CN1811454A - 一种四环素族抗生素酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种四环素族抗生素酶联免疫检测试剂盒，涉及酶免疫分析技术。本发明采用酶免疫吸附、蛋白质偶联和生物化学制备技术制备了本检测试剂盒。其关键技术是将四环素族经改造后以琥珀酸酐为桥与蛋白BSA偶联制备包被抗原，四环素族以戊二醛为桥与蛋白BSA偶联合成免疫抗原。再用酶免疫吸附间接竞争法检测四环素族。试剂盒具有简便、快速、准确检测动物性食品中四环素族抗生素的优点，其检测范围在1950ng/g－1.90ng/g之间，检测时间仅需4小时。本方法平均回收率80％－120％，批内误差小于8％，批间误差小于10％。适用于奶制品、蜂产品、水产品、肉类产品中四环素族抗生素的检测。

Description

一种四环素族抗生素酶联免疫检测试剂盒

技术领域

一种四环素族抗生素酶联免疫检测试剂盒，本发明属于酶免疫分析技术领域。应用于对动物源食品，尤其是肉类产品、水产品、蜂产品及奶制品中四环素族抗生素含量的检测。

背景技术

四环素族抗生素包括金霉素、土霉素和四环素等，可作为预防和治疗畜禽疾病的兽药，或作为促进畜禽生长的饲料添加剂，在水产养殖业中用于治疗多种鱼类疾病；在乳业中用于提高奶牛产奶量；在养蜂业中用于预防蜜蜂的感染性疾病。但过量使用不可避免使母体、代谢产物等相关抗生素残留于食源性动物的肌肉、蛋、奶、脏器组织中，通过生物链影响人体健康。在执行食品安全计划中，鉴于抗生素的作用与危害并存，动物性食品中四环素族抗生素的残留问题格外受到关注，各国制定了动物源性食品中兽药最高残留量标准和检测方法。

目前，动物源性食品中四环素族抗生素残留的检测方法主要是微生物抑制法、色谱法和免疫法等。微生物抑制法和免疫分析法适用于常规筛选方法，物理化学法用于鉴定和定量，但微生物抑制法缺乏灵敏度和专一性，物理化学法需要专业化的职员，样品预处理要求高，免疫分析法专一、灵敏，是最有发展潜力的方法之一。而酶联免疫(ELISA)法的推广应用，必须有相应成熟的试剂盒产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种结构简单，操作方便，检测快速的四环素族抗生素酶联免疫检测试剂盒。本发明是针对四环素族抗生素残留测定的酶联免疫检测试剂盒，制备能产生四环素族抗体的人工抗原、包被抗原、抗四环素族的抗体，并与四环素族抗生素有一定的交叉反应，将相关试剂组装成可直接使用的试剂盒，应用于动物源食品，尤其是肉类产品、水产品、蜂产品及奶制品中四环素族抗生素含量的检测。

本发明综合采用酶联免疫吸附、蛋白质偶联和生物化学制备等技术制备了四环素族抗生素残留酶联免疫检测试剂盒。将四环素与载体蛋白偶联制备成人工免疫抗原和包被抗原；用人工免疫抗原免疫动物制备抗四环素族的抗体；将四环素族包被抗原包被吸附于固相载体上；并将检测用的试剂配制成可直接使用的试剂。使用时将标准品或样品和抗体混合后与固相载体上的抗原竞争结合，洗涤去除游离的抗原抗体复合物，结合在固相载体上抗原与酶标抗抗体结合，用酶底物进行测定，结合的酶标记物将无色的显色剂转化为蓝色的产物。加入反应终止液后使颜色由蓝转变为黄色。用酶标仪在450nm处测量，吸收光强度与样品中的四环素族浓度成反比。

本发明的技术方案：本检测试剂盒由1.标准品溶液试剂瓶、2.酶标抗抗体溶液试剂瓶、3.抗体溶液试剂瓶、4.底物溶液试剂瓶、5.显色剂溶液试剂瓶、6.终止液试剂瓶、7.洗涤液试剂瓶、8.酶标板及9.酶标板支架、10.盒体所组成。试剂瓶1-7和酶标板及酶标板支架均安装在盒体内。包被酶标板的包被抗原，制备抗体的人工免疫抗原均由四环素族与BSA蛋白偶合人工合成。

酶标板(8)是包被四环素族抗原的聚苯乙烯微量反应板，有24孔、或48孔、或96孔。

所用试剂的配制和酶标板的包被为：

a)标准溶液的配制：准确称取标准盐酸四环素族1mg，精确到0.00002g，配成0.5mg/mL标准品溶液母液，灌装入试剂瓶(1)中，使用时，用PBS(磷酸盐缓冲液)稀释成所需的浓度(10-1000ng/mL)。

b)酶标抗抗体溶液配制：辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG原液，灌装入试剂瓶(2)中，使用时用洗涤液按1∶4000配制成工作浓度；

c)抗体溶液配制：用人工免疫抗原免疫动物制备所得到的多克隆或单克隆抗体，将所得的四环素族抗体用磷酸盐缓冲液稀释成工作浓度1∶4000，灌装入试剂瓶(3)。

d)底物溶液配制：使用0.1mol/L pH5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液，再配制成质量浓度0.3％H₂O₂作贮备液，每1ml缓冲液中加入14μL储备液，灌装入试剂瓶(4)。

e)显色剂溶液配制：用丙酮配制成10mg/mL的四甲基联苯胺溶液，用0.1mol/LpH5.0的醋酸钠—柠檬酸缓冲液配制成0.2mg/mL的四甲基联苯胺溶液，灌装入试剂瓶(5)。

f)终止液配制：2mol/L H₂SO₄溶液，灌装入试剂瓶(6)。

g)洗涤液配制(PBST)：含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液(PBS)：0.01mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液中含0.15mol/L的氯化钠，灌装入试剂瓶(7)。

h)酶标板的包被：包被抗原的聚苯乙烯微量反应板，取四环素族人工包被抗原150-200μL，加入反应板孔中，4℃冰箱中过夜，倒出孔内液体，用洗涤液(7)洗涤3-5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，吸干，在已包被抗原的酶标板小孔中加200μL 1％BSA PBS封闭液，37℃恒温培育1h，用洗涤液(7)洗涤，重复3次，用吸水纸吸干，封装。

所用包被抗原的制备如下：

将四环素族改造成4-亚肼基-4-脱二甲氨基四环素族，再通过琥珀酸酐为桥与载体蛋白BSA偶联，反应式如下图：

所用免疫抗原的制备：

四环素族通过戊二醛为桥与载体蛋白BSA偶联，反应式如下：

所用四环素族抗体的制备如下；

将上述人工免疫抗原免疫动物制备多克隆或单克隆抗体。

多克隆抗体的制备

体重1.5-2kg临床健康的雄性新西兰免，用四环素族人工抗原为免疫原，按体重500μg/kg的剂量免疫，首次用含福氏完全佐剂的免疫原皮下或皮内多点注射，此后每间隔四周用含福氏不完全佐剂的免疫原加强免疫，前后共四次，最后一次免疫后10天，宰杀、采血、分离血清后冷藏备用。

单克隆抗体的制备

用四环素族人工抗原为免疫原，免疫BALB/C小白鼠，免疫剂量40μg，含福氏完全佐剂的免疫原首次免疫，以后每隔四周，用含福氏不完全佐剂的免疫原加强免疫，前后共四次，最后一次免疫后10天，采血，取脾细胞。取免疫小白鼠的脾细胞与小白鼠的骨髓瘤细胞杂交融合，制备杂交瘤细胞。采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，筛选能稳定分泌四环素族单克隆抗体的杂交瘤细胞株。单克隆抗体的生产与纯化，小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，采集腹水，经硫酸铵盐析纯化，分装待用。

检测方法

本发明的四环素族抗生素检测试剂盒的检测方法是将标准溶液或样品溶液与适当稀释的四环素族抗体加入酶标板小孔中，同时设置空白和阴性对照孔，25-37℃恒温培育0.5-1h，倒出孔内液体，重复用洗涤液洗涤2-5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍打；加入适当稀释度的酶标抗抗体溶液于酶标板小孔中，25-37℃恒温培育0.5-1h，用洗涤液重复洗3-5次，吸干；加入底物溶液和显色溶液到待测酶标板小孔中，25-37℃恒温培育15min，再加入终止液，立即显黄色；用酶标仪在波长450m处测定吸收值A，以不加抗体的小孔作为空白调零。测定系列四环素族标准溶液孔的吸收值A，以四环素各浓度的吸收值为纵坐标对应四环素族浓度log值为横坐标，在半对数坐标纸上或以EXCEL绘制标准曲线图。以待测样品溶液的吸收值，在标准曲线上查出相应四环素浓度，再换算出样品中四环素的含量。

本发明的有益效果

所制备的酶联免疫快速检测试剂盒，具有简便、快速、准确的特点。并适用于奶制品、蜂产品、水产品、肉类产品中四环素族抗生素的检测。其检测范围在1950ng/g-1.90ng/g之间，检测时间仅需4小时。本方法平均回收率80％-120％，批内误差小于8％，批间误差小于10％。

附图说明

图1四环素族抗生素检测试剂盒示意图。

1、标准品溶液试剂瓶，2、酶标抗抗体溶液试剂瓶，3、抗体溶液试剂瓶，4、底物溶液试剂瓶，5、显色剂溶液试剂瓶，6、终止液试剂瓶，7、洗涤液试剂瓶，8、酶标板，9、酶标板支架，10、盒体。

图2酶标板示意图。

具体实施方式

实施例1

1包被抗原的制备

秤取盐酸四环素1克溶于50mL水中，加入2.7克氯代琥珀酰亚胺，反应30分钟后，过滤，用水洗涤粗制品。粗制品用150mL水和***(体积比1∶1)处理，弃水相，蒸干***相，再用水洗涤，过滤，即得纯品(约5.6克)，为改造四环素。

取20mg改造的四环素和6mg琥珀酸酐溶于2mL二氧六环，置37℃反应2h，置4℃过夜，此为①液。另取35mg卵清蛋白(OVA)溶于2mL水，再加入1mL二氧六环，此为②液。再取1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)125mg溶于2mL水中，此为③液，取③液1mL缓慢加入①液中搅拌0.5h，将此反应液缓慢滴入②液中，搅拌4h，再加入③液0.5mL。继续搅拌4h后，再加入③液0.5mL，搅拌过夜，次日对蒸馏水透析后回收。

2免疫抗原的制备

称取盐酸四环素170mg溶于2ml甲醇，缓慢加入0.1mol/mL pH4.0醋酸100ml缓冲液中，再依次加入8ml 25％戊二醛溶液、20mg BSA，室温搅拌5小时。将反应液通过0.01mol/mL pH4.0醋酸缓冲液平衡过的SephadexG-75层析柱(1×22cm)，用同样缓冲液进行洗脱，部分收集器收集在280nm和356nm波长处有并存峰的洗脱液，用聚乙二醇6000吸收浓缩得到人工免疫抗原四环素—戊二醛-BSA。

3四环素族多克隆抗体的制备

体重1.5-2kg临床健康的雄性新西兰免，以四环素-戊二醛-BSA为免疫原，按体重500μg/kg的剂量免疫四次，第一次用含1.5mL福氏完全佐剂的免疫原皮下或皮内多点注射，此后每间隔四周，用含1.5mL福氏不完全佐剂的免疫原加强免疫，前后共四次，每次加强免疫后采血测定抗体的消长情况，末一次免疫后10天，宰杀、采血、分离血清后冷藏备用。

4试剂盒的制备

a)包被抗原的聚苯乙烯微量反应板：取1-10μg/ml浓度的抗原溶液200μL，加入到酶标板小孔中，摇匀，置4℃冰箱中过夜。倒出孔内液体，用PBST洗涤液洗涤，重复3-5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，吸干。在已包被抗原的酶标板小孔中加200μL 1％BSA PBS封闭液，37℃恒温培育1h，用洗涤液洗涤，重复3次，用吸水纸吸干。封装。

b)标准溶液的配制：准确称取标准盐酸四环素1mg(精确到0.00002g)，配成0.5mg/mL母液，用PBS稀释成所需的浓度(10-1000ng/mL)。灌装为试剂1。

c)酶标抗抗体溶液：辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG原液。灌装为试剂2。

d)四环素抗体溶液：抗四环素抗体用磷酸盐缓冲液按1∶4000稀释成工作浓度。灌装为试剂3。

e)底物溶液：先用0.1mol/L pH5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成0.3％H₂O₂贮备液，每1mL缓冲液中加入14μL贮备液。灌装为试剂4。

f)显色溶液：先用丙酮配制10mg/mL的四甲基联苯胺溶液，用0.1mol/L pH5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成0.2mg/mL的四甲基联苯胺溶液。灌装为试剂5。

g)终止液：2mol/L H₂SO₄溶液。灌装为试剂6。

h)洗涤液(PBST)：含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液(PBS)：0.01mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液中含0.15mol/L的氯化钠。灌装为试剂7。

将上述的试剂瓶、酶标板及酶标板支架装入盒内，组成四环素酶联免疫检测试剂盒。

实施例2

抗原：改用盐酸土霉素标准品、抗体：改用土霉素抗体溶液。酶标板改用土霉素包被抗原包被，其余试剂瓶的配置同实施例1，即为土霉素酶联免疫检测试剂盒。

实施例3

抗原：改用盐酸金霉素标准品、抗体：改用金霉素抗体溶液。酶标板改用金霉素包被抗原包被，其余试剂瓶的配置同实施例1，即为金霉素酶联免疫检测试剂盒。

实施例4

1样品处理

a)乳制品脱脂奶可用PBS以脱脂奶：PBS为1∶10稀释后直接测定，全脂奶则应离心去脂肪后再经PBS以1∶10稀释后测定。

b)蜂蜜称取蜂蜜10g以10％乙醇-PBST溶解并定容到25mL，搅拌均匀并过滤，取滤液测定。

c)蜂王浆称取混和均匀的王浆200mg，置于带刻度的离心管中，加pH8.0PBS至2mL刻度处并稀释均匀，离心取上清液测定。

d)肉制品称取样品5g用少量10％乙醇-PBST，置玻璃研磨器中，研磨成均匀糊状，然后用10％乙醇-PBST洗出，并定容到25mL，搅拌均匀后，经冷冻离心去脂肪，取上清液测定。

e)水产品称取样品5g于玻璃匀浆器中，加少量2.0％酪蛋白-PBST，均质后将其定容到20mL，离心后取上清液检测。

2测定步骤

a)准备

分析前将所有试剂平衡至室温；按要求将有关试剂稀释至使用浓度；分析后立即将所有试剂放回4℃～8℃冰箱；在所有培育中，避光，盖上微孔板盖。

b)试剂配置

酶标二抗(试剂2)的稀释：使用前取酶标二抗250μL用洗涤剂(试剂7)稀释成使用液。

c)定位

根据需要设定限量法(见表1)和定量法(见表2)。取足够数量的酶标板微孔置于酶标板支架上，记录标准品孔和试样孔的位置。限量法时控制标准孔号中的浓度为限量值/稀释倍数，并通过调节稀释倍数使之浓度在10-1000mg/mL测定范围内。

                           表1限量法微孔定位

零标准孔号	控制标准孔号	样品孔号
								1	2	3	4	5	6	7	8

                                     表2定量法微孔定位

标准孔浓度μg/L						样品孔号
												a	b	c	d	e	f	1	2	3	4	5	6

d)免疫反应

在每孔中依次加入试剂，加入50μL标准溶液或试样提取液至相应微孔中；再加入50μL抗体溶液到每个微孔中。摇匀，将酶标板放在塑料袋内，置暗处，室温(25℃～37℃)反应1小时。将微孔中液体倾倒到水池内，倒置微孔支架，在干净纸巾上轻拍，除去所有残留的液体，加洗涤液约250μL到每个微孔中洗板，再排空液体，重复洗涤4次。在每孔中依次加入100μL酶标二抗溶液到每个微孔中。摇匀，将酶标板放在塑料袋内，置暗处，室温(20℃～30℃)反应1小时。按上述洗涤方法进行洗涤。

e)显色测定

每孔分别加入底物溶液和显色剂溶液各50μuL(相当于一滴)，充分摇匀，置暗处，室温(25℃～37℃)反应15min。(每次滴溶液前先挤去2-3滴后再滴入微孔。)加50μL(相当于一滴)终止液到每孔中，摇匀。用酶标仪在450nm处，以空气为空白调零，测定吸收值。在60min内读数。

3结果计算和表述

a)限量法

若试样孔的吸收值小于标准孔的吸收值，即A_450nm试样孔＜A_450nm标准孔，超过限量值，为阳性。若试样孔的吸收值大于标准孔的吸收值，即A_450nm试样孔＞A_450nm标准孔，则小于所设限量值，为阴性。

b)定量法

标准曲线的绘制：所测标准品的吸收值对应四环素族(μg/L)的半对数坐标作标准曲线图，曲线在一定范围内应当成线性。根据试样的百分吸收值，通过标准曲线，查得相对应浓度。按式(1)计算试样中的四环素族含量。

试样中的四环素族含量X，单位为微克每千克(μg/kg)，按下式计算；

$X=\frac{\mathrm{CVn}}{m}---\left(1\right)$

式中：

C-从标准曲线上查得相对应提取液中四环素族浓度，单位为微克每升(μg/L)；

V-试样提取液体积，单位为毫升(mL)；

n-试样稀释倍数；

m-试样质量，单位为克(g)。

计算结果表示到小数点后一位有效数字。

Claims (5)

1.一种四环素族抗生素酶联免疫检测试剂盒，其特征是由标准品溶液试剂瓶(1)、酶标抗抗体溶液试剂瓶(2)、抗体溶液试剂瓶(3)、底物溶液试剂瓶(4)、显色剂溶液试剂瓶(5)、终止液试剂瓶(6)、洗涤液试剂瓶(7)、酶标板(8)及酶标板支架(9)、盒体(10)所组成，试剂瓶(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)和酶标板(8)及酶标板支架(9)均安装在盒体(10)内，包被酶标板的包被抗原，制备抗体的人工免疫抗原均由四环素族与BSA蛋白偶合人工合成；

a)标准品溶液配制：准确称取标准盐酸四环素族1mg，精确到0.00002g，配成0.5mg/mL标准品溶液母液，灌装入试剂瓶(1)，使用时，用磷酸盐缓冲液稀释成所需的浓度10-1000ng/mL的系列标准品溶液；

b)酶标抗抗体溶液配制：酶标抗抗体为辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG原液，灌装入试剂瓶(2)，使用时用洗涤液按1∶4000配制成工作浓度；

c)抗体溶液配制：用人工免疫抗原免疫动物制备所得到的多克隆或单克隆抗体，将所得的四环素族抗体用磷酸盐缓冲液稀释成工作浓度1∶4000，灌装入试剂瓶(3)；

d)底物溶液配制：使用0.1mol/L pH5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液，再配制质量浓度0.3％H₂O₂作贮备液，每1ml缓冲液中加入14μL贮备液，灌装入试剂瓶(4)；

e)显色剂溶液配制：用丙酮配制成10mg/mL的四甲基联苯胺溶液，用0.1mol/LpH5.0的醋酸钠—柠檬酸缓冲液配制成0.2mg/mL的四甲基联苯胺溶液，灌装入试剂瓶(5)；

f)终止液配制：2mol/L H₂SO₄溶液，灌装入试剂瓶(6)；

g)洗涤液配制：含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液，0.01mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液中含0.15mol/L的氯化钠，灌装入试剂瓶(7)；

h)酶标板的包被：取四环素族人工包被抗原150-200μL，加入反应板孔中，4℃冰箱中过夜，倒出孔内液体，用洗涤液(7)洗涤3-5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，吸干在已包被抗原的酶标板小孔中加200μL 1％BSA PBS封闭液，37℃恒温培育1h，用洗涤液(7)洗涤，重复3次，用吸水纸吸干，封装。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征是酶标板(8)是包被四环素族抗原的聚苯乙烯微量反应板，有24孔、或48孔、或96孔。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征是包被抗原的制备：将四环素族改造成4-亚肼基-4-脱二甲氨基四环素族再通过琥珀酸酐为桥与载体蛋白BSA偶联。

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征是人工免疫抗原的制备：四环素族通过戊二醛为桥与载体蛋白BSA偶联。

5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征是所述的四环素族抗生素为四环素、或金霉素、或土霉素。

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