CN101046473A - 改进胶乳结合的抗原或抗体粒子稳定性的方法 - Google Patents
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Abstract
一种改进胶乳结合的抗原或抗体粒子稳定性的方法,用于临床诊断试剂的配制,其特点是:在该试剂溶液中含0.1~2%的封闭剂和2~20%的稳定剂。封闭剂为多种封闭蛋白,包括白蛋白,凝胶蛋白等;稳定剂指特殊的调节密度的物质,包括甘油,蔗糖等,调节密度为1.01~1.09g/ml。本发明对使用胶乳增强法的生物体液诊断试剂可以确保稳定性,在临床检验学上,有广泛的应用前景。
Description
技术领域:
本发明属于生物技术领域。具体涉及一种改进胶乳结合的抗原或抗体粒子稳定性的方法。
背景技术
1956年singer和plotz开始使用直径为微米级的粒子,通过附着在胶乳粒子上的抗原或者抗体与血清中的抗体或抗原进行定性的玻片凝集法检测一些存在于体液中的微量被测物,主要包括类风湿,前白蛋白,***等。随着粒子合成技术的发展,粒子直径由微米级提高到纳米级,同时粒子表面可以根据需要进行一些特殊的处理,产生活性基团,纳米级的粒子被应用于免疫比浊测定中,开发出一系列定量测定的诊断试剂,包括类风湿,抗O,Lp(a),尿微球蛋白,前白蛋白,C反应蛋白,***,β2微球蛋白,肌钙蛋白,糖化血红蛋白等。随着临床检测要求的提高,国内外已广泛采用胶乳增强试剂对微量蛋白进行定量测定。
胶乳增强法是一种新的临床诊断方法,通过将抗原或者抗体与胶乳粒子进行共价交联后与对应的抗体或者抗原进行抗原抗体反应,大幅度增强了普通免疫法的灵敏度,比普通免疫比浊至少提高一个数量级,可以达到放射免疫测定法(RIA)的水平,但没有放射污染,操作简单,可以用普通生化分析仪进行测定,符合现代临床检验的要求,实现了一些低含量物质的定量测定。由于使用了胶乳颗粒,并在颗粒上结合了蛋白,形成的胶乳增强粒子体积通常为0.05~0.5um,但是,它们在溶液中是以悬浮状态存在,并不能在溶液中长期稳定,所以必须解决胶胶乳结合的抗原或抗体粒子的稳定性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种改进胶乳结合的抗原或抗体粒子稳定性的方法,它在对生物体液样本进行定量测定以及分析样本中的分析物浓度时处于稳定状态,可以使临床诊断试剂测量结果重复性更好,并且不会出现存放一定时期的试剂底部出现少量沉淀,空白升高等问题。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的:本发明提供了一种改进胶乳结合的抗原或抗体粒子稳定性的方法,用于临床诊断试剂的配制,其特征在于:该试剂溶液中加入0.1~2%的封闭剂和2~20%的稳定剂。
在上述试剂中,封闭剂指多种封闭蛋白,包括白蛋白,凝胶蛋白等;稳定剂指特殊的调节密度的物质,包括甘油,蔗糖等,调节密度为1.01~1.09g/ml。
上述试剂中,所述封闭剂最佳浓度为0.3%~1.2%。
上述试剂中,所述稳定剂最佳浓度为6~10%。
上述试剂中,所述稳定剂调节的最佳密度为1.03~1.07g/ml。
本发明基于下列原理本发明主要应用于使用胶乳增强法的临床诊断试剂的稳定,其实质就是通过调节试剂的密度,并使用封闭蛋白保证粒子所带电荷一致均匀,使得胶乳离子能够稳定的长期悬浮。已知结合蛋白后的胶乳粒子并不是完全被蛋白封闭的,需要使用一定量对反应影响很小的水容性强,带电荷比较多的蛋白保证胶乳增强粒子充分的封闭和均一,这里使用的封闭蛋白包括白蛋白,凝胶蛋白等,含量一般为0.1~2%。调节密度主要使用相对惰性的物质甘油和蔗糖,含量一般为2~20%,由于胶乳粒子本身的密度一般为1.05g/ml,所以需要调节密度最佳为1.03~1.07g/ml,保证带有均一电荷的粒子更容易长期稳定悬浮存在。利用本发明配制的胶乳增强试剂在4℃贮存9~12个月后,仍能符合临床要求,故在临床检验学上有着广泛的应用前景。
本发明应用于临床诊断的试剂品种主要有:类风湿,抗O,Lp(a),尿微球蛋白,前白蛋白,C反应蛋白(包括普通增强和超敏),***,β2微球蛋白,肌钙蛋白,糖化血红蛋白等,但不限于这些试剂,试剂通常是用蛋白进行封闭的,也包括一些非蛋白的封闭剂,封闭蛋白包括白蛋白,凝胶蛋白等,但不限于这几种。调节密度物质一般是相对惰性的物质,通常是甘油,蔗糖等,但不限于这几种。
在实施本专利时,根据检测试剂的组成,合理组合合适的封闭剂与恰当的调节密度的物质,根据所要检测对象使用的不同缓冲液,以反应的要求不同来选择不同浓度的封闭剂和调节密度物质。
具体实施方式
实施例一:
配制稳定的胶乳增强法类风湿试剂(RF)该试剂分A,B两部分,使用时先将4份试剂A和样品混合,37℃孵育300秒,再将一份试剂B加入,反应300秒后,通过计算570nm下(或者600nm也可)终点和刚加入试剂B的时候的吸光度变化,对照校准品的吸光度变化,计算出样本中类风湿因子的含量。该计算可以在自动分析仪上自动进行。试剂配方如下:
胶乳增强粒子的制备:
准备好处理过的人IgG,0.124um带活化基团的粒子(浓度10%mg/ml),并配制好500mM的MES缓冲液(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid 106.7g/L),去离子水。配制胶乳增强粒子如下:
加入含10%胶乳粒子的溶液 1ml
500mM的MES溶液 1ml
人IgG 14mg
EDAC(N-(3-dimethylaminopropyl)N’-ethylcarbodiimidehydrochloride)
100mg
去离子水加至10ml混匀3小时后离心去上清,加入如下缓冲液至40ml
EDTA Na2 0.0298g
BSA 0.4mg
蔗糖 3.2mg
PBS缓冲液pH=8.0 100mM(Na2HPO4·12H2O 33.9155g/l,KH2PO4 0.721275g/lNaCl 8.8g/l)至40ml。
搅拌均匀即可获得试剂B。
试剂A:PBS缓冲液pH=8.0 100mM
EDTA Na2 2mM
PEG8000 2%
BSA 1%
试剂B:PBS缓冲液pH=8.0 100mM
EDTA Na2 2mM
BSA 1%
蔗糖 8%
胶乳增强粒子 0.25%
上述试剂A和B为配制溶液的各组分浓度,可根据具体的溶液量折算各组分的量。
配制好的试剂放置4℃贮存1,3,6,12月后,测量同一份标准质控血清,其变异度<5%
实施例二:
配制稳定的胶乳增强法C反应蛋白试剂(CRP)该试剂分A,B两部分,使用时先将4份试剂A和样品混合,37℃孵育300秒,再将一份试剂B加入,反应300秒后,通过计算570nm下(或者600nm也可)终点和刚加入试剂B的时候的吸光度变化,对照校准品的吸光度变化,计算出样本中C反应蛋白的含量。该计算可以在自动分析仪上自动进行。试剂配方如下:
胶乳增强粒子的制备:
准备好处理过的C反应蛋白抗体,0.201um带活化基团的粒子(浓度10%),并配制好500mM的MES缓冲液,去离子水。配制胶乳增强粒子如下:
加入含10%胶乳粒子的溶液 1ml
500mM的MES溶液 1ml
C反应蛋白抗体 21mg
EDAC 100mg
去离子水加至10ml混匀3小时后离心去上清,加入如下缓冲液至40ml
EDTA Na2 0.0298g
BSA 0.36mg
蔗糖 3.6mg
PBS缓冲液pH=8.0 100mM(同实例一)至40ml
搅拌均匀即可获得试剂B。
试剂A:PBS缓冲液pH=8.0 100mM
EDTA Na2 2mM
PEG6000 2.4%
BSA 1%
试剂B:PBS缓冲液pH=8.0 100mM
EDTA Na2 2mM
BSA 0.9%
蔗糖 9%
胶乳增强粒子 0.25%
上述试剂A和B为配制溶液的各组分浓度,可根据具体的溶液量折算各组分的量。
配制好的试剂放置4℃贮存1,3,6,12月后,测量同一份标准质控血清,其变异度<5%。
实例三
利用本发明配制的胶乳增强试剂与普通溶液条件下保存的胶乳增强粒子进行对比研究(本处胶乳增强粒子对比使用的是实例一中制备的RF胶乳增强粒子),结果如下:
封闭蛋白 调节密度
溶液1:0.1%BSA 无
溶液2:0.3%BSA 无
溶液3:1%BSA 无
溶液4:2%BSA 无
溶液5:0.1%BSA 蔗糖5%
溶液6:0.1%BSA 蔗糖8%
溶液7:0.1%BSA 蔗糖12%
溶液8 0.3%封闭蛋白 蔗糖8%
溶液9:1%封闭蛋白 蔗糖8%
溶液10:2%封闭蛋白 蔗糖8%
测量时使用分光光度计,空白为试剂A和试剂B按4∶1混合,加样品为生理盐水时的吸光度。把0时间测定的初始吸光度定为100%(初始吸光度Abs这里为0.7211),把校准品吸光度作为100%(这里选择的靶值为150U/L的校准品,初始吸光度变化ΔA为1.0278)
表1:实际测量的空白吸光度和相对靶值的百分比(%)如果不加封闭蛋白,胶乳粒子一周后全部沉淀并分层,所以下表对照研究至少使用0.1%的封闭蛋白。
1个月后 | 3个月后 | 6个月后 | 12个月后 | |
溶液1空白Abs | 110 | 129 | 154 | 182 |
相对靶值ΔA | 91 | 78 | 61 | 39 |
溶液2空白Abs | 108 | 121 | 142 | 164 |
相对靶值ΔA | 93 | 84 | 70 | 56 |
溶液3空白Abs | 106 | 111 | 124 | 138 |
相对靶值ΔA | 95 | 90 | 83 | 72 |
溶液4空白Abs | 113 | 118 | 125 | 136 |
相对靶值ΔA | 89 | 86 | 82 | 73 |
溶液5空白Abs | 107 | 123 | 145 | 167 |
相对靶值ΔA | 94 | 83 | 68 | 54 |
溶液6空白Abs | 104 | 109 | 118 | 129 |
相对靶值ΔA | 97 | 92 | 86 | 78 |
溶液7空白Abs | 105 | 111 | 119 | 130 |
相对靶值ΔA | 96 | 90 | 85 | 78 |
溶液8空白Abs | 103 | 106 | 112 | 117 |
相对靶值ΔA | 98 | 95 | 89 | 86 |
溶液9空白Abs | 101 | 103 | 106 | 109 |
相对靶值ΔA | 100 | 98 | 95 | 92 |
溶液10空白Abs | 105 | 107 | 111 | 115 |
相对靶值ΔA | 96 | 94 | 90 | 88 |
上表结果表明,在仅加0.1%封闭蛋白并不调节密度的情况下,胶乳增强粒子很不稳定,同时测量空白吸光度可以看到明显的空白吸光度增加,这是由于胶乳粒子发生凝聚所引起的。溶液2~4是加封闭蛋白的梯度,可以看到1%左右最佳,高于2%以后明显的空白比较高,低于0.2%的时候,效果也不是很明显。溶液5~7是调节密度后的结果,高于8%以后虽然同样对胶乳增强粒子稳定效果很好,但从实际应用角度考虑,只需要选择能达到效果的最合适浓度即可,也就是调节密度到适合胶乳增强粒子稳定的密度即可,稍微多一些几乎不影响稳定性。通过封闭蛋白封闭和调整密度相对不进行稳定的胶乳粒子稳定性都有非常明显的提高。溶液8~10是同时进行了调节密度和封闭蛋白的对比,当使用1%封闭,含8%蔗糖的溶液中,12月后空白吸光度只增加了9%,同时校准品的吸光度变化仅仅下降了8%。实际应用中可以根据使用的不同直径,密度的粒子,以及粒子上包含不同量的蛋白,调整最佳的封闭蛋白浓度和调节最佳密度。
因而,利用本发明技术配制的胶乳增强试剂在4℃贮存9~12月后,仍能符合临床检验的要求。
Claims (7)
1、一种改进胶乳结合的抗原或抗体粒子稳定性的方法,其特征在于在配制的诊断试剂溶液中加入0.1~2%的封闭剂和2~20%的稳定剂。
2、一种改进胶乳结合的抗原或抗体粒子稳定性的方法,其特征在于在配制的诊断试剂溶液中加入0.3~1.2%的封闭剂和6~10%的稳定剂。
3、根据权利要求1所述的一种改进胶乳结合的抗原或抗体粒子稳定性的方法,其特征在于加入封闭剂和稳定剂之后的诊断试剂溶液的调节密度为1.01~1.09%。
4、根据权利要求1所述的一种改进胶乳结合的抗原或抗体粒子稳定性的方法,其特征在于加入封闭剂和稳定剂之后的诊断试剂溶液的调节密度为1.03~1.07%。
5、根据权利要求1所述的一种改进胶乳结合的抗原或抗体粒子稳定性的方法,其特征在于其中所述的封闭剂为白蛋白或凝胶蛋白。
6、根据权利要求1所述的一种改进胶乳结合的抗原或抗体粒子稳定性的方法,其特征在于其中所述的稳定剂为甘油或蔗糖。
7、一种权利要求1所述的改进胶乳结合的抗原或抗体粒子稳定性的方法在类风湿、抗O、LP(α)、尿微球蛋白、前白蛋白、C反应蛋白、***、β2微球蛋白、肌钙蛋白或糖化血红蛋白诊断试剂液配制中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20071003 |