CN1825118A - 一种药物残留的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物残留的检测方法，针对食品安全中的兽药残留检测种类繁多，检测通量需求高的特点，为解决当前药物残留检测中存在的价格昂贵、样本需求量大、操作费时、检测通量低等缺陷，利用药物分子的单克隆抗体和偶联抗原建立液相芯片竞争定量检测方法，建立了一种全新的多种药物残留检测方法，包括如下步骤：1).小分子－蛋白偶联物与单克隆抗体的预处理；2).液相芯片***中微球的活化；3).标准曲线的绘制；4).待测样品信号值的测定；5).根据标准曲线，计算待测样品中药物残留的含量。真正实现了高通量，可以在一个流程中同时对几种药物的残留情况进行检测；简化了操作程序，有效的降低了检测成本，缩短了检测时间。

Description

一种药物残留的检测方法

技术领域

本发明涉及药物残留的检测方法。

背景技术

所谓兽药残留是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及/或其代谢物，以及与兽药有关的杂质的残留。兽药残留既包括原药也包括药物在动物体内的代谢产物。主要的残留兽药有抗生素类残留、激素类残留和驱虫药类残留。兽药通常是通过在预防和治疗动物疾病用药、在饲料添加剂中使用以及在食品保鲜中引入药物而带来对食品的污染。

兽药残留对人体的危害：

1.人长期摄入含兽药残留的动物源性食品后，兽药残留不断在人体内蓄积，当积累到一定程度后，就会对人体产生毒性作用。如磺胺类药物可引起肾损害，特别是乙酰化磺胺在尿中溶解度低，析出结晶后对肾脏损害更大。

2.经常食用一些含低剂量抗菌药物的食品还能使易感个体出现过敏反应，这些药物包括青霉素、四环素、磺胺类药物及某些氨基糖苷类抗生素等。这些药物具有抗原性，刺激机体内抗菌素体的形成，造成过敏反应，严重者可引起休克、喉头水肿、呼吸困难等严重症状。呋喃类引起人体的不良反应主要是胃肠反应和过敏反应，表现在以周围神经炎、药热、嗜酸性白细胞增多为特征的过敏反应。磺胺类药物的过敏反应表现为皮炎、白细胞减少、溶血性贫血和药热。青霉素药物引起的***反应，轻者表现为接触性皮炎和皮肤反应，严重者表现为致死性过敏性休克。

3.动物在经常反复接触某一种抗菌药物后，其体内的敏感菌株将受到选择性的抑制，细菌产生耐药性，产生大量耐药菌株。如果耐药菌株传播到人类身上，将会产生严重后果。当人体发生疾病时，就给临床上感染性疾病的治疗带来一定的困难，延误正常的治疗。已发现长期食用低剂量的抗生素能导致金黄色葡萄菌耐药菌株的出现，也能引起大肠杆菌耐药菌株的产生。至今为止，具有耐药性的微生物通过动物性食品转移到人体内时，对人体健康产生危害的问题尚未得到解决。

4.在正常条件下，人体内有非常多的有益菌，有益菌群能抑制其他菌群的过度繁殖，某些菌群能合成B族维生素和维生素K以供机体使用。过多应用药物会使这种平衡发生紊乱，造成一些非致病菌死亡，使菌群的平衡失调，从而导致长期的腹泻或引起维生素缺乏等反应，造成对人体的危害。

5.长期食用含低剂量激素动物性食品的后果也不可忽视。

除以上影响以外，兽药残留还具有致畸、致癌、致突变作用。

目前对于这些兽药残留的检测方法有高效液相色谱分析法(HPLC)和气象色谱/质谱联用分析法(GC/MS)或液相色谱/质谱联用分析法(LC/MS)。这些方法普遍存在着仪器昂贵，方法复杂，操作繁琐，试剂消耗量大的局限性。酶联免疫(ELISA)和放射免疫(RIA)技术以灵敏度高，特异性好，成本低，操作简单在兽药残留检测中广泛应用。但ELISA试剂盒，价格昂贵，仅能对单一的兽药检测，通量较低，且操作费时，不便于进行大批量分析。

液相芯片***是生物芯片领域已经发展成熟的一项技术。

液相芯片***包括液相芯片工作站和不同荧光编码的微球等。液相芯片工作站是一自动化程度极高的检测和分析仪器，荧光编码的微球目前共有100种，可检测100种与之相偶联的不同种类的目标分子。将这些微球悬浮于一个液相体系中，就构成了一个液相芯片***，利用这个***，可以对同一个样品中的多个不同的检测对象同时进行检测，这种检测技术称之为xMAP(flexible Multi～AnalyteProfiling)技术。

在液相***中，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的微球都带有一个独特的色彩编号。在微球的制造过程中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种红色分类荧光的比例不同，可以把微球分为100种。利用这100种微球，可以标记上100种不同的探针分子，同时对一个样本中的100种不同的目的分子进行检测。

为了将不同特性的探针分子偶联到微球表面，在微球的表面进行了一系列的化学修饰，可与各种蛋白，肽，核酸等生物分子进行偶联固定。

将这种标记好探针的微球与样品反应。探针可以与相应的目标分子特异性的结合，带有绿色报告荧光的报告分子也与目的分子特异性的结合，本方法适用于定量和定性分析。

检测的原理是使微球呈单列高速通过检测通道，并使用双色激光同时对微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测。红色激光激发的是微球上的红色分类荧光，根据微球的不同荧光编码，可以将微球分类，从而将各个不同的分析反应区分开来。绿色激光激发的是报告荧光分子，目的是确定微球上结合的报告荧光分子的数量，从而确定微球上结合的目的分子的数量。因此，通过红绿双色激光的同时检测，可以确定被结合的待测物的种类和数量。由于液相芯片***检测是的某种荧光编码的群体信号，因此可信度更高。

发明内容

本发明针对食品安全中的兽药残留检测种类繁多，检测通量需求高的特点，为解决当前药物残留检测中存在的价格昂贵、样本需求量大、操作费时、检测通量低等缺陷，利用药物分子的单克隆抗体和偶联抗原建立液相芯片竞争定量检测方法，建立了一种全新的多种药物残留检测方法。

本发明的具体技术方案如下：

本发明提供一种药物残留的检测方法，包括如下步骤：

1)小分子-蛋白偶联物与单克隆抗体的预处理；

2)液相芯片***中微球的活化；

3)标准曲线的绘制；

4)待测样品信号值的测定；

5)根据标准曲线，计算待测样品中药物残留的含量。

步骤1)所述的小分子-蛋白偶联物与单克隆抗体的预处理是指先将小分子-蛋白偶联物和单克隆抗体分别进行纯化、除盐和除杂质，然后将抗体与D-生物素偶联；所述的小分子是指呋哺唑酮代谢物、喹乙醇和金霉素。

步骤2)所述的液相芯片***中的微球的活化是指用EDC活化微球上的羧基。

步骤3)所述的制定标准曲线是指用步骤1)预处理好的抗原标准品，通过浓度梯度实验，测定在不同浓度抗原存在的情况下，液相芯片***检测到的信号值，利用抗原浓度和液相芯片***检测到的信号值绘制标准曲线。

步骤4)所述的测定待测样品的信号值是指将待测样品进行预处理后，加至检测试剂中，利用液相芯片***检测其信号值。

作为优化方案，本发明所提供的药物残留的检测方法包括如下步骤：

1).小分子-蛋白偶联物和单克隆抗体的处理：用缓冲液，除盐柱(购自SIGMA公司)将小分子-蛋白偶联物和单克隆抗体分别进行纯化、除盐和除杂质，再溶解于适量的pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中；

A.用30mL PBS 7.4的磷酸盐缓冲液平衡除盐柱；

B.加入抗体，收集除盐柱洗脱下的液体，前3mL弃掉；

C.用离心管依次收集第4，5，6，7四个1mL的液体；

D.测定OD280，估算蛋白的量；

2).单克隆抗体偶联生物素：

A.将D-BIONTIN(D-生物素)(SIGMA公司)加入第一步得到的抗体中，室温轻摇1～2小时；

B.生物素标记单克隆抗体后，检测生物素偶联的效率，将过量的D-BIONTIN用透析法除去，冻干；

3).液相芯片检测药物残留的试验：

A.用漩涡振荡器或者超声波悬浮微球(luminex公司)，大约20s；

B.取50μL微球于1.5mL的离心管中，8000g离心1～2min，去上清液；

C.加入100μL双蒸水，用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，大约20s，8000g离心1～2min；

D.吸弃上清，加入80μL的磷酸盐缓冲液(100mM Monobasic Sodium Phosphate，pH 6.2)(配方及试剂来源见附表)用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，大约20s；

E.加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS(diluted in dH₂O)，用漩涡振荡器混匀；

F.加入10μL 50mg/mL EDC(diluted in dH₂O)(sigma公司)。用漩涡振荡器混匀；

G.在室温避光静置20min，每10min用漩涡振荡器轻轻的混匀；

H.将已经活化的微球≥8000g离心1～2min；

I.吸弃上清，加入250μL的50mM MES(配方及试剂来源见附表)，用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，大约20s；

J.将微球≥8000g离心1～2min；

K.吸弃上清，加入120μL的50mM MES，用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，大约20s；

L.加入0.1μg小分子-蛋白偶联物到重悬浮的微球中，用50mM MES，pH 5.0将总体积调到500μL；

M.用漩涡振荡器混匀，室温避光摇动2hr；

N.将微球≥8000g离心1～2min；

O.吸弃上清，用250～500μL的PBS-TBN用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，大约20s。室温避光摇动30min；

P.将微球≥8000g离心1～2min，吸弃上清，加入1mL的PBS-TBN，用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，大约20s；

Q.将微球在≥8000g离心1～2min，吸弃上清，用100μL的PBS-TBN重悬浮微球；

R.在1.5mL的离心管中依次加入抗原标准品或被检样品的前处理产物，5μL偶联抗原的微球、生物素标记的抗体、最后用PBS补足体积到100μL；

S.把反应物混匀，避光室温旋转60min，将SA-PE(藻红蛋白)(INVITROGEN公司)用PBS-1％OVA稀释到4μg/mL；

T.向每个反应里加25μL的稀释的SA-PE，把反应物混匀，避光室温旋转30min，上样50～75μL到LIQUIDCHIP WORK STATION中；

U.根据不同浓度标准品所得到的信号值绘制标准曲线，在标准曲线上找到样品对应的浓度值，得出样品中药物残留的浓度。

本发明所提供的药物残留的检测方法应用于药物残留的检测。

本发明实现的有益效果如下：

真正实现了高通量，可以在一个流程中同时对几种药物的残留情况进行检测；简化了操作程序，有效的降低了检测成本，缩短了检测时间；可以检测到pg级的水平。

附图说明

图1：呋喃唑酮代谢物残留、喹乙醇残留和金霉素残留6个标准浓度的标准曲线图。

具体实施方式

实施例1：

实验材料如下：

3-氨基-2恶唑酮(AOZ)单克隆抗体(晶美公司)，

金霉素单克隆抗体(晶美公司)，

3-甲基喹喔啉(MQCA)单克隆抗体(晶美公司)，

卵清蛋白(OVA)与3-氨基-2恶唑酮偶联的全抗原：OVA-AOZ(晶美公司)

卵清蛋白与金霉素偶联的全抗原：OVA-金霉素(晶美公司)

卵清蛋白与3-甲基喹喔啉偶联的全抗原：OVA-MQCA(晶美公司)

液相芯片仪QIAGEN LIQUIDCHIP WORK STATION及配套三种号码的微球(QIAGEN公司)。

实验设计：

1)在本实施例中，用33号微球偶联OVA-AOZ，用34号微球偶联OVA-金霉素，用35号微球偶联OVA-MQCA，最后将偶联了抗原的微球等比例混在一起，再加入抗体和样品前处理的待检物以及标准品。

2)同时依照同样的方法作交叉试验。

3)准备已知量的每种小分子的样品2个(一个1ng，一个20ng)，做盲实验。

实验方法如下：

1)用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，大约20s。

2)取三种微球各50μL，分别转移到三个1.5mL的离心管中，离心，去上清。

3)加入100μL的dH₂O，用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，约20s。

4)≥8000g离心1～2min。

5)吸弃上清，加入80μL的磷酸盐缓冲液(100mM Monobasic Sodium Phosphate，pH 6.2)，用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，约20s，用漩涡振荡器混匀。

6)加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS(diluted in dH₂O)，用漩涡振荡器混匀。

7)向微球加入10μL 50mg/mL EDC(diluted in dH₂O)(SIGMA公司)，用漩涡振荡器混匀。

8)在室温避光静置20min，每10min用漩涡振荡器轻轻的混匀。

9)将已经活化的微球≥8000g离心1～2min。

10)吸弃上清，用250μL的50mM MES(配方见后)，pH 5.0用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，约20s。

11)将微球≥8000g离心1～2min。

12)吸弃上清，用120μL的50mM MES，pH 5.0用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，大约20s。

13)分别将加入0.1μg的三种小分子-蛋白偶联物到相应的三种悬浮的微球中.用50mM MES将总体积调到500μL。

14)用漩涡振荡器混匀，在室温下避光轻摇2hr。

15)将微球在大于等于8000g离心1～2min。

16)吸弃上清，加入250～500μL的PBS-TBN(配方见附表)，用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，大约20s.在室温摇30min。

17)将微球≥8000g离心1～2min。

18)吸弃上清，加入1mL到250μL的PBS-TBN用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，约20s。

19)将微球≥8000g离心1～2min。

20)用100μL的PBS-TBN重悬浮微球。

21)将3套微球等体积混合在一起，并分配到6个试管中。10μL/管。同时另取四个试管，做两份盲样试验。

22)每个试管各加入偶联了生物素的3种抗体各50ng，和不同浓度的1种或者3种标准抗原(例如0ng，1ng，5ng，10ng，20ng，50ng，具体浓度视情况而定)到6个管中，用PBS-TBN调整体积到75μL混匀。

23)避光室温轻摇60min。

24)将SA-PE(藻红蛋白)用PBS-1％OVA(卵清蛋白)稀释到4μg/mL。向每个反应里加25μL的稀释的SA-PE。用枪上下打几次把反应物混匀。避光室温轻摇30min。

25)上样50-75μL到LIQUIDCHIP WORK STATION(液芯工作站)中。

26)检测结果如表1、表2所示。

5.检测盲样的实验：根据表2结果，绘制三种小分子作信号值与浓度的标准曲线(见附图1)。将检测到的信号与标准曲线比较，得出盲样品的量，做比较。

实验结果：

抗体梯度和交叉反应：如表1所示，液相芯片上三种小分子-蛋白偶联物和抗体有比较好的特异性反应，每种小分子-蛋白偶联物与其他抗体的交叉反应较低。微球本身的背景值也比较低。

间接竞争：如表2A，2B，2C，2D可见，三种微球同时检测三种标准品，在每种微球上所得到的信号值(代表此种标准品的量)和三种微球同时检测一种标准品在此种微球上所得到的信号值(代表此种标准品的量)是比较相近的，样品之间的干扰性较低。

检测样品的盲实验：按照表2结果，绘制信号值对小分子量的标准曲线。表3显示了盲样品的信号值和从标准曲线推出的他们的浓度，与实际浓度比较，偏差比较小。

表1：液相芯片上三种小分子-蛋白偶联物和抗体的特异性实验和交叉实验

表2A

表2B

表2C

35号微球信号

566

479

358

255

152

86

表2D

表3

	盲样1信号值	盲样1测量值	盲样1实际值	盲样1偏差	盲样2信号值	盲样2测量值	盲样2实际值	盲样2偏差
									AOZ	502	1.04ng	1ng	0.4％	235	5.02	5ng	0.4％
金霉素	615	1.01ng	1ng	0.1％	290	5.01	5ng	0.2％
									MQCA	428	1.02ng	1ng	0.2％	144	5.03	5ng	0.6％

结果分析：

呋喃唑酮，喹乙醇，金霉素等在动物性产品中的残留，对人体具有明显的急慢性毒性，包括癌症和染色体突变等特殊毒性，直接危害国民的身体健康及生命。这些药物的大量使用对畜禽健康也构成直接威胁。目前对于这些兽药残留的检测方法有高效液相色谱分析法(HPLC)和气象色谱/质谱联用分析法(GC/MS)或液相色谱/质谱联用分析法(LC/MS)。这些方法普遍存在着仪器昂贵，方法复杂，操作繁琐，试剂消耗量大的局限性。酶联免疫(ELISA)和放射免疫(RIA)技术以灵敏度高，特异性好，成本低，操作简单在兽药残留检测中广泛应用。但我国的免疫试剂盒的研究与开发大部分处在研发阶段，目前主要依靠国外进口的ELISA试剂盒，价格昂贵，且仅能对单一的兽药检测，对样本的需求量大，且操作费时，不便于进行大批量分析。

与传统的ELISA分析相比，流式液相芯片技术比ELISA的灵敏度高10倍左右，准确性好，需要的样本量和试剂少，监测过程操作比现有方法更简便，不需要洗板步骤；流式液相芯片的稳定性，可重复性好，批间差异非常少；液相环境更有利于探针和被检测物的反应；流式液相芯片的定量线性范围广，比ELISA多两个数量级；可同时检测多个指标，真正具备高通量的特点，有效降低成本60％以上，大大缩短检测时间。所以流式液相芯片技术更具有实用价值，因此我们开展此项研究。

高通量，稳定性和灵敏度是对所有检测方法的要求。流式液相芯片技术采用荧光编码的微球为包被基质，解决了在同一反应体系中同时识别多个不同的探针的问题，从而实现了检测的高通量。在本试验中，我们用衍生合成的抗原包被微球，保证了捕获被检测物的探针的特异性。在抗体的制备中，我们用蛋白A柱加亲和层析的方法纯化抗体。最后的抗体的纯度在95％以上。经验证三种抗体和四环素，土霉素，强力霉素及呋喃他酮的交叉反应率小于3％，并且在交叉试验中得到了三种抗体与三种抗原之间的交叉反应率小于5％，从而保证了三种反应在同一体系中进行。试验中我们同时做了直接竞争和间接竞争两套方案，经对比发现间接竞争的效果更好一些。所以最后我们采取了用抗原偶联微球，再加入被检测物和抗体，用偶联微球的抗原和被检测物同时竞争抗体的间接竞争法。通过三种小分子-蛋白偶联物浓度的筛选，封闭液等条件的优化，进一步提高了反应的灵敏度。可以检测到pg级的水平。

为了检验本方法的可行性，我们做了大量的盲样及与ELISA检测方法的对比，通过试验可以看出，液态芯片的灵敏度更高，在更低的蛋白质浓度下，曲线即呈现线性趋势。并且实现了一个反应可以同时检测三种兽残的目的。同时缩短了检测时间，2hr内即可完成样品处理和检测，得出精确的结果。为大批量的样品检验缩短了时间，提供了保证。

本方法的建立为解决如何更快，更精确地检测兽药残留找到了一条新的途径，相信在这个平台上我们将会开发出更多新的产品，以解决目前在兽药残留检测领域所存在的问题和不足。

附表：各种试剂的配方

0.1M NaH₂PO₄ pH 6.2                                 (Activation Buffer)                                       250mL

Reagent

Catalog Number

FinalConcentration

Amount/250mL

附表：各种试剂的配方

0.1M NaH₂PO₄ pH 6.2                                 (Activation Buffer)                                       250mL

Reagent	Catalog Number	FinalConcentration	Amount/250mL
				NaH2PO4(Sodium Phosphate，monobasic anhydrous)	Sigma S-3139	0.1M NaH2PO4	3g
5N NaOH	Fisher SS256-500	------	~40drops

Filter Sterilize and store at 4℃

0.05M MES，pH 5.0                                       (Coupling Buffer)*                                       250mL

Reagent	Catalog Number	FinalConcentration	Amount/250mL
				MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)	Sigma M-2933	0.05M	2.44g
5M NaOH	Fisher SS256-500	------	~5drops

Filter Sterilize and store at 4℃

PBS pH 7.4                                              (Alternate Coupling Buffer)**                            1000mL

Reagent	Catalog Number	FinalConcentration	Amount/1L
				PBS pH7.4	Sigma P-3813	138mM NaCl2.7mM KCl	1packet

Filter Sterilize and store at 4℃

PBS，1％OVA，0.05％Azide pH 7.4                 (PBS-TONBlocking/Storage Buffer)                                                                                             1000mL

Reagent	Catalog Number	FinalConcentration	Amount/1L
				PBS，1％OVA，pH 7.4	Sigma P-3688	138mM NaCl2.7mM KCl1％BSA	1packet
Sodium Azide	Sigma S-8032	0.05％Azide	500mg

Filter Sterilize and store at 4℃

PBS，0.1％BSA，0.02％TWEEN，0.05％Azide pH 7.4

                                                                                                                 1000mL

(PBS-TN Blocking/Storage Buffer)

Reagent	Catalog Number	FinalConcentration	Amount/1L
				PBS pH 7.4	Sigma P-3813	138mM NaCl2.7mM KCl	1packet
OVA	Sigma A-7888		1g
				Tween-20	Sigma P-9416		0.2mL
Sodium Azide	Sigma S-8032	0.05％Azide	500mg

Filter Sterilize and store at 4℃

PBS.1％OVA                                              (Assay Buffer)                                            1000mL

Reagent	Catalog Number	FinalConcentration	Amount/1L
				PBS，1％OVA，pH 7.4	Sigma P-3688	138mM NaCl2.7mM KCl1％BSA	1packet

Filter Sterilize and store at 4℃

Claims (7)

1.本发明提供一种药物残留的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

1)小分子-蛋白偶联物与单克隆抗体的预处理；

2)液相芯片***中微球的活化；

3)标准曲线的绘制；

4)待测样品信号值的测定；

5)根据标准曲线，计算待测样品中药物残留的含量

2.根据权利要求1所述的药物残留的检测方法，其特征在于：步骤1)所述的小分子-蛋白偶联物与单克隆抗体的预处理是指先将小分子-蛋白偶联物和单克隆抗体分别进行纯化除盐和除杂质，然后将抗体与D-生物素偶联

3.根据权利要求1所述的药物残留的检测方法，其特征在于：步骤1)所述的小分子是指呋喃唑酮代谢物喹乙醇和金霉素

4.根据权利要求1所述的药物残留的检测方法，其特征在于：步骤2)所述的液相芯片***中的微球的活化是指用EDC活化微球上的羧基

5.根据权利要求1所述的药物残留的检测方法，其特征在于：步骤3)所述的制定标准曲线是指用步骤1)预处理好的抗原标准品，通过浓度梯度实验，测定在不同浓度抗原存在的情况下，液相芯片***检测到的信号值，利用抗原浓度和液相芯片***检测到的信号值绘制标准曲线

6.根据权利要求1所述的药物残留的检测方法，其特征在于：步骤4)所述的测定待测样品的信号值是指将待测样品进行预处理后，加至检测试剂中，利用液相芯片***检测其信号值

7.根据权利要求1-6任意一项所述的药物残留的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

1).小分子-蛋白偶联物和单克隆抗体的处理：

A.用30mL PBS 7.4的磷酸盐缓冲液平衡除盐柱；

B.加入抗体，收集除盐柱洗脱下的液体，前3mL弃掉；

C.用离心管依次收集第4，5，6，7四个1mL的液体；

D.测定OD280，估算蛋白的量；

2).单克隆抗体偶联生物素：

A.将D-BIONTIN加入第一步得到的抗体中，室温轻摇1～2小时；

B.生物素标记单克隆抗体后，检测生物素偶联的效率，将过量的

D-BIONTIN用透析法除去，冻干；

3).液相芯片检测药物残留的试验：

A.用漩涡振荡器或者超声波悬浮微球，大约20s；

B.取50μL微球于1.5mL的离心管中，8000g离心1～2min，去上清液；

C.加入100μL双蒸水，用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，大约20s，8000g离心1～2min；

D.吸弃上清，加入80μL的磷酸盐缓冲液用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，大约20s；

E.加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS，用漩涡振荡器混匀；

F.加入10μL 50mg/mL EDC，用漩涡振荡器混匀；

G.在室温避光静置20min，每10min用漩涡振荡器轻轻的混匀；

H.将已经活化的微球≥8000g离心1～2min；

I.吸弃上清，加入250μL的50mM MES，用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，大约20s；

J.将微球≥8000g离心1～2min；

K.吸弃上清，加入120μL的50mM MES，用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，大约20s；

L.加入0.1μg小分子-蛋白偶联物到重悬浮的微球中。用50mM MES，pH5.0将总体积调到500μL；

M.用漩涡振荡器混匀，室温避光摇动2hr；

N.将微球≥8000g离心1～2min；

O.吸弃上清，用250～500μL的PBS-TBN用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，大约20s室温避光摇动30min；

P.将微球≥8000g离心1～2min，吸弃上清，加入1mL的PBS-TBN，用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，大约20s；

Q.将微球在≥8000g离心1～2min，吸弃上清，用10μL的PBS-TBN重悬浮微球；

R.在1.5mL的离心管中依次加入抗原标准品或被检样品的前处理产物，5μL偶联抗原的微球生物素标记的抗体最后用PBS补足体积到100μL；

S.把反应物混匀，避光室温旋转60min，将SA-PE用PBS-1％OVA稀释到4μg/mL；

T.向每个反应里加25μL的稀释的SA-PE，把反应物混匀，避光室温旋转30min，上样50～75μL到LIQUIDCHIP WORK STATION中；

U.根据不同浓度标准品所得到的信号值绘制标准曲线，在标准曲线上找到样品对应的浓度值，得出样品中药物残留的浓度。

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