCGCGCCACC AGACATAATA GCTGACAGAC TAACAGACTG TTCCTTTCCA TGGGTCTTTT     1860CTGCAGTCAC CGTCCTTAGA TCTGCTGTGC CTTCTAGTTG CCAGCCATCT GTTGTTTGCC     1920CCTCCCCCCT GCCTTCCTTG ACCCTCGAAG GTGCCACTCC CACTGTCCTT TCCTAATAAA     1980ATGAGGAAAT TGCATCGCAT TGTCTGAGTA GGTGTCATTC TATTCTGGCG GGTGGGGTGG     2040GGCAGCACAG CAAGGGGGAG GATTGGGAAG ACAATAGCAG GCATGCTGGG GATCCGGTGG     2100GCTCTATGGG TACCCAGGTG CTGAAGAATT GACCCGGTTC CTCCTGGGCC AGAAAGAAGC     2160AGGCACATCC CCTTCTCTGT GACACACCCT GTCCACGCCC CTGGTTCTTA GTTCCAGCCC     2220CACTCATAGG ACACTCATAG CTCAGGAGGG CTCCGCCTTC AATCCCACCC GCTAAAGTAC     2280TTCGAGCGGT CTCTCCCTCC CTCATCAGCC CACCAAACCA AACCTAGCCT CCAACAGTGG     2340GAAGAAATTA AAGCAAGATA GGCTATTAAG TGCAGAGGGA GAGAAAATGC CTCCAACATG     2400TGAGGAAGTA ATGAGAGAAA TCATAGAATT TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG     2460CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA     2520TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATCTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC     2580AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG     2640CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC     2700CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCCCTTACC     2760GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC TTTCTCAATG CTCACGCTGT     2820AGGTATCTCA GTTCGCTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC     2880GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA     2940CACGACTTAT CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA     3000GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG AAGGACAGTA     3060TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA     3120TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT GGTTTTTTTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG     3180CGCAGAAAAA AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG     3240TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC     3300TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA TGAGTAAACT     3360TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT     3420CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC GTGTAGATAA CTACGATACG GGAGGGCTTA     3480CCATCTGGCC CCAGTGCTGC AATGATACCG CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA     3540TCAGCAATAA ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC AACTTTATCC     3600GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT     3660AGTTTGCCCA ACGTTGTTTC CATTGCTACA GGCATCGTGG TGTCACCCTC GTCGTTTGGT     3720ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA TCAAGGCGAG TTACATGATC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(i)序列特征：
    (A)长度：2196bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：双链
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：ATTGGCTATT GGCCATTGCA TACGTTGTAT CCATATCATA ATATGTACAT TTATATTGGC       60TCATGTCCAA CATTACCGCC ATGTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA ATAGTAATCA      120ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA ACTTACGGTA      180AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT AATGACGTAT      240GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA GTATTTACGG      300TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC CCCTATTGAC      360GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT ATGGGACTTT      420CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT GCGGTTTTGG     480CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG TCTCCACCCC     540ATTGACGTCA ATCGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC AAAATGTCCT     600AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA GGTCTATATA     660AGCAGAGCTC GTTTAGTGAA CCGTCAGATC GCCTGGAGAC GCCATCCACG CTGTTTTGAG     720CTCCATAGAA GACACCGGGA CCGATCCAGC CTCCGCGGCC GGGAACGGTG CATTGGAACG     780CGGATTCCCC GTGCCAAGAG TGACGTAACT ACCGCCTATA GAGTCTATAG GCCCACCCCC     840TTGGCTTCTT ATGCATGCTA TACTGTTTTT GGCTTGGGGT CTATACACCC CCGCTTCCTC     900ATGTtATAGG TGATGGTATA GCTTAGCCTA TAGGTGTGGG TTATTGACCA TTATTGACCA     960CTCCCCTATT GGTGACGATA CTTTCCATTA CTAATCCATA ACATGGCTCT TTGCCACAAC    1020TCTCTTTATT GGCTATATGC CAATACACTG TCCTTCAGAG ACTGACACGG ACTCTGTATT    1080TTTACAGGAT GGGGTCTCAT TTATTATTTA CAAATTCACA TATACAACAC CACCGTCCCC    1140AGTGCCCGCA GTTTTTATTA AACATAACGT GGGATCTCCA CGCGAATCTC GGGTACGTGT    1200TCCGGACATG GGCTCTTCTC CGGTAGCGGC GGAGCTTCTA CATCCGAGCC CTGCTCCCAT    1260GCCTCCAGCG ACTCATGGTC GCTCGGCAGC TCCTTGCTCC TAACAGTGGA GGCCAGACTT    1320AGGCACAGCA CGATGCCCAC CACCACCAGT GTGCCGCACA AGGCCGTGGC GGTAGGGTAT    1380GTGTCTGAAA ATGAGCTCGG GGAGCGGGCT TGCACCGCTG ACGCATTTGG AAGACTTAAG    1440GCAGCGGCAG AAGAAGATGC AGGCAGCTGA GTTGTTGTGT TCTGATAAGA GTCAGAGGTA    1500ACTCCCGTTG CGGTGCTGTT AACGGTGGAG GGCAGTGTAG TCTGAGCAGT ACTCGTTGCT    1560GCCGCGCGCG CCACCAGACA TAATAGCTGA CAGACTAACA GACTGTTCCT TTCCATGGGT    1620CTTTTCTGCA GTCACCGTCC TTAGATCTGC TGTGCCTTCT AGTTGCCAGC CATCTGTTGT    1680TTGCCCCTCC CCCGTGCCTT CCTTGACCCT GGAAGGTGCC ACTCCCACTG TCCTTTCCTA    1740ATAAAATGAG GAAATTGCAT CGCATTGTCT GAGTAGGTGT CATTCTATTC TGGGGGGTGG    1800GGTGGGGCAG CACAGCAAGG GGGAGGATTG GGAAGACAAT AGCAGGCATG CTGGGGATGC    1860GGTGGGCTCT ATGGGTACCC AGGTGCTGAA GAATTGACCC GGTTCCTCCT GGGCCAGAAA    1920GAAGCAGGCA CATCCCCTTC TCTGTGACAC ACCCTGTCCA CGCCCCTGGT TCTTAGTTCC    1980AGCCCCACTC ATAGGACACT CATAGCTCAG GAGGGCTCCG CCTTCAATCC CACCCGCTAA    2040AGTACTTGGA GCGGTCTCTC CCTCCCTCAT CAGCCCACCA AACCAAACCT AGCCTCCAAG    2100AGTGGGAAGA AATTAAAGCA AGATAGGCTA TTAAGTGCAG AGGGAGAGAA AATGCCTCCA    2160ACATGTGAGG AAGTAATGAG AGAAATCATA GAATTC                              2196(2)SEQ ID NO：12：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：71bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：单链
    (D)拓扑：线形
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：GTCACCGTCC TTAGATCAAT TCCAGCAAAA GCAGGGTAGA TAATCACTCA CTGAGTGACA        60TCAAAATCAT G                                                             71(2)SEQ ID NO：13：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：117bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：双链
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：ACCGTCCTTA GATCAGCTTG GCAAAAGCAG GCAAACCATT TGAATGGATG TCAATCCGAC        60CTTACTTTTC TTAAAAGTGC CAGCACAAAA TGCTATAAGC ACAACTTTCC CTTATAC          117(2)SEQ ID NO：14：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：136bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：双链
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：GTCACCGTCC TTAGATCAAT TCCAGCAAAA GCAGGGTGAC AAAAACATAA TGGATCCAAA       60CACTGTGTCA AGCTTTCAGG TAGATTGCTT TCTTTGGCAT GTCCGCAAAC GAGTTGCAGA      120CCAAGAACTA GGTGAT                                                      136(2)SEQ ID NO：15：的资料：(i)序列特征：
(A)长度：152bp
(B)类型：核酸
(C)链：双链
(D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：TCTGCAGTCA  CCGTCCTTAG  ATCAGCTTGG  AGCAAAAGCA   GGGGAAAATA   AAAACAACCA                60AAATGAAGGC  AAACCTACTG  GTCCTGTTAA  GTGCACTTGC   AGCTGCAGAT   GCAGACACAA               120TATGTATAGG  CTACCATGCG  AACAATTCAA  CC                                                 152(2)SEQ ID NO：16：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：162bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：双链
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：TTTTCTGCAG   TCACCGTCCT  TAGATCCCGA  ATTCCAGCAA   AAGCAGGTCA   ATTATATTCA                60ATATGGAAAG   AATAAAAGAA  CTAAGAAATC  TAATGTCGCA   GTCTGCCACC   CCGGAGATAC               120TCACAAAAAC   CACCGTGGAC  CATATGGCCA  TAATCAAGAA   GT                                    162(2)SEQ ID NO：17：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：122bp
    (B)类型：核酸
   (C)链：双链
(D)拓扑：两种(ii)分子类型：cDNA(iii)假立的：否(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：GTCACCGTCC   TTAGATCTAC   CATGAGTCTT  CTAACCGAGG   TCGAAACGTA   CGTACTCTCT                60ATCATCCCGT   CAGGCCCCCT   CAAAGCCGAG  ATCGCACAGA   GACTTGAAGA   GTTCACGGAA               120GA                                                                                       122(2)SEQ ID NO：18：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：4864bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：双链
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA       60CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG      120TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC      180ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGATTGG      240CTATTGGCCA TTGCATACGT TGTATCCATA TCATAATATG TACATTTATA TTGGCTCATG      300TCCAACATTA CCGCCATGTT GACATTGATT ATTGACTAGT TATTAATAGT AATCAATTAC      360GGGGTCATTA GTTCATAGCC CATATATGGA GTTCCGCGTT ACATAACTTA CGGTAAATGG      420CCCGCCTGGC TGACCGCCCA ACGACCCCCG CCCATTGACG TCAATAATGA CGTATGTTCC      480CATAGTAACG CCAATAGGGA CTTTCCATTG ACGTCAATGG GTGGAGTATT TACGGTAAAC      540TGCCCACTTG GCAGTACATC AAGTGTATCA TATGCCAAGT ACGCCCCCTA TTGACGTCAA      600TGACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCATTATGC CCAGTACATG ACCTTATGGG ACTTTCCTAC      660TTGGCAGTAC ATCTACGTAT TAGTCATCGC TATTACCATG GTGATGCGGT TTTGGCAGTA      720CATCAATGGG CGTGGATAGC GGTTTGACTC ACGGGGATTT CCAAGTCTCC ACCCCATTGA      780CGTCAATGGG AGTTTGTTTT GGCACCAAAA TCAACGGGAC TTTCCAAAAT GTCGTAACAA      840CTCCGCCCCA TTGACGCAAA TGGGCGGTAG GCGTGTACGG TGGGAGGTCT ATATAAGCAG      900AGCTCGTTTA GTGAACCGTC AGATCCCCTC GAGACCCCAT CCACGCTGTT TTGACCTCCA      960TAGAAGACAC CGGGACCGAT CCAGCCTCCG CGGCCGGGAA CGGAGCATTG GAACGCGGAT     1020TCCCCGTGCC AAGAGTGACG TAAGTACCGC CTATAGAGTC TATAGGCCCA CCCCCTTGGG     1080TTCTTATGCA TGCTATACTG TTTTTGGCTT GGGGTCTATA CACCCCCGCT TCCTCATGTT     1140ATAGGTGATC GTATAGCTTA GCCTATAGGT GTGGGTTATT GACCATTATT GACCACTCCC     1200CTATTGGTGA CGATACTTTC CATTACTAAT CCATAACATG GCTCTTTGCC ACAACTCTCT     1260TTATTGGCTA TATGCCAATA CACTGTCCTT CAGAGACTGA CACGGACTCT GTATTTTTAC     1320AGGATGGCGT CTCATTTATT ATTTACAAAT TCACATATAC AACACCACCG TCCCCAGTGC     1380CCGCAGTTTT TATTAAACAT AACGTGGGAT CTCCACGCGA ATCTCGGGTA CGTGTTCCGG     1440ACATGGGCTC TTCTCCGGTA GCGGCGGAGC TTCTACATCC GAGCCCTGCT CCCATGCCTC     1500CAGCGACTCA TGGTCGCTCG GCAGCTCCTT GCTCCTAACA GTGGAGGCCA GACTTAGGCA     1560CAGCACGATG CCCACCACCA CCAGTGTGCC GCACAAGGCC GTGGCGGTAG GGTATGTGTC     1620TGAAAATGAG CTCGGGGAGC GGGCTTGCAC CGCTGACGCA TTTGGAAGAC TTAAGGCAGC     1680GGCAGAAGAA GATGCAGGCA GCTGAGTTGT TGTGTTCTGA TAAGAGTCAG AGGTAACTCC     1740CGTTGCGGTG CTGTTAACGG TGGAGGGCAG TGTAGTCTGA GCAGTACTCG TTGCTGCCGC     1800GCGCGCCACC AGACATAATA GCTGACAGAC TAACAGACTG TTCCTTTCCA TGGGTCTTTT     1860CTGCAGTCAC CGTCCTTAGA TCTGCTGTGC CTTCTAGTTG CCAGCCATTT GTTGTTTGCC     1920CCTCCCCCGT GCCTTCCTTG ACCCTGGAAG GTGCCACTCC CACTGTCCTT TCCTAATAAA     1980ATGAGGAAAT TGCATCGCAT TGTCTGAGTA GGTGTCATTC TATTCTGGGG GGTGGGGTGG     2040GGCAGCACAG CAAGGGGGAG GATTGGGAAG ACAATAGCAG GCATGCTGGG GATGCGGTGG     2100GCTCTATGGG TACCCAGGTG CTGAAGAATT GACCCGGTTC CTCCTGGGCC AGAAAGAAGC     2160AGGCACATCC CCTTCTCTGT GACACACCCT GTCCACGCCC CTGGTTCTTA GTTCCAGcCC     2220CACTCATAGG ACACTCATAG CTCAGGAGGG CTCCGCCTTC AATCCCACCC GCTAAAGTAC     2280TTGGAGCGGT CTCTCCCTCC CTCATCAGCC CACCAAACCA AACCTAGCCT CCAAGAGTGG     2340GAAGAAATTA AAGCAAGATA GGCTATTAAG TGCAGAGGGA GAGAAAATGC CTCCAACATG     2400TGAGGAAGTA ATGAGAGAAA TCATAGAATT TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG     2460CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA     2520TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC     2580AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG     2640CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC     2700CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCTTACC     2760GGATACCTGT   CCGCCTTTCT   CCCTTCGGGA   AGCGTGGCGC    TTTCTCAATG   CTCACGCTGT           2920AGGTATCTCA   GTTCGGTGTA   CGTCGTTCGC   TCCAAGCTGG    GCTGTGTGCA   CGAACCCCCC           2880GTTCAGCCCG   ACCGCTGCGC   CTTATCCGGT   AACTATCGTC    TTGAGTCCAA   CCCGGTAAGA           2940CACGACTTAT   CGCCACTGGC   AGCAGCCACT   GGTAACAGGA    TTAGCAGAGC   GAGGTATGTA           3000GGCGGTGCTA   CAGAGTTCTT   GAAGTGGTGG   CCTAACTACG    CCTACACTAG   AAGGACAGTA           3060TTTGGTATCT   GCGCTCTGCT   GAAGCCAGTT   ACCTTCGGAA    AAAGAGTTGG   TAGCTCTTCA           3120TCCGGCAAAC   AAACCACCGC   TGGTAGCGGT   GGTTTTTTTG    TTTGCAAGCA   GCAGATTACG           3180CGCAGAAAAA   AAGGATCTCA   AGAAGATCCT   TTGATCTTTT    CTACGGGGTC   TGACGCTCAG           3240TGGAACGAAA   ACTCACGTTA   AGGGATTTTG   GTCATGAGAT    TATCAAAAAG   GATCTTCACC           3300TAGATCCTTT   TAAATTAAAA   ATGAAGTTTT   AAATCAATCT    AAAGTATATA   TGAGTAAACT           3360TGGTCTGACA   GTTACCAATG   CTTAATCAGT   GAGGCACCTA    TCTCAGCGAT   CTGTCTATTT           3420CGTTCATCCA   TAGTTGCCTG   ACTCCGGGGG   GGGGGGGCGC    TGAGGTCTGC   CTCGTGAAGA           3480AGGTGTTGCT   GACTCATACC   AGGCCTGAAT   CGCCCCATCA    TCCAGCCAGA   AAGTGAGGGA           3540GCCACGGTTG   ATGAGAGCTT   TGTTGTAGGT   GGACCAGTTG    GTGATTTTGA   ACTTTTGCTT           3600TGCCACGGAA   CGGTCTGCGT   TGTCGGGAAG   ATGCGTGATC    TGATCCTTCA   ACTCAGCAAA           3660AGTTCGATTT   ATTCAACAAA   GCCGCCGTCC   CGTCAAGTCA    GCGTAATGCT   CTGCCAGTGT           3720TACAACCAAT   TAACCAATTC   TGATTAGAAA   AACTCATCGA    GCATCAAATG   AAACTGCAAT           3780TTATTCATAT   CAGGATTATC   A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(i)序列特征：
    (A)长度：15bp
    (B)类型：核酸
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(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：AGCAGAAGCA GAGCA                                          15(2)SEQ ID NO：20：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：119bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：双链
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA(iii)假立的：否(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID N0：20：TCACCGTCCT   TAGATCAAGC   AGGCTTAATA   ATCACTCACT   GAGTGACATC   AAAATCATGG                60CGTCCCAAGG   CACCAAACGG   TCTTATGAAC   AGATGCAAAC   TGATGCCGAA   CGCCAGATT                119(2)SEQ ID NO：21：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：67bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：双链
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：GAGGGGCAAA CAACAGATGG CTGGCAACTA GAAGGCACAG CAGATATTTT TTCCTTAATT        60GTCGTAC                                                                  67(2)SEQ ID NO：22：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：15bp
    (B)类型：核酸
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(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：AGCAGAAGCA CGCAC                                          15(2)SEQ ID NO：23：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：15bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：单链
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(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：AGCAGAAGCA CAGCA                                         15(2)SEQ ID NO：24：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：33bp
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(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：CCTTAGATCG CAAATAAAAA CAACCAAAAT GAA                      33(2)SEQ ID NO：25：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：36bp
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(iv)反义：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：GCAGATCCTT ATATTTCTGA AATTCTGGTC TCAGAT                  36(2)SEQ ID NO：26：的资料：
(i)序列特征：
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(i)序列特征：
    (A)长度：42bp
    (B)类型：核酸
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(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：GGCACAGCAG ATCTTTCAAT AACGTTTCTT TGTAATGGTA AC            42(2)SEQ ID NO：28：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：23bp
    (B)类型：核酸
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(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：CTAACAGACT GTTCCTTTCC ATG                                 23(2)SEQ ID NO：29：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：18bp
    (B)类型：核酸
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(iii)假立的：否
(iv)反义：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：GGAGTGGCAC CTTCCAGG                                        18(2)SEQ ID NO：30：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：12bp
    (B)类型：核酸
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(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：AGCAAAAGCA GG                                           12(2)SEQ ID NO：31：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：14bp
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(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：AGCAGAAGCG GAGC                                           14(2)SEQ ID NO：32：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：35bp
    (B)类型：核酸
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(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：CCACATGTCG ACCCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGG                   35(2)SEQ ID NO：33：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：33bp
    (B)类型：核酸
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(iii)假立的：否
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(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：GGTACAACCA TGAAGACTAT CATTGCTTTG AGC                     33(2)SEQ ID NO：34：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：37bp
    (B)类型：核酸
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(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：CCACATAGAT CTTCAAATGC AAATGTTGCA CCTAATG                  37(2)SEQ ID NO：35：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：38bp
    (B)类型：核酸
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(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：GGTACAACCA TGAAAGCAAA ACTACTAGTC CTGTTATG                 38(2)SEQ ID NO：36：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：32bp
    (B)类型：核酸
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(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：CCACATTCAG ATGCATATTC TACACTGCAA AG                       32(2)SEQ ID NO：37：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：36bp
    (B)类型：核酸
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(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：GGTACAACCA TGAAGGCAAT AATTGTACTA CTCATG                   36(2)SEQ ID NO：38：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：36bp
    (B)类型：核酸
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(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：38：CCACATTTAT AGACAGATGG AGCAAGAAAC ATTGTC                  36(2)SEQ ID NO：39：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：33bp
    (B)类型：核酸
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(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：39：GGTACAAGAT CTACCATGCT TCTAACCGAG GTC                      33(2)SEQ ID NO：40：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：36bp
    (B)类型：核酸
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(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：40：CCACATAGAT CTTCACTTGA ACCGIIGCAT CTGCAC                  36(2)SEQ ID NO：41：的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：39bp
(B)类型：核酸
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(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：41：GGTACAGGAT CCACCATGTC CAACATGGAT ATTGACGGC                39(2)SEQ ID NO：42：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：39bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：两种
    (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：42：CCACATGGAT CCTTAATAAT CGAGGTCATC ATAATCCTC                39(2)SEQ ID NO：43：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：42bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：两种
    (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：43：GGTACAGGAT CCACCATGTC GCTGTTTGGA GACACAATTG CC            42(2)SEQ ID NO：44：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：38bp
    (B)类型：核酸
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(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：44：CCACATGGAT CCTTATAGGT ATTTCTTCAC AAGAGCTG                38(2)SEQ ID NO：45：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：3553bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：双链
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(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：45：GATATTGCCT ATTGGCCATT GCATACGTTG TATCCATATC ATAATATGTA CATTTATATT        60GGCTCATGTC CAACATTACC GCCATGTTGA CATTGATTAT TGACTAGTTA TTAATAGTAA       120TCAATTACGG   GGTCATTAGT  TCATAGCCCA   TATATGGAGT  TCCGCGTTAC   ATAACTTACG              180GTAAATGGCC   CGCCTGGCTG  ACCGCCCAAC   GACCCCCGCC  CATTGACGTC   AATAATGACG              240TATCTTCCCA   TAGTAACGCC  AATAGGGACT   TTCCATTGAC  GTCAATGGGT   GGAGTATTTA              300CGGTAAACTG   CCCACTTGGC  AGTACATCAA   GTGTATCATA  TGCCAAGTAC   GCCCCCTATT              360GACGTCAATG   ACGGTAAATC  GCCCGCCTGG   CATTATCCCC  AGTACATGAC   CTTATGGGAC              420TTTCCTACTT   GGCAGTACAT  CTACGTATTA   GTCATCGCTA  TTACCATGGT   GATGCGGTTT              480TGGCAGTACA   TCAATGGCCG  TGGATAGCGG   TTTCACTCAC  GGGGATTTCC   AAGTCTCCAC              540CCCATTGACG   TCAATGGGAG  TTTGTTTTGG   CACCAAAATC  AACGGGACTT   TCCAAAATGT              600CGTAACAACT   CCGCCCCATT  GACGCAAATG   GGCGGTAGGC  GTGTACGGTG   GGAGGTCTAT              660ATAAGCAGAG   CTCGTTTAGT  GAACCGTCAG   ATCGCCTGGA  GACGCCATCC   ACGCTGTTTT              720GACCTCCATA   GAAGACACCG  GGACCGATCC   AGCCTCCGCG  GCCGGGAACG   GTGCATTGGA              780ACGCGGATTC   CCCGTGCCAA  GAGTGACGTA   AGTACCGCCT  ATAGAGTCTA   TAGGCCCACC              840CCCTTGGCTT   CTTATGCATG  CTATACTGTT   TTTGGCTTGG  GGTCTATACA   CCCCCGCTTC              900CTCATGTTAT   AGGTGATGGT  ATAGCTTAGC   CTATAGGTGT  GGGTTATTGA   CCATTATTGA              960CCACTCCCCT   ATTGGTGACG  ATACTTTCCA   TTACTAATCC  ATAACATGGC   TCTTTGCCAC             1020AACTCTCTTT   ATTGGCTATA  TGCCAATACA   CTGTCCTTCA  GAGACTGACA   CGGACTCTGT             1080ATTTTTACAG   GATGGGGTCT  CATTTATTAT   TTACAAATTC  ACATATACAA   CACCACCGTC             1140CCCAGTGCCC   GCAGTTTTTA  TTAAACATGC   TAACGTGGGA  TCTCCACGCG   AATCTCGGGT             1200ACGTGTTCCG   GACATGGGCT  CTTCTCCGGT   AGCGGCGGAG  CTTCTACATC   CGAGCCCTGC             1260TCCCATGCCT   CCAGCGACTC  ATGGTCGCTC   GGCAGCTCCT  TGCTCCTAAC   AGTGGAGGCC             1320AGACTTAGGC   ACAGCACGAT  GCCCACCACC   ACCAGTGTGC  CGCACAAGGC   CGTGGCGGTA             1380GGGTATGTGT   CTGAAAATGA  GCTCGGGGAG   CGGGCTTGCA  CCGCTGACGC   ATTTGGAAGA             1440CTTAAGGCAG   CGGCAGAAGA  AGATGCAGGC   AGCTGAGTTG  TTGTGTTCTG   ATAAGAGTCA             1500GAGGTAACTC   CCGTTGCGGT  GCTGTTAACG   GTGGAGGGCA  GTGTAGTCTG   AGCAGTACTC             1560GTTGCTGCCG   CGCGCGCCAC  CAGACATAAT   AGCTGACAGA  CTAACAGACT   GTTCCTTTCC             1620ATGGGTCTTT   TCTGCAGTCA  CCGTCCTTAG   ATCTGCTGTG  CCTTCTAGTT   GCCAGCCATC             1680TGTTGTTTGC   CCCTCCCCCG  TGCCTTCCTT   GACCCTGGAA  GGTGCCACTC   CCACTGTCCT             1740TTCCTAATAA   AATGAGGAAA  TTGCATCGCA   TTGTCTGAGT  AGGTGTCATT   CTATTCTGGG             1800GGGTGGGGTG   GGGCAGCACA  GCAAGGGGGA   GGATTGGGAA  GACAATAGCA   GGCATGCTGG             1860GGATGCGGTG   GGCTCTATGG  GTACGGCCGC   AGCGGCCGTA  CCCAGGTGCT   GAAGAATTGA             1920CCCGGTTCCT   CGACCCGTAA  AAAGGCCGCG   TTGCTGGCGT  TTTTCCATAG   GCTCCGCCCC             1980CCTGACGAGC   ATCACAAAAA  TCGACGCTCA   AGTCAGAGGT   GGCGAAACCC   GACAGGACTA           2040TAAACATACC   AGCCGTTTCC  CCCTGGAAGC   TCCCTCGTGC   GCTCTCCTGT   TCCGACCCTG           2100CCGCTTACCG   GATACCTGTC  CGCCTTTCTC   CCTTCGGGAA   GCGTGGCGCT   TTCTCAATGC           2160TCACGCTGTA   GGTATCTCAG  TTCGGTGTAG   GTCGTTCGCT   CCAAGCTGGG   CTGTGTGCAC           2220GAACCCCCCG   TTCAGCCCGA  CCGCTGCGCC   TTATCCGGTA   ACTATCGTCT   TGACTCCAAC           2280CCGGTAAGAC   ACGACTTATC  GCCACTGGCA   GCAGCCACTG   GTAACAGGAT   TAGCAGAGCG           2340AGGTATGTAG   GCGGTGCTAC  AGAGTTCTTG   AAGTGGTGGC   CTAACTACGG   CTACACTAGC           2400TGAAGGACAG   TATTTGGTAT  CTGCGCTCTG   CTGAAGCCAG   TTACCTTCGG   AAAAAGAGTT           2460GGTAGCTCTT   GATCCGGCAA  ACAAACCACC   GCTGGTAGCG   GTGGTTTTTT   TGTTTGCAAG           2520CAGCAGATTA   CGCGCAGAAA  AAAAGGATCT   CAAGAAGATC   CTTTGATCTT   TTCTACGTGA           2580TCCCGTAATG   CTCTGCCAGT  GTTACAACCA   ATTAACCAAT   TCTGATTAGA   AAAACTCATC           2640GAGCATCAAA   TGAAACTGCA  ATTTATTCAT   ATCAGGATTA   TCAATACCAT   ATTTTTGAAA           2700AAGCCGTTTC   TGTAATGAAG  GAGAAAACTC   ACCGAGGCAG   TTCCATAGGA   TGGCAAGATC           2760CTCGTATCGG   TCTGCGATTC  CGACTCGTCC   AACATCAATA   CAACCTATTA   ATTTCCCCTC           2820GTCAAAAATA   AGGTTATCAA  GTGAGAAATC   ACCATGAGTG   ACGACTGAAT   CCGGTGAGAA           2880TGGCAAAAGC   TTATGCATTT  CTTTCCAGAC   TTGTTCAACA   GGCCAGCCAT   TACGCTCGTC           2940ATCAAAATCA   CTCCCATCAA  CCAAACCGTT   ATTCATTCGT   GATTGCGCCT   GAGCGAGACG           3000AAATACGCGA   TCGCTGTTAA  AAGGACAATT   ACAAACAGGA   ATCGAATGCA   ACCGGCGCAG           3060GAACACTGCC   AGCGCATCAA  CAATATTTTC   ACCTGAATCA   GGATATTCTT   CTAATACCTG           3120GAATGCTGTT   TTCCCGGGGA  TCGCAGTGGT   GAGTAACCAT   GCATCATCAG   GAGTACGGAT           3180AAAATGCTTG   ATGGTCGGAA  GAGGCATAAA   TTCCGTCAGC   CAGTTTAGTC   TGACCATCTC           3240ATCTGTAACA   TCATTGGCAA  CGCTACCTTT   GCCATGTTTC   AGAAACAACT   CTGGCGCATC           3300GGGCTTCCCA   TACAATCGAT  AGATTGTCGC   ACCTGATTGC   CCGACATTAT   CGCGAGCCCA           3360TTTATACCCA   TATAAATCAG  CATCCATGTT   GGAATTTAAT   CGCGGCCTCG   AGCAAGACGT           3420TTCCCGTTGA   ATATGGCTCA  TAACACCCCT   TGTATTACTG   TTTATGTAAG   CAGACAGTTT           3480TATTGTTCAT   GATGATATAT  TTTTATCTTG   TGCAATGTAA   CATCAGAGAT   TTTGAGACAC           3540AACGTGGCTT   TCC                                                                     3553(2)SEQ ID NO：46：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：72bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：两种
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：46：TCACCGTCCT TAGATCGGTA CAACCATGAA GACTATCATT GCTTTGAGCT ACATTTTATG      60TCTGGTTTTC GC                                                          72(2)SEQ ID NO：47：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：111bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：两种
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：47：TCATGCTTTT TGCTTTGTGT TGTTTTGCTG GGGTTCATCA TGTGGGCCTG CCAAAAAGGC     60AACATTAGGT GCAACATTTG CATTTGAAGA TCTATGTGGG ATCTGCTGTG C             111(2)SEQ ID NO：48：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：63bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：两种
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：48：TTAGATCGGA   ACATGAAAGC  AAAACTACTA  GTCCTGTTAT   GTGCATTTAC   AGCTACATAT             60GCA                                                                                   63(2)SEQ ID NO：49：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：102bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：双链
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：49：CTGGTGCTTT TGGTCTCCCT GGGGGCAATC AGCTTCTGGA TGTCTTCTAA TGGGTCTTTG                  60CAGTGTAGAA TATGCATCTG AATGTGGGAT CTGCTGTGCC TT                                    102(2)SEQ ID NO：50：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：108bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：两种
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：50：CCTTAGATCG GTACAACCAT GAAGGCAATA ATTGTACTAC TCATGGTAGT AACATCCAAC                  60GCAGATCGAA TCTGCACTGG GATAACATCT TCAAACTCAC CTCATGTG                              108(2)SEQ ID NO：51：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：102bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：两种
    (D)拓扑：两种(ii)分子类型：cDNA(iii)假立的：否(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：51：TTGGCTGTAA CATTGATGAT AGCTATTTTT ATTGTTTATA TGGTCTCCAG AGACAATGTT      60TCTTGCTCCA TCTGTCTATA AATGTGGGAT CTGCTGTGCC TT                        102(2)SEQ ID NO：52：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：84bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：两种
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：52：GTCCTTAGAT CCACCATGGC GTCCCAAGGC ACCAAACGGT CTTATGAACA GATGGAAACT        60GATGGGGAAC GCCAGAATGC AACT                                               84(2)SEQ ID NO：53：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：108bp
    (B)类型：核酸
(C)链：两种
(D)拓扑：两种(ii)分子类型：cDNA(iii)假立的：否(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：53：GAAAAGGCAA CGAACCCGAT CGTGCCCTCT TTTGACATGA GTAATGAAGG ATCTTATTTC       60TTCGGAGACA ATGCAGAAGA GTACGACAAT TAAGGATCTG CTGTGCCT                   108(2)SEQ ID NO：54：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：132bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：两种
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：54：CTTAGATCCA GATCTACCAT GAGTCTTCTA ACCGAGGTCG AAACGTATGT TCTCTCTATC        60GTTCCATCAG GCCCCCTCAA AGCCGAAATC GCGCAGAGAC TTGAAGATGT CTTTGCTGGG       120AAAAACACAG AT                                                           132(2)SEQ ID NO：55：的资料：(i)序列特征：
(A)长度：129bp
(B)类型：核酸
(C)链：两种
(D)拓扑：两种(ii)分子类型：cDNA(iii)假立的：否(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：55：GGGACTCATC CTAGCTCCAG TACTGGTCTA AAAGATGATC TTCTTGAAAA TTTGCAGACC                            60TATCAGAAAC GAATGGGGGT GCAGATGCAA CGGTTCAAGT GAAGATCTAT GTGGGATCTG                           120CTGTGCCTT                                                                                   129(2)SEQ ID NO：56：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：81bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：两种
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：56：CTTAGATCCA   CCATGTCCAA   CATGGATATT   GACGGTATCA  ACACTGGGAC   AATTGACAAA                60ACACCGGAAG   AAATAACTTC   T                                                               81(2)SEQ ID NO：57：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：96bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：两种
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：57：GTTGAAATTC CAATTAAGCA GACCATCCCC AATTTCTTCT TTGGGAGGGA CACAGCAGAG                           60GATTATGATG ACCTCGATTA TTAAGGATCT GCTGTG                                                     96(2)SEQ ID NO：58：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：96bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：两种
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：58：CTTAGATCCA CCATGTCGCT GTTTGGAGAC ACAATTGCCT ACCTGCTTTC ATTGACAGAA      60GATGGAGAAG GCAAAGCAGA ACTAGCAGAA AAATTA                                96(2)SEQ ID NO：59：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：123bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：两种
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：59：AGATCTCTTG GGGCAAGTCA AGAGAATCGG GAAGGAATTG CAAAGGATGT CATGGAAGTG      60CTAAAGCAGA GCTCTATGGG AAATTCAGCT CTTGTGAAGA AATACCTATA AGGATCTGCT     120GTG                                                                   123(2)SEQ ID NO：60：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：33bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：两种
(D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：60：GGTACAAATA TTGGCTATTG GCCATTGCAT ACG                     33(2)SEQ ID NO：61：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：36bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：两种
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：61：CCACATCTCG AGGAACCGGG TCAATTCTTC AGCACC                  36(2)SEQ ID NO：62：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：38bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：两种
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(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：62：GGTACAGATA TCGGAAAGCC ACGTTGTGTC TCAAAATC                  38
(2)SEQ ID NO：63：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：37bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：两种
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：63：CCACATGGAT CCGTAATGCT CTGCCAGTGT TACAACC                 37
(2)SEQ ID NO：64：的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：39bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：两种
    (D)拓扑：两种
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假立的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：64：GGTACATGAT CACGTAGAAA AGATCAAAGG ATCTTCTTG                39

Claims (25)

1.含有编码流感病毒基因之核酸的DNA构建体，其中所说的DNA构建体可诱导抗原流感病毒基因产物的表达，它在所说的DNA构建体被引入动物活体组织，结果被表达编码的流感病毒基因的细胞摄入后，可诱导流感病毒特异性的免疫反应。
2.如权利要求1的DNA构建体，其中流感病毒基因编码核蛋白质、血凝素、聚合酶、基质或非结构性人流感病毒基因产物。
3.含有DNA构建体的多核苷酸疫苗，它在所说DNA药物被引入动物活体组织后，其中动物是脊椎动物，可诱导抗人流感病毒的中和抗体、流感病毒特异性的细胞毒性淋巴细胞或保护性免疫反应，而多核苷酸疫苗编码流感病毒基因，它在被导入所说脊椎动物的活体组织中后得以表达。
4.如权利要求3的多核苷酸疫苗，它含有选自下列一个或多个的DNA构建体：a)pnRSV-PR-NP，b)V1-PR-NP，c)V1J-PR-NP，其5′末端是SEQ.ID：12：，d)V1J-PR-PB1，其5′末端是SEQ.ID：13：，e)V1J-PR-NS，其5′末端是SEQ.ID：14：，f)V1J-PR-HA，其5′末端是SEQ.ID：15：，g)V1J-PR-PB2，其5′末端是SEQ.ID：16：，h)V1J-PR-M1，其5′末端是SEQ.ID：17：，i)V1Jneo-EJ-NP，其5′末端是SEQ.ID：20：，而3′末端是
SEQ.ID：21：，j)V1Jneo-TX-NP，其5′末端是SEQ.ID：24：，而3′末端是
SEQ.ID：25：，和k)V1Jneo-PA-HA，其5′末端是SEQ.ID：26：，而3′末端是
SEQ.ID：27：，1)V1Jns-GA-HA(A/Georgia/03/93)，构建体大小为6.56kb，其
5′末端是SEQ.ID：46：，而3′末端是SEQ.ID：47：，m)V1Jns-TX-HA(A/Texas/36/91)，构建体大小为6.56kb，其
5′末端是SEQ.ID：48：，而3′末端是SEQ.ID：49：，n)V1Jns-PA-HA(B/Panama/45/90)，构建体大小为6.61kb，其
5′末端是SEQ.ID：50：，而3′末端是SEQ.ID：51：，o)V1Jns-BJ-NP(A/Beijing/353/89)，构建体大小为6.42kb，
其5′末端是SEQ.ID：52：，而3′末端是SEQ.ID：53：，p)V1Jns-BJ-M1(A/Beijing/353/89)，构建体大小为5.62kb，
其5′末端是SEQ.ID：54：，而3′末端是SEQ.ID：55：，q)V1Jns-PA-NP(B/Panama/45/90)，构建体大小为6.54kb，其
5′末端是SEQ.ID：56：，而3′末端是SEQ.ID：57：，和r)V1Jns-PA-M1(B/Panama/45/90)，构建体大小为5.61kb，其
5′末端是SEQ.ID：58：，而3′末端是SEQ.ID：59：。
5.表达载体V1J，SEQ.ID：10：。
6.表达载体V1J-neo，SEQ.ID：18：。
7.对抗人流感病毒感染的保护方法，包括用预防有效剂量的权利要求1的DNA免疫接种。
8.对抗人流感病毒感染的保护方法，包括用预防有效剂量的权利要求3的DNA免疫接种。
9.对抗人流感病毒感染的保护方法，包括用预防有效剂量的权利要求4的DNA免疫接种。
10.如权利要求7的方法，包括将DNA直接施用于活体组织中。
11.如权利要求10的方法，其中所使用的DNA或者为不带有载体的生理上可接受的溶液中的裸露DNA，或者为DNA和脂质体的混合物，或者为与佐剂或便于转染的制剂的混合物。
12.使用流感病毒基因以诱导活体内免疫反应的方法，包括：
a)分离基因，
b)将基因与调节序列连接以使基因可操作地连接于调节序列，此序列引入活体组织时会引导基因的转录开始及随后的翻译，和
c)将基因引入活体组织。
13.如权利要求12的方法，它进一步包含通过在多种场合下引入流感病毒基因以促进经诱导的免疫反应。
14.如权利要求12的方法，其中流感病毒基因编码人流感病毒核蛋白质、血凝素、基质、非结构蛋白质或聚合酶基因产物。
15.如权利要求14的方法，其中人流感病毒基因编码核蛋白质、碱性聚合酶1、非结构蛋白质1、血凝素、基质1或源于一种或多种人流感病毒分离株A/PR/8/34，A/Beijing/353/89，A/Texas/36/91，A/Georgia/03/93和B/Panama/45/90的碱性聚合酶2。
16.诱导对抗由流感病毒株引起之感染或疾病的免疫反应的方法，包括将编码第一株流感病毒的特异性流感病毒保守性抗原决定基的核酸引入脊椎动物体内，以使经诱导的免疫反应不仅能对抗由第一株流感病毒引起的感染或疾病，也能对抗由不同于第一病毒株的病毒株引起的感染或疾病。
17.如权利要求7-16中任何一项的方法，其中用此方法治疗的生物体是人。
18.DNA：a)pnRSV-PR-NP，b)V1-PR-NP，c)V1J-PR-NP，其5′末端是SEQ.ID：12：，d)V1J-PR-PB1，其5′末端是SEQ.ID：13：，e)V1J-PR-NS，其5′末端是SEQ.ID：14：，f)V1J-PR-HA，其5′末端是SEQ.ID：15：，g)V1J-PR-PB2，其5′末端是SEQ.ID：16：，h)V1J-PR-M1，其5′末端是SEQ.ID：17：，i)V1Jneo-BJ-NP，其5′末端是SEQ.ID：20：，而3′末端是
SEQ.ID：21：，j)V1Jneo-TX-NP，其5′末端是SEQ.ID：24：，而3′末端是
SEQ.ID：25：，和k)V1Jneo-PA-HA，其5′末端是SEQ.ID：26：，而3′末端是
SEQ.ID：27：，1)V1Jns-GA-HA(A/Georgia/03/93)，构建体大小为6.56kb，其
5′末端是SEQ.ID：46：，而3′末端是SEQ.ID：47：，m)V1Jns-TX-HA(A/Texas/36/91)，构建体大小为6.56kb，其
5′末端是SEQ.ID：48：，而3′末端是SEQ.ID：49：，n)V1Jns-PA-HA(B/Panama/45/90)，构建体大小为6.61kb，其
5′末端是SEQ.ID：50：，而3′末端是SEQ.ID：51：，o)V1Jns-BJ-NP(A/Beijing/353/89)，构建体大小为6.42kb，
其5′末端是SEQ.ID：52：，而3′末端是SEQ.ID：53：，p)V1Jns-BJ-M1(A/Beijing/353/89)，构建体大小为5.62kb，
其5′末端是SEQ.ID：54：，而3′末端是SEQ.ID：55：，q)V1Jns-PA-NP(B/Panama/45/90)，构建体大小为6.54kb，其
5′末端是SEQ.ID：56：，而3′末端是SEQ.ID：57：，和r)V1Jns-PA-M1(B/Panama/45/90)，构建体大小为5.61kb，其
5′末端是SEQ.ID：58：，而3′末端是SEQ.ID：59：。
19.编码A型和B型人流感病毒的基因的核酸构建体组合物。
20.如权利要求19的组合物，包括编码至少三株流感病毒的血凝素基因，至少两株流感病毒的核蛋白质基因以及至少两株流感病毒的基质蛋白质基因的核酸构建体。
21.如权利要求19的组合物，其中所说流感病毒基因衍生于H1N1，H2N2，和H3N2流感病毒以及流感病毒B株。
22.如权利要求19的组合物，包括：a)V1Jns-GA-HA(A/Georgia/03/93)，构建体大小为6.56kb，其
5′末端是SEQ.ID：46：，而3′末端是SEQ.ID：47：，b)V1Jns-TX-HA(A/Texas/36/91)，构建体大小为6.56kb，其
5′末端是SEQ.ID：48：，而3′末端是SEQ.ID：49：，c)V1Jns-PA-HA(B/Panama/45/90)，构建体大小为6.61kb，其
5′末端是SEQ.ID：50：，而3′末端是SEQ.ID：51：，d)V1Jns-BJ-NP(A/Beijing/353/89)，构建体大小为6.42kb，
其5′末端是SEQ.ID：52：，而3′末端是SEQ.ID：53：，e)V1Jns-BJ-M1(A/Beijing/353/89)，构建体大小为5.62kb，
其5′末端是SEQ.ID：54：，而3′末端是SEQ.ID：55：，f)V1Jns-PA-NP(B/Panama/45/90)，构建体大小为6.54kb，其
5′末端是SEQ.ID：56：，而3′末端是SEQ.ID：57：，和g)V1Jns-PA-M1(B/Panama/45/90)，构建体大小为5.61kb，其
5′末端是SEQ.ID：58：，而3′末端是SEQ.ID：59：。
23.表达载体V1Jns。
24.表达载体V1JR，SEQ.ID：45：。
25.分离的人流感病毒基因可操作地与一种或多种调节序列连接以掺入疫苗中用于抗人流感病毒感染的免疫接种之应用。
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